JP2023125282A - 解析方法および解析装置 - Google Patents

Abstract

【課題】二次元撮影または三次元撮影を単独で行う場合よりも、試料の解析結果を精度よく得ることができる解析方法および解析装置を提供する。【解決手段】この解析装置は、二次元撮像部３０、三次元撮像部４０、および解析部としてのコンピュータ５０を備える。二次元撮像部３０は、試料を二次元撮影することにより、二次元画像Ｄ２を取得する。三次元撮像部４０は、試料を三次元撮影することにより、三次元画像Ｄ３を取得する。コンピュータ５０は、まず、二次元画像Ｄ２を解析することにより、二次元解析結果Ｒ２を出力する。次に、コンピュータ５０は、三次元画像Ｄ３を解析することにより、三次元解析結果Ｒ３を出力する。このとき、コンピュータ５０は、二次元解析結果Ｒ２に含まれる指標を利用して、三次元画像Ｄ３を解析する。これにより、三次元解析結果Ｒ３の精度を向上させることができる。【選択図】図４

Description

本発明は、複数の被観察物が三次元的に分布する試料を解析する解析方法および解析装置に関する。

従来、病理医学や細胞培養において、複数の細胞が三次元的に分布する生体試料を撮影し、得られた画像に基づいて、生体試料を解析することが行われている。生体試料の撮影方法としては、光学顕微鏡による二次元撮影を行う方法や、光干渉断層撮影（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）により三次元撮影を行う方法などが、知られている。例えば、特許文献１には、光干渉断層撮影により胚の三次元画像を取得する技術が、記載されている。

特開２０１９－１３３４２９号公報

光学顕微鏡による二次元撮影では、三次元撮影に比べて、高い解像度の画像を取得することができる。ただし、二次元撮影の場合、単一の画像では、生体試料の立体的な構造が把握できない。このため、光学顕微鏡の焦点位置を変化させながら、複数回の撮影を行い、得られた複数枚の二次元画像に基づいて、生体試料の解析が行われる。

一方、光干渉断層撮影等の三次元撮影を行えば、二次元撮影よりも、生体試料の立体的な構造を把握しやすいという利点がある。ただし、三次元撮影の場合、二次元撮影に比べて、得られる画像の解像度が低いことが多く、細部の構造について精度のよい解析結果を得ることが難しい、という問題がある。

本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、二次元撮影または三次元撮影を単独で行う場合よりも、試料の解析結果を精度よく得ることができる解析方法および解析装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため、本願の第１発明は、複数の被観察物が三次元的に分布する試料を解析する解析方法であって、ａ）前記試料を二次元撮影することにより、二次元画像を取得する工程と、ｂ）前記試料を三次元撮影することにより、三次元画像を取得する工程と、ｃ）前記二次元画像を解析することにより、二次元解析結果を出力する工程と、ｄ）前記三次元画像を解析することにより、三次元解析結果を出力する工程と、を有し、前記工程ｄ）では、前記二次元解析結果に含まれる指標を利用して、前記三次元画像を解析する。

本願の第２発明は、請求項１に記載の解析方法であって、前記試料は、胚であり、前記被観察物は、前記胚に含まれる細胞であり、前記二次元解析結果は、前記胚に含まれる前記細胞の数である。

本願の第３発明は、第２発明の解析方法であって、前記三次元解析結果は、前記胚に含まれる複数の前記細胞の形状同定結果であり、前記工程ｄ）では、前記工程ｃ）により取得した前記細胞の数に基づいて、前記細胞の形状同定結果を算出する領域の数を決定する。

本願の第４発明は、第２発明または第３発明の解析方法であって、ｅ）前記工程ｄ）の後に、前記三次元解析結果に基づいて、前記胚の状態を表すＶｅｅｃｋ分類結果を出力する工程をさらに有する。

本願の第５発明は、複数の被観察物が三次元的に分布する試料を解析する解析方法であって、ａ）前記試料を二次元撮影することにより、二次元画像を取得する工程と、ｂ）前記試料を三次元撮影することにより、三次元画像を取得する工程と、ｃ）前記二次元画像を解析することにより、二次元解析結果を出力する工程と、ｄ）前記三次元画像を解析することにより、三次元解析結果を出力する工程と、ｅ）前記二次元解析結果および前記三次元解析結果に基づいて、統合解析結果を出力する工程と、を有する。

本願の第６発明は、第５発明の解析方法であって、前記試料は、胚であり、前記二次元解析結果、前記三次元解析結果、および前記統合解析結果は、前記胚の状態を表すＶｅｅｃｋ分類結果である。

本願の第７発明は、第１発明から第６発明までのいずれか１発明の解析方法であって、前記工程ａ）では、焦点位置を変更しつつ、明視野撮影を行うことにより、複数の前記二次元画像を取得し、前記工程ｃ）では、複数の前記二次元画像を解析することにより、前記二次元解析結果を取得する。

本願の第８発明は、第１発明から第７発明までのいずれか１発明の解析方法であって、前記工程ｂ）では、光干渉断層撮影により、前記三次元画像を取得する。

本願の第９発明は、複数の被観察物が三次元的に分布する試料を解析する解析装置であって、前記試料を二次元撮影することにより、二次元画像を取得する二次元撮像部と、前記試料を三次元撮影することにより、三次元画像を取得する三次元撮像部と、前記二次元画像および前記三次元画像に基づいて、試料を解析する解析部と、を備え、解析部は、前記二次元画像を解析することにより、二次元解析結果を出力する二次元解析処理と、前記三次元画像を解析することにより、三次元解析結果を出力する三次元解析処理と、を実行し、前記三次元解析処理では、前記二次元解析結果に含まれる指標を利用して、前記三次元画像を解析する。

本願の第１０発明は、複数の被観察物が三次元的に分布する試料を解析する解析装置であって、前記試料を二次元撮影することにより、二次元画像を取得する二次元撮像部と、前記試料を三次元撮影することにより、三次元画像を取得する三次元撮像部と、前記二次元画像および前記三次元画像に基づいて、試料を解析する解析部と、を備え、解析部は、前記二次元画像を解析することにより、二次元解析結果を出力する二次元解析処理と、前記三次元画像を解析することにより、三次元解析結果を出力する三次元解析処理と、前記二次元解析結果および前記三次元解析結果に基づいて、統合解析結果を出力する統合解析処理と、を実行する。

本願の第１発明～第４発明によれば、二次元解析により精度よく得られる指標を利用して、三次元画像を解析できる。これにより、精度のよい三次元解析結果を得ることができる。

特に、本願の第２発明によれば、二次元解析により、三次元解析よりも精度よく取得できる細胞数の情報を、三次元解析に利用する。これにより、精度のよい三次元解析結果を得ることができる。

特に、本願の第３発明によれば、二次元解析により取得した細胞の数に基づいて、細胞の三次元解析結果を精度よく算出できる。

また、本願の第５発明～第８発明によれば、二次元解析と三次元解析の２通りのアプローチにより得られる２つの解析結果を利用して、統合解析結果を出力する。これにより、精度のよい統合解析結果を得ることができる。

特に、本願の第６発明によれば、二次元解析と三次元解析の２通りのアプローチにより得られる２つのＶｅｅｃｋ分類結果を統合して、最終的なＶｅｅｃｋ分類結果を出力する。これにより、精度のよいＶｅｅｃｋ分類結果を得ることができる。

特に、本願の第７発明によれば、複数の二次元画像を解析することにより、精度のよい二次元解析結果を得ることができる。

特に、本願の第８発明によれば、光干渉断層撮影により、三次元画像を精度よく取得できる。

また、本願の第９発明によれば、二次元解析により精度よく得られる指標を利用して、三次元画像を解析できる。これにより、精度のよい三次元解析結果を得ることができる。

また、本願の第１０発明によれば、二次元解析と三次元解析の２通りのアプローチにより得られる２つの解析結果を利用して、統合解析結果を出力する。これにより、精度のよい統合解析結果を得ることができる。

解析装置の構成を示した図である。 胚の例を示した図である。 解析装置の制御ブロック図である。 第１実施形態に係る撮影・解析処理を実現するためのコンピュータの機能を、概念的に示したブロック図である。 第１実施形態に係る撮影・解析処理の流れを示したフローチャートである。 第２実施形態に係る撮影・解析処理を実現するためのコンピュータの機能を、概念的に示したブロック図である。 第２実施形態に係る撮影・解析処理の流れを示したフローチャートである。

以下、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明する。

＜１．解析装置の構成＞
図１は、本発明の一実施形態に係る解析装置１の構成を示した図である。この解析装置１は、試料容器９０内に保持された試料を撮影し、得られた画像に基づいて、試料の状態を解析する装置である。

本実施形態では、解析対象となる試料が、ヒトの胚９である場合について、説明する。図２は、胚９の例を示した図である。胚９は、受精卵が卵割を行うことにより形成される。図２に示すように、胚９は、球面状の透明帯９１の中に、被観察物である複数の細胞９２が、三次元的に分布したものである。各細胞９２は、透明または半透明である。

図１に示すように、解析装置１は、ステージ１０、光照射部４０、二次元撮像部２０、三次元撮像部３０、およびコンピュータ５０を備える。

ステージ１０は、試料容器９０を支持する支持台である。試料容器９０には、例えば、ウェルプレートが使用される。ウェルプレートは、複数のウェル（凹部）を有する。試料である胚９は、各ウェルの中に、培養液とともに保持される。ただし、試料容器９０は、１つの凹部のみを有するディッシュであってもよい。試料容器９０の材料には、光を透過する透明な樹脂が使用される。ステージ１０は、上下方向に貫通する開口部１１を有する。試料容器９０は、ステージ１０の当該開口部１１に嵌め込まれた状態で、水平に支持される。したがって、試料容器９０の上面および下面は、ステージ１０に覆われることなく露出する。

光照射部４０は、ステージ１０に支持された試料容器９０の上方に配置されている。光照射部４０は、ＬＥＤ等の発光素子を有する。二次元撮像部２０による撮影を行うときには、光照射部４０の発光素子が発光する。これにより、光照射部４０から下方の試料容器９０へ向けて、光が照射される。

二次元撮像部２０は、試料容器９０内の胚９を、光学顕微鏡により二次元撮影するユニットである。二次元撮像部２０は、ステージ１０に支持された試料容器９０の下方に配置されている。図１に示すように、二次元撮像部２０は、撮像光学系２１、カメラ２２、および焦点移動機構２３を有する。撮像光学系２１は、対物レンズ２１１を含む複数の光学部品を有する。対物レンズ２１１は、カメラ２２の焦点を、試料容器９０内の胚９に合わせるためのレンズである。カメラ２２は、ＣＣＤやＣＭＯＳ等の撮像素子を有する。

二次元撮影を行うときには、光照射部４０から試料容器９０へ向けて光を照射しつつ、カメラ２２が、試料容器９０内の胚９を明視野で撮影する。これにより、胚９の二次元画像を、デジタルデータとして取得する。取得された二次元画像は、カメラ２２からコンピュータ５０へ入力される。二次元画像は、二次元座標上に配列された複数の画素により構成され、画素毎に輝度値が規定されたデータである。

焦点移動機構２３は、カメラ２２の焦点位置を変化させる機構である。焦点移動機構２３は、モータまたはピエゾ等のアクチュエータにより、対物レンズ２１１の位置を、光軸に沿って微小移動させる。これにより、カメラ２２の焦点位置が、上下方向に微小移動する。二次元撮像部２０は、焦点移動機構２３により、焦点の位置を変化させながら、胚９を複数回撮影（マルチフォーカス撮影）する。これにより、焦点位置の異なる複数の二次元画像が取得される。

また、二次元撮像部２０は、図示を省略した移動機構により、光照射部４０とともに、水平方向に移動可能となっている。これにより、二次元撮像部２０の視野を、複数のウェルの間で切り替えることができる。

三次元撮像部３０は、試料容器９０内の胚９を、三次元撮影するユニットである。三次元撮像部３０は、ステージ１０に支持された試料容器９０の下方に配置されている。三次元撮像部３０には、胚９の断層画像を撮影することが可能な、光干渉断層撮影（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）装置が用いられる。

図１に示すように、三次元撮像部３０は、光源３１、物体光学系３２、参照光学系３３、検出部３４、および光ファイバカプラ３５を有する。光ファイバカプラ３５は、第１光ファイバ３５１～第４光ファイバ３５４が、接続部３５５において連結されたものである。光源３１、物体光学系３２、参照光学系３３、および検出部３４は、光ファイバカプラ３５により構成される光路を介して、互いに接続されている。

光源３１は、ＬＥＤ等の発光素子を有する。光源３１は、広帯域の波長成分を含む低コヒーレンス光を出射する。胚９の内部まで光を到達させるために、光源３１から出射される光は、近赤外線であることが望ましい。光源３１は、第１光ファイバ３５１に接続されている。光源３１から出射される光は、第１光ファイバ３５１へ入射し、接続部３５５において、第２光ファイバ３５２へ入射する光と、第３光ファイバ３５３へ入射する光とに、分岐される。

第２光ファイバ３５２は、物体光学系３２に接続されている。接続部３５５から第２光ファイバ３５２へ進む光は、物体光学系３２へ入射する。物体光学系３２は、コリメータレンズ３２１および対物レンズ３２２を含む複数の光学部品を有する。第２光ファイバ３５２から出射された光は、コリメータレンズ３２１および対物レンズ３２２を通って、試料容器９０内の胚９へ照射される。このとき、対物レンズ３２２により、光が胚９へ向けて収束する。そして、胚９において反射した光（以下「観察光」と称する）は、対物レンズ３２２およびコリメータレンズ３２１を通って、再び第２光ファイバ３５２へ入射する。

図１に示すように、物体光学系３２は、走査機構３２３に接続されている。走査機構３２３は、コンピュータ５０からの指令に従って、物体光学系３２を、鉛直方向および水平方向に微小移動させる。これにより、胚９に対する光の入射位置を、鉛直方向および水平方向に微小移動させることができる。

また、三次元撮像部３０は、図示を省略した移動機構により、水平方向に移動可能となっている。これにより、三次元撮像部３０の視野を、複数のウェルの間で切り替えることができる。

第３光ファイバ３５３は、参照光学系３３に接続されている。接続部３５５から第３光ファイバ３５３へ進む光は、参照光学系３３へ入射する。参照光学系３３は、コリメータレンズ３３１およびミラー３３２を有する。第３光ファイバ３５３から出射された光は、コリメータレンズ３３１を通って、ミラー３３２へ入射する。そして、ミラー３３２により反射された光（以下「参照光」と称する）は、コリメータレンズ３３１を通って、再び第３光ファイバ３５３へ入射する。

図１に示すように、ミラー３３２は、進退機構３３３に接続されている。進退機構３３３は、コンピュータ５０からの指令に従って、ミラー３３２を、光軸方向に微小移動させる。これにより、参照光の光路長を変化させることができる。

第４光ファイバ３５４は、検出部３４に接続されている。物体光学系３２から第２光ファイバ３５２へ入射した観察光と、参照光学系３３から第３光ファイバ３５３へ入射した参照光とは、接続部３５５において合流して、第４光ファイバ３５４へ入射する。そして、第４光ファイバ３５４から出射された光は、検出部３４へ入射する。このとき、観察光と参照光との間で、位相差に起因する干渉が生じる。この干渉光の分光スペクトルは、観察光の反射位置の高さによって異なる。

検出部３４は、分光器３４１および光検出器３４２を有する。第４光ファイバ３５４から出射された干渉光は、分光器３４１において波長成分ごとに分光されて、光検出器３４２へ入射する。光検出器３４２は、分光された干渉光を検出し、その検出信号を、コンピュータ５０へ出力する。コンピュータ５０は、光検出器３４２から得られる検出信号をフーリエ変換することで、観察光の鉛直方向の光強度分布を求める。また、走査機構３２３により、物体光学系３２を水平方向に移動させつつ、上記の光強度分布の算出を繰り返すことにより、三次元空間の各座標における観察光の光強度分布を求めることができる。その結果、コンピュータ５０は、胚９の三次元画像を得ることができる。三次元画像は、三次元座標上に配列された複数の画素により構成され、画素毎に輝度値が規定されたデータである。

コンピュータ５０は、解析装置１内の各部を動作制御する制御部としての機能を有する。また、コンピュータ５０は、二次元撮像部２０から入力される二次元画像および三次元撮像部３０から入力される三次元画像に基づいて、胚９の状態を解析する解析部としての機能も有する。

図３は、解析装置１の制御ブロック図である。図３中に概念的に示したように、コンピュータ５０は、ＣＰＵ等のプロセッサ５１、ＲＡＭ等のメモリ５２、およびハードディスクドライブ等の記憶部５３を有する。記憶部５３内には、解析装置１内の各部を動作制御するための制御プログラムＰ１と、二次元撮像部２０から入力される二次元画像Ｄ２および三次元撮像部３０から入力される三次元画像Ｄ３に基づいて、胚９の状態を解析するための解析プログラムＰ２とが、記憶されている。

また、図３に示すように、コンピュータ５０は、上述した光照射部４０、カメラ２２、焦点移動機構２３、光源３１、走査機構３２３、進退機構３３３、光検出器３４２、および後述する表示部７０と、それぞれ通信可能に接続されている。コンピュータ５０は、制御プログラムＰ１に従って、上記の各部を動作制御する。これにより、試料容器９０に保持された胚９の撮影処理が進行する。また、コンピュータ５０は、二次元撮像部２０から入力される二次元画像および三次元撮像部３０から入力される三次元画像を、解析プログラムＰ２に従って処理することにより、胚９の状態を解析する。

＜２．解析処理について＞
＜２－１．第１実施形態＞
続いて、上記の解析装置１における胚９の撮影・解析処理の第１実施形態について、説明する。

図４は、第１実施形態に係る撮影・解析処理を実現するためのコンピュータ５０の機能を、概念的に示したブロック図である。図４に示すように、コンピュータ５０は、二次元解析部６２および三次元解析部６３を有する。二次元解析部６２および三次元解析部６３の各機能は、コンピュータ５０のプロセッサ５１が、上述した解析プログラムＰ２に従って動作することにより、実現される。

図５は、第１実施形態に係る撮影・解析処理の流れを示したフローチャートである。解析装置１において胚９を撮影・解析するときには、まず、ステージ１０に試料容器９０をセットする（ステップＳ１１）。試料容器９０内には、培養液とともに胚９が保持されている。

次に、解析装置１は、二次元撮像部２０により、胚９の二次元撮影を行う（ステップＳ１２）。これにより、胚９の二次元画像Ｄ２を取得する。具体的には、光照射部４０から試料容器９０へ向けて光を照射しつつ、カメラ２２が、試料容器９０内の胚９を明視野で撮影する。また、焦点移動機構２３により、焦点の位置を変化させながら、上記の撮影を複数回行う。これにより、焦点位置の異なる複数の二次元画像Ｄ２が取得される。取得された二次元画像Ｄ２は、カメラ２２からコンピュータ５０へ入力される。

次に、解析装置１は、三次元撮像部３０により、胚９の三次元撮影を行う（ステップＳ１３）。本実施形態では、光干渉断層撮影により、胚９の三次元画像Ｄ３を取得する。具体的には、光源３１から光を出射し、走査機構３２３により物体光学系３２を微少移動させながら、観察光および参照光の干渉光を、波長成分ごとに、光検出器３４２で検出する。コンピュータ５０は、光検出器３４２から出力される検出信号に基づいて、胚９の各座標位置における光強度分布を算出する。これにより、胚９の三次元画像Ｄ３が得られる。

このように、ステップＳ１２とステップＳ１３とで、同一の胚９について、複数の二次元画像Ｄ２および三次元画像Ｄ３を取得する。

なお、ステップＳ１２の二次元撮影と、ステップＳ１３の三次元撮影の順序は、逆であってもよい。すなわち、三次元撮像部３０による胚９の三次元撮影を行った後に、二次元撮像部２０による胚９の二次元撮影を行ってもよい。また、ステップＳ１２の二次元撮影と、ステップＳ１３の三次元撮影とを、同時に行ってもよい。胚９の状態は時間の経過とともに変化するため、ステップＳ１２およびステップＳ１３は、同時またはほぼ同時（逐次）に実行されることが望ましい。

次に、コンピュータ５０の二次元解析部６２が、二次元撮像部２０により取得した二次元画像Ｄ２に基づいて、胚９の二次元解析を行う（ステップＳ１４）。本実施形態では、二次元解析部６２は、二次元画像Ｄ２に基づいて、胚９に含まれる細胞９２の数をカウントする。三次元撮影に比べて、二次元撮影は、高い解像度で画像を取得することができる。このため、三次元画像Ｄ３に比べて、二次元画像Ｄ２では、細胞９２の輪郭を捉えやすい。したがって、二次元画像Ｄ２では、三次元画像Ｄ３よりも、細胞９２の数を精度よくカウントすることができる。

細胞９２の数をカウントする方法としては、例えば、深層学習を利用する方法が考えられる。具体的には、胚９の二次元画像Ｄ２を入力変数とし、その胚９に含まれる細胞９２の数を出力変数とする学習モデルを、予め機械学習により準備しておく。そして、当該学習モデルに、二次元撮像部２０により撮影された二次元画像Ｄ２を入力することで、学習モデルから、細胞９２の数の推定値を出力することができる。深層学習のアルゴリズムには、例えば、分類ネットワークを使用することができる。

また、細胞９２の中央位置にピークをもつ二次元ガウス分布を正解画像として学習し、得られた学習モデルに、二次元撮像部２０により撮影された二次元画像Ｄ２を入力してもよい。この場合、学習モデルから、各細胞９２に対応する二次元ガウス分布をもつ画像が出力される。このため、当該出力画像のピークの数をカウントすることで、細胞９２の数を推定することができる。

二次元解析部６２は、二次元画像Ｄ２の解析により得られた細胞９２の数を、二次元解析結果Ｒ２として、記憶部５３に記憶する。また、二次元解析部６２は、当該二次元解析結果Ｒ２を、液晶ディスプレイ等の表示部７０に表示する。

次に、コンピュータ５０の三次元解析部６３が、三次元撮像部３０により取得した三次元画像Ｄ３に基づいて、胚９の三次元解析を行う（ステップＳ１５）。本実施形態では、三次元解析部６３は、三次元画像Ｄ３に基づいて、胚９に含まれる複数の細胞９２の体積を算出する。具体的には、三次元解析部６３は、三次元画像Ｄ３を、複数の細胞９２に相当する細胞領域と、細胞９２以外の領域（例えば、フラグメントに相当する領域）とに、分類する。このような領域の分類方法としては、例えば、公知のLocal Thickness法などを利用すればよい。

そして、三次元解析部６３は、三次元画像Ｄ３に含まれる上記の細胞領域において、各細胞９２の境界を特定する。これにより、細胞領域を、細胞９２ごとの領域に分割する。このような細胞９２の境界を特定するための方法としては、例えば、公知のWatershedアルゴリズムなどを利用すればよい。その後、三次元解析部６３は、細胞９２ごと分割された複数の領域のそれぞれの体積を算出する。

このとき、二次元解析結果Ｒ２である細胞９２の数の情報を使用することで、細胞９２の境界を、より精度よく特定することができる。例えば、Watershedアルゴリズムでは、三次元画像Ｄ３において、各細胞９２の位置の指標となるマーカーを指定する。このマーカーの数が、二次元解析結果Ｒ２と一致するように、マーカーの指定を行うとよい。そうすれば、マーカーの数を、胚９に含まれる細胞９２の数と、精度よく一致させることができる。すなわち、体積を算出する領域の数を、胚９に含まれる細胞９２の数と、精度よく一致させることができる。したがって、細胞９２の境界を精度よく特定し、胚９に含まれる複数の細胞９２の体積を、精度よく出力できる。

三次元解析部６３は、三次元画像Ｄ３の解析により得られた細胞９２の体積を、三次元解析結果Ｒ３として、記憶部５３に記憶する。また、三次元解析部６３は、当該三次元解析結果Ｒ３を、液晶ディスプレイ等の表示部７０に表示する。

以上のように、この解析装置１では、二次元解析結果Ｒ２に含まれる指標を利用して、三次元画像Ｄ３を解析する。したがって、三次元解析よりも二次元解析の方が高精度に得られる指標を利用して、三次元画像Ｄ３を解析することができる。これにより、精度の良い三次元解析結果Ｒ３を得ることができる。

特に、本実施形態では、１つの胚９に対して、マルチフォーカス撮影により、複数の二次元画像Ｄ２を取得している。そして、その複数の二次元画像Ｄ２に基づいて、二次元解析を行っている。このため、１枚の二次元画像Ｄ２に基づいて二次元解析を行う場合よりも精度のよい二次元解析結果Ｒ２を得ることができる。

また、本実施形態では、三次元解析よりも二次元解析の方が精度よく取得できる細胞９２の数の情報を、三次元解析に利用している。これにより、三次元解析を精度よく行うことができる。特に、三次元解析において細胞９２の体積を算出する場合には、細胞９２の数の情報が、重要な参考情報となる。したがって、二次元解析により精度よく得られる細胞９２の数の情報を利用することにより、細胞９２の体積を精度よく算出できる。

＜２－２．第２実施形態＞
続いて、上記の解析装置１における胚９の撮影・解析処理の第２実施形態について、説明する。

図６は、第２実施形態に係る撮影・解析処理を実現するためのコンピュータ５０の機能を、概念的に示したブロック図である。図４に示すように、コンピュータ５０は、二次元解析部６２、三次元解析部６３、および統合解析部６４を有する。二次元解析部６２、三次元解析部６３、および統合解析部６４の各機能は、コンピュータ５０のプロセッサ５１が、上述した解析プログラムＰ２に従って動作することにより、実現される。

図７は、第２実施形態に係る撮影・解析処理の流れを示したフローチャートである。第２実施形態においても、解析装置１は、まず、ステージ１０に試料容器９０をセットし（ステップＳ２１）、二次元撮像部２０により胚９の二次元撮影を行い（ステップＳ２２）、三次元撮像部３０により胚９の三次元撮影を行う（ステップＳ２３）。このステップＳ２１～Ｓ２３の処理は、上述した第１実施形態のステップＳ１１～Ｓ１３と同等であるため、重複説明を省略する。

次に、コンピュータ５０の二次元解析部６２は、二次元撮像部２０により取得した二次元画像Ｄ２に基づいて、胚９の二次元解析を行う（ステップＳ２４）。本実施形態では、二次元解析部６２は、二次元画像Ｄ２に基づいて、胚９のＶｅｅｃｋ分類を行う。Ｖｅｅｃｋ分類は、分割期の胚９の状態を、グレード１～グレード５の５段階で表すものである。Ｖｅｅｃｋ分類においては、胚９に含まれる細胞９２の大きさの均一性と、胚９に含まれるフラグメントの量とに基づいて、胚９の状態が評価される。

ステップＳ２４では、二次元解析部６２は、マルチフォーカス撮影により得られた複数の二次元画像Ｄ２に基づいて、細胞９２の大きさの均一性と、フラグメントの量とを、算出する。そして、算出されたこれらの指標値に基づいて、その胚９のＶｅｅｃｋ分類結果を決定し、出力する。なお、ステップＳ２４では、深層学習を用いて、細胞９２の大きさの均一性や、フラグメント量の高低・多少をカテゴライズしてもよい。また、二次元解析部６２は、細胞９２の大きさの均一性や、フラグメントの量などを算出することなく、分類ネットワーク等の深層学習を利用して、複数の二次元画像Ｄ２から、直接Ｖｅｅｃｋ分類結果を決定してもよい。

二次元解析部６２は、二次元画像Ｄ２の解析により得られたＶｅｅｃｋ分類結果を、二次元解析結果Ｒ２として、記憶部５３に記憶する。また、二次元解析部６２は、当該二次元解析結果Ｒ２を、液晶ディスプレイ等の表示部７０に表示する。

次に、コンピュータ５０の三次元解析部６３は、三次元撮像部３０により取得した三次元画像Ｄ３に基づいて、胚９の三次元解析を行う（ステップＳ２５）。本実施形態では、三次元解析部６３は、三次元画像Ｄ３に基づいて、胚９のＶｅｅｃｋ分類を行う。具体的には、三次元解析部６３は、三次元画像Ｄ３に基づいて、細胞９２の大きさの均一性と、フラグメントの量とを、算出する。そして、算出されたこれらの指標値に基づいて、その胚９のＶｅｅｃｋ分類結果を決定し、出力する。ただし、三次元解析部６３は、細胞９２の大きさの均一性や、フラグメントの量などを算出することなく、分類ネットワーク等の深層学習を利用して、三次元画像Ｄ３から、Ｖｅｅｃｋ分類結果を直接決定してもよい。

三次元解析部６３は、三次元画像Ｄ３の解析により得られたＶｅｅｃｋ分類結果を、三次元解析結果Ｒ３として、記憶部５３に記憶する。また、三次元解析部６３は、当該三次元解析結果Ｒ３を、液晶ディスプレイ等の表示部７０に表示する。

このように、本実施形態では、ステップＳ２４とステップＳ２５とで、同一の胚９について、２通りのアプローチで、Ｖｅｅｃｋ分類結果を取得する。

なお、ステップＳ２４の二次元解析と、ステップＳ２５の三次元解析の順序は、逆であってもよい。すなわち、三次元解析による胚９のＶｅｅｃｋ分類を行った後に、二次元解析による胚９のＶｅｅｃｋ分類を行ってもよい。また、ステップＳ２４の二次元解析と、ステップＳ２５の三次元解析とを、同時に行ってもよい。

その後、コンピュータ５０の統合解析部６４が、二次元解析により得られたＶｅｅｃｋ分類結果と、三次元解析により得られたＶｅｅｃｋ分類結果とに基づいて、統合解析結果Ｒ４としてのＶｅｅｃｋ分類結果を出力する（ステップＳ２６）。例えば、統合解析部６４は、二次元解析結果Ｒ２としてのＶｅｅｃｋ分類結果と、三次元解析結果Ｒ３としてのＶｅｅｃｋ分類結果とが、一致している場合にのみ、そのＶｅｅｃｋ分類結果を、統合解析結果Ｒ４として出力する。

また、二次元解析結果Ｒ２としてのＶｅｅｃｋ分類結果と、三次元解析結果Ｒ３としてのＶｅｅｃｋ分類結果とが、一致していない場合には、両方の結果を出力してもよいし、あるいは、二次元解析結果Ｒ２および三次元解析結果Ｒ３のどちらを統合解析結果Ｒ４とするかを、ユーザに選択させてもよい。また、二次元解析結果Ｒ２としてのＶｅｅｃｋ分類結果と、三次元解析結果Ｒ３としてのＶｅｅｃｋ分類結果とが、一致していない場合に、二次元解析結果Ｒ２および三次元解析結果Ｒ３のどちらかを、統合解析部６４が自動的に選択しつつ、結果の信頼性が低い旨の情報を、統合解析結果Ｒ４に付加してもよい。

統合解析部６４は、ステップＳ２６の統合解析により得られたＶｅｅｃｋ分類結果を、統合解析結果Ｒ４として、記憶部５３に記憶する。また、統合解析部６３は、当該統合解析結果Ｒ４を、液晶ディスプレイ等の表示部７０に表示する。

以上のように、本実施形態では、二次元解析と三次元解析の２通りのアプローチにより得られる２つのＶｅｅｃｋ分類結果を利用して、統合解析結果Ｒ４としてのＶｅｅｃｋ分類結果を出力する。これにより、精度の良いＶｅｅｃｋ分類結果を得ることができる。

なお、Ｖｅｅｃｋ分類の指標となる細胞９２の大きさ（体積）については、二次元画像Ｄ２よりも三次元画像Ｄ３の方が、精度よく算出することができる。一方、Ｖｅｅｃｋ分類の他の指標であるフラグメントの量については、三次元画像Ｄ３よりも二次元画像Ｄ２の方が、精度よく算出することができる。このため、二次元画像Ｄ２に基づいて算出されたフラグメント量を二次元解析結果Ｒ２とし、三次元画像Ｄ３に基づいて算出された細胞９２の大きさの均一性を三次元解析結果Ｒ３として、それらに基づいて、統合解析部６４が、統合解析結果Ｒ４としてのＶｅｅｃｋ分類結果を出力してもよい。このようにすれば、二次元解析と三次元解析のそれぞれの長所を生かして、精度の良いＶｅｅｃｋ分類結果を出力することができる。

＜３．変形例＞
以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は、上記の実施形態に限定されるものではない。

上記の第１実施形態では、ステップＳ１４の二次元解析において、胚９に含まれる細胞９２の数を出力していた。しかしながら、二次元解析において、他の指標を出力してもよい。例えば、ステップＳ１４の二次元解析において、胚９に含まれるフラグメントの量、胚９の中における細胞９２の位置、胚９の中における細胞９２の広がり、Ｖｅｅｃｋ分類結果などを、二次元解析結果Ｒ２として出力してもよい。

また、上記の第１実施形態では、ステップＳ１５の三次元解析において、胚９に含まれる細胞９２の体積を出力していた。しかしながら、三次元解析において、二次元解析により得られた細胞９２の数に基づいて、複数の細胞９２の形状を同定し、三次元解析結果Ｒ３として、細胞９２の形状同定結果を出力してもよい。また、三次元解析において、二次元解析結果Ｒ２を利用しつつ、他の指標を出力してもよい。例えば、ステップＳ１５の三次元解析において、胚９に含まれるフラグメントの量や、Ｖｅｅｃｋ分類結果などを出力してもよい。また、上記の第１実施形態において、ステップＳ１５の三次元解析の後に、コンピュータ５０が、三次元解析結果に基づいて、Ｖｅｅｃｋ分類結果を出力してもよい。

また、上記の第２実施形態では、ステップＳ２６において、統合解析結果Ｒ４として、Ｖｅｅｃｋ分類結果を出力していた。しかしながら、統合解析結果Ｒ４として、Ｖｅｅｃｋ分類結果以外の指標を出力してもよい。例えば、統合解析結果Ｒ４として、細胞９２の体積や、フラグメントの量などを出力してもよい。

また、上記の実施形態では、二次元撮像部２０が、明視野において、マルチフォーカス撮影を行うものであった。しかしながら、二次元撮像部２０は、他の撮影方法により、二次元画像Ｄ２を取得するものであってもよい。

また、上記の実施形態では、三次元撮像部３０が、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）を行うものであった。しかしながら、三次元撮像部３０は、他の撮影方法により、三次元画像Ｄ３を取得するものであってもよい。

また、上記の実施形態では、解析装置１は、二次元解析結果Ｒ２、三次元解析結果Ｒ３、および統合解析結果Ｒ４を、それぞれ、表示部７０に出力していた。しかしながら、解析装置１は、二次元解析結果Ｒ２、三次元解析結果Ｒ３、および統合解析結果Ｒ４を、他のコンピュータへ、データ出力するものであってもよい。

また、上記の実施形態では、解析の対象となる試料がヒトの胚９であり、被観察物が胚９に含まれる細胞９２である場合について、説明した。しかしながら、本発明における「試料」は、胚９に限らず、複数の被観察物が三次元的に分布するものであればよい。

また、上記の実施形態や変形例に登場した各要素を、矛盾が生じない範囲で、適宜に組み合わせてもよい。

１ 解析装置
９ 胚
１０ ステージ
２０ 二次元撮像部
２１ 撮像光学系
２２ カメラ
２３ 焦点移動機構
３０ 三次元撮像部
３１ 光源
３２ 物体光学系
３３ 参照光学系
３４ 検出部
３５ 光ファイバカプラ
４０ 光照射部
５０ コンピュータ
６２ 二次元解析部
６３ 三次元解析部
６４ 統合解析部
７０ 表示部
９０ 試料容器
９１ 透明帯
９２ 細胞
Ｄ２ 二次元画像
Ｄ３ 三次元画像
Ｒ２ 二次元解析結果
Ｒ３ 三次元解析結果
Ｒ４ 統合解析結果

Claims (10)

1. 複数の被観察物が三次元的に分布する試料を解析する解析方法であって、
   ａ）前記試料を二次元撮影することにより、二次元画像を取得する工程と、
   ｂ）前記試料を三次元撮影することにより、三次元画像を取得する工程と、
   ｃ）前記二次元画像を解析することにより、二次元解析結果を出力する工程と、
   ｄ）前記三次元画像を解析することにより、三次元解析結果を出力する工程と、
   を有し、
   前記工程ｄ）では、前記二次元解析結果に含まれる指標を利用して、前記三次元画像を解析する、解析方法。
2. 請求項１に記載の解析方法であって、
   前記試料は、胚であり、
   前記被観察物は、前記胚に含まれる細胞であり、
   前記二次元解析結果は、前記胚に含まれる前記細胞の数である、解析方法。
3. 請求項２に記載の解析方法であって、
   前記三次元解析結果は、前記胚に含まれる複数の前記細胞の形状同定結果であり、
   前記工程ｄ）では、前記工程ｃ）により取得した前記細胞の数に基づいて、前記細胞の形状同定結果を算出する領域の数を決定する、解析方法。
4. 請求項２または請求項３に記載の解析方法であって、
   ｅ）前記工程ｄ）の後に、前記三次元解析結果に基づいて、前記胚の状態を表すＶｅｅｃｋ分類結果を出力する工程
   をさらに有する、解析方法。
5. 複数の被観察物が三次元的に分布する試料を解析する解析方法であって、
   ａ）前記試料を二次元撮影することにより、二次元画像を取得する工程と、
   ｂ）前記試料を三次元撮影することにより、三次元画像を取得する工程と、
   ｃ）前記二次元画像を解析することにより、二次元解析結果を出力する工程と、
   ｄ）前記三次元画像を解析することにより、三次元解析結果を出力する工程と、
   ｅ）前記二次元解析結果および前記三次元解析結果に基づいて、統合解析結果を出力する工程と、
   を有する、解析方法。
6. 請求項５に記載の解析方法であって、
   前記試料は、胚であり、
   前記二次元解析結果、前記三次元解析結果、および前記統合解析結果は、前記胚の状態を表すＶｅｅｃｋ分類結果である、解析方法。
7. 請求項１から請求項６までのいずれか１項に記載の解析方法であって、
   前記工程ａ）では、焦点位置を変更しつつ、明視野撮影を行うことにより、複数の前記二次元画像を取得し、
   前記工程ｃ）では、複数の前記二次元画像を解析することにより、前記二次元解析結果を取得する、解析方法。
8. 請求項１から請求項７までのいずれか１項に記載の解析方法であって、
   前記工程ｂ）では、光干渉断層撮影により、前記三次元画像を取得する、解析方法。
9. 複数の被観察物が三次元的に分布する試料を解析する解析装置であって、
   前記試料を二次元撮影することにより、二次元画像を取得する二次元撮像部と、
   前記試料を三次元撮影することにより、三次元画像を取得する三次元撮像部と、
   前記二次元画像および前記三次元画像に基づいて、試料を解析する解析部と、
   を備え、
   解析部は、
   前記二次元画像を解析することにより、二次元解析結果を出力する二次元解析処理と、
   前記三次元画像を解析することにより、三次元解析結果を出力する三次元解析処理と、
   を実行し、
   前記三次元解析処理では、前記二次元解析結果に含まれる指標を利用して、前記三次元画像を解析する、解析装置。
10. 複数の被観察物が三次元的に分布する試料を解析する解析装置であって、
    前記試料を二次元撮影することにより、二次元画像を取得する二次元撮像部と、
    前記試料を三次元撮影することにより、三次元画像を取得する三次元撮像部と、
    前記二次元画像および前記三次元画像に基づいて、試料を解析する解析部と、
    を備え、
    解析部は、
    前記二次元画像を解析することにより、二次元解析結果を出力する二次元解析処理と、
    前記三次元画像を解析することにより、三次元解析結果を出力する三次元解析処理と、
    前記二次元解析結果および前記三次元解析結果に基づいて、統合解析結果を出力する統合解析処理と、
    を実行する、解析装置。

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