JP2023137302A - 画像標準化方法および観察装置 - Google Patents

Abstract

【課題】複数の細胞により構成される生体試料の画像について、観察対象領域の輝度値の差を小さくすることができる技術を提供する。【解決手段】まず、画像中の生体試料の全体または一部分に相当する領域を、観察対象領域として抽出する。次に、複数の観察対象領域のそれぞれについて、輝度値の集約値を算出する。その後、集約値の差が小さくなるように、複数の観察対象領域の輝度値を調整する。これにより、複数の観察対象領域の明暗のばらつきが小さくなる。これにより、複数の生体試料を公平に観察・評価することができる。【選択図】図４

Description

本発明は、複数の細胞により構成される生体試料の画像の輝度値を標準化する技術に関する。

従来、複数の細胞により構成される生体試料を光干渉断層撮影（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）により撮影し、得られた断層画像に基づいて、生体試料を観察する観察装置が知られている。従来の観察装置については、例えば特許文献１に記載されている。この種の観察装置を使用すれば、生体試料の立体構造を非侵襲的に観察することができる。

特開２０１８－１０５６８３号公報

上記の観察装置において、光干渉断層撮影を行うときは、ウェルプレート等の試料容器内に培養液とともに保持された生体試料に向けて、近赤外光を照射する。その際、近赤外光は、生体試料に照射される前に、試料容器や培養液を通過する。このため、生体試料に照射される近赤外光の量は、試料容器の材質、厚さ、形状、表面コーティング、培養液の量などの影響を受ける。このため、これらの要素にばらつきがあると、得られる断層画像の輝度にもばらつきが生じる。

また、複数の細胞により構成されるスフェロイドやオルガノイド等の生体試料は、１つ１つ形状や大きさが異なる。このため、仮に、試料容器や培養液等の環境要因が一定であったとしても、生体試料自体の形状・大きさの違いによって、生体試料の内部に到達する近赤外光の量にばらつきが生じる。その結果、断層画像の輝度値にばらつきが生じる場合がある。

本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、複数の細胞により構成される生体試料の画像について、観察対象領域の輝度値の差を小さくすることができる技術を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため、本願の第１発明は、複数の細胞により構成される生体試料の画像の輝度値を標準化する画像標準化方法であって、ａ）前記画像中の前記生体試料の全体または一部分に相当する領域を、観察対象領域として抽出する工程と、ｂ）複数の前記観察対象領域のそれぞれについて、輝度値の集約値を算出する工程と、ｃ）前記集約値の差が小さくなるように、複数の前記観察対象領域の輝度値を調整する工程と、を有する。

本願の第２発明は、第１発明の画像標準化方法であって、前記集約値は、前記観察対象領域に含まれる複数の輝度値の平均値である。

本願の第３発明は、第１発明の画像標準化方法であって、前記集約値は、前記観察対象領域に含まれる複数の輝度値の中央値である。

本願の第４発明は、第１発明から第３発明までのいずれか１発明の画像標準化方法であって、前記画像中の前記生体試料に相当する領域は、輝度値が異なる複数の領域を含み、前記工程ａ）では、前記複数の領域のうちの１つを、前記観察対象領域として抽出する。

本願の第５発明は、第１発明から第４発明までのいずれか１発明の画像標準化方法であって、前記画像は、光干渉断層撮影により得られた前記生体試料の断層画像または三次元画像である。

本願の第６発明は、複数の細胞により構成される生体試料を観察する観察装置であって、前記生体試料の画像を取得する画像取得部と、前記画像中の前記生体試料の全体または一部分に相当する領域を、観察対象領域として抽出する領域抽出部と、複数の前記観察対象領域のそれぞれについて、輝度値の集約値を算出する集約値算出部と、前記集約値の差が小さくなるように、複数の前記観察対象領域の輝度値を調整する輝度値調整部と、を有する。

本願の第７発明は、第６発明の観察装置であって、前記集約値は、前記観察対象領域に含まれる複数の輝度値の平均値である。

本願の第８発明は、第６発明の観察装置であって、前記集約値は、前記観察対象領域に含まれる複数の輝度値の中央値である。

本願の第９発明は、第６発明から第８発明までのいずれか１発明の観察装置であって、前記画像中の前記生体試料に相当する領域は、輝度値が異なる複数の領域を含み、前記領域抽出部は、前記複数の領域のうちの１つを、前記観察対象領域として抽出する。

本願の第１０発明は、第６発明から第９発明までのいずれか１発明の観察装置であって、前記画像取得部は、光干渉断層撮影により、前記生体試料の断層画像または三次元画像を取得する。

本願の第１１発明は、第６発明から第１０発明までのいずれか１発明の観察装置であって、前記輝度値調整部により輝度値が調整された画像に基づいて、前記生体試料の評価値を出力する評価値出力部をさらに備える。

本願の第１発明～第１１発明によれば、複数の観察対象領域の明暗のばらつきが小さくなる。これにより、複数の生体試料を公平に観察・評価することができる。

特に、本願の第３発明および第８発明によれば、観察対象領域中に、輝度値が極端に異なる外れ値の画素が存在する場合でも、外れ値の影響を抑えて、観察対象領域の全体的な明るさを反映した集約値を算出できる。

特に、本願の第５発明および第１０発明によれば、光干渉断層撮影において特に生じやすい生体試料毎の輝度値のばらつきを抑制できる。

観察装置の構成を示した図である。 観察装置の制御ブロック図である。 コンピュータの機能を、概念的に示したブロック図である。 撮影・評価処理の流れを示したフローチャートである。 複数の断層画像を、模式的に示した図である。 断層画像から観察対象領域を抽出した結果を、模式的に示した図である。 標準化後の複数の断層画像を、模式的に示した図である。 輝度値が異なる複数の領域を含む断層画像の例を、模式的に示した図である。

以下、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明する。

＜１．観察装置の構成＞
図１は、本発明の一実施形態に係る観察装置１の構成を示した図である。この観察装置１は、試料容器９０内に保持された生体試料９を撮影し、得られた画像に基づいて、生体試料９の状態を評価する装置である。生体試料９は、複数の細胞により構成されるスフェロイドやオルガノイド等の細胞集塊である。生体試料９は、例えば、再生医療用の幹細胞から得られる細胞集塊であってもよく、受精卵が卵割を行うことにより形成される胚であってもよい。また、生体試料９は、創薬時のスクリーニングに使用される腫瘍組織などであってもよい。

図１に示すように、観察装置１は、ステージ１０、撮像部２０、およびコンピュータ３０を備えている。

ステージ１０は、試料容器９０を支持する支持台である。試料容器９０には、例えば、ウェルプレートが使用される。ウェルプレートは、複数のウェル（凹部）９１を有する。各ウェル９１は、Ｕ字状またはＶ字状の底部を有する。生体試料９は、各ウェル９１の底部付近に、培養液とともに保持される。試料容器９０の材料には、光を透過する透明な樹脂またはガラスが使用される。

ステージ１０は、上下方向に貫通する開口部１１を有する。試料容器９０は、ステージ１０の当該開口部１１に嵌め込まれた状態で、水平に支持される。したがって、試料容器９０の下面は、ステージ１０に覆われることなく、撮像部２０へ向けて露出する。

撮像部２０は、試料容器９０内の生体試料９を撮影するユニットである。撮像部２０は、ステージ１０に支持された試料容器９０の下方に配置されている。本実施形態の撮像部２０は、生体試料９の断層画像および三次元画像を撮影することが可能な、光干渉断層撮影（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）装置である。

図１に示すように、撮像部２０は、光源２１、物体光学系２２、参照光学系２３、検出部２４、および光ファイバカプラ２５を有する。光ファイバカプラ２５は、第１光ファイバ２５１～第４光ファイバ２５４が、接続部２５５において連結されたものである。光源２１、物体光学系２２、参照光学系２３、および検出部２４は、光ファイバカプラ２５により構成される光路を介して、互いに接続されている。

光源２１は、ＬＥＤ等の発光素子を有する。光源２１は、広帯域の波長成分を含む低コヒーレンス光を出射する。生体試料９を侵襲することなく、生体試料９の内部まで光を到達させるために、光源２１から出射される光は、近赤外線であることが望ましい。光源２１は、第１光ファイバ２５１に接続されている。光源２１から出射される光は、第１光ファイバ２５１へ入射し、接続部２５５において、第２光ファイバ２５２へ入射する光と、第３光ファイバ２５３へ入射する光とに、分岐される。

第２光ファイバ２５２は、物体光学系２２に接続されている。接続部２５５から第２光ファイバ２５２へ進む光は、物体光学系２２へ入射する。物体光学系２２は、コリメータレンズ２２１および対物レンズ２２２を含む複数の光学部品を有する。第２光ファイバ２５２から出射された光は、コリメータレンズ２２１および対物レンズ２２２を通って、試料容器９０内の生体試料９へ照射される。このとき、対物レンズ２２２により、光が生体試料９へ向けて収束する。そして、生体試料９において反射した光（以下「観察光」と称する）は、対物レンズ２２２およびコリメータレンズ２２１を通って、再び第２光ファイバ２５２へ入射する。

図１に示すように、物体光学系２２は、走査機構２２３に接続されている。走査機構２２３は、コンピュータ３０からの指令に従って、物体光学系２２を、鉛直方向および水平方向に微小移動させる。これにより、生体試料９に対する光の入射位置を、鉛直方向および水平方向に微小移動させることができる。

また、撮像部２０は、図示を省略した移動機構により、水平方向に移動可能となっている。これにより、撮像部２０の視野を、複数のウェル９１の間で切り替えることができる。

第３光ファイバ２５３は、参照光学系２３に接続されている。接続部２５５から第３光ファイバ２５３へ進む光は、参照光学系２３へ入射する。参照光学系２３は、コリメータレンズ２３１およびミラー２３２を有する。第３光ファイバ２５３から出射された光は、コリメータレンズ２３１を通って、ミラー２３２へ入射する。そして、ミラー２３２により反射された光（以下「参照光」と称する）は、コリメータレンズ２３１を通って、再び第３光ファイバ２５３へ入射する。

図１に示すように、ミラー２３２は、進退機構２３３に接続されている。進退機構２３３は、コンピュータ３０からの指令に従って、ミラー２３２を、光軸方向に微小移動させる。これにより、参照光の光路長を変化させることができる。

第４光ファイバ２５４は、検出部２４に接続されている。物体光学系２２から第２光ファイバ２５２へ入射した観察光と、参照光学系２３から第３光ファイバ２５３へ入射した参照光とは、接続部２５５において合流して、第４光ファイバ２５４へ入射する。そして、第４光ファイバ２５４から出射された光は、検出部２４へ入射する。このとき、観察光と参照光との間で、位相差に起因する干渉が生じる。この干渉光の分光スペクトルは、観察光の反射位置の高さによって異なる。

検出部２４は、分光器２４１および光検出器２４２を有する。第４光ファイバ２５４から出射された干渉光は、分光器２４１において波長成分ごとに分光されて、光検出器２４２へ入射する。光検出器２４２は、分光された干渉光を検出し、その検出信号を、コンピュータ３０へ出力する。

コンピュータ３０の後述する画像取得部４１は、光検出器２４２から得られる検出信号をフーリエ変換することで、観察光の鉛直方向の光強度分布を求める。また、走査機構２２３により、物体光学系２２を水平方向に移動させつつ、上記の光強度分布の算出を繰り返すことにより、三次元空間の各座標における観察光の光強度分布を求めることができる。その結果、コンピュータ３０は、生体試料９の断層画像および三次元画像を得ることができる。

断層画像は、二次元座標上に配列された複数の画素（ピクセル）により構成され、画素毎に輝度値が規定されたデータである。三次元画像は、三次元座標上に配列された複数の画素（ボクセル）により構成され、画素毎に輝度値が規定されたデータである。

コンピュータ３０は、撮像部２０を動作制御する制御部としての機能を有する。また、コンピュータ３０は、撮像部２０から入力される検出信号に基づいて断層画像および三次元画像を作成し、得られた断層画像および三次元画像に基づいて、生体試料９の状態を評価する評価処理部としての機能を有する。

図２は、観察装置１の制御ブロック図である。図２中に概念的に示したように、コンピュータ３０は、ＣＰＵ等のプロセッサ３１、ＲＡＭ等のメモリ３２、およびハードディスクドライブ等の記憶部３３を有する。記憶部３３内には、観察装置１内の各部を動作制御するための制御プログラムＰ１と、断層画像および三次元画像を作成して、生体試料９の状態を評価するための評価プログラムＰ２とが、記憶されている。

また、図３に示すように、コンピュータ３０は、上述した光源２１、走査機構２２３、進退機構２３３、光検出器２４２、および後述する表示部７０と、それぞれ通信可能に接続されている。コンピュータ３０は、制御プログラムＰ１に従って、上記の各部を動作制御する。これにより、試料容器９０に保持された生体試料９の撮影処理が進行する。

＜２．撮影・評価処理について＞
続いて、上記の観察装置１における生体試料９の撮影・評価処理について、説明する。

図３は、撮影・評価処理を実現するためのコンピュータ３０の機能を、概念的に示したブロック図である。図３に示すように、コンピュータ３０は、画像取得部４１、領域抽出部４２、集約値算出部４３、輝度値調整部４４、および評価値出力部４５を有する。画像取得部４１、領域抽出部４２、集約値算出部４３、輝度値調整部４４、および評価値出力部４５の各機能は、コンピュータ３０のプロセッサ３１が、上述した評価プログラムＰ２に従って動作することにより、実現される。

図４は、撮影・評価処理の流れを示したフローチャートである。観察装置１において生体試料９を撮影・評価するときには、まず、ステージ１０に試料容器９０をセットする（ステップＳ１）。試料容器９０内には、培養液とともに生体試料９が保持されている。

次に、観察装置１は、撮像部２０により、生体試料９の撮影を行う（ステップＳ２）。本実施形態では、撮像部２０が、光干渉断層撮影を行う。具体的には、光源２１から光を出射し、走査機構２２３により物体光学系２２を微少移動させながら、観察光および参照光の干渉光を、波長成分ごとに、光検出器２４２で検出する。コンピュータ３０の画像取得部４１は、光検出器２４２から出力される検出信号に基づいて、生体試料９の各座標位置における光強度分布を算出する。これにより、生体試料９の断層画像Ｄ１および三次元画像Ｄ２が得られる。

観察装置１は、１つの生体試料９について、複数の断層画像Ｄ１と、１つの三次元画像Ｄ２とを取得する。また、観察装置１は、撮影対象となるウェル９１を変更しながら、ステップＳ２の処理を繰り返すことにより、複数の生体試料９の断層画像Ｄ１および三次元画像Ｄ２を取得する。得られた断層画像Ｄ１および三次元画像Ｄ２は、コンピュータ３０の記憶部３３に記憶される。また、コンピュータ３０は、得られた断層画像Ｄ１および三次元画像Ｄ２を、表示部７０に表示する。

図５は、複数の断層画像Ｄ１を模式的に示した図である。試料容器９０の材質、厚さ、形状、表面コーティング、培養液の量などにばらつきがあると、生体試料９に照射される近赤外線の量に差が生じる。その場合、図５のように、光干渉断層撮影により得られる複数の断層画像Ｄ１に、相対的に明るい画像と暗い画像とが、混在する。コンピュータ３０は、このような複数の断層画像Ｄ１に対して、輝度値の標準化を行う。輝度値の標準化は、図４に示すステップＳ３～Ｓ５の処理により、実現される。

まず、コンピュータ３０の領域抽出部４２が、複数の断層画像Ｄ１のそれぞれについて、観察対象領域Ａの抽出を行う（ステップＳ３）。領域抽出部４２は、各断層画像Ｄ１中の生体試料９に相当する領域を、観察対象領域Ａとして抽出する。図６は、複数の断層画像Ｄ１のそれぞれについて、観察対象領域Ａを抽出した結果を、模式的に示した図である。

このステップＳ３では、例えば、断層画像Ｄ１のうち、輝度値が予め設定された閾値よりも大きい領域を、観察対象領域Ａとして抽出する。また、深層学習を利用して、断層画像Ｄ１から観察対象領域Ａを抽出するための学習モデルを予め作成しておき、当該学習モデルを使用して、観察対象領域Ａを抽出してもよい。

次に、コンピュータ３０の集約値算出部４３が、ステップＳ３で抽出された複数の観察対象領域Ａのそれぞれについて、輝度値の集約値Ｖを算出する（ステップＳ４）。集約値Ｖは、１つの観察対象領域Ａの全体的な明るさを表す指標である。本実施形態では、集約値算出部４３は、観察対象領域Ａに含まれる複数の画素の輝度値の平均値を、集約値Ｖとする。集約値算出部４３は、１つの観察対象領域Ａに対して、１つの集約値Ｖを算出する。

次に、コンピュータ３０の輝度値調整部４４が、ステップＳ４で算出された集約値Ｖに基づいて、複数の観察対象領域Ａの輝度値を調整する（ステップＳ５）。輝度値調整部４４は、複数の観察対象領域Ａの間で、集約値Ｖの差が小さくなるように、各断層画像Ｄ１の観察対象領域Ａの輝度値を調整する。例えば、輝度値の集約値Ｖが所定の基準値よりも大きい観察対象領域Ａについては、各画素の輝度値を下げる。また、輝度値の集約値Ｖが所定の基準値よりも小さい観察対象領域Ａについては、各画素の輝度値を上げる。

また、輝度値調整部４４は、観察対象領域Ａの各画素の輝度値を、その観察対象領域Ａの輝度値の集約値Ｖで除算することにより、調整後の各画素の輝度値を算出してもよい。このようにすれば、各観察対象領域Ａの輝度値の集約値Ｖを、同一とすることができる。以上のステップＳ３～Ｓ５の処理により、複数の断層画像Ｄ１の輝度値が標準化される。

標準化後の断層画像Ｄ１は、記憶部３３に記憶される。また、コンピュータ３０は、標準化後の断層画像Ｄ１を、表示部７０に表示する。図７は、標準化後の複数の断層画像Ｄ１を、模式的に示した図である。図７のように、標準化後の複数の断層画像Ｄ１は、観察対象領域Ａの明るさが均一となる。

その後、コンピュータ３０の評価値出力部４５は、ステップＳ５で輝度値が調整された観察対象領域Ａに基づいて、生体試料９の評価値Ｒを出力する（ステップＳ６）。評価値Ｒは、生体試料９の状態を表す指標値である。具体的には、生体試料９の２点間距離、断層面積、体積、真球度、面粗度、内部空洞体積などが、評価値Ｒとして算出される。算出された評価値Ｒは、記憶部３３に記憶される。また、評価値出力部４５は、算出された評価値Ｒを、表示部７０に表示する。上述した輝度値の標準化により、複数の観察対象領域Ａの明暗のばらつきが低減されている。このため、複数の生体試料９について、評価値Ｒを公平に算出することができる。

立体構造を有するスフェロイド等の生体試料９は、生体試料９自体の形状・大きさの違いによって、生体試料９の内部に到達する近赤外光の量にばらつきが生じやすい。また、光干渉断層撮影では、光検出器２４２の検出信号に基づいて、コンピュータ３０が、各座標に相対的な輝度値を割り当てる。このため、立体構造を有する生体試料９を光干渉断層撮影により撮影するときには、特に、生体試料９毎に、輝度値のばらつきが生じやすいという問題がある。しかしながら、本実施形態の観察装置１では、上記のように、複数の観察対象領域Ａの輝度値を標準化することによって、生体試料９毎の輝度値のばらつきを抑制できる。したがって、複数の生体試料９の内部の状態を公平に評価できる。

＜３．変形例＞
以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は、上記の実施形態に限定されるものではない。

＜３－１．第１変形例＞
上記の実施形態では、集約値Ｖとして、観察対象領域Ａに含まれる複数の輝度値の平均値を算出していた。しかしながら、平均値を使用すると、観察対象領域Ａ中に、輝度値が極端に異なる外れ値の画素が存在する場合に、当該外れ値の影響で、集約値Ｖが、観察対象領域Ａの全体的な明るさと整合しない場合がある。そのような場合には、集約値Ｖとして、観察対象領域Ａに含まれる複数の輝度値の中央値を使用してもよい。中央値を使用すれば、観察対象領域Ａ中に、輝度値が極端に異なる外れ値の画素が存在する場合でも、当該外れ値の影響を抑えて、観察対象領域Ａの全体的な明るさを反映した集約値Ｖを算出できる。

＜３－２．第２変形例＞
上記の実施形態では、断層画像Ｄ１中の生体試料９に相当する領域の全体を、観察対象領域Ａとしていた。しかしながら、断層画像Ｄ１中の生体試料９に相当する領域の一部分を、観察対象領域Ａとしてもよい。

例えば、培養の過程でスフェロイドの内部が壊死したような場合には、生体試料９の外表面付近と内部とで、細胞の構造が異なる。また、複数種類の細胞を組み合わせてスフェロイドを作成したときには、種類毎に細胞が局在する場合がある。これらの場合には、図８のように、断層画像Ｄ１中の生体試料９に相当する領域の中に、輝度値が異なる複数の領域Ａ１，Ａ２が含まれることとなる。

このような場合において、コンピュータ３０の領域抽出部４２は、複数の領域Ａ１，Ａ２のうちの１つを、観察対象領域Ａとして抽出してもよい。具体的には、上述したステップＳ３において、領域抽出部４２が、所望の輝度値の範囲に属する領域のみを抽出することにより、複数の領域Ａ１，Ａ２のうち、評価したい領域のみを、観察対象領域Ａとすればよい。また、深層学習を利用して、複数の領域Ａ１，Ａ２のうちの１つを、観察対象領域Ａとして抽出してもよい。

仮に、ステップＳ３において、領域Ａ１，Ａ２の全体を観察対象領域Ａとして抽出すると、ステップＳ４において算出される集約値Ｖは、領域Ａ１，Ａ２の全体の平均的な明るさを反映したものとなる。その場合、ステップＳ５において調整される輝度が、一部分の領域のみの評価に適した輝度とならない場合がある。このため、一部分の領域のみを評価したい場合には、ステップＳ３において、当該領域のみを観察対象領域Ａとして抽出することが望ましい。

＜３－３．第３変形例＞
上記の実施形態では、断層画像Ｄ１を標準化する場合について説明した。しかしながら、標準化の対象は、三次元画像Ｄ２であってもよい。三次元画像Ｄ２を対象とする場合、上述したステップＳ３において、三次元画像Ｄ２を構成する三次元座標のうち、生体試料９の全体または一部分に相当する三次元領域を、観察対象領域Ａとして抽出する。そして、ステップＳ４において、複数の観察対象領域Ａのそれぞれについて、輝度値の集約値Ｖを算出する。その後、集約値Ｖの差が小さくなるように、三次元の観察対象領域Ａの各画素の輝度値を調整すればよい。

＜３－４．他の変形例＞
また、上記の実施形態では、撮像部２０が、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）を行うものであった。しかしながら、撮像部は、他の撮影方法により、生体試料の断層画像または三次元画像を取得するものであってもよい。

また、上記の実施形態では、試料容器９０が、複数のウェル（凹部）９１を有するウェルプレートであった。そして、各ウェル９１に、１つの生体試料９が保持されていた。しかしながら、１つのウェルの中に、複数の生体試料が保持されていてもよい。その場合、１つの画像の中に、複数の生体試料に相当する領域が含まれていてもよい。また、生体試料を保持する試料容器は、１つの凹部のみを有するディッシュであってもよい。

また、上記の実施形態や変形例に登場した各要素を、矛盾が生じない範囲で、適宜に組み合わせてもよい。

１ 観察装置
９ 生体試料
１０ ステージ
２０ 撮像部
２１ 光源
２２ 物体光学系
２３ 参照光学系
２４ 検出部
２５ 光ファイバカプラ
３０ コンピュータ
４１ 画像取得部
４２ 領域抽出部
４３ 集約値算出部
４４ 輝度値調整部
４５ 評価値出力部
７０ 表示部
９０ 試料容器
９１ ウェル
Ａ 観察対象領域
Ｄ１ 断層画像
Ｒ 評価値
Ｖ 集約値

Claims (11)

1. 複数の細胞により構成される生体試料の画像の輝度値を標準化する画像標準化方法であって、
   ａ）前記画像中の前記生体試料の全体または一部分に相当する領域を、観察対象領域として抽出する工程と、
   ｂ）複数の前記観察対象領域のそれぞれについて、輝度値の集約値を算出する工程と、
   ｃ）前記集約値の差が小さくなるように、複数の前記観察対象領域の輝度値を調整する工程と、
   を有する、画像標準化方法。
2. 請求項１に記載の画像標準化方法であって、
   前記集約値は、前記観察対象領域に含まれる複数の輝度値の平均値である、画像標準化方法。
3. 請求項１に記載の画像標準化方法であって、
   前記集約値は、前記観察対象領域に含まれる複数の輝度値の中央値である、画像標準化方法。
4. 請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載の画像標準化方法であって、
   前記画像中の前記生体試料に相当する領域は、輝度値が異なる複数の領域を含み、
   前記工程ａ）では、前記複数の領域のうちの１つを、前記観察対象領域として抽出する、画像標準化方法。
5. 請求項１から請求項４までのいずれか１項に記載の画像標準化方法であって、
   前記画像は、光干渉断層撮影により得られた前記生体試料の断層画像または三次元画像である、画像標準化方法。
6. 複数の細胞により構成される生体試料を観察する観察装置であって、
   前記生体試料の画像を取得する画像取得部と、
   前記画像中の前記生体試料の全体または一部分に相当する領域を、観察対象領域として抽出する領域抽出部と、
   複数の前記観察対象領域のそれぞれについて、輝度値の集約値を算出する集約値算出部と、
   前記集約値の差が小さくなるように、複数の前記観察対象領域の輝度値を調整する輝度値調整部と、
   を有する、観察装置。
7. 請求項６に記載の観察装置であって、
   前記集約値は、前記観察対象領域に含まれる複数の輝度値の平均値である、観察装置。
8. 請求項６に記載の観察装置であって、
   前記集約値は、前記観察対象領域に含まれる複数の輝度値の中央値である、観察装置。
9. 請求項６から請求項８までのいずれか１項に記載の観察装置であって、
   前記画像中の前記生体試料に相当する領域は、輝度値が異なる複数の領域を含み、
   前記領域抽出部は、前記複数の領域のうちの１つを、前記観察対象領域として抽出する、観察装置。
10. 請求項６から請求項９までのいずれか１項に記載の観察装置であって、
    前記画像取得部は、光干渉断層撮影により、前記生体試料の断層画像または三次元画像を取得する、観察装置。
11. 請求項６から請求項１０までのいずれか１項に記載の観察装置であって、
    前記輝度値調整部により輝度値が調整された画像に基づいて、前記生体試料の評価値を出力する評価値出力部
    をさらに備える、観察装置。

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