JP6114820B2 - プテリジノン誘導体およびｅｇｆｒ、ｂｌｋ、ｆｌｔ３の阻害剤としての応用 - Google Patents

プテリジノン誘導体およびｅｇｆｒ、ｂｌｋ、ｆｌｔ３の阻害剤としての応用 Download PDF

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Description

本発明は、プテリジノン系化合物の合成およびその薬物化学と薬物治療学の分野における応用に関し、具体的に、異なる置換基のプテリジノン系化合物のEGFR、BLK、FLT3の阻害剤としての、特に腫瘍関連疾患の薬物の製造における応用に関する。
悪性腫瘍は、細胞性病変で、その特徴は細胞の正常の分裂が制御されず、無限に分化・増殖し、且つ局所の組織に侵入して転移を引き起こすことである。悪性腫瘍は、既に人類の命と健康を脅かすよく見られる病気となって、大まかな統計によると、全世界で毎年2000万に近い新規発病がある。そのため、抗腫瘍薬の研究と開発は、今生命科学で挑戦的で且つ意義がある分野である。
伝統の抗腫瘍薬は、主に細胞毒性系薬物で、このような薬物は避けられない毒性・副作用、低い選択性、薬物耐性が生じやすいなどの欠点がある。生命科学技術の素早い発展に従い、悪性腫瘍細胞内シグナル伝達、細胞周期の調節、血管新生などの各種の基本の生命過程が次第に明らかになっている。腫瘍細胞の増殖に関連するシグナル伝達経路のある鍵酵素を薬物選別の標的とし、治療効果が良く、毒性・副作用が低い抗腫瘍薬を開発するのは、今抗腫瘍薬の研究の重要な方向の一つとなっている。プロテインチロシンキナーゼ（protein tyrosine kinase）は、ATPにおけるγ-リン酸のタンパク質の特定のアミノ酸残基への移動を触媒するタンパク質で、細胞内シグナル伝達経路で重要な役割を担い、且つ細胞の生長、分化、死亡などの一連の生理過程を調節する。既存の資料では、50％超の癌原遺伝子およびその産物はプロテインチロシンキナーゼの活性を持ち、これらの異常発現が細胞の生命周期を乱し、さらに腫瘍の発生につながる。また、チロシンキナーゼの異常発現は腫瘍の転移、化学治療の耐性などにも密接に関係する。
上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase、EGFR）は、いくつかのシグナル伝達経路を仲介し、細胞外シグナルを細胞内に伝達し、正常細胞と腫瘍細胞の増殖、分化およびアポトーシスのいずれにも重要な調節作用を発揮する（Cell, 2000, 100, 113-127）。そのため、選択的にEGFRによるシグナル伝達経路を抑制することで、腫瘍を治療する目的が実現され、腫瘍の標的治療に実行可能な道を開いた。EGFRを標的とする薬物、例えばGefitinib、Erlotinib及びLaptinibは既に市販され、非小細胞肺癌と乳癌の治療に使用される。しかし、臨床経験から、非小細胞肺癌の患者の多くは、Gefitinib又はErlotinibによる治療を繰り返した後、薬物耐性が生じることがわかった。中では、50％のケースの薬物耐性は、EGFRキナーゼのドメインにおける一つのアミノ酸の突然変異（790番目のトレオニン残基のメチオニンへの突然変異、T790M）に関係する（The New England Journal of Medicine, 2005, 352, 786-792）。
T790M突然変異に関係する薬物耐性を克服するために、一連の不可逆的なATP競合阻害剤（例えばCI-1033、BIBW2992、HKI-272、PF00299804など）が既に臨床の研究に入っている。不可逆的阻害剤は、マイケル受容体の断片を含有し、EGFRのATP結合サイトの一つの保存アミノ酸残基（Cys797）と共有結合を形成することで、可逆的阻害剤よりも強いEGFR結合親和力を得る（Journal of Medicinal Chemistry, 2009, 52, 1231-1246）。それにしても、オフターゲット効果による毒性作用、低選択性による副作用、患者の体内で十分な薬物濃度が実現できないなどの理由で、上述不可逆的阻害剤の臨床試験の結果はまだ満足できるものではない（Nature, 2009, 462, 1070-1074）。そのため、新規な不可逆的EGFR阻害剤の開発は重要な臨床の意義と応用の将来性がある。
B細胞チロシンキナーゼ（B lymphocyte tyrosine kinase、BLK）は、非受容体型チロシンキナーゼに属し、c-Src、Fyn、Lck、c-Yes、Fgr、Hck、LynなどとともにSrcファミリーに入れられた。BLKは、主にB細胞系で発現され、形質細胞期以外のB細胞の生長の全過程でBLKの発現がある。BLKは、B細胞受容体（BCR）のシグナル伝達の下流に関連し（Molecular Biology Reports，2011, 38，4445-4453）、且つ前駆B細胞受容体の関連機能に影響を与える（Journal of Experimental Medicine，2003, 198, 1863-1873）ため、BLKがB細胞の分化と増殖に影響する。ネズミのB細胞系、T細胞系で発現された構造的に活性化したBLKは、それぞれB細胞性リンパ腫、T細胞性リンパ腫の発生を引き起こす（Proceedings of the National Academy of Sciences, 1998, 95, 7351-7356）。
より重要なのは、ヒト皮膚T細胞性リンパ腫（Cutaneous T-cell lymphomas，CTCL）にBLKの異所性発現が存在し（Blood, 2009, 113, 5896-5904）、BLKが潜在の抗腫瘍薬の標的にできることが示唆された。また、BLKの遺伝子多型は、全身性紅斑性狼瘡（systemic lupus erythematosus、SLE）、関節リウマチ（rheumatoid arthritis、RA）などの自身免疫性疾患の発病と密接に関係し(The New England Journal of Medicine, 2008, 358, 900-909)、B細胞のアポトーシスを誘導することで上述疾患を有効に治療することができる(Nat Reviews Immunology, 2006, 6, 394-403)。
FMS様チロシンキナーゼ3（FMS-like tyrosine kinase 3、FLT3）は、III型受容体チロシンキナーゼファミリーに属し、FLT3は造血細胞の増殖、分化およびアポトーシスの過程で重要な作用を果たす（Oncogene, 1993, 8, 815-822）。FLT3は、FLT3リガンドと結合した後、STAT5、Ras/MAPK及びPI3K/AKT経路を含むいくつかの下流のシグナル経路を活性化する。約1/3の急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia、AML）の患者では、膜近傍のドメインのエクソン14及び（又は）15の遺伝子内縦列重複配列（FLT3-ITD）の突然変異、チロシンキナーゼドメインの活性化ループにおけるアミノ酸の欠失または挿入（FLT3-TKD）の突然変異を含むFLT3の突然変異が存在する（Blood, 2002, 100, 1532-1542）。
また、急性白血病のケースでは、FLT3の高発現現象が存在し(Blood, 2004, 103, 1901)、FLT3の過剰発現、FLT3-ITD突然変異およびFLT3-TKD突然変異はいずれもAML患者の予後不良につながる。そのため、FLT3は、AML治療の重要な標的となっている。今まで、FLT3阻害剤はまだ臨床の使用に許可されず、多くの臨床試験段階にあるFLT3阻害剤の臨床効果はまだ満足できるものではない。
そのため、小分子キナーゼ阻害剤の臨床有効率の向上はいま抗腫瘍標的薬物の研究開発の焦点となって、最も将来性のある策略は、同時に多くの疾患（腫瘍）の発生に関連するキナーゼを標的とする多標的阻害剤の開発である。
本発明者は、コンピューター支援薬物設計手段でEGFR、BLK、FLT3の特異性小分子阻害剤の模擬選別プラットフォームを構築し、総合的にファーマコフォアと分子連結方法を考慮し、商業化合物データベース（ACD-3D（化学品ライブラリー）、ACD-SC、MDDR-3D（薬物活性データ報告ライブラリー）及びCNPD）に対して選別し、一連の潜在のEGFR、BLK、FLT3抑制活性を持つ候補を見つけた。
得られた候補の化合物に対して構造の最適化を行い、一連の文献で未報告のプテリジノン系化合物を設計して合成し、且つ構造を特徴付けた。この一連の化合物に対して分子レベルと細胞レベルの活性テストを行い、一連の高いEGFR抑制活性を持つ化合物が得られた。ここで、化合物032は、EGFRWT、EGFRL858R、EGFRT790M/L858Rキナーゼに対する抑制活性のIC50値がそれぞれ3.67、2.36、1.17 nMで、HCC827（非小細胞肺癌細胞、EGFRdel E746-A750）、H1975（非小細胞肺癌細胞、EGFRL858R/T790M）細胞の増殖に対する抑制活性のIC50が0.004、0.038 μMである。
本発明に係るプテリジノン系化合物は、EGFR阻害剤として用いられ、EGFRのリン酸化過程を遮断し、腫瘍細胞の生長、増殖および分化を抑制するため、新規な抗腫瘍薬を開発することができる。また、本発明のプテリジノン系化合物は、B細胞キナーゼ（BLK）、FMS様チロシンキナーゼ（FLT3）を抑制する高い活性を有し、腫瘍、免疫性疾患を治療する薬物の開発に使用することができる。
本発明に係るプテリジノン系化合物は、一般式Iで表される構造を有する。
（式中において、
A及びBは、各種の置換基を有するベンゼン環あるいは5員または6員の複素環である。
Cは、以下のような基から選ばれる任意の一つである。
ここで、XはO、S及びSeから選ばれ、R1は水素、ハロゲン原子、C1-C6アルコキシ基（例えばメトキシ基、エトキシ基など）、任意に置換されたC1-C6アルキル基（例えばハロゲンで置換されたアルキル基）、任意に置換されたアリール基（例えばハロゲンで置換されたアリール基）または任意に置換されたアリールアルキル基（例えばアリールメチル基）である。
R2は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、C1-C6アルコキシ基、ヒドロキシ基、任意に置換されたアシルオキシ基、アミノ基、任意に置換されたアシルアミノ基、任意に置換されたC1-C6アルキル基、CN、スルホン酸基、アミノスルホニル基、アミノホルミル基、カルボキシ基、任意に置換されたアルコキシホルミル基、任意に置換されたフェニル基、任意に置換されたN-アルキルピペラジル基、任意に置換されたモルホリル基、任意に置換されたピペリジル基、任意に置換されたピロリル基、任意に置換されたピロリジル基、-NRaRb、任意に置換されたピリジル基から選ばれる。
R3は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、C1-C6アルコキシ基、ヒドロキシ基、任意に置換されたアシルオキシ基、アミノ基、任意に置換されたアシルアミノ基、任意に置換されたC1-C6アルキル基、CN、スルホン酸基、アミノスルホニル基、アミノホルミル基、カルボキシ基、任意に置換されたアルコキシホルミル基、任意に置換されたフェニル基、任意に置換されたN-アルキルピペラジル基、任意に置換されたモルホリル基、任意に置換されたピペリジル基、任意に置換されたピロリル基、任意に置換されたピロリジル基、-NRaRbおよび任意に置換されたピリジル基から選ばれる。
Ra及びRbは、それぞれ独立に、アルキル基およびアルケニル基から選ばれる。
且つ、m及びnは0、1、2、3又は4である。）
一つの実施例において、R3は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシ基、任意に置換されたアシルオキシ基、アミノ基、任意に置換されたアシルアミノ基、任意に置換されたC1-C4アルキル基、CN、スルホン酸基、アミノスルホニル基、カルボキシ基、任意に置換されたアルコキシホルミル基から選ばれる。
一つの実施例において、Cは、下述式の基である。
一つの実施例において、R1は、H及びアルキル基から選ばれる。
一つの実施例において、A及びBは、いずれも任意に置換されたフェニル基である。
一つの実施例において、R2は、独立に、H、アルコキシ基、モルホリル基、ハロゲン、N-アルキルピペラジル基、ピペリジル基、ピロリル基、ピロリジル基、ピリジル基、-NRaRb、アシルアミノ基およびアミノホルミル基（NH2C(O)-）から選ばれ、ここで、Ra及びRbは、アルキル基およびアルケニル基から選ばれてもよい。
一つの実施例において、R2は、独立に、4-N-メチルピペラジル基、N-モルホリル基、N-ピペリジル基、N-ピロリル基、N-ピロリジル基、N,N-ジエチルアミノ基、N,N-ジメチルメチルアミン基および4-ピリジル基から選ばれる。
一つの実施例において、R3は、独立に、水素、アミノ基、アシルオキシ基、アルコキシ基、ハロゲン、ヒドロキシ基、アルキル基、CN、スルホン酸基、アミノスルホニル基、カルボキシ基、モルホリル基、N-アルキルピペラジル基、ピペリジル基、ピロリル基、ピロリジル基、ピリジル基、-NRaRb、アシルアミノ基およびアミノホルミル基から選ばれ、ここで、Ra及びRbは、アルキル基およびアルケニル基から選ばれてもよい。
一つの実施例において、R3は、独立に、アシルアミノ基、アシルオキシ基およびアルコキシ基から選ばれる。
一つの実施例において、R3は、独立に、以下の基から選ばれる。
（ここで、Xはハロゲンである。）
一つの実施例において、R3は、独立に、以下の基から選ばれる。
一つの実施例において、R3は、以下の基から選ばれる。
一つの実施例において、mは、1又は2である。
一つの実施例において、nは、1、2、3又は4である。
一つの実施例において、Cで表される基では、R1を含む部分の波形がCと連結し、且つもう一方の部分がNHと連結している。
本発明の一つの好適な案は、前述化合物が一般式IIで表される構造を有する。
（式中において、
Yは、N、CHから選ばれる。
Zは、N、CR6から選ばれる。
R1は水素、ハロゲン、C1-C6アルコキシ基、任意に置換されたC1-C6アルキル基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたアリールアルキル基である。
R3は、独立に、水素、アミノ基、ヒドロキシ基、任意に置換されたアシルオキシ基、アルコキシ基、ハロゲン、任意に置換されたアルキル基、CN、スルホン酸基、アミノスルホニル基、カルボキシ基、モルホリル基、N-アルキルピペラジル基、ピペリジル基、ピロリル基、ピロリジル基、ピリジル基、-NRaRb、任意に置換されたアシルアミノ基、任意に置換されたアルコキシホルミル基およびアミノホルミル基から選ばれる。
R4、R5、R6及びR7は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、C1-C6アルコキシ基、ヒドロキシ基、任意に置換されたアシルオキシ基、アミノ基、任意に置換されたアシルアミノ基、任意に置換されたC1-C6アルキル基、CN、スルホン酸基、アミノスルホニル基、アミノホルミル基、カルボキシ基、任意に置換されたアルコキシホルミル基、任意に置換されたフェニル基、任意に置換されたN-アルキルピペラジル基、任意に置換されたモルホリル基、任意に置換されたピペリジル基、任意に置換されたピロリル基、任意に置換されたピロリジル基、-NRaRb、任意に置換されたピリジル基から選ばれる。
Ra及びRbは、アルキル基およびアルケニル基から選ばれる。
且つ、mは、0〜3の整数である。）
式IIの一つの好適な実施例において、R3は、任意に置換されたアシルオキシ基、アミノ基、任意に置換されたアシルアミノ基、任意に置換されたC1-C4アルキル基、CN、スルホン酸基、アミノスルホニル基、カルボキシ基および任意に置換されたアルコキシホルミル基から選ばれる。
本発明の一つのより好適な案は、前述化合物が一般式IIIで表される構造を有する。
（式中において、
R1は水素、ハロゲン、C1-C6アルコキシ基、任意に置換されたC1-C6アルキル基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたアリールアルキル基である。
R3は、独立に、水素、アミノ基、ヒドロキシ基、任意に置換されたアシルオキシ基、アルコキシ基、ハロゲン、任意に置換されたアルキル基、CN、スルホン酸基、アミノスルホニル基、カルボキシ基、モルホリル基、N-アルキルピペラジル基、ピペリジル基、ピロリル基、ピロリジル基、ピリジル基、-NRaRb、任意に置換されたアシルアミノ基、任意に置換されたアルコキシホルミル基およびアミノホルミル基から選ばれる。
R5、R6及びR7は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、C1-C6アルコキシ基、ヒドロキシ基、任意に置換されたアシルオキシ基、アミノ基、任意に置換されたアシルアミノ基、任意に置換されたC1-C6アルキル基、CN、スルホン酸基、アミノスルホニル基、アミノホルミル基、カルボキシ基、任意に置換されたアルコキシホルミル基、任意に置換されたフェニル基、任意に置換されたN-アルキルピペラジル基、任意に置換されたモルホリル基、任意に置換されたピペリジル基、任意に置換されたピロリル基、任意に置換されたピロリジル基、-NRaRb、任意に置換されたピリジル基から選ばれる。
Ra及びRbは、アルキル基およびアルケニル基から選ばれる。
且つ、mは0、1、2または3である。）
式IIIの一つの好適な実施例において、R1は、H及びアルキル基から選ばれる。
式IIIの一つの好適な実施例において、R3は、任意に置換されたアシルオキシ基、アミノ基、任意に置換されたアシルアミノ基、任意に置換されたC1-C4アルキル基、CN、スルホン酸基、アミノスルホニル基、カルボキシ基および任意に置換されたアルコキシホルミル基から選ばれる。
式IIIの一つの好適な実施例において、R5及びR6は、独立に、H、アルコキシ基、モルホリル基、ハロゲン、N-アルキルピペラジル基、ピペリジル基、ピロリジル基、-NRaRb、アシルアミノ基およびアミノホルミル基（NH2C(O)-）から選ばれ、ここで、Ra及びRbは、アルキル基およびアルケニル基から選ばれてもよい。
式IIIの一つの好適な実施例において、R5は、H、アルコキシ基、モルホリル基、ハロゲン、N-アルキルピペラジル基、ピペリジル基、ピロリル基、ピロリジル基、ピリジル基、-NRaRb、アシルアミノ基およびアミノホルミル基（NH2C(O)-）から選ばれ、ここで、Ra及びRbは、アルキル基およびアルケニル基から選ばれてもよい。
式IIIの一つの好適な実施例において、R5は、H、アルコキシ基、モルホリル基、ハロゲン、N-アルキルピペラジル基、ピペリジル基、ピロリル基、ピロリジル基、ピリジル基、-NRaRb、アシルアミノ基およびアミノホルミル基（NH2C(O)-）から選ばれ、ここで、Ra及びRbは、アルキル基およびアルケニル基から選ばれてもよく、R6は、Hである。
式IIIの一つの好適な実施例において、R5は、ハロゲン、4-N-メチルピペラジル基、N-モルホリル基、N-ピペリジル基、N-ピロリル基、N-ピロリジル基、N,N-ジエチルアミノ基、N,N-ジメチルメチルアミン基および4-ピリジル基から選ばれる。
式IIIの一つの好適な実施例において、R5及びR6は、Hで、R7は、アシルアミノ基である。
式IIIの一つの好適な実施例において、R3は、独立に、アシルアミノ基、アシルオキシ基およびアルコキシ基から選ばれる。
式IIIの一つの好適な実施例において、R3は、独立に、以下の基から選ばれる。
式IIIの一つの好適な実施例において、R3は、以下の基から選ばれる。
式IIIの一つの好適な実施例において、R3は、以下の基から選ばれる。
式IIIの一つの好適な実施例において、mは、1である。
式IIIの一つの好適な実施例において、mは、1で、Rは、フェニル基の4位にある。
また、本発明は、上皮成長因子受容体キナーゼ（EGFR）による疾患を治療する薬物の製造における本発明化合物の使用を含む。
さらに、本発明は、B細胞キナーゼ（BLK）又はFMS様チロシンキナーゼ3（FLT3）による疾患を治療する薬物の製造における本発明化合物の使用を含む。
一つの実施例において、前述疾患は、癌症である。
一つの実施例において、前述癌症は、びまん性B細胞性リンパ腫、慢性リンパ球性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、濾胞性リンパ腫、前駆B リンパ芽球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、節外周辺帯B 細胞リンパ腫、リンパ組織型辺縁帯B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、胸腺大細胞型 B 細胞性リンパ腫、血管内大細胞型B細胞性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、リンパ芽球性リンパ腫、Tリンパ球性白血病、T細胞顆粒リンパ球性白血病、アグレッシブNK細胞白血病、皮膚T細胞性リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性前骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性未分化性白血病、退行性大細胞型リンパ腫、前リンパ球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、成人Ｔ細胞ALL、AMLに伴う三血統脊髄形成異常、混合血統白血病、骨髄異形成症候群、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫から選ばれる。
一つの実施例において、前述疾患は、免疫性疾患である。
一つの実施例において、前述免疫性疾患は、関節炎、狼瘡、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、骨関節炎、スティル病、若年性関節炎、糖尿病、重症筋無力症、橋本甲状腺炎、オード甲状腺炎、バセドウ病、関節リウマチ症候群、多発性硬化症、伝染性神経炎、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、再生不良性貧血、自己免疫性肝炎、視神経炎、銀血症、移植片対宿主病、移植・輸血による過敏反応、アレルギー反応、I型アレルギー反応、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎から選ばれる。
一つの実施例において、前述癌症は、非小細胞肺癌、乳癌、前立腺癌、神経膠細胞腫、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、食道癌、肝臓癌、腎臓癌、膵臓腺癌、結腸癌、皮膚癌、白血病、リンパ腫、胃癌、多発性骨髄腫および固形腫瘍から選ばれる。
また、本発明は、上皮成長因子受容体キナーゼ（EGFR）を抑制する薬物の製造における本発明化合物の使用を含む。さらに、本発明は、B細胞キナーゼ（BLK）又はFMS様チロシンキナーゼ3（FLT3）を抑制する薬物の製造における本発明化合物の使用を含む。
本発明は、式III化合物の上述使用が特に好ましい。
本発明は、本発明化合物を含む薬物組成物も含み、当該薬物組成物は、さらに、任意に薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などを含んでもよい。
具体的な実施形態
以下、ここで記載された用語をさらに説明する。
ここで、「アルキル基」とは、炭素鎖の長さが炭素原子1〜10個の飽和の分枝鎖または直鎖のアルキル基で、好適なアルキル基は、長さが炭素原子2〜8個、炭素原子1〜6個、炭素原子1〜4個、炭素原子3〜8個、炭素原子1〜3個炭素原子の異なるアルキル基を含む。アルキル基の例は、メチル基、エチル基、n-プロピル基、iso-プロピル基、n-ブチル基、iso-ブチル基、ヘプチル基などを含む。
アルキル基は、1個または複数個（例えば2、3、4又は5個）の置換基で置換され、例えばハロゲン又はハロアルキル基で置換されている。例えば、アルキル基は、1〜4個のフッ素原子で置換されたアルキル基でもよく、或いはフルオロアルキル基で置換されたアルキル基でもよい。
ここで、「アルコキシ基」とは、アルキル基で置換されたオキシ基である。好ましいアルコキシ基は、長さが炭素原子1〜6個のアルコキシ基で、より好ましくは長さが炭素原子1〜4個のアルコキシ基である。アルコキシ基の例は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基などを含むが、これらに限定されない。
ここで、「アルケニル基」とは、通常、少なくとも一つの二重結合を有する1価の炭化水素基で、通常2〜8個の炭素原子、好ましくは2〜8個の炭素原子を含有し、直鎖でも分枝鎖でもよい。アルケニル基の例は、ビニル基、プロペニル基、iso-プロペニル基、ブテニル基、iso-ブテニル基、ヘキセニル基などを含むが、これらに限定されない。
ここで、「アルキニル基」とは、通常、少なくとも一つの三重結合を有する1価の炭化水素基で、通常2〜8個の炭素原子、好ましくは2〜6個の炭素原子、より好ましくは2〜4個の炭素原子を含有し、直鎖でも分枝鎖でもよい。アルキニル基の例は、エチニル基、プロパルギル基、iso-プロパルギル基、ブチニル基、iso-ブチニル基、ヘキシニル基などを含む。
ここで、「ハロゲン原子」又は「ハロゲン」とはフッ素、塩素、臭素およびヨウ素である。
「アリール基」とは、6〜14個の炭素原子を含有する単環、二環または三環の芳香族基で、フェニル基、ナフチル基、フェナントレニル基、アントラセニル基、インデニル基、フルオレニル基、テトラヒドロナフチル基、インダニル基などを含む。アリール基は、任意にハロゲン、C1-4アルデヒド基、C1-6アルキル基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、ヒドロキシメチル基、ハロゲンで置換されたアルキル基（例えばトリフルオロメチル基）、ハロゲンで置換されたアルコキシ基（例えばトリフルオロメトキシ基）、カルボキシ基、C1-4アルコキシ基、エトキシホルミル基、N(CH3)及びC1-4アシル基など、複素環基またはヘテロアリール基などから選ばれる1〜5個（例えば、1、2、3、4又は5個）の置換基で置換されてもよい。
ここで、「ヘテロアルキル基」とは、アリール基で置換されたアルキル基、例えばフェニル基で置換されたC1-C6アルキル基である。ヘテロアルキル基の例は、アリールメチル基、アリールエチル基など、例えばベンジル基、フェネチル基などを含むが、これらに限定されない。
例えば、アリール基は、ハロゲン、-OH、C1-4アルコキシ基、C1-4アルキル基、-NO2、-NH2、-N（CH3）2、カルボキシ基、及びエトキシホルミル基などから選ばれる1〜3個の基で置換されてもよい。
ここで使用される「5員または6員の複素環」は、O、S及びNから選ばれる1〜3個のヘテロ原子を含有する複素環基を含むが、これらに限定されない。フリル基、チエニル基、ピロリル基、ピロリジニル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、トリアゾリル基、オキサゾリル基、ピラニル基、ピリジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、ピペリジニル基、モルホリル基などを含むが、これらに限定されない。
ここで使用される「ヘテロアリール基」とは、5〜14個の環原子を含有し、且つ環系に6個、10個または14個の電子を共有する。そして、含有される環原子は、炭素原子および酸素、窒素、硫黄から任意に選ばれる1〜3個のヘテロ原子である。使用できるヘテロアリール基は、ピペラジニル基、モルホリル基、ピペリジニル基、ピロリジニル基、チエニル基、フリル基、ピラニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピリジニル基を含み、2-ピリジニル基、3-ピリジニル基および4-ピリジニル基、ピラジニル基、ピリミジニル基などを含む。
ヘテロアリール基あるいは5員または6員の複素環は、任意にハロゲン、C1-4アルデヒド基、C1-6の直鎖または分枝鎖のアルキル基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、ヒドロキシメチル基、ハロゲンで置換されたアルキル基（例えばトリフルオロメチル基）、ハロゲンで置換されたアルコキシ基（例えばトリフルオロメトキシ基）、カルボキシ基、C1-4アルコキシ基、エトキシホルミル基、N(CH3)及びC1-4アシル基から選ばれる1〜5個（例えば、1、2、3、4又は5個）の置換基で置換されてもよい。
ここで、「アシルオキシ基」とは、構造式が「-O-C（O）-R」の基である。ここで、Rは、アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基から選ばれてもよい。前述Rは、任意に置換されてもよい。
ここで、「アシルアミノ基」とは、構造式が「-R'-NH-C（O）-R」の基である。ここで、R'は、結合またはアルキル基から、Rは、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、NRaRbで置換されたアルキル基、NRaRbで置換されたアルケニル基およびNRaRbで置換されたアルキニル基、ハロゲンで置換されたアルキル基、シアノ基で置換されたアルケニル基、
から選ばれてもよい。ここで、Ra及びRbは、アルキル基およびアルケニル基から選ばれてもよい。
ここで、「任意に置換された」とは、その修飾された置換基は、任意にハロゲン、C1-4アルデヒド基、C1-6の直鎖または分枝鎖のアルキル基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、ヒドロキシメチル基、ハロゲンで置換されたアルキル基（例えばトリフルオロメチル基）、ハロゲンで置換されたアルコキシ基（例えばトリフルオロメトキシ基）、カルボキシ基、C1-4アルコキシ基、エトキシホルミル基、N(CH3)及びC1-4アシル基から選ばれる1〜5個（例えば、1、2、3、4又は5個）の置換基で置換されてもよいことである。
本発明は、治療有効量の本発明の式I、II又はIIIの化合物またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む薬物組成物を含む。
本発明化合物の薬学的に許容される塩の例は、無機酸および有機酸の塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、マンデル酸塩及びシュウ酸塩、並びに塩基、例えばナトリウム、ヒドロキシ基、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン（TRIS、トロメタモール）及びN-メチルグルコサミンで形成された無機塩基および有機塩基の塩を含むが、これらに限定されない。
個人の必要によるが、本発明の薬物組成物におけるすべての活性成分の最適使用量は、本分野の技術者によって決めることができる。通常の場合は、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩は、哺乳動物に毎日経口投与し、薬物の量は約0.0025〜50mg/kg体重に準じる。最も好ましくは1kgあたりに約0.01〜10mg経口投与する。例えば、1単位の経口投与量は、約0.01〜50mg、最も好ましくは約0.1〜10mgの本発明化合物を含む。1単位の投与量は、1回または数回投与し、毎日は1錠または数錠で、1錠あたりに約0.1〜50mg、好ましくは約0.25〜10mgの本発明化合物またはその溶媒和物を含む。
本発明の薬物組成物は、各種の投与経路に適する製剤様態に調製して腫瘍およびほかの疾患の治療に使用してもよく、腸管外、皮下、静脈、筋肉、腹腔内、経皮、口腔、鞘内、頭蓋内、鼻腔または外用経路によって投与する様態を含むが、これらに限定されない。投与量は、有効に一つ又は複数の病症を改善・解消する薬物の量である。特定の疾患の治療に対し、有効量は、疾患に関連する症状を改善、またはある方式で軽減する薬物の量である。このような薬物の量は、単一の製剤で使用しても、或いは有効な治療方案で投与してもよい。投与量は、疾患を完治できるかもしれないが、投与は通常疾患の症状を改善するためである。通常、必要な症状の改善を実現するために、投与を繰り返す必要がある。薬物の投与量は、患者の年齢、健康および体重、併用する治療の種類、治療の頻度、および必要な治療効果によって決まる。
本発明の薬物製剤は、本発明化合物の治療効果が得られる限り、任意の哺乳動物に投与することができる。これらの哺乳動物の中でも、最も重要なのはヒトである。
本発明の化合物またはその薬物組成物は、上皮成長因子受容体キナーゼ（EGFR）による各種の疾患の治療または予防に有用である。ここで、EGFRによる疾患は各種の癌症である。前述癌症は、非小細胞肺癌、乳癌、前立腺癌、神経膠細胞腫、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、食道癌、肝臓癌、腎臓癌、膵臓腺癌、結腸癌、皮膚癌、白血病、リンパ腫、胃癌、多発性骨髄腫および固形腫瘍を含むが、これらに限定されない。
本発明の化合物またはその薬物組成物は、B細胞キナーゼ（BLK）又はFMS様チロシンキナーゼ3（FLT3）による各種の疾患の治療に有用である。ここで、BLK、FLT3による疾患は各種の癌症、免疫性疾患である。前述癌症は、びまん性B細胞性リンパ腫、慢性リンパ球性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、濾胞性リンパ腫、前駆B リンパ芽球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、節外周辺帯B 細胞リンパ腫、リンパ組織型辺縁帯B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、胸腺大細胞型 B 細胞性リンパ腫、血管内大細胞型B細胞性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、リンパ芽球性リンパ腫、Tリンパ球性白血病、T細胞顆粒リンパ球性白血病、アグレッシブNK細胞白血病、皮膚T細胞性リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性前骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性未分化性白血病、退行性大細胞型リンパ腫、前リンパ球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、成人Ｔ細胞ALL、AMLに伴う三血統脊髄形成異常、混合血統白血病、骨髄異形成症候群、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫を含むが、これらに限定されない。
前述免疫性疾患は、関節炎、狼瘡、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、骨関節炎、スティル病、若年性関節炎、糖尿病、重症筋無力症、橋本甲状腺炎、オード甲状腺炎、バセドウ病、関節リウマチ症候群、多発性硬化症、伝染性神経炎、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、再生不良性貧血、自己免疫性肝炎、視神経炎、銀血症、移植片対宿主病、移植・輸血による過敏反応、アレルギー反応、I型アレルギー反応、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎を含むが、これらに限定されない。
本発明の薬物製剤は、既知の方法で製造することができる。例えば、伝統の混合、造粒、製錠、溶解または冷凍乾燥の過程で製造される。経口投与製造を製造する場合、固形補助材と活性化合物を合わせ、必要によって混合物を研磨してもよい。必要によって適量の補助材を入れた後、顆粒混合物を加工し、タブレット剤または錠剤コアを得る。
適切な補助材は、特にフィラー、例えば乳糖やショ糖のような糖類、マンニトールやソルビトール、セルロース製剤またはリン酸カルシウム塩、例えばリン酸三カルシウムやリン酸水素カルシウム、および粘着剤、例えばコーンスターチ、小麦澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉を含む澱粉糊、ゼラチン、タラカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、又はポリビニルピロリドンである。必要があれば、崩壊剤、例えば上述の澱粉、およびカルボキシメチル澱粉、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、或いはアルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸またはその塩を入れてもよい。
補助材は、特に流動調節剤および潤滑剤、例えば、シリカ、タルク、マグネシウムステアリン酸カルシウム、ステアリン酸のようなステアリン酸塩類またはポリエチレングリコールである。必要があれば、錠剤コアに胃液に抵抗する適切なコーディングを与えてもよい。そのために、濃縮糖類溶液を使用してもよい。この溶液は、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール及び/又は二酸化チタン、漆溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい。胃液に抵抗するコーティングを製造するため、適切なセルロース溶液、例えば酢酸フタル酸セルロースまたはフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースを使用してもよい。タブレット又は錠剤コアのコーティングに染料または色素を入れてもよい。例えば、活性成分の使用量の組合わせを識別または特徴付けるためである。
そのため、本発明は、必要な対象に本発明の化合物または薬物組成物を投与することを含むEGFRによる疾患を治療・予防する方法も提供する。
さらに、本発明は、必要な対象に本発明の化合物または薬物組成物を投与することを含むBLK又はFLT3による疾患を治療・予防する方法を提供する。
投与方法は、本分野で周知の各種の投与方法を含むが、これらに限定されず、患者の実情によって決まる。これらの方法は、腸管外、皮下、静脈、筋肉、腹腔内、経皮、口腔、鞘内、頭蓋内、鼻腔または外用経路による投与を含むが、これらに限定されない。
また、本発明は、EGFR、BLK又はFLT3による疾患を治療する薬物の製造における本発明化合物の使用を含む。
さらに、本発明は、キナーゼを抑制する薬物の製造における本発明化合物の使用、およびキナーゼを抑制する方法を含む。前述方法は、必要な対象に抑制に有効な量または治療/予防に有効な量で本発明の化合物または薬物組成物ことを含む。
本発明において、対象は哺乳動物の対象でもよく、好ましくはヒトである。
本発明において、前述キナーゼは、EGFR、BLK、FLT3、HER2、HER4、FLT1、CDK2、JAK2、LCK、LYNA、cKit、PIM1、FGFR3、FGFR1、PDGFRa、PDGFRb、KDR、SRC、ABL、AUR B、C-MET、BRAF、PKACa、IKKB、IGF1R、GSK3b、P38a及びERK1を含むが、これらに限定されない。
本発明は、前述キナーゼによる各種の疾患を抑制する薬物の製造における本発明化合物の使用、上述各種のキナーゼによる疾患を治療・予防する方法も含む。前述方法は、必要な対象に治療/予防に有効な量で本発明の化合物または薬物組成物ことを含む。前述キナーゼによる各種の疾患は、前述の各種の癌症および免疫性疾患を含むが、これらに限定されない。
阻害剤の合成部分
以下の実施例では、例を挙げて本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を説明するためのものだけで、何らかに本発明を制限することがない。
試薬および条件：（ａ）ArNH2、DIPEA、1,4-ジオキサン、室温、（b）ArNH2、DIPEA, 1,4-ジオキサン、室温、（c）Pd/C、H2、EtOH、（d）R2COCOOEt、HOAc、EtOH、還流、（e）トリフルオロ酢酸、CH2Cl2、0℃からr.t.まで、（f）塩化アシル、Et3N、CH2Cl2、0℃から室温まで、或いは塩化アシル、1-メチル-2-ピロリドン、CH3CN、0℃から室温まで。
上述製造過程において、R1〜R4の定義は上述の通りである。本分野の技術者は、実際の製造の要求に従い、本分野の通常の各種の開始化合物を原料として、本発明の化合物を製造することができる。
実施例1
上述工程a〜fの具体的な合成方法は以下の通りである。
(4-(2-クロロ-5-ニトロピリミジン-4-イルアミノ)フェニル)カルバミン酸-t-ブチルの合成（工程a）
2,4-ジクロロ-5-ニトロピリミジン（95 mg、0.49 mmol）を量って10 mLの丸底フラスコに置き、3 mLのジオキサンを入れ、室温で撹拌し、さらに(4-アミノフェニル)カルバミン酸-t-ブチル（100 mg、0.48 mmol）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（69 mg、0.53 mmol）を取って2 mLの1,4-ジオキサンに溶解させ、且つ上述反応液に滴下し、滴下終了後、室温で0.5時間撹拌を続け、原料が完全に転化するまでTLCによってモニターした。回転蒸発で溶媒を除去し、粗製品をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル/酢酸エチル＝10:1、ｖ/v）によって分離し、(4-(2-クロロ-5-ニトロピリミジン-4-イルアミノ)フェニル)カルバミン酸-t-ブチルのオレンジ色固体144 mgが得られ、収率が82％であった。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.38 (s, 1H), 9.46 (s, 1H), 9.12 (s, 1H), 7.49 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.39 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 1.49 (s, 9H)。
(4-(2-(4-メトキシフェニルアミノ)-5-ニトロピリミジン-4-イルアミノ)フェニル)カルバミン酸-t-ブチルの合成（工程b）
(4-(2-クロロ-5-ニトロピリミジン-4-イルアミノ)フェニル)カルバミン酸-t-ブチル（50 mg、0.14 mmol）、p-メトキシアニリン（17 mg、0.14 mmol）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（18 mg、0.18 mmol）を量って10 mLの丸底フラスコに置き、5 mLの1,4-ジオキサンを入れ、室温で4時間撹拌し、原料が完全に転化するまでTLCによってモニターした。回転蒸発で溶媒を除去し、粗製品をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル/酢酸エチル＝4:1、ｖ/v）によって精製し、(4-(2-(4-メトキシフェニルアミノ)-5-ニトロピリミジン-4-イルアミノ)フェニル)カルバミン酸-t-ブチルの黄色固体51 mgが得られ、収率が82％であった。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.30 (s, 1H), 10.26 (s, 1H), 9.45 (s, 1H), 9.04 (s, 1H), 7.49 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.40 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.75 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 3.73 (s, 3H), 1.50 (s, 9H)。
(4-(5-アミノ-2-(4-メトキシフェニルアミノ)ピリミジン-4-イルアミノ)フェニル)カルバミン酸-t-ブチルの合成（工程c）
(4-(2-(4-メトキシフェニルアミノ)-5-ニトロピリミジン-4-イルアミノ)フェニル)カルバミン酸-t-ブチル（45 mg、0.10 mmol）を量って50 mLの丸底フラスコに置き、20 mLのエタノール、5 mgのパラジウム炭素（10％Pd）を入れ、水素を導入し、室温で一晩撹拌した。反応終了後、吸引ろ過し、ろ液を回転蒸発で乾燥し、粗製品をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（塩化メチレン/メタノール＝5:1、ｖ/v）によって精製し、(4-(5-アミノ-2-(4-メトキシフェニルアミノ)ピリミジン-4-イルアミノ)フェニル)カルバミン酸-t-ブチルの淡ピンク色固体30 mgが得られ、収率が83％であった。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.23 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.62 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.56 (s, 1H), 7.53 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.40 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.77 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.70 (s, 3H), 1.48 (s, 9H)。
(4-(2-(4-メトキシフェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)カルバミン酸-t-ブチルの合成（工程d）
(4-(5-アミノ-2-(4-メトキシフェニルアミノ)ピリミジン-4-イルアミノ)フェニル)カルバミン酸-t-ブチル（30 mg、0.07 mmol）を量って10 mLの丸底フラスコに置き、0.29 mLの氷酢酸、5 mLの無水エタノールを入れ、さらにグリオキシル酸エチル（50％トルエン溶液）（16 mg、0.08 mmol）を入れ、還流まで加熱して一晩撹拌した。反応終了後、固体が析出し、吸引ろ過し、ケーキをエタノール、アンモニア水、脱イオン水で洗浄し、乾燥した。(4-(2-(4-メトキシフェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)カルバミン酸-t-ブチルの黄色固体18 mgが得られ、収率が76％であった。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.08 (s, 1H), 9.64 (s, 1H), 8.84 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.65 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.30-7.28 (m, 4H), 6.61 (br, 2H), 3.67 (s, 3H), 1.52 (s, 9H)。
8-(4-アミノフェニル）-2-(4-メトキシフェニル)-7(8H)-プテリジノン（化合物001）の合成（工程e）
(4-(2-(4-メトキシフェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)カルバミン酸-t-ブチル（18 mg、0.04 mmol）を量って5 mLの丸底フラスコに置き、2 mLの塩化メチレンを入れ、0℃で撹拌し、0.5 mLのトリフルオロ酢酸を入れた。その後、0℃で1時間撹拌を続け、室温で1時間撹拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウムを入れて溶液が若干塩基性になるまで中和し、塩化メチレンで抽出し（3×50 mL）、有機相を脱イオン水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、回転乾燥で溶媒を除去した。8-(4-アミノフェニル）-2-(4-メトキシフェニル)-7(8H)-プテリジノンの黄色固体14 mgが得られ、収率が99％であった。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.04 (br, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.40 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.73 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.67 (br, 2H), 5.44(s, 2H), 3.70 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 159.19, 158.53, 157.17, 154.95, 151.76, 149.66, 146.68, 133.17, 129.22, 122.66, 121.04, 120.70, 114.37, 113.87, 55.55. HRMS(ESI) 計算値C19H17N6O2 [M+H]+ 361.1413, 実験値361.1414。
N-(4-(2-(4-メトキシフェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミド（化合物002）の合成（工程f）
8-(4-アミノフェニル）-2-(4-メトキシフェニル)-7(8H)-プテリジノン（100 mg、0.28 mmol）を量って100 mLの丸底フラスコに置き、50 mLの塩化メチレン、トリエチルアミン（28 mg、0.28 mmol）を入れ、0℃で撹拌し、別途にアクリルクロリド（29 mg、0.31 mmol）を5 mLの塩化メチレンに溶解させ、且つ上述反応液に滴下し、滴下終了後、室温で一晩撹拌した。回転蒸発で溶媒を除去し、粗製品をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（塩化メチレン/酢酸エチル＝5:1、ｖ/v）によって精製し、N-(4-(2-(4-メトキシフェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミドの黄色固体34 mgが得られ、収率が30％であった。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.42 (s, 1H), 10.07 (br, 1H), 8.84 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.87 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.30 (br, 2H), 6.59 (br, 2H), 6.52 (dd, J = 17.0, 10.0 Hz, 1H), 6.33 (dd, J = 17.0, 1.8 Hz, 1H), 5.82 (dd, J = 10.0, 1.8 Hz, 1H), 3.62 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 163.90, 159.28, 158.51, 156.68, 155.02, 151.44, 146.65, 139.72, 133.00, 130.18, 129.50, 127.72, 121.02, 120.61, 113.77, 55.40. HRMS(ESI) 計算値C22H19N6O3 [M+H]+ 415.1519, 実験値415.1515。
以下の化合物はいずれも上述工程a〜fの方法で合成された。
N-(4-(2-(4-モルホリルフェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミド（化合物003）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.44 (s, 1H), 10.00 (s, 1H), 8.82 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.88 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.22 (br, 2H), 6.59 (br, 2H), 6.52 (dd, J = 17.2, 10.2 Hz, 1H), 6.33 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 5.85 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 3.67 (br, 4H), 2.92 (br, 4H). HRMS(ESI) 計算値C25H24N7O3 [M+H]+ 470.1941, 実験値470.1932。
N-(4-(2-(4-メトキシフェニルアミノ)-6-メチル-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミド（化合物004）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.44 (s, 1H), 9.90 (br, 1H), 8.77 (s, 1H), 7.87 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.29 (br, 2H), 6.59 (br, 2H), 6.52 (dd, J = 17.0, 10.0 Hz, 1H), 6.33 (dd, J = 17.0, 1.9 Hz, 1H), 5.82 (dd, J = 10.0, 1.9 Hz, 1H), 3.61 (s, 3H), 2.42 (s, 3H). HRMS(ESI) 計算値C23H21N6O3 [M+H]+ 429.1675, 実験値429.1671。
8-(3-アミノフェニル）-2-(4-メトキシフェニル)-7(8H)-プテリジノン（化合物005）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.06 (br, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.41 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.22 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.67 (br, 2H), 6.53 (s, 1H), 6.48 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.35 (s, 2H), 3.69 (s, 3H). HRMS(ESI) 計算値C19H17N6O2 [M+H]+ 361.1413, 実験値361.1413。
N-(3-(2-(4-メトキシフェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミド（化合物006）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.42 (s, 1H), 10.10 (br, 1H), 8.85 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.84 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.56 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.31 (br, 2H), 7.13 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.58 (br, 2H), 6.45 (dd, J = 16.8, 10.4 Hz, 1H), 6.26 (dd, J = 16.8, 1.6 Hz, 1H), 5.77 (dd, J = 10.4, 1.6 Hz, 1H), 3.65 (s, 3H). HRMS(ESI) 計算値C22H19N6O3 [M+H]+ 415.1519, 実験値415.1516。
N-(3-(2-(4-メトキシフェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)プロピオンアミド（化合物007）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.13 (s, 1H), 10.09 (s, 1H), 8.85 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.74 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.53 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.31 (br, 2H), 7.07 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.59 (br, 2H), 3.67 (s, 3H), 2.33 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.07 (t, J = 7.6 Hz, 3H). HRMS(ESI) 計算値C22H21N6O3 [M+H]+ 417.1675, 実験値417.1678。
N-(4-(2-(4-メトキシフェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)プロピオンアミド（化合物008）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.15 (s, 1H), 10.08 (br, 1H), 8.85 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.80 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.35-7.33 (m, 4H), 6.61 (br, 2H), 3.67 (s, 3H), 2.41 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.14 (t, J = 7.6 Hz, 3H). HRMS(ESI) 計算値C22H21N6O3 [M+H]+ 417.1675, 実験値417.1674。
4-(ジメチルアミノ)-N-(4-(2-(4-メトキシフェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)-2-クロトンアミド（化合物009）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.45 (s, 1H), 10.10 (br, 1H), 8.85 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.87 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.30 (br, 2H), 6.82 (td, J = 15.4, 6.0 Hz, 1H), 6.60 (br, 2H), 6.40 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.27 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 2.33 (s, 6H). HRMS(ESI) 計算値C25H26N7O3 [M+H]+ 472.2097, 実験値472.2095。
4-(ジメチルアミノ)-N-(3-(2-(4-メトキシフェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)-2-クロトンアミド（化合物010）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.33 (s, 1H), 10.08 (br, 1H), 8.86 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.83 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.55 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.32 (br, 2H), 7.11 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.74 (td, J = 15.2, 5.6 Hz, 1H), 6.59 (br, 2H) 6.30 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 3.66 (s, 3H), 3.06 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.17 (s, 6H). HRMS(ESI) 計算値C25H24N7O3 [M+H]+ 472.2097, 実験値472.2094。
アクリル酸 4-(2-(4-メトキシフェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル（化合物011）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.15 (s, 1H), 8.87 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.51 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.31 (br, 2H), 6.69 (br, 2H), 6.60 (dd, J = 17.2, 1.6 Hz, 1H), 6.51 (dd, J = 17.2, 9.9 Hz, 1H), 6.22 (dd, J = 9.9, 1.6 Hz, 1H), 3.67 (s, 3H). HRMS(ESI) 計算値C22H18N5O4 [M+H]+ 416.1359, 実験値416.1359。
4-(ジメチルアミノ)-N-(4-(7-オキソ-2-(フェニルアミノ)-8(7H)-プテリジニル)フェニル)-2-クロトンアミド（化合物012）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.37 (s, 1H), 10.19 (br, 1H), 8.90 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.87 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.03 (br, 1H), 6.88 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.82 (td, J = 15.4, 5.6 Hz, 1H), 6.37 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 3.14 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.24 (s, 6H). HRMS(ESI) 計算値C24H24N7O2 [M+H]+ 442.1991, 実験値442.1989。
4-(ジメチルアミノ)-N-(3-(7-オキソ-2-(フェニルアミノ)-8(7H)-プテリジニル)フェニル)-2-クロトンアミド（化合物013）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.32 (s, 1H), 10.17 (s, 1H), 8.90 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.81-7.79 (m, 2H), 7.55 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.12 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.01 (br, 2H), 6.87 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 6.73 (td, J = 15.2, 5.6 Hz, 1H), 6.28 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 3.05 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.16 (s, 6H). HRMS(ESI) 計算値C24H24N7O2 [M+H]+ 442.1991, 実験値442.1996。
N-(4-(7-オキソ-2-(フェニルアミノ)-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミド（化合物014）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.44 (s, 1H), 10.19 (br, 1H), 8.90 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.88 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.41-7.38 (m, 4H), 7.03 (br, 2H), 6.88 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 6.53 (dd, J = 16.8, 10.4 Hz, 1H), 6.35 (dd, J = 16.8, 1.6 Hz, 1H), 5.84 (dd, J = 10.4, 1.6 Hz, 1H). HRMS(ESI) 計算値C21H17N6O2 [M+H]+ 385.1413, 実験値385.1405。
N-(3-(7-オキソ-2-(フェニルアミノ)-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミド（化合物015）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.42 (s, 1H), 10.19 (s, 1H), 8.91 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.84-7.81 (m, 2H), 7.57 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.41 (br, 2H), 7.15 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.02 (br, 2H), 6.87 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.45 (dd, J = 16.8, 10.4 Hz, 1H), 6.26 (dd, J = 16.8, 1.6 Hz, 1H), 5.77 (dd, J = 10.4, 1.6 Hz, 1H). HRMS(ESI) 計算値C21H17N6O2 [M+H]+ 385.1413, 実験値385.1413。
N-(4-(2-(4-クロロフェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミド（化合物016）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.46 (s, 1H), 10.34 (s, 1H), 8.92 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.88 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.41-7.36 (m, 4H), 7.06 (br, 2H), 6.53 (dd, J = 16.8, 10.4 Hz, 1H), 6.36 (dd, J = 16.8, 1.6 Hz, 1H), 5.84 (dd, J = 10.4, 1.6 Hz, 1H). HRMS(ESI) 計算値C21H16N6O2Cl [M+H]+ 419.1023, 実験値419.1031。
N-(3-(2-(4-クロロフェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミド（化合物017）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.44 (s, 1H), 10.34 (br, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.81 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.59 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.15 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.46 (dd, J = 16.8, 10.4 Hz, 1H), 6.26 (dd, J = 16.8, 1.8 Hz, 1H), 5.77 (dd, J = 10.12, 1.8 Hz, 1H). HRMS(ESI) 計算値C21H16N6O2Cl [M+H]+ 419.1023, 実験値419.1027。
N-(3-(2-(4-モルホリルフェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミド（化合物018）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.43 (s, 1H), 10.06 (s, 1H), 8.84 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.92 (br, 1H), 7.72 (s, 1H), 7.56 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.27 (br, 2H), 7.12 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.58 (br, 2H), 6.45 (dd, J = 16.8, 10.4 Hz, 1H), 6.26 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 5.78 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 3.71 (br, 4H), 2.94 (br, 4H)。HRMS(ESI) 計算値C25H24N7O3 [M+H]+ 470.1941, 実験値470.1939。
N-(4-(2-(4-(4-メチル-1-ピペラジニル)フェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミド（化合物019）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.51 (s, 1H), 10.06 (s, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.89 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.17 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 6.56-6.49 (m, 3H), 6.34 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 5.85 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 2.94 (br, 4H), 2.37 (br, 4H), 2.20 (s, 3H)。HRMS(ESI) 計算値C26H27N8O2 [M+H]+ 483.2257, 実験値483.2259。
N-(3-(2-(4-(4-メチル-1-ピペラジニル)フェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミド（化合物020）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.45 (s, 1H), 10.06 (s, 1H), 8.84 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.93 (br, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.56 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.25 (br, 2H), 7.12 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.57 (br, 2H), 6.46 (dd, J = 16.8, 10.4 Hz, 1H), 6.27 (dd, J = 16.8, 1.8 Hz, 1H), 5.78 (dd, J = 10.4, 1.8 Hz, 1H), 2.98 (br, 4H), 2.42 (br, 4H), 2.22 (s, 3H)。HRMS(ESI) 計算値C26H27N8O2 [M+H]+ 483.2257, 実験値483.2259。
N-(3-(7-オキソ-2-(4-(1-ピペリジニル)フェニルアミノ)-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミド（化合物021）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.44 (s, 1H), 10.03 (s, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.94 (br, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.55 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.24 (br, 2H), 7.11 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.57 (br, 2H), 6.46 (dd, J = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 6.26 (dd, J = 17.0, 1.8 Hz, 1H), 5.77 (dd, J = 10.2, 1.8 Hz, 1H), 2.95 (br, 4H), 1.57 (br, 4H), 1.49 (br, 2H)。HRMS(ESI) 計算値C26H26N7O2 [M+H]+ 468.2148, 実験値468.2146。
N-(3-(7-オキソ-2-(4-(1-ピロリジニル)フェニルアミノ)-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミド（化合物022）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.40 (s, 1H), 9.92 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.90 (br, 1H), 7.74 (br, 1H), 7.54 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.20 (br, 2H), 7.10 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.46 (dd, J = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 6.26 (dd, J = 17.0, 1.8 Hz, 1H), 6.20 (br, 2H), 5.77 (dd, J = 10.2, 1.8 Hz, 1H), 3.10 (br, 4H), 1.91 (br, 4H)。HRMS(ESI) 計算値C25H24N7O2 [M+H]+ 454.1991, 実験値454.1995。
N-(3-(2-(4-(ジエチルアミノ)フェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミド（化合物023）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.42 (s, 1H), 9.92 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.92 (br, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.53 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.19 (br, 2H), 7.09 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.46 (dd, J = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 6.32 (br, 2H), 6.27 (dd, J = 17.0, 1.8 Hz, 1H), 5.76 (dd, J = 10.2, 1.8 Hz, 1H), 3.20 (br, 4H), 1.00 (t, J = 6.8 Hz, 6H)。HRMS(ESI) 計算値C25H26N7O2 [M+H]+ 456.2148, 実験値456.2143。
N-(3-(2-(4-(アセチルアミノ)フェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミド（化合物024）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.43 (s, 1H), 10.16 (br, 1H), 9.78 (s, 1H), 8.87 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.82 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.56 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.32 (br, 2H), 7.23 (br, 2H), 7.15 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.46 (dd, J = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 6.25 (dd, J = 17.0, 1.8 Hz, 1H), 5.76 (dd, J = 10.2, 1.8 Hz, 1H), 1.98 (s, 3H)。HRMS(ESI) 計算値C23H20N7O3 [M+H]+ 442.1628, 実験値442.1624。
4-(8-(3-アクリルアミドフェニル)-7-オキソ-7,8-ジヒドロプテリジン-2-イルアミノ)ベンズアミド（化合物025）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.43 (s, 1H), 10.40 (s, 1H), 8.95 (s, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.79 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.71 (br, 1H), 7.61 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.47 (br, 2H), 7.18 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 6.44 (dd, J = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 6.25 (dd, J = 17.0, 1.8 Hz, 1H), 5.76 (dd, J = 10.2, 1.8 Hz, 1H)。HRMS(ESI) 計算値C22H18N7O3 [M+H]+ 428.1471, 実験値428.1476。
N-(3-(2-(4-メトキシフェニルアミノ)-6-メチル-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミド（化合物026）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.42 (s, 1H), 9.93 (br, 1H), 8.78 (s, 1H), 7.83 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.56 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.31 (br, 2H), 7.11 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.58 (br, 2H), 6.45 (dd, J = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 6.26 (d, J = 17.0 Hz, 1H), 5.77 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 3.65 (s, 3H), 2.42 (s, 3H)。HRMS(ESI) 計算値C23H21N6O3 [M+H]+ 429.1675, 実験値429.1675。
N-(3-(8-(4-メトキシフェニル)-7-オキソ-7,8-ジヒドロプテリジン-2-イルアミノ)フェニル)アクリルアミド（化合物027）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.17 (s, 1H), 10.01 (s, 1H), 8.89 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.63 (br, 1H), 7.33 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.27 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.11 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.89 (br, 1H), 6.46 (dd, J = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 6.25 (dd, J = 17.0, 1.8 Hz, 1H), 5.74 (dd, J = 10.2, 1.8 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H)。HRMS(ESI) 計算値C22H19N6O3 [M+H]+ 415.1519, 実験値415.1519。
2-(3-アミノフェニルアミノ）-8-(4-メトキシフェニル)-7(8H)-プテリジノン（化合物028）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.91 (s, 1H), 8.85 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.35 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.16 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.68-6.65 (m, 3H), 6.16 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.63 (s, 2H), 3.86 (s, 3H)。HRMS(ESI) 計算値C19H17N6O2 [M+H]+ 361.1413, 実験値361.1411。
N-(4-(8-(4-メトキシフェニル)-7-オキソ-7,8-ジヒドロプテリジン-2-イルアミノ)フェニル)アクリルアミド（化合物029）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.19 (br, 1H), 10.03 (s, 1H), 8.87 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.36-7.34 (m, 6H), 7.16 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.41 (dd, J = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 6.23 (dd, J = 17.0, 1.6 Hz, 1H), 5.72 (dd, J = 10.2, 1.6 Hz, 1H), 3.92 (s, 1H)。HRMS(ESI) 計算値C22H19N6O3 [M+H]+ 415.1519, 実験値415.1524。
2-(4-アミノフェニルアミノ）-8-(4-メトキシフェニル)-7(8H)-プテリジノン（化合物030）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.87 (s, 1H), 8.77 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.32 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.13 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.08 (br, 2H), 6.24 (br, 2H), 4.84 (s, 2H), 3.88 (s, 3H)。HRMS(ESI) 計算値C19H17N6O2 [M+H]+ 361.1413, 実験値361.1417。
N-(4-(2-(2-メトキシ)-4-(4-メトキシ-1-ピペラジニル)フェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミド（化合物031）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.43 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.85 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.54-6.48 (m, 2H), 6.33 (dd, J = 17.0, 1.6 Hz, 1H), 6.02 (br, 1H), 5.84 (dd, J = 10.2, 1.6 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.02 (br, 4H), 2.43 (br, 4H), 2.23 (s, 3H)。HRMS(ESI) 計算値C27H29N8O3 [M+H]+ 513.2363, 実験値513.2362。
N-(3-(2-(2-メトキシ-4-(4-メチル-1-ピペラジニル)フェニルアミノ)-7-オキソ-8(7H)-プテリジニル)フェニル)アクリルアミド（化合物032）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.41 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.44 (br, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.86 (br, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.52 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.53 (s, 1H), 6.46 (dd, J = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 6.26 (dd, J = 17.0, 1.8 Hz, 1H), 6.02 (br, 1H), 5.78 (dd, J = 10.2, 1.8 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.04 (br, 4H), 2.44 (br, 4H), 2.23 (s, 3H)。HRMS(ESI) 計算値C27H29N8O3 [M+H]+ 513.2363, 実験値513.2361。
実施例2
生物活性テスト部分1
本発明によって提供される化合物のEGFRキナーゼ活性に対する体外抑制効果の実験は、以下のように行われた。
体外酵素活性分析：野生型および各種の変異型（T790M, L858R, L861Q, L858R/T790M）EGFR、Z’-Lyte Kinase Assay KitはいずれもInvitrogenから購入された。すべての被験化合物は、5.1 × 10-11 mol/L〜1.0 × 10-6 mol/Lの10段の濃度勾配とした。
異なるキナーゼの濃度は、最適化実験によって決まり、相応の濃度がEGFR (PV3872、Invitrogen) 0.287 μg/μL、EGFR-T790M (PV4803、Invitrogen) 0.174 μg/μL、EGFR-L858R (PV4128、Invitrogen) 0.054 μg/μL、EGFR-L858R/T790M (PV4879、Invitrogen) 0.055 μg/μLであった。化合物は、DMSOで5.1x10-9 Mから1x10-4 Mに3倍希釈した。4 μLの化合物を96 μLの水に溶解させ、4xの化合物溶液を得た。40 μMのATPを1.33xキナーゼ緩衝液に溶解させ、キナーゼ/ペプチド混合物は2xキナーゼ、4 μMのチロシン4ペプチドを含み、用意して使用に備えた。
10 μLのキナーゼ反応は、2.5 μLの化合物溶液、5 μLキナーゼ/ペプチド混合物、2.5μL のATP溶液を含んだ。キナーゼ/ペプチド混合物の代わりに、5 μLのリン酸化ペプチド溶液を100％リン酸化対照として使用した。ATP溶液の代わりに2.5 μLの1.33xキナーゼ緩衝液を100％抑制対照として使用し、化合物溶液の代わりに2.5 μLの4％DMSOを0％抑制対照として使用した。プレート内で溶液を十分に混合した後、室温で1.5時間培養した。各ウェルに5 μLずつDevelopment Solutionを入れた後、続いて室温で1時間培養し、未リン酸化ペプチドはこの期間内で分解された。最後に、5 μLのStop Reagentを入れて反応を終わらせた。プレートをEnVision Multilabel Reader（Perkin Elmer）で測定した。実験データはGraphPad Prism version 4.0で計算した。各実験はいずれも3回以上繰り返した。
テストの結果は表1に示す。
生物活性テスト部分2
細胞の増殖と生長に対する抑制の分析：H1975（非小細胞肺癌細胞、EGFRL858R/T790M）、HCC827（非小細胞肺癌細胞、EGFRdel E746-A750）、A549（非小細胞肺癌細胞、EGFR野生型）、BT474（乳癌細胞、Her2過剰発現）、SK-BR-3（乳癌細胞、Her2過剰発現）、MCF-7（乳癌細胞、Her2過剰発現）細胞はいずれもATCCから入手した。細胞の増殖活性はMTS分析法で評価した。細胞を処理条件に72時間晒し、各細胞系の各実験で使用される細胞数は吸光度値（490 nmにおける吸光度値が1.3〜2.2）によって調整した。被験化合物は、6段の濃度勾配（0.1 nM - 10 μM）とし、各濃度値は少なくとも6組の並行対照を使用した。
H1975、HCC827、A549、BT474、MCF-7、SK-BR-3細胞は、相応の培地で培養し、回復した後少なくとも2代継代し、実験に使用した。対数期の細胞は、トリプターゼで作用し、且つ培地に再懸濁させた。H1975（各ウェル1000細胞）、BT474（各ウェル1500細胞）、MCF-7（各ウェル1500細胞）、HCC827（各ウェル2000細胞）、SK-BR-3（各ウェル2000細胞）、A549（各ウェル2000細胞）は96ウェルプレートに接種し、体積が100 μLで、6組並行で7列とした。プレートを37℃、5％二酸化炭素のインキュベーターで一晩置いた。化合物をDMSOに溶解させ、濃度が1Lあたりに10 μMになるように調製した後、化合物の濃度を段階にそれぞれ1Lあたりに10 μM、1 μM、0.1 μM、0.01 μM、0.001 μM、0.0001 μMとした。
2 μLの化合物溶液を998 μLの培地に入れ、混合物を十分に混合した。100 μLの混合物を96ウェルプレートに入れた。化合物溶液の代わりに2 μLのDMSOを0％抑制対照として使用した。68時間培養した後、20 μL MTT（5 mg/mL）を入れた。4時間後、上清を捨て150 μLのDMSOを入れた。10分間振とうした後、プレートのデータをSynergy HT（Bio TeK）（OD490）で読み取った。データはGraphPad Prism version 4.0で計算し、IC50値は使用量反応曲線を使用した非線形回帰モデルによって調整して得た。
テストの結果は表2、表3に示す。
生物活性テスト部分3
キナーゼの選択性の分析：キナーゼ選択性実験は、Caliper assay screening platformを使用し、上海睿智化学研究有限公司によって行われ、すべてのキナーゼおよびほかの材料はいずれも市販品として購入された。化合物の異なるキナーゼに対する抑制活性のテストは、対照化合物としてstaurosporineおよびPI103を使用した。
I．移動度変化分析
1．キナーゼテストに使用されるキナーゼ基質緩衝液と終止緩衝液の調製：1）1xキナーゼ基質緩衝液：50 mM HEPES pH 7.5、0.0015％ Brij-35、10 mM MgCl2、2 mM DTT。2) 終止緩衝液: 100 mM HEPES、pH 7.5、0.015％ Brij-35、0.2％ Coating Reagent #3、50 mM EDTA。
2．化合物溶液の調製：1）化合物を100％ DMSOでテストで使用される最高濃度の50倍の濃度に希釈し、100 μLの上述化合物溶液を96ウェルプレートの一つのウェルに入れた。2）30 μLの化合物溶液を隣接のウェルの60 μLの100％ DMSOに移し、上述操作を繰り返し、順に化合物を希釈した。3）100 μLの100％ DMSOを2つの空いたウェルに入れて無化合物と無酵素の対照とし、プレートを保存液プレートとした。4）保存液プレートから10 μLの溶液をもう一つの96ウェルプレートに入れ、臨時プレートとして、各ウェルに90 μLの1xキナーゼ緩衝液を入れ、臨時プレートをシェーカーに置いて化合物溶液を均一に混合した。
3．分析プレートの準備：臨時96ウェルプレートの各ウェルから5 μLの溶液を384ウェルプレートに入れ、独立実験を繰り返した。
4．キナーゼ反応：1）2.5ｘ酵素溶液を調製し、1xキナーゼ基質緩衝液にキナーゼを入れた。2）2.5ｘペプチド溶液の調製：1xキナーゼ基質緩衝液にFAMで標識されたペプチド、ATPを入れた。3）2.5ｘ酵素溶液を分析プレートに移した。4）分析プレートに5 μLの化合物の10％DMSO溶液が含まれた。5）10 μLの2.5ｘ酵素溶液を分析用384ウェルプレートの各ウェルに入れた。6）室温で10分間インキュベートした。7）2.5ｘペプチド溶液を分析プレートに移し、10 μLのペプチド溶液を分384ウェルプレートの各ウェルに入れた。8）キナーゼ反応と終止：28℃で所定の時間でインキュベートした後、25 μLの終止緩衝液を入れて反応を終わらせた。
5．Caliper読み取り：Caliperで実験データを収集した。
6．曲線フィッティング：Caliperのプログラムからデータをコピーして変換した。2）百分抑制率＝（最大値-変換値）/（最大値-最小値）×100で変換値を抑制率とし、「最大値」はDMSO対照で、最小値は低対照である。
II．Kinase-Glo分析
1．PI3Kaキナーゼテストに使用される1xキナーゼ緩衝液の調製：1xキナーゼ緩衝液：50 mM HEPES、pH 7.5、3 mM MgCl2、1 mM EGTA, 100 mM NaCl、0.03％ CHAPS、2 mM DTT。
2．PI3Kaキナーゼテストに使用される化合物の準備：1）化合物を連続に希釈し、保存液プレートを準備した。化合物を100％ DMSOで反応で使用される最高濃度の100倍の濃度に希釈し、100 μLの上述化合物溶液を96ウェルプレートのウェルに移した。30 μLの化合物溶液を隣接のウェルの60 μLの100％ DMSOに移し、上述操作を繰り返し、順に化合物を希釈した。100 μLの100％ DMSOを2つの空いたウェルに入れて無化合物と無酵素の対照とし、プレートを保存液プレートとした。2）臨時プレートの準備：保存液プレートから4 μLの化合物溶液をもう一つの96ウェルプレートに移し、各ウェルに96 μLの1xキナーゼ緩衝液を入れ、臨時プレートをシェーカーに置いて10分間振とうし、化合物溶液を均一に混合した。3）分析プレートの準備：臨時96ウェルプレートの各ウェルから2.5 μLの溶液を384ウェルプレートに入れ、独立実験を繰り返した。
3．キナーゼPI3Ka反応：1）4xキナーゼ溶液の準備：PI3Kaの1ｘキナーゼ緩衝液溶液を調製し、濃度が試験における最終濃度の4倍であった。2.5 μLの1ｘキナーゼ溶液を分析プレートの各ウェルに入れ（対照ウェル以外は代わりに2.5 μLのキナーゼ緩衝液を）、分析プレートを振とうした。2）2ｘ基質溶液を準備した。PIP2基質、ATPの1ｘキナーゼ反応緩衝液溶液を準備し、濃度が試験における最終濃度の2倍で、5 μLの基質溶液を分析プレートの各ウェルに入れ、振とうして均一に混合した。3）キナーゼ反応を行い、室温で1時間インキュベートした。
4．キナーゼの検出：Kinase-Glo試薬を室温とし、10 μLのKinase-Glo試薬を分析プレートに入れて反応を終わらせた。簡単に混合した後、遠心し、シェーカーの上でゆっくり15分間振とうした後、冷光リーダーでデータを読み取った。
5．データを読み取り、Flexstationでデータを採取した。
6．曲線フィッティング：FlexstationのプログラムからRLUデータをコピーし、RLUデータを百分抑制率に変換した。百分抑制率＝（サンプルRLU-最小値）/（最大値-最小値）×100で、「最大値」は無酵素対照群のRLU値で、「最小値」はDMSO対照群のRLU値である。
III．BRAF 分析
1．1xキナーゼ緩衝液の準備：50 mM HEPES、pH 7.5、10 mM MgCl2、1 mM EGTA、0.01％ BRIJ-35。
2．キナーゼBRAFのテストに使用される化合物の準備：1）化合物を連続に希釈し、保存液プレートを準備した。化合物を100％ DMSOで反応で使用される最高濃度の100倍の濃度に希釈し、100 μLの上述化合物溶液を96ウェルプレートのウェルに移した。30 μLの化合物溶液を隣接のウェルの60 μLの100％ DMSOに移し、上述操作を繰り返し、順に化合物を希釈した。100 μLの100％ DMSOを2つの空いたウェルに入れて無化合物と無酵素の対照とし、プレートを保存液プレートとした。2）臨時プレートの準備：保存液プレートから4 μLの化合物溶液をもう一つの96ウェルプレートに移し、各ウェルに96 μLの1xキナーゼ緩衝液を入れ、臨時プレートをシェーカーに置いて10分間振とうし、化合物溶液を均一に混合した。3）分析プレートの準備：臨時96ウェルプレートの各ウェルから2.5 μLの溶液を384ウェルプレートに入れ、独立実験を繰り返した。
3．キナーゼBRAF反応：1）2xキナーゼ溶液の準備：BRAFの1ｘキナーゼ緩衝液の溶液を調製し、濃度が試験における最終濃度の2倍であった。5 μLのキナーゼ溶液を分析プレートの各ウェルに入れ（対照ウェル以外は代わりに5 μLの1ｘキナーゼ緩衝液を）、分析プレートを振とうした。2）4ｘ基質溶液を準備した。Fluorescein-MAP2K1、ATPの基質を1ｘキナーゼ緩衝液に溶解した溶液を準備し、濃度が試験における最終濃度の4倍で、2.5 μL基質溶液を分析プレートに入れて反応を開始し、分析プレートを振とうした。3）キナーゼ反応を行い、室温で1時間インキュベートした。
4．キナーゼの検出：最終濃度の2倍の検出溶液を抗体希釈緩衝液に溶解した溶液を準備し、最終濃度が抗体2 nM、EDTA 10 μMであった。10 μLの検出溶液を分析プレートの各ウェルに終止緩衝液として入れて、簡単に混合して遠心し、30分間以上インキュベートした。
5．データの読み取り：Envisionでデータを読み取り、340 nMで激励し、520 nM、495 nMで放出させた。
6．曲線フィッティング：EnvisionのプログラムからRFU値をコピーし、RFU 520 nM/495 nMの比率を計算し、比率値を百分抑制率に変換した。百分抑制率＝（最大値-サンプル比率）/（最大値-最小値）×100で、「最大値」はDMSO対照の比率で、「最小値」は無酵素対照の比率である。曲線をXLFit excel add-in version 4.3.1でフィッテイングした。
テスト結果を以下の表に示す。
生物活性テスト部分4
本発明によって提供される化合物のBLK、FLT3キナーゼ活性に対する体外抑制効果の実験は、以下のように行われ、ここで、BLK、FLT3はBPSから購入され、スタウロスポリン（staurosporine）を対照化合物とした。
1ｘキナーゼ基質緩衝液と終止緩衝液を調製した。1xキナーゼ基質緩衝液：50 mM HEPES、pH 7.5、0.0015％Brij-35、10mM 塩化マグネシウム、2 mM DTT。終止緩衝液：100 mM HEPES、pH 7.5、0.0015％Brij-35、0.2％ Coating Reagent #3、50 mM EDTA。化合物溶液を調製した。化合物を100％ DMSOに溶解させ、50倍の最終の最高抑制濃度の溶液を調製し、100 μLの上述溶液を96ウェルプレートに移した。
順に上述化合物溶液を最終の必要な濃度に希釈した。同一の96ウェルプレートの2つの空いたウェルに、100 μLの100％ DMSOを無化合物と無キナーゼ対照として入れ、このプレートを開始プレートとした。中間プレートを準備し、開始プレートから10 μLの化合物溶液を中間プレートとしてもう一つの96ウェルプレートに移し、中間プレートの各ウェルに90 μLの1ｘキナーゼ緩衝液を入れ、中間プレートを10分間振とうした。分析プレートを準備し、中間プレートの各ウェルから5 μLの溶液を384ウェルプレートに取り、且つ重複対照をした。キナーゼ反応を行った。2.5ｘキナーゼ溶液、2.5ｘペプチド溶液を調製し、2.5ｘキナーゼ溶液を分析プレートに移し、分析プレートに5 μL化合物の10％ DMSO溶液を入れ、分析用384ウェルプレートの各ウェルに10 μLの2.5ｘキナーゼ溶液を入れ、室温で10分間インキュベートし、2.5ｘペプチド溶液を各ウェルに移し、28℃で相応の時間でインキュベートした後、25 μLの終止緩衝液を入れて反応を終わらせた。Caliperに実験データを採取した。曲線フィッティングは、Caliperのプログラムから実験データをコピーし、実験データを抑制率に変換し、抑制百分率＝（Max-Conversion）/（Max-Min）×100で、「Max」はDMSO対照で、「Min」は低対照である。
テストの結果は下述表5に示す。

Claims (8)

  1. 一般式IIIで表される構造を有することを特徴とする化合物。
    （式中において、
    R1は水素、ハロゲン、C1-C6アルコキシ基、任意に置換されたC1-C6アルキル基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたアリールアルキル基である。
    R3は、独立に、-O-C（O）-R、ここで、Rは、炭素原子1〜4個のアルキル基もしくは炭素原子2〜6個のアルケニル基である、または、-R'-NH-C（O）-R、ここで、R'は、結合であり、Rは、炭素原子1〜4個のアルキル基、炭素原子2〜6個のアルケニル基もしくはNRaRbで置換された炭素原子2〜6個のアルケニル基であり、ここで、Ra及びRbは、炭素原子1〜4個のアルキル基である、から選ばれる。
    R5は、それぞれ独立に、ハロゲン、C1-C6アルコキシ基、-R'-NH-C（O）-R、ここで、R'は、結合であり、Rは、炭素原子1〜4個のアルキル基である、アミノホルミル基、N-C1-C4アルキルピペラジル基、モルホリル基、ピペリジル基、ピロリジル基、-NRaRb、ここで、Ra及びRbは、それぞれ独立に、炭素原子1〜4個のアルキル基から選ばれる、から選ばれる。
    R6は、それぞれ独立に、水素又はC1-C6アルコキシ基から選ばれる。
    R7は、水素である。
    且つ、mは1又は2である。）
  2. R1は、H又はC1-C6アルキル基から選ばれ、
    R3は、-R'-NH-C（O）-R、ここで、R'は、結合であり、Rは、炭素原子2〜6個のアルケニル基から選ばれ、
    R5は、C1-C6アルコキシ基、モルホリル基、ハロゲン、N-C1-C4アルキルピペラジル基、ピペリジル基、ピロリジル基、-NRaRb、ここで、Ra及びRbは、それぞれ独立に、炭素原子1〜4個のアルキル基から選ばれる、から選ばれ、
    R6は、H又はC1-C4アルコキシ基から選ばれ、
    R7は、Hであり、且つ
    mは1である、
    ことを特徴とする請求項1に記載の化合物。
  3. R5は、塩素、メトキシ、4-N-メチルピペラジル基、N-モルホリル基、N-ピペリジル基、N,N-ジエチルアミノ基から選ばれ、
    R3は、以下の基から選ばれる任意の一つで、
    R6は、H又はメトキシであり、
    R7は、Hである、
    ことを特徴とする請求項1に記載の化合物。
  4. 以下の化合物から選ばれる化合物。
  5. 請求項1〜4のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含むことを特徴とする薬物組成物。
  6. EGFR、BLK、FLT3、HER2、HER4、FLT1、JAK2、LCK、LYNA、cKit、PIM1、KDR、SRC、ABL、AUR B、C-MET、BRAF、PKACa、IKKB、IGF1R、GSK3b、P38a及びERK1による疾患を治療・予防する薬物、またはEGFR、BLK、FLT3、HER2、HER4、FLT1、JAK2、LCK、LYNA、cKit、PIM1、KDR、SRC、ABL、AUR B、C-MET、BRAF、PKACa、IKKB、IGF1R、GSK3b、P38a及びERK1を抑制する薬物の製造における請求項1〜5のいずれかに記載の化合物の使用。
  7. 前述疾患は、癌症または免疫性疾患であることを特徴とする請求項6に記載の使用。
  8. 前述癌症は、非小細胞肺癌、乳癌、前立腺癌、神経膠細胞腫、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、食道癌、肝臓癌、腎臓癌、膵臓腺癌、結腸癌、皮膚癌、白血病、リンパ腫、胃癌、固形腫瘍、びまん性B細胞性リンパ腫、慢性リンパ球性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、濾胞性リンパ腫、前駆B リンパ芽球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、節外周辺帯B 細胞リンパ腫、リンパ組織型辺縁帯B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、胸腺大細胞型 B 細胞性リンパ腫、血管内大細胞型B細胞性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、リンパ芽球性リンパ腫、Tリンパ球性白血病、T細胞顆粒リンパ球性白血病、アグレッシブNK細胞白血病、皮膚T細胞性リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性前骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性未分化性白血病、退行性大細胞型リンパ腫、前リンパ球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、成人Ｔ細胞ALL、AMLに伴う三血統脊髄形成異常、混合血統白血病、骨髄異形成症候群、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫から選ばれ、
    前述免疫性疾患は、関節炎、狼瘡、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、骨関節炎、スティル病、若年性関節炎、糖尿病、重症筋無力症、橋本甲状腺炎、オード甲状腺炎、バセドウ病、関節リウマチ症候群、多発性硬化症、伝染性神経炎、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、再生不良性貧血、自己免疫性肝炎、視神経炎、銀血症、移植片対宿主病、移植・輸血による過敏反応、アレルギー反応、I型アレルギー反応、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎から選ばれる、
    ことを特徴とする請求項7に記載の使用。
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