CN109391758B - 对样品保持器中的样品进行成像 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对样品保持器中的样品进行成像。提供了一种用于对样品保持器中的样品进行成像的系统100和方法。为了提供自动聚焦，经由散光光学元件120将二维图案投射到样品保持器050上。经由放大光学元件150通过光学传感器140获取样品的图像数据172。沿着第一轴线和第二轴线测量图像数据中所述二维图案的清晰度的差异。基于所述差异，确定摄像机子系统相对于所述样品保持器的散焦的大小和方向。这使得能够以快速且可靠的方式使得所述样品保持器聚焦到焦点上并从而使得所述样品聚焦到焦点上。

Description

对样品保持器中的样品进行成像
技术领域
本发明涉及用于对样品保持器中的样品进行成像的成像系统和方法。本发明还涉及包括用于使处理器系统执行所述方法的指令的计算机程序。
背景技术
数字显微镜和类似的设备(诸如微孔板读取器)通常配备有图像传感器以获取样品的图像数据。为了获得具有足够清晰度的这样的图像数据，这样的成像系统可以被设置有自动聚焦功能，以能够聚焦到样品保持器上，例如，聚焦到样品保持器的底部部分上、聚焦到样品保持器的上部部分上和/或聚焦到样品保持器内的中间位置上。
已知多种类型的自动聚焦，它们通常被分类为“主动的”或“被动的”。在此，“主动”自动聚焦通常涉及使用专用硬件，诸如专用光源和检测器，而“被动”自动聚焦通常利用所获取的图像数据，从而使用现有的成像硬件，以确定样品是否在焦点上。被动自动聚焦的优点通常是其成本较低，因为可以不需要专用硬件。然而，明显的缺点是其自动聚焦速度通常较低，这是因为被动自动聚焦通常基于在不同的焦平面上获取若干个图像。主动自动聚焦可以根据单次焦点测量确定正确的焦点。
WO2015197601结合了主动自动聚焦和被动自动聚焦。描述了一种专用自动聚焦光设备，其经由自动聚焦照明束路径将参考图案投射通过显微镜物镜并且朝向样品。从在样品内或在样品附近的参考表面反向散射的光通过显微镜物镜返回，且经由自动聚焦检测束路径被引导朝向自动聚焦检测器，在此它形成自动聚焦检测图案。参考表面由定位在样品处或靠近样品定位的界面中的一个限定。
自动聚焦照明和检测束路径被设计成使得，根据参考表面的位置，沿着光学轴线且相对于显微镜物镜的所选界面，自动聚焦检测图案改变其尺寸、其位置和/或其形状。据说，用于获得此位置信息的多种方法，也称为高度编码，在本领域中是已知的。例如，样品平面中的参考图案可以是单个斑点，从而产生一个自动聚焦检测图案，该自动聚焦检测图案也是一个斑点，但是当参考表面和显微镜物镜之间的轴向距离变化时，该自动聚焦检测图案改变其尺寸(由于模糊、未聚焦成像)、其形状(由于散光、横向失真成像)或其横向位置(由于自动聚焦照明和/或检测束路径相对于显微镜的光学轴线倾斜)。
不利地，WO2015197601的稳健性可能不足，例如，在样品或样品保持器的表面上有划痕或灰尘的情况下。
发明内容
在被配置用于对样品保持器中的样品进行成像的成像系统中获得更稳健的自动聚焦将是有利的。
根据本发明的第一方面，提供了一种用于对样品保持器中的样品进行成像的成像系统。所述成像系统包括：
-一个摄像机子系统，包括图像传感器和放大光学器件并且被配置为经由所述放大光学器件对所述样品进行成像；
-一个投射子系统，包括光源和散光光学元件并且被配置为经由所述散光光学元件和所述放大光学器件将二维图案投射到所述样品保持器上；
-一个处理器子系统，包括：
-一个摄像机接口，被配置为接收通过所述摄像机子系统获取的图像数据；
-一个存储器，包含代表一组指令的指令数据；以及
-一个处理器，被配置为与所述摄像机接口和所述存储器通信并且执行该组指令，其中当所述处理器执行该组指令时，该组指令使得所述处理器：
-分析所述图像数据以识别所述二维图案；
-确定所述二维图案的沿着所述图像数据中的第一轴线的清晰度量度；
-确定所述二维图案的沿着所述图像数据中的第二轴线的清晰度量度，所述第二轴线与所述第一轴线正交；
-确定沿着所述第一轴线的清晰度量度和沿着所述第二轴线的清晰度量度之间的差异，并基于所述差异，确定所述摄像机子系统相对于所述样品保持器的散焦的大小和方向。
根据本发明的另一方面，提供一种对样品保持器中的样品进行成像的计算机实施的方法，其中通过光源经由散光光学元件将二维图案投射到所述样品保持器上，所述方法包括：
-获得经由放大光学器件通过图像传感器获取的所述样品的图像数据；
-分析所述图像数据以识别所述二维图案；
-确定所述二维图案的沿着所述图像数据中的第一轴线的清晰度量度；
-确定所述二维图案的沿着所述图像数据中的第二轴线的清晰度量度，所述第二轴线与所述第一轴线正交；以及
-确定沿着所述第一轴线的清晰度量度和沿着所述第二轴线的清晰度量度之间的差异，确定所述摄像机子系统相对于所述样品保持器的散焦的大小和方向。
根据本发明的另一方面，提供了一种暂时性或非暂时性计算机可读介质，其包括计算机程序，所述计算机程序包括用于使处理器系统执行所述方法的指令。
本发明的以上方面涉及对样品保持器(诸如微孔板的孔或载玻片)中的样品进行成像。为此，提供了摄像机子系统，所述摄像机子系统包括图像传感器(诸如CCD或CMOS传感器)和放大光学器件(诸如一个或多个透镜)。此外，提供了处理器子系统，所述处理器子系统可以被实施为例如计算机等，且所述处理器子系统包括存储器、处理器和到所述摄像机子系统的摄像机接口。
此外，提供了投射子系统，所述投射子系统具有光源(诸如发光二极管)和散光光学元件(诸如倾斜玻璃板或圆柱形透镜)。所述投射子系统被配置为经由所述散光光学元件并经由所述摄像机子系统的放大光学器件将二维(2D)图案投射到所述样品保持器上。在此，术语“二维”是指在图案在两个维度上延伸，从而在两个维度上具有空间细节。当所述图案被投射到所述样品保持器上时，所述图案在通过所述摄像机子系统获取的图像数据中可见。
然后按如下方式确定所述摄像机子系统相对于所述样品保持器(从而相对于所述样品)的聚焦(散焦)。当二维图案被投射到所述样品保持器上时获取图像。沿着所述图像数据中的第一轴线确定所述二维图案的清晰度的量，并沿着所述图像数据中的与所述第一轴线正交的第二轴线确定所述二维图案的清晰度的量。两个轴线可以被选择成与所述散光光学元件的切向平面和矢状平面旋转地对齐，所述切向平面和矢状平面可常常对应于所述图像数据的竖直轴线和水平轴线。然后确定测量的两个清晰度的量之间的差异，然后所述差异被用来确定所述摄像机子系统相对于所述样品保持器的散焦的量和方向。然后可以使所述样品保持器聚焦到所述摄像机子系统的焦点上并因此使样品聚焦到所述摄像机子系统的焦点上。
更详细的解释如下。通过经由所述散光光学元件投射二维图案，在所述散光光学元件的切向平面和矢状平面中传播的光线可以具有不同的焦距。举例来说，下面假设这些平面与图像数据中示出的二维图案的水平轴线和竖直轴线对齐。因此，二维图案的水平空间信息可以被投射到第一焦平面上，而竖直空间信息可以被投射到第二焦平面上。发明人已经设想了使用焦距的此差异来获得快速且可靠的自动聚焦。即，如果焦平面中存在反射表面，例如，来自所述样品保持器的一个表面，则表示投射的二维图案的光将通过所述放大光学器件反射回来，其中反射的二维图案然后被成像在所述图像传感器的表面。如果在获取图像数据的同时逐渐增加或减小样品保持器和放大光学器件之间的相对位置，则首先二维图案的水平(或竖直)空间细节将在图像数据中显得清晰，然后水平空间细节和竖直空间细节将在图像数据中显得同样清晰，再然后竖直(或水平)空间细节将显得清晰。在除了中间位置之外的任何其他位置，对于水平空间细节和竖直空间细节而言二维图案的空间细节将被不同程度地模糊，这取决于当前的焦点与通过散光建立的二维图案的不同焦距的相对位置。通过比较沿着两个图像轴线的清晰度，可以确定散焦的大小和方向。
即，所述摄像机子系统的焦平面可以与所述样品保持器的上述位置中的任何一个具有已知关系。例如，通过合适的机械设计和/或光学设计，所述摄像机子系统的焦平面可以与所述样品保持器的“中间位置”重合，在所述“中间位置”，投射的二维图案的水平空间细节和竖直空间细节将显得同样清晰。替代地，所述摄像机子系统的焦平面可以通过所述机械设计和/或光学设计与所述投射子系统的两个焦平面中的任何一个重合。在所述摄像机子系统的焦平面和所述投射子系统的焦平面之间也可存在已知的偏移，例如，如可以在制造期间通过校准确定并且作为数据存储在存储器中。在此基础上，可以使所述样品保持器聚焦到焦点上并且从而使所述样品聚焦到焦点上。
尽管基于散光的自动聚焦本身是已知的，但是这样的已知的自动聚焦通常基于激光投射点的形状改变。发明人已经确定，不能够从图像传感器的图像数据足够可靠地确定这样的形状改变，特别是在所述样品或所述样品保持器的表面上存在划痕或灰尘的情况下。然而，可以可靠地测量水平清晰度和竖直清晰度，特别是如果使用的图案在图像数据中相当大(sizable)并且在任一方向上具有足够的图像细节。因此，获得比基于激光投射点的自动聚焦更可靠同时比完全被动自动聚焦更快速的自动聚焦。
可选地，当通过所述处理器执行该组指令时，该组指令使所述处理器基于施加到所述图像数据的空间滤波操作或所述图像数据的频率变换来确定每个清晰度量度。通过使用合适的空间滤波器，可以在空间域中量化在一个特定方向上的空间细节的量。一个非限制性实施例是边缘检测滤波器，诸如基于Sobel内核的滤波器。替代地，可以在频域中量化空间细节，例如，使用二维傅里叶变换。
可选地，所述投射子系统还包括一个光学元件，诸如消色差透镜，所述光学元件被配置为使所述光源发射的光在穿过所述散光光学元件之后准直。例如，所述消色差透镜可以是形成没有色差的图像的复合透镜系统。
可选地，所述投射子系统被配置为经由所述放大光学器件将所述二维图案投射到所述样品保持器上，且所述摄像机子系统被配置为经由所述放大光学器件对所述样品进行成像。因此，被所述摄像机子系统使用的所述放大光学器件可以被所述投射子系统(重新)使用，以将所述二维图案投射到所述样品保持器上。
可选地，所述成像系统包括一个反射镜(mirror)，所述反射镜被配置为用一侧将被所述样品反射的并且已经穿过所述放大光学器件的光的至少一部分反射到所述图像传感器上，并用另一侧使所述光源发射的光的至少一部分传向所述放大光学器件。这样的反射镜允许使所述投射子系统发射的光改向朝着所述放大光学器件，同时使所述样品和/或样品保持器反射的光改向朝着所述摄像机子系统。
可选地，所述二维图案是二维格(grid)。例如，所述格可以具有多个水平格线和多个竖直格线。每种数目可以是例如5到15个格线或10到20个格线的范围，或者通常具有任何其他合适的值。格线的间隔可以是规则间隔，例如，在宽度为5μm时为50μm。在一些实施方案中，清晰度量度可以仅被应用于二维格的一部分，例如，感兴趣的区域。例如，所述感兴趣的区域可以包括11×11的格线。
可选地，所述二维图案由布置在所述光源和所述散光光学元件之间的板(plate)提供。例如，在所述图案是格的情况下，所述板可以是网格板(例如，由线格(网)或束格(网)构成)或其上绘制有图案的透明板等。替代地，可以通过任何已知的投射技术建立所述二维图案。例如，可以使用透射或反射微型显示器。
可选地，所述成像系统还包括：
-一个致动器，被配置为调节所述样品保持器和所述放大光学器件之间的距离；以及
-在所述处理器子系统中，一个致动器接口被配置为控制所述致动器，
其中当所述处理器执行该组指令时，该组指令使所述处理器基于散焦的大小和/或方向经由所述致动器接口控制所述致动器,以使得所述样品和/或样品保持器聚焦到焦点上。
应理解，可以使用致动器以多种方式调节所述样品保持器和所述放大光学器件之间的距离，例如，通过使用致动器来移动所述样品保持器、所述放大光学器件或二者的组合。如此，除非另有说明，否则对“使得所述样品和/或样品保持器聚焦到焦点上”的任何提及应被理解为包括这些选项中的任何一个。
通常，可以提供一种用于对样品保持器中的样品进行成像的系统和方法。为了提供快速且可靠的自动聚焦，可以经由散光光学元件将二维图案投射到所述样品保持器上。可以经由放大光学器件通过图像传感器获取所述样品的图像数据。可以沿着第一轴线和第二轴线测量在所述图像数据中二维图案的清晰度的差异。基于所述差异，可以相对于所述样品保持器确定所述摄像机子系统的散焦的大小和方向。这使得能够以快速且可靠的方式使得所述样品保持器聚焦到焦点上并从而使得所述样品聚焦到焦点上。
本领域技术人员将理解，本发明的上文提及的多个实施方案、多个实施方式和/或多个方面中的两个或更多个可以以任何被认为有用的方式组合。
对应于所述成像系统的所描述的改型和变化的方法和/或计算机程序的改型和变化可以由本领域技术人员基于本说明书来实现。
附图说明
本发明的这些和其他方面从在下文中描述的实施方案变得明显并且将参考在下文中描述的实施方案得以阐明。在附图中，
图1示出了用于对样品保持器中的样品进行成像的成像系统，其中该成像系统被布置用于通过经由散光光学元件将二维图案投射到样品保持器上并且比较两个正交空间方向上图像数据的清晰度来确定相对于样品保持器的散焦；
图2示出了格形式的二维图案的一个实施例；
图3A示出了在第一Z位置处获取的格的成像版本，在该第一Z位置处，竖直格线以最大清晰度示出；
图3B示出了在第二Z位置处获取的格的成像版本，在该第二Z位置处，水平格线以最大清晰度示出；
图3C示出了在第一Z位置和第二Z位置之间的中间Z位置处获取的格的成像版本，在该中间Z位置处，竖直格线和水平格线以类似的清晰度示出；
图4A示出了对于在2x放大率下的孔(well)，就水平清晰度和竖直清晰度而言清晰度量度随Z位置的变化；
图4B示出了对于在4x放大率下的孔，就水平清晰度和竖直清晰度而言清晰度量度随Z位置的变化；
图5示出了对样品保持器中的样品进行成像的方法；以及
图6示出了包括非暂时性数据的计算机可读介质，其中所述数据代表用于执行该方法的计算机程序。
应注意，在不同图中具有相同附图标记的项具有相同的结构特征和相同的功能，或是相同的信号。在已经解释了这样的项的功能和/或结构的情况下，在详细描述中不需要对其进行重复解释。
参考和缩写列表
提供以下附图标记和缩写列表以便于解释附图，且以下附图标记和缩写列表不应被解释为限制权利要求。
050 样品保持器
100 成像系统
110 光源
112 发射的光
115 格板
120 散光光学元件
125 消色差透镜
130、132 反射镜
140 图像传感器
142 反射的光
145 镜筒透镜
150 放大光学器件
160 处理器子系统
170 摄像机接口
172 图像数据
180 处理器
182、184 数据通信
190 存储器
200 二维图案
202 水平格线
204 竖直格线
300 在第一z位置处成像的图案
302 第一z位置
310 在第二z位置处成像的图案
312 第二z位置
320 在中间z位置处成像的图案
322 中间z位置
400 以μm为单位的z位置
402 根据Sobel内核的清晰度量度
410 对于在2x放大率下的孔测量的清晰度
412 在水平方向上的清晰度
414 在竖直方向上的清晰度
420 对于在4x放大率下的孔测量的清晰度
422 在水平方向上的清晰度
424 在竖直方向上的清晰度
430 孔底的底部表面的反射的峰
440 孔底的上部表面的反射的峰
500 对样品保持器中的样品进行成像的方法
510 获得样品的图像数据
520 确定沿着第一轴线的清晰度量度
530 确定沿着第二轴线的清晰度量度
540 确定散焦的大小和方向
600 计算机可读介质
610 非暂时性数据
具体实施方式
图1示出了用于对样品保持器050中的样品进行成像的成像系统100的一个实施例，该样品保持器诸如是微孔板的孔或透明显微镜载玻片或生物芯片，诸如被配置用于细胞计数的生物芯片。可以被成像的样品可以是生物样品，但不限于此。
成像系统100包括摄像机子系统，该摄像机子系统包括图像传感器140和放大光学器件150，其中该摄像机子系统被配置为使用放大光学器件150对样品保持器050中的样品进行成像。图像传感器140可以是用于对样品保持器050中的样品进行成像的任何合适类型。例如，图像传感器140可以是CMOS或CCD型传感器，且可以被集成到摄像机模块内。可以选择放大光学器件150以提供特定的放大水平，诸如，但不限于2x、4x和10x放大率，或这样的水平的范围。在一个具体实施例中，摄像机可以是具有500万像素分辨率和2/3〃传感器尺寸的CMOS摄像机，放大光学器件可以包括2x放大率物镜，例如，数值孔径(NA)为0.08，工作距离为6.20mm，视场为13.25mm，且XY分辨率为4.19μm。进一步示出的是光学元件145，在此实施例中，该光学元件145包括具有0.5x放大率的镜筒透镜并且其可以被布置成用于使光学分辨率大致匹配于摄像机的像素尺寸。
成像系统100还包括投射子系统，该投射子系统包括光源110(诸如发光二极管(LED)或LED排列)以及散光光学元件120(诸如倾斜玻璃板或圆柱形透镜)。图1示出了倾斜玻璃板120，例如厚度d为1mm并且倾斜角α为30°的倾斜玻璃板。该投射子系统被配置为借助于光源110发射的光经由散光光学元件120将二维图案投射到样品保持器050上。为此，可以使用不同的投射技术。在图1的实施例中，该二维图案被设置在布置在光源110和散光光学元件120之间的板115上。例如，板115可以是网格板，该网格板借助于线格或束格(例如‘网’状结构)建立格形式的二维图案。板115也可以是透明板，在该透明板上绘制有图案，或者以吸收光的方式以另一种方式建立图案。在又一个实施例中，板115可以是不透明的，但具有由板115的材料雕刻的图案，以便局部穿过形成图案的光。在又一个实施例中，代替板115，可以使用透射或反射微型显示器来投射图案。
图1还示出了由光源110发射的光112，所述光112在穿过散光光学元件120之后，穿过被配置为使光112准直的消色差透镜125，之后光112被反射镜130、132改向至朝向放大光学器件150。应注意，代替消色差透镜125，可以使用其他类型的透镜，诸如非球面透镜等。
成像系统100还被示出为包括处理器子系统160，该处理器子系统包括摄像机接口170、存储器190和处理器180，其中处理器180经由数据通信182与摄像机接口170通信并且经由数据通信184与存储器190通信。摄像机接口170可以被配置为接收由图像传感器140获取的图像数据172。在一些实施方案中，摄像机接口170还可以被配置为向图像传感器140和/或摄像机子系统提供控制数据，以使得处理器180能够控制该摄像机子系统。
存储器190可以包括代表一组指令的指令数据，当在操作成像系统100期间处理器180执行该指令数据时，该指令数据使处理器180确定二维图案的沿着图像数据172中的第一轴线的清晰度量度，确定二维图案的沿着图像数据172中的与该第一轴线正交的第二轴线的清晰度量度，以及确定沿着该第一轴线的清晰度量度和沿着该第二轴线的清晰度量度之间的差异，并且基于所述差异，确定摄像机子系统相对于样品保持器的散焦的大小和方向。将参考图2-图4B进一步解释处理器180的此操作，包括其可选方面。
尽管未在图1中示出，但是成像系统100还可以包括致动器，诸如电动马达，该致动器可以被配置为调节样品保持器050和放大光学器件150之间的距离。例如，该致动器可以被配置为移动样品保持器050、放大光学器件150或二者。此外，在处理器子系统160中，可以设置致动器接口，该致动器接口可以被配置为使得处理器180能够控制该致动器。因此，处理器180可以基于散焦的大小和方向，经由该致动器接口来控制该致动器，使得样品和/或样品保持器050聚焦到焦点上。例如，该样品保持器可以是通过致动器可在Z方向上定位的，Z方向指的是平行于摄像机子系统在放大光学器件和样品保持器之间的光学路径的方向。因此，样品保持器050可以被带到Z位置，在该Z位置处，样品和/或样品保持器050在摄像机子系统的焦点上。
通常，摄像机接口170可以采用任何合适的形式，包括但不限于USB、FireWire、Wi-Fi以及类似类型的有线数据通信接口和无线数据通信接口。注意到，摄像机接口170可以包括多个接口或由多个接口组成，例如，并联和/或串联布置的多个接口。例如，摄像机接口170可以包括用于接收来自摄像机的图像数据的HDMI接口，以及用于控制摄像机的I2C接口。尽管未在图1中示出，但是该摄像机子系统可以包括对应类型的接口。
在一些实施方案中，处理器子系统160可以被实施为与摄像机子系统和投射子系统分离的设备、仪器或系统。例如，处理器子系统160可以由工作站、服务器、个人计算机等来实施，它们可以经由摄像机接口170连接到摄像机子系统。在一个具体实施方案中，该摄像机子系统可以是微孔板读取器的一部分，该微孔板读取器还可以包括投射子系统和微孔板运输装置(图1中未示出)，且该微孔板读取器可以经由一个或多个数据通信接口(包括但不限于摄像机接口170)连接到实施处理器子系统160的设备、仪器或系统。替代地，摄像机子系统、投射子系统和处理器子系统160可以是同一设备、仪器或系统的一部分，该设备、仪器或系统例如是具有被配置用于执行参考处理器180所描述的操作的一个或多个嵌入式处理器的微孔板读取器。
通常，处理器子系统160可以被实施为一个设备、仪器或系统-或被实施在一个设备、仪器或系统中。该设备、仪器或系统可以包括一个或多个处理器，诸如微处理器，所述处理器执行适当的软件。实施处理器180的所描述的操作的软件可能已经被下载和/或被存储在一个对应的存储器190或多个存储器中，例如，存储在诸如RAM的易失性存储器中或存储在诸如闪存的非易失性存储器中。替代地，处理器180可以以可编程逻辑(例如，如现场可编程门阵列(FPGA))的形式实施在设备、仪器或系统中。摄像机接口和可选的致动器接口各自可以由设备、仪器或系统的相应接口来实施。通常，处理器子系统的每个单元可以以电路的形式和/或以分布式方式实施，例如，涉及不同的设备或仪器。例如，分布式可以是根据客户端-服务器模型，例如，使用服务器和客户端工作站。
图2示出了呈格200的形式的二维图案的一个实施例。格200可以具有多个水平格线202和多个竖直格线204，它们可以是但不必是规则地间隔的。在图2的实施例中，格200是12×12的格，但是通常，沿着每个轴线的格线的数目可以变化，例如，在5和15之间或在20和30之间。同样地设想多种其他类型的二维图案。优选地，这样的二维图案在水平方向和竖直方向上(或通常，沿着建立散光所沿着的两个轴线)含有相等或类似的细节量，其中所述细节量可以以与在使用成像系统期间相同的方式测量。例如，二维图案可以包括圆形形状、矩形形状或三角形形状。
图3A示出了一个格的成像版本300，例如，如可以在图像数据中示出的，出于例示性的目的，该图像数据是在样品保持器的第一Z位置处获取的，在该第一Z位置处，以最大清晰度示出水平格线。在此Z位置处，水平格线在摄像机子系统的焦点上，而竖直格线是离焦的并且因此在该图像数据中显得模糊。注意到，图3A的格相对于图2的格反转，这可能是由于通过光在格线处透射而不是通过吸收来投射格。图3B示出了在第二Z位置处获取的该格的成像版本310，在第二Z位置处，以最大清晰度示出竖直格线。在此Z位置处，竖直格线在摄像机子系统的焦点上，而水平格线是离焦的并且因此在该图像数据中显得模糊。图3C示出了在第一Z位置和第二Z位置之间的中间Z位置处获取的格的成像版本320，在该中间Z位置处，以类似的清晰度示出水平格线和竖直格线。此Z位置对应于如下的Z位置，在该Z位置处，将代表该格的光朝向摄像机子系统反射回的反射表面在焦点上。
图4A示出了测量曲线图410，该测量曲线图示出了清晰度量度402随以μm为单位的Z位置400的变化，从而产生水平方向上的清晰度的测量曲线412和竖直方向上的清晰度(sharpness)的测量曲线414。在此，以μm为单位的Z位置是摄像机子系统和样品保持器050之间的相对距离，且代表摄像机子系统的焦距。
在此实施例中，可以看到，在大约2900μm处，所述格的水平格线以最大清晰度成像，而在大约2750μm处，所述格的竖直格线以最大清晰度成像。最后，在介于两者之间的中间位置处，例如在大约2850μm处，水平格线和竖直格线在图像数据中显得同样清晰。这三个Z位置在概念上分别对应于第一Z位置302、第二Z位置312和中间Z位置322，这些位置参考图3A至图3C得以描述并且在图4A中由虚线表示。
从图4A可以看到，水平方向和竖直方向上的清晰度的测量对应于两个测量曲线412、414的截面，且可以看到对所述曲线有(大概)认识能够通过两个方向上的清晰度的相应的值确定最佳聚焦位置，例如，中间Z位置322。然而，对所述曲线的这样的认识可以用线性近似或一阶近似代替。例如，在与图4A的实施例略有不同的实施例中，其中清晰度的量由在竖直方向上的格线标准偏差(SDver)和在水平方向上的格线标准偏差(SDhor)限定，焦点函数可以被定义为：
Figure BDA0001761426800000141
Figure BDA0001761426800000142
在此，F的符号可以指示方向，而F的绝对值可以与朝最佳焦距的距离成比例。一个新位置可以被计算为Znew＝Zold+k*F，其中k是系统相关因子。
可以设想多种其他清晰度量度。例如，最大强度可以是清晰度量度，因为在焦点上的格线产生具有较高最大强度的较窄峰(对于明亮背景上的黑线)，而离焦格线产生具有较低最大强度的较宽峰。因此，最大强度可以被用作清晰度量度。在其他实施例中，可以在频域中计算清晰度量度，例如，如通过快速傅里叶变换(FFT)或任何其他合适的变换所获得的。
注意到，不需要精确地计算散焦的量和方向(从而不需要精确地计算最佳聚焦位置)。相反，取决于使用实例，一些不准确度是可接受的。此外，可以迭代地应用自动聚焦测量，以便在两个或更多个测量内收敛到最佳聚焦位置，例如，直到聚焦误差在预定义的限制以下。在使用期间，如果焦点“丢失”，例如由于温度影响，单次测量可能足以使得样品保持器和/或样品重新聚焦到焦点上。
图4A的测量曲线图410涉及以2x放大率成像的孔。图4B示出了与图4A的测量曲线图类似的测量曲线图420，其中它示出了水平方向上的清晰度的测量曲线422和竖直方向上的清晰度的测量曲线424，但是现在针对的是在4x放大率下的孔。可以看到，在稍微不同的Z位置处实现了最佳聚焦。此外，图4B例示了成像的图案可以是多个反射(例如，来自样品保持器的不同表面)的叠加。例如，在样品保持器是含有液体的孔的情况下，成像的图案可以是在孔底的上部表面(例如在液体和孔底的交界处)处的反射和孔底的底部表面(例如在孔底和周围空气之间)处的反射的叠加。两个反射都提供非重合峰，其中一个反射提供“主”峰430，且另一个反射在3200μm和3300μm处作为次峰440可见。在此实施例中，主峰430来自孔底的底部表面的反射，因为在此折射率的差异最大，而次峰440来自孔底的上部表面的反射。如果期望聚焦在上部表面上，则可以对所确定的聚焦位置施加偏移，或可以在测量曲线图中检测两组峰430、440。偏移可以是预先确定的偏移，例如通过例如在制造期间校准获得的。
通常，最佳聚焦位置可以属于样品保持器的表面中的一个。如果期望另一个相对于此表面具有已知相对位置的聚焦位置，例如样品保持器的另一个表面或样品内的一个位置，则可以对所确定的聚焦位置施加偏移。
尽管图4A和4B涉及2x和4x放大率，但是实验已经证明了其他放大因数(例如10x)的可行性。
通常，所要求保护的本发明可以被用于利用样品容器(诸如微孔板、载玻片、芯片等)的明视场成像应用。此外，所要求保护的本发明可以被应用在荧光成像应用中。
图5示出了用于对样品保持器中的样品进行成像的计算机实施的方法500。方法500在标题为“获取样品的图像数据”的操作中包括获得510经由放大光学器件通过图像传感器获取的样品的图像数据。方法500在标题为“确定沿着第一轴线的清晰度量度”的操作中还包括确定520二维图案的沿着图像数据中的第一轴线的清晰度量度。方法500在标题为“确定沿着第二轴线的清晰度量度”的操作中还包括确定530二维图案的沿着图像数据中与所述第一轴线正交的第二轴线的清晰度量度。方法500在标题为“确定散焦的大小和方向”的操作中还包括确定540沿着第一轴线的清晰度量度和沿着第二轴线的清晰度量度之间的差异，并基于所述差异，确定摄像机子系统相对于样品保持器的散焦的大小和方向。
可以利用如本说明书中描述的成像系统来执行方法500，但是所述成像系统也可以是不同类型的，只要它包括用于经由散光光学元件将二维图案投射到样品保持器上的装置。如果基于限定图案的投射数据来执行这样的投射，例如，在使用微型显示器执行投射的情况下，该方法还可以包括作为初始操作的生成用于经由散光光学器件将二维图案投射到样品保持器上的投射数据。替代地，如果光源是计算机控制的，则该方法可以包括作为初始操作的控制该光源以经由散光光学元件将二维图案投射到样品保持器上。
方法500可以作为计算机实施的方法、作为专用硬件或作为二者的组合在处理器系统上(例如，在计算机上)实施。还如图6中例示的，用于计算机的指令(例如，可执行代码)可以被存储在计算机可读介质600上，例如，以一系列机器可读物理标记610的形式和/或作为具有不同的电学属性或电学值(例如磁属性或磁值)或光学属性或光学值的一系列元件。可执行代码可以以暂时或非暂时的方式存储。计算机可读介质的实施例包括存储器设备、光学存储设备、集成电路、服务器、在线软件等。图6示出了光盘600。
无论是否被指示为非限制性的，实施例、实施方案或可选特征不应被理解为限制所要求保护的本发明。
应注意，上文提及的实施方案例示本发明而非限制本发明，且在不背离所附权利要求的范围的前提下，本领域技术人员将能够设计许多替代实施方案。
在权利要求中，放置在括号内的任何参考符号不应被解释为限制权利要求。动词“包括”及其变形的使用不排除在权利要求中陈述的那些元件或步骤之外的元件或步骤的存在。元件前面的冠词“一”或“一个”不排除存在多个这样的元件。本发明可以借助于包括若干不同元件的硬件以及借助于适当编程的计算机来实施。在列举了若干个装置的设备权利要求中，这些装置中的若干个可以由同一个硬件项来体现。在相互不同的从属权利要求中记载某些措施的仅有事实并不指示这些措施的组合不能够被用来获益。

Claims (13)

1.一种用于对样品保持器(050)中的样品进行成像的成像系统(100)，所述成像系统包括：
-一个摄像机子系统，包括图像传感器(140)和放大光学器件(150)并且被配置为经由所述放大光学器件对所述样品进行成像；
-一个投射子系统，包括光源(110)和散光光学元件(120)并且被配置为经由所述散光光学元件和所述放大光学器件(150)将二维图案(200)投射到所述样品保持器上；
-一个致动器，被配置为调节所述样品保持器(050)和所述放大光学器件(150)之间的距离；以及
-一个处理器子系统(160)，包括：
-一个摄像机接口(170)，被配置为接收通过所述摄像机子系统获取的图像数据(172)；
-一个致动器接口，被配置为控制所述致动器；
-一个存储器(190)，包含代表一组指令的指令数据；以及
-一个处理器(180)，被配置为与所述摄像机接口和所述存储器通信并且执行该组指令，其中当所述处理器执行该组指令时，该组指令使得所述处理器：
-确定所述二维图案的沿着所述图像数据中的第一轴线的清晰度量度(412，422)；
-确定所述二维图案的沿着所述图像数据中的第二轴线的清晰度量度(414，424)，所述第二轴线与所述第一轴线正交；
-确定沿着所述第一轴线的清晰度量度和沿着所述第二轴线的清晰度量度之间的差异，并基于所述差异，确定所述摄像机子系统相对于所述样品保持器的散焦的大小和方向；以及
-基于散焦的大小和/或方向，经由所述致动器接口控制所述致动器以使得所述样品和/或样品保持器聚焦到焦点上。
2.根据权利要求1所述的成像系统(100)，其中当所述处理器(180)执行该组指令时，该组指令使得所述处理器基于施加到所述图像数据(172)的空间滤波操作或所述图像数据的频率变换来确定每个清晰度量度。
3.根据权利要求1或2所述的成像系统(100)，其中所述散光光学元件(120)是倾斜玻璃板或圆柱形透镜。
4.根据权利要求1或2所述的成像系统(100)，其中所述投射子系统还包括一个光学元件(125)，所述光学元件被配置为使所述光源(110)发射的光(112)在穿过所述散光光学元件(120)之后准直。
5.根据权利要求1或2所述的成像系统(100)，还包括一个反射镜(130)，所述反射镜(130)被配置为用一侧将所述样品反射的并且已经穿过所述放大光学器件(150)的光(142)的至少一部分反射到所述图像传感器(140)上，并用另一侧将所述光源发射的光(112)的至少一部分传向所述放大光学器件。
6.根据权利要求1或2所述的成像系统(100)，其中所述二维图案(200)是二维格。
7.根据权利要求6所述的成像系统(100)，其中所述二维格(200)具有多个水平格线(202)和多个竖直格线(204)，每种格线在5到15个格线的范围内。
8.根据权利要求1或2所述的成像系统(100)，其中所述二维图案(200)由布置在所述光源(110)和所述散光光学元件(120)之间的板(115)提供。
9.根据权利要求1或2所述的成像系统(100)，其中所述光源(110)是发光二极管。
10.根据权利要求1或2所述的成像系统(100)，其中所述成像系统是微孔板读取器。
11.根据权利要求1或2所述的成像系统(100)，其中所述样品保持器(050)是载玻片或微孔板的孔。
12.一种对样品保持器中的样品进行成像的方法(500)，其中通过光源经由散光光学元件和放大光学器件将二维图案投射到所述样品保持器上，所述方法包括：
-获得(510)经由所述放大光学器件通过图像传感器获取的所述样品的图像数据；
-确定(520)所述二维图案的沿着所述图像数据中的第一轴线的清晰度量度；
-确定(530)所述二维图案的沿着所述图像数据中的第二轴线的清晰度量度，所述第二轴线与所述第一轴线正交；以及
-确定(540)沿着所述第一轴线的清晰度量度和沿着所述第二轴线的清晰度量度之间的差异，并基于所述差异，确定摄像机子系统相对于所述样品保持器的散焦的大小和方向；
经由致动器接口，控制被配置为调节所述样品保持器和所述放大光学器件之间距离的致动器，其中基于散焦的大小和/或方向，所述控制包括控制所述致动器以使得所述样品和/或样品保持器聚焦到焦点上。
13.一种包括计算机程序(610)的暂时性或非暂时性计算机可读介质(600)，所述计算机程序包括用于使根据权利要求1所述的成像系统的处理器执行根据权利要求12所述的方法的指令。
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