CN116036063B

CN116036063B - 蛋白乳酸化抑制剂小分子的医药用途

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Publication number: CN116036063B
Application number: CN202310310882.0A
Authority: CN
Inventors: 张跃; 赵波; 吕凌; 古鉴; 刘景滔; 丁建军
Original assignee: Nanjing Normal University; Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing Normal University; Nanjing Medical University
Priority date: 2023-03-28
Filing date: 2023-03-28
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2043-03-28
Also published as: CN116036063A

Abstract

本发明公开了蛋白乳酸化抑制剂小分子的医药用途，本发明提供了式（I）化合物及其药学上可接受的盐应用在制备RIG‑I^lys852位点抑制剂或者敲除试剂中的应用。本发明通过实验发现RIG‑I蛋白LYS852氨基酸会发生乳酸化现象，并发现该现象会导致信号通路中RIG‑I‑MAVS结合减弱，从而促进肿瘤生长，本发明以RIG‑I蛋白LYS852为作用位点，设计了蛋白乳酸化抑制剂小分子，可以用于抑制RIG‑I蛋白乳酸化及相关疾病如结肠癌肝转移治疗。 I

Description

蛋白乳酸化抑制剂小分子的医药用途

技术领域

本发明属于生物医药，特别涉及蛋白乳酸化抑制剂小分子的医药用途。

背景技术

肿瘤细胞的代谢特征表现为由氧化磷酸化向有氧糖酵解转变，主要体现在葡萄糖摄取量增加及高通量的葡萄糖分子通过糖酵解代谢成乳酸。这种代谢转变与氧浓度无关，被称为“Warburg effect”。乳酸是癌症代谢重编程中的重要的代谢产物。肿瘤细胞来源的乳酸在促进肿瘤血管生成、抑制免疫细胞功能及促进肿瘤侵袭转移中有重要的作用。

现有技术中研究发现乳酸可以作为前体物质参与组蛋白赖氨酸的乳酸化修饰。在人类 HeLa 细胞和小鼠 BMDM 中分别鉴定出核心组蛋白上的26个和16个赖氨酸乳酸化（Kla）位点，其中包括 H3、H4、H2A和H2B。同时研究发现在M1巨噬细胞极化的晚期，组蛋白乳酸化修饰的增加可以直接促进基因转录并诱导稳态基因，包括M2巨噬细胞的标记物Arg1的上调。研究人员还在从小鼠黑色素瘤和肺肿瘤中分离的巨噬细胞中检测到组蛋白乳酸化，并观察到组蛋白Kla与修复型M2巨噬细胞产生的致癌物质之间的正相关，表明巨噬细胞中高水平的乳酸以及组蛋白乳酸化修饰可能有助于肿瘤的形成和进展。然而乳酸化修饰影响巨噬细胞极化方向以及促进肿瘤生长的的作用机理还并不明确。因此阐明巨噬细胞中乳酸化发生发展的分子机制是治疗乳酸化介导的相关疾病领域亟待解决的核心问题。

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是最常见的消化系统肿瘤之一，结直肠癌肝转移（colorectal cancer liver metastases，CRLM）是 CRC 最常见的转移方式，也是其致死的主要因素。研究已表明，很多CRC患者在确诊同时伴有肝转移，另有一些患者在原发灶切除术后出现肝转移； CRLM患者的生存率明显低于无转移的早期 CRC 患者。在治疗方面，转移灶切除是治疗 CRLM 患者的唯一治愈手段，但是很多患者亦可出现术后复发；现有的标准化疗方案使得部分患者受益，然而仍有部分患者会出现化疗耐药；因此，开发新型靶向药物仍是目前CRLM治疗领域亟待解决的关键问题。

发明内容

发明目的：针对目前组蛋白乳酸化现象导致巨噬细胞M2型极化机理还不明确的现象以及结直肠癌肝转移治疗药物缺乏的问题，本发明首次提出了式（I）所述的化合物及其药学上可接受的盐在作为蛋白乳酸化抑制剂小分子在制备RIG-I^lys852位点抑制剂或者敲除试剂中的应用，从而提出在制备治疗RIG-I^lys852位点乳酸化介导的疾病药物中的应用。本发明采用分子模拟与体外细胞试验，发现巨噬细胞表达的RIG-I蛋白的LYS852位点乳酸化会抑制免疫应答通路RIG-I-MAVS的活化减弱从而导致巨噬细胞M2型极化，促进肿瘤的生长。

本发明还提出了一种预防或治疗RIG-I^lys852位点乳酸化介导的疾病的药物组合物。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述式（I）所述的化合物及其药学上可接受的盐在制备RIG-I^lys852位点抑制剂或者敲除试剂中的应用，

。

本发明所述式（I）所述的化合物及其药学上可接受的盐在制备RIG-I^lys852位点乳酸化的抑制剂中的应用。

本发明所述的化合物及其药学上在制备治疗RIG-I^lys852位点乳酸化介导的疾病药物中的应用。

其中，所述疾病为肿瘤。

其中，所述肿瘤为结肠癌或者结肠癌肝转移。

本发明所述的化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗结肠癌肝转移药物中的应用。

进一步地，所述式（I）所述的化合物及其药学上可接受的盐联合5-FU在制备治疗结肠癌肝转移药物中的应用。本发明的化合物和5-FU这种化疗药联用相对于单用5-FU可以更加显著抑制结肠癌肝转移的进展，提示式I化合物可对结肠癌肝转移具有一定的治疗作用。

本发明所述一种预防或治疗RIG-I^lys852位点乳酸化介导的疾病的药物组合物，其含有所述的式I化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分和药学上可接受的载体。

其中，所述药物组合物是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。

本发明针对目前乳酸化治疗药物开发上的空白，本发明以RIG-I^lys852为靶点，设计筛选了一种高活性的RIG-I^lys852乳酸化抑制剂小分子（式I），通过体内外活性评价，发现该化合物可以用于抑制RIG-I蛋白乳酸化及相关疾病（如结肠癌肝转移）治疗。

本发明通过实验发现巨噬细胞RIG-I蛋白LYS852氨基酸会发生乳酸化现象，并发现该现象会导致信号通路中RIG-I-MAVS结合减弱，从而导致巨噬细胞M2型极化，促进肿瘤的生长。本发明从该靶点出发利用虚拟筛选技术结合体内外生物活性评价进行药物筛选，设计并发现一个可以抑制RIG-I^lys852乳酸化的小分子抑制剂，可进一步用于开发新型抗癌药物。

具体地，本发明基于上述全新的靶点，本发明通过药物设计的方法，以RIG-I蛋白LYS852为作用位点，得到一个RIG-I蛋白乳酸化抑制剂小分子。通过体外活性评价证实其的确具有抑制RIG-I蛋白乳酸化以及抑制巨噬细胞M2型极化的功能，并通过小鼠体内试验发现该化合物是治疗结肠癌肝转移的潜在小分子药物。

本发明运用分子模拟技术发现在抗感染免疫应答相关的通路RIG-I-MAVS中，蛋白RIG-I^lys852位点起着重要作用，因此推断乳酸通过与该位点结合，进而阻断RIG-I蛋白和MAVS蛋白的结合，抑制了RIG-I-MAVS信号通路的激活和抗感染免疫应答，进而促使巨噬细胞向M2极化。进一步通过体外细胞实验证明RIG-I^lys852位点确实是决定巨噬细胞向M2型极化的关键乳酸化修饰位点。为了探究临床转化应用的可能性，利用计算机辅助药物设计的手段，以RIG-I^lys852 作为靶点，小分子数据库为配体，进行基于分子对接的虚拟筛选方法，设计筛选得到一个RIG-I^lys852乳酸化抑制剂的先导化合物并通过生物活性实验验证该小分子具有阻断RIG-I^lys852乳酸化的效果，并发现其在抗结肠癌肝转移药物开发领域具有很好的应用价值和前景。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明采用分子模拟与体外生物实验相结合的方法，发现了组蛋白乳酸化影响巨噬细胞极化并促进肿瘤生长的可能作用机理。本发明通过筛选和药物设计获得具有抑制RIG-I^lys852位点乳酸化活性的全新结构的小分子化合物。

本发明首次提供了式I化合物作为RIG-I^lys852位点抑制剂或者敲除试剂，尤其是在抑制RIG-I^lys852位点乳酸化现象，可以用于开发治疗RIG-I^lys852位点乳酸化介导的疾病的药物，从而发挥治疗如结肠癌肝转移等疾病的用途。本发明通过体外活性评价证实式I化合物其的确具有抑制RIG-I蛋白乳酸化以及抑制巨噬细胞M2型极化的功能，并通过体内试验发现该化合物是治疗结肠癌肝转移的潜在小分子药物，并具有非常好的效果，同时可以和5-FU这种化疗药联用相对于单用5-FU可以更加显著抑制结肠癌肝转移。

附图说明

图1为RIG-I和MAVS蛋白对接图；

图2为乳酸或乳酸/RIG-Ilys852抗体联合处理小鼠Kupffer细胞后，巨噬细胞标志物免疫荧光染色图；

图3为RIG-I蛋白的三级结构图；

图4为筛选流程图；

图5为化合物1与RIG-I蛋白相互作用的3D图；

图6为化合物1对RIG-I蛋白乳酸化抑制情况的western blot实验图；

图7为化合物1处理Kupffer细胞后，巨噬细胞标志物免疫荧光染色图；

图8为化合物1处理Kupffer细胞后，巨噬细胞标志物ARG1、MRC1、CD86和NOS2的mRNA水平直方图；

图9为使用化合物1处理小鼠，小鼠肝转移灶表面肿瘤数量的代表性图像；

图10为5-FU或5-FU /化合物1联合处理小鼠，小鼠肝转移灶表面肿瘤数量的代表性图像。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。

6-8周龄雌性野生型c57bl/6小鼠：来自南京医科大学实验动物基地6-8周龄雌性C57BL/6小鼠。

RIG-I^lys852抗体（RIG-I^{lys 852}Ab），为公知抗体，针对RIG-I蛋白的第838-866个氨基酸设计并通过常规抗体制备方法制备得到RIG-I^{lys 852}Ab，购买于景杰生物。

实施例1

通过体外细胞实验以及计算机模拟技术发现RIG-I^lys852乳酸化现象会导致巨噬细胞M2型极化，促进肿瘤的生长。

具体的，其包括步骤：

RIG-I-MAVS蛋白对接模拟：RIG-I-MAVS通路是已经明确的一条与抗感染免疫应答相关的通路，本发明通过分子模拟技术将RIG-I蛋白与MAVS蛋白进行对接，使用RosettaDock获得RIG-I-MAVS化合物的初始结构。先运行低分辨率的Monte Carlo（MC）搜索，再进行高分辨率的细化搜索。RIG-I相对于MAVS的起始方向由ZDOCK（https://zdock.umassmed.edu/）生成。从15000步的低分辨率的刚体MC搜索，在进行500循环的细化，最后基于Score选择最佳的结合模式，再使用pymol2.2进行模型生成。RIG-I和MAVS的lys852位点结合模型基于野生型的样本。

实验结果发现RIG-I和现RIG-I蛋白和MAVS蛋白在氨基酸残基LYS852位点存在3.7Å的共价连接（图1），因此推测该位点在RIG-I-MAVS通路的抗感染免疫应答中起着重要作用。在此基础上，推断乳酸通过与该位点结合，进而阻断RIG-I蛋白和MAVS蛋白的结合，抑制了RIG-I-MAVS信号通路的激活和抗感染免疫应答，进而促使巨噬细胞向M2极化。

体外细胞实验：提取6-8周龄雌性野生型c57bl/6小鼠的骨髓巨噬细胞（BMDM）等量分3组进行体外培养：①对照组；②培养环境中加入5mM浓度乳酸；③ 5mM浓度乳酸及1mM浓度的RIG-I^lys852抗体。在37℃，5%的CO₂中培养三天后进行免疫荧光染色，观察M1型巨噬细胞的标志物iNOS和M2型巨噬细胞的标志物CD206的表达差异。

免疫荧光检测CD206、iNOS的表达方法：使用免疫荧光试剂盒（迈新生物，KIT-7710）进行操作，肝脏肿瘤标本石蜡切片脱蜡、抗原修复、血清封闭后，与一抗4°C孵育过夜，再加对应的HRP标记的二抗室温孵育50min。PBS洗涤3次后滴加TSA，避光室温孵育10min，TBST洗涤3次。滴加DAPI复染，封片，于荧光显微镜下观察并采集图像。

实验结果：只加入乳酸的②组，其M2型巨噬细胞的特异性标志物CD206表达增多，M1型巨噬细胞的标志物iNOS表达减少（图2），表明乳酸会促进巨噬细胞向M2类型的极化，而M2型巨噬细胞具有抗炎、促肿瘤的作用。而加入RIG-I^lys852抗体的③组，M1型巨噬细胞的标志物iNOS表达增多、而M2型巨噬细胞的标志物CD206的表达减少（图2），说明抑制RIG-I^lys852会导致巨噬细胞向M2类型的极化变少，因此推断LYS852氨基酸是RIG-I蛋白的乳酸化位点。因此可以通过抑制RIG-I^lys852位点乳酸化，抑制巨噬细胞M2型的极化，从而抑制肿瘤的发展。

实施例2

设计并筛选以RIG-I蛋白的第852号赖氨酸为靶点的小分子抑制剂。

通过计算机虚拟筛选技术建立虚拟筛选模型对Specs数据库进行筛选，综合根据构象、Docking score、类药性五原则参数和药代动力学对筛选结果进行过滤，然后对挑选的化合物进行抑制RIG-I^lys852位点乳酸化活性评价，最终得到抑制RIG-I^lys852乳酸化的小分子苗头化合物。

具体的，快速筛选RIG-I^lys852乳酸化小分子抑制剂的方法，其包括步骤：

(1) RIG-I蛋白三维结构的获取、分析及处理；

在蛋白数据库(http://www.rcsb.org )中搜寻并获得RIG-I蛋白的三维结构(PDB code:6KYV)，图3为RIG-I蛋白的三级结构图。使用薛定谔软件包中 Maestro 2015的Protein preparation wizard模块进行准备，首先对蛋白进行加氢，并删除蛋白中的水分子和RNA，用Prime程序填充缺失的侧链和loop区，用PROPKA程序在pH=7.0的条件下，利用残基的质子化状态对体系中的氢键进行优化处理，应用OPLS-2005分子力场对侧链进行赋予电荷，然后对体系采取能量最小化操作；

(2)以RIG-I蛋白的氨基酸Lys852为活性中心位点，确定活性空腔；

使用薛定谔软件包中 Maestro 2015的Receptor Grid Generation模块，以RIG-I蛋白的氨基酸Lys852作为格点盒子的中心生成格点文件，盒子大小为 20Å*20Å*20Å；

(3)虚拟筛选数据库的初步过滤、分析及处理；

首先过滤掉Specs数据库中的PAINS（频繁干扰分子）和不符合Lipinski andVeber规则的小分子以提高虚拟筛选的阳性率，然后使用Maestro工具中LigPrep模块对配体化合物进行准备工作，以生成相应的低能量三维结构。采用Epik方法预测抑制剂结构的质子化状态和互变异构体，手性中心保持与输入结构一致，采用OPLS-2005力场产生不同的质子化状态、不同的立体异构体、互变异构体和环状构象,为每个输入结构产生多个输出结构；

(4)运用步骤(2)的计算机虚拟活性空腔对步骤(3)中的小分子配体库进行筛选；

使用薛定谔软件包中Maestro 2015里Glide的HTVS (high through-put virtualscreening)模式进行初筛，并选取打分前10％的化合物用SP (standard precision)模式进行复筛，然后根据打分选取前10％的化合物用XP(extra precision)模式进行精筛；

(5)综合根据构象、Docking score、Glide energy、氢键个数、类药性五原则参数和药代动力学分析虚拟筛选结果，具体的筛选流程见图4，选取其中综合打分最高的小分子作为先导化合物并进行结构设计得到式I化合物。

实验结果：本发明设计得到一个具有抑制RIG-I蛋白乳酸化的先导化合物，所述化合物具有如下特征：

化合物1，英文名称：Indeno[1,2-a]indene, 9,10-dihydro-2,7-diacetic acid

化合物结构：

从图5中可以看到化合物1与蛋白氨基酸残基共形成3个氢键作用，1个盐桥相互作用还有1个π-π堆积相互作用。其中，化合物1中的一个末端羧酸的碳氧双键中的氧原子与氨基酸残基ARG664上的氨基氢形成距离为1.62 Å的强氢键相互作用。化合物1另一个末端羧酸跟碳氧双键中的氧原子与氨基酸残基ASN668的一个氨基氢形成距离2.73 Å的氢键相互作用，与氨基酸残基LYS858的一个氨基氢形成2.09 Å的氢键相互作用，另一个氧原子与LYS858的氨基氮形成4.90Å的盐桥相互作用。除此之外，化合物1与氨基酸残基LYS852形成4.14 Å的π-π堆积作用。因此推断该分子可能具有阻断RIG-I^lys852乳酸化的作用。

表1显示了可能的活性化合物1的Docking score、Lipinski五规则参数和药代动力学参数预测，由表1可以看出化合物1与RIG-I蛋白具有较高的对接打分。除此之外，根据这些分子的药代动力学重要物理量参数和Lipinski五规则参数来评判ADME性能的好坏，其中当分子量（Mt）小于500，氢键供体（D）数小于5，氢键受体（A）数小于10，五规则为0和分配系数（QPlogPo/w）小于5时说明这些分子在理论上具有成药性的可能。药代动力学特征中的人体口服吸收值的百分比大于80是高水平，小于25是低水平。血脑屏障（QPlogBB）应在-3至1.2之间，水溶性（QPlogS）在-6.5到0.5之间。从表1中可以看到化合物1的Lipinski五规则参数以及药代动力学预测结果，都在合理范围内，证明该分子具有较好ADME性能以及成药可能。

表1 Docking score、Lipinski五规则参数和药代动力学预测

实施例3

化合物1的合成路线：

在-78℃下向1-茚满酮-5-羧酸（1-1）(1g，5.68mmol)的DMF(1L)搅拌溶液中逐滴添加二异丙胺基锂(LDA) (4.5mL)，升温至-20℃持续搅拌2小时，然后再次冷却至-78℃。逐滴添加2-溴- 3-苯甲酸(溴乙基)（1-2）(2.5g，8.52mmol，溶解于4mL DMF中)且在-78℃下搅拌反应混合物1小时。随后将反应混合物升温至室温且搅拌2小时。TLC监测反应完成后，将反应混合物倾入冰NaHCO₃溶液中，随后用乙醚(4mL×3)萃取，将合并的有机层Na₂SO₄干燥且在减压下浓缩通过硅胶(100至200目)柱层析（二氯甲烷：甲醇=10：1）纯化获得半纯样品。将其经由反相层析法用ACN及0.1%甲酸/水洗脱再纯化以获得2-溴-3-苯甲酸-2,3-二氢-1-茚满酮-5-羧酸（1-3）。

MS(ESI)m/z：388.9[M+H]⁺，¹H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 12.75 (dt, J =1.8, 1.2Hz, 2H) δ 8.10 (dt, J = 1.8, 0.9 Hz, 1H), 8.03 (d, J = 8.4 Hz, 1H),7.99 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.60 (dd, J = 7.8, 1.2 Hz, 1H), 7.45 (ddd, J= 7.9, 2.1, 1.0 Hz, 1H), 7.28 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 3.59 (p, J = 8.2 Hz, 1H),3.49 (ddd, J = 14.1, 8.3, 0.9 Hz, 1H), 3.32 (ddd, J = 14.3, 8.3, 1.1 Hz, 1H),2.93 (ddd, J = 14.2, 8.2, 1.0 Hz, 1H), 2.78 (ddd, J = 14.1, 8.1, 0.9 Hz, 1H).

向含2-溴-3-苯甲酸-2,3-二氢-1-茚满酮-5-羧酸（1-3）(0.6g，1.54mmol)的无水DMF (30mL)溶液中搅拌添加NiCl₂(19.98mg，0.154mmol)及CrCl₂(1.89g，15.4mmol)，随后在120℃下搅拌16小时。TLC监测反应完成后，将反应混合物用冰水淬灭,然后用乙醚2mL×2)萃取，将合并的有机层经Na₂SO₄干燥且在减压下浓缩通过硅胶(100至200目)柱层析（二氯甲烷：甲醇=10：1）纯化，获得9,10 -二氢茚[1,2-a]茚-4b(9H)-羟基-2,7-二羧酸（1-4）。

MS(ESI)m/z：311.1[M+H]⁺，¹H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 12.75 (dt, J =1.8, 1.2Hz, 2H) δ 8.01 (dd, J = 1.8, 0.9 Hz, 2H), 7.95 (d, J = 2.0 Hz, 1H),7.94 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.52 (s, 1H), 4.82 (s, 1H) 4.30 (s, 1H),3.16 (ddd,J = 14.4, 7.6, 0.9 Hz, 2H), 2.96 (p, J = 7.7 Hz, 1H), 2.86 (ddd, J = 14.3,7.5, 0.9 Hz, 2H).

在0℃下向9,10 -二氢茚[1,2-a]茚-4b(9H)-羟基-2，7-二羧酸（1-4）(0.5g，1.62mmol)的DCM (5mL)搅拌溶液中添加H₃PO₄(6mL)且在室温下搅拌12小时。反应通过TLC监测。将反应混合物倒入冰水中后用乙醚(2×5mL)萃取。将合并的有机层用盐水溶液(5mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥且在减压下浓缩。粗化合物经柱层析（二氯甲烷：甲醇=10：1）纯化，以获得9,10-二氢茚并[1 ,2-a]茚-2,7-二羧酸（化合物1，本发明式I化合物）。

MS(ESI)m/z：393.1[M+H]⁺，¹H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 12.75 (dt, J =1.8, 1.2Hz, 2H) δ 8.04 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.00(d, J = 1.6 Hz, 2H), 7.65 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 3.48 (s, 4H).

实施例4

通过体外生物活性测试，证明化合物1具有抑制RIG-Ilys852位点乳酸化以及抑制巨噬细胞向M2型极化的作用。

具体的，其包括步骤：

（1）体外细胞实验1：提取6-8周龄雌性野生型c57bl/6小鼠的骨髓巨噬细胞（BMDM）等量分3组进行体外培养：①对照组；②培养环境中加入5mM浓度乳酸；③培养环境中加入5mM浓度乳酸及1mM浓度的化合物1，在37℃，5%的CO₂中培养三天后提细胞的蛋白进行western blot实验，比较Lac RIG-I、RIG-1的表达量的差异。

Western blot实验：收集经处理的各组细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法进行定量。取等量蛋白进行SDS⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉溶液封闭1h，加入一抗，于4℃孵育过夜，清洗后加入兔二抗（1∶2000）室温孵育2h，清洗后加入ECL发光剂于暗室中显影、曝光。

实验结果：从图6中可以看到化合物1对Lac RIG-I表达的抑制情况，三行条带从上往下依次是乳酸化RIG-1、RIG-I和内参，内参表达的强弱一般不会受变量的影响，所以每组之间的表达量无差异，3个泳道从左到右依次是空白对照（来自不加任何干预培养的巨噬细胞）、乳酸组（培养环境中加入乳酸的巨噬细胞）和乳酸+小分子1（培养环境中加入乳酸和化合物1），其中只有第三个泳道的Lac RIG-I的表达相对减低了，提示小分子1对RIG-I的乳酸化具有抑制作用。

（2）体外细胞实验2：提取6-8周龄雌性野生型c57bl/6小鼠的肝巨噬细胞（Kupffercells），分3组进行培养：①对照组；②培养环境中加入5mM浓度乳酸；③培养环境中加入5mM浓度乳酸及1mM浓度的小分子1。在37℃，5%的CO₂中培养第三天进行免疫荧光染色，观察M2型巨噬细胞的标志物CD206的表达差异，从蛋白的角度依此分析不同组巨噬细胞的极化情况。

实验结果，图7中可以看到相较Lac组，加入小分子化合物1后，M2型巨噬细胞的标志物CD206的表达明显减少。以上结果从蛋白的角度表明化合物1可以抑制巨噬细胞向M2极化。

（3）体外细胞实验3：提取6-8周龄雌性野生型c57bl/6小鼠的肝巨噬细胞（Kupffercells），分3组进行培养：①对照组；②培养环境中加入5mM浓度乳酸；③培养环境中加入5mM浓度乳酸及1mM浓度的小分子1。在37℃，5%的CO₂中培养第三天进行通过qPCR实验从基因的角度的研究小分子化合物对巨噬细胞极化方向的影响。

qPCR实验：首先收集经处理的各组细胞，提取RNA，使用NanoDrop检测RNA的浓度及纯度。然后将其逆转录为cDNA后，按照纯水：SYBR mix：前引物：后引物：cDNA=3.6:5:0.2:0.2:1比例避光配置q-PCR体系(10μl)，最后进行荧光定量qPCR检测。分别检测空白对照（来自不加任何干预培养的巨噬细胞）、乳酸组（培养环境中加入乳酸的巨噬细胞）和乳酸+小分子1（培养环境中加入乳酸和化合物1）三组培养液中M1型巨噬细胞的特异性标志物CD86和NOS2以及M2型巨噬细胞的标志物ARG1和MRC1的mRNA的表达水平。

实验结果，图8中可以看到：相较空白组，加入乳酸之后M1型巨噬细胞的特异性标志物CD86和NOS2的表达减少，而M2型巨噬细胞的标志物ARG1和MRC1的表达增多。而加入小分子化合物1后，M1型巨噬细胞的特异性标志物CD86和NOS2的表达增加，而M2型巨噬细胞的标志物ARG1和MRC1的表达减少。以上结果从基因的角度表明化合物1可以抑制巨噬细胞向M2极化。

实施例5

通过小鼠动物实验测试，发现化合物1在治疗结肠癌肝转移疾病的作用。

具体的，其包括步骤：

（1）小鼠结肠癌肝转移模型的建立：使用6-8周龄雌性野生型c57bl/6小鼠建立结肠癌肝转移模型，小鼠结肠癌肝转移模型的建立方法：小鼠麻醉后行左上腹横行切口，打开腹腔，于腹外侧游离并显露脾脏，用1ml注射器从脾下极平行进针约3mm，注入肿瘤细胞悬液至脾被膜下，肿瘤细胞悬液浓度为1×10⁶/ml，每只注入0.1ml，见注射部位脾被膜发白肿胀后拔出针头，压迫止血2分钟，逐层关腹。Day21收集小鼠肝脏组织，每个实验组的样本量为5。

（2）小鼠动物实验1：构建的模型分为两组：①在建立模型的第7天腹腔注射100μl生理盐水；②在建立模型的第7天腹腔注射一次200 mg/kg量的化合物1，用药2周。所有小鼠在建模的第21天处死，去除肝脏观察肿瘤进展情况。

通过对肝脏表面转移瘤的数量来评估结肠癌肝转移的进展，柱状图反应的是两组不同小鼠的肝转移数量差异，从图9中可以看到相较对照组①来说，使用化合物1可明显减少肝脏表面转移瘤的数量，提示化合物1对结肠癌肝转移具有明显的治疗作用。

（3）小鼠动物实验2：构建的模型分为三组：①在建立模型的第7天腹腔注射100μl生理盐水；②在建立模型的第7天开始每隔一天腹腔注射5mg/kg的5-氟尿嘧啶，用药2周；③在建立模型的第7天腹腔注射一次200 mg/kg量的化合物1，并从建立模型的第7天开始每隔一天腹腔注射5mg/kg的5-氟尿嘧啶，用药2周。所有小鼠在建模的第21天处死，去除肝脏观察肿瘤进展情况。

通过对肝脏表面转移瘤的数量来评估结肠癌肝转移的进展，柱状图反应的是三组不同小鼠的肝转移数量差异，从图10中可以看到相较对照组①来说，使用5-FU可明显减少肝脏表面转移瘤的数量，而化合物1和5-FU这种化疗药联用相对于单用5-FU可以更加显著抑制结肠癌肝转移的进展，提示化合物1和5-FU联用用药可加强对结肠癌肝转移的治疗作用。

Claims

1.如式（I）所示的化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗RIG-I^lys852位点乳酸化介导的疾病药物中的应用，所述疾病为结肠癌肝转移，

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2.如式（I）所示的化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗结肠癌肝转移药物中的应用，

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3.如式（I）所示的化合物及其药学上可接受的盐联合5-FU在制备治疗结肠癌肝转移药物中的应用，

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4.一种预防或治疗RIG-I^lys852位点乳酸化介导的疾病的药物组合物，其含有如权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分和药学上可接受的载体，所述疾病为结肠癌肝转移。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。