JP6100171B2 - 炎症関連障害の治療および予防に使用するための組成物 - Google Patents

Description

本発明は、炎症関連障害、特に、障害の発症が主として粘膜組織で起こる炎症関連障害を治療および予防する薬物と組み合わせたヒアルロン酸の組成物を提供する。

ヒアルロン酸は、ヒアルロナン、ヒアルロン酸塩、およびヒアルロン酸ナトリウムとしても知られ、一般にＨＡと表示され、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸が交互のβ−１，３およびβ−１，４グリコシド結合により交互に連結されたものから構成される、二糖類を含む天然のグリコサミノグリカン高分子である。天然に見られる、５０，０００ダルトン（Ｄａ）〜数１００万ダルトンの間の分子量（Ｍｗ）を有するＨＡは、通常、高い粘度を有する。

天然に見られるＨＡは弾性を有する細胞外材料であり、主に細胞の保護および潤滑化、制御性Ｔ細胞の輸送のためのプラットフォームの提供、さらにコラーゲン網の安定化およびコラーゲン網の機械的損傷からの保護のために、細胞とコラーゲン繊維の間を満たし、一部の表皮組織を被覆している。また、ＨＡはその潤滑特性および高度緩衝性のために腱および腱鞘内および滑膜表面上では主要な潤滑剤となり、組織の流動力学、運動、および細胞増殖に役立ち（非特許文献１参照）、一部の細胞の表面上の受容体相互作用に関与し、特にはＣＤ４４の主要な受容体である。ＣＤ４４は、活性化リンパ球のマーカーとして広く認められている（非特許文献２参照）。

近年、ＨＡは、主として眼、皮膚、整形外科、手術、関節炎、動脈処置、および化粧品の分野で、ナトリウム塩の形態で臨床処置に適用されている。アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン（例えば、マグネシウムイオン）、アルミニウムイオン、アンモニウムイオンを含むＨＡ、およびアンモニウムイオン置換塩の形態は、薬物吸収を助けるための担体となり得る（特許文献１参照）。ＨＡの重金属塩のうち、銀塩は抗真菌薬として用いられ、また金塩は関節リウマチの処置に用いられる（特許文献２参照）。

抗炎症性とは、炎症を軽減する物質または処置の特性をさす。抗炎症薬は鎮痛薬の約半数を構成し、中枢神経系に影響を及ぼすオピオイドとは対照的に、炎症を軽減することによって疼痛を軽減する。関連薬物としては次のように記載される。

１．ステロイド、特に、グルココルチコイドは、グルココルチコイド受容体に結合することによって炎症または腫脹を軽減する。これらの薬物はコルチコステロイドと呼ばれる場合が多い。

２．非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）酵素を中和することによって疼痛を緩和する。ＣＯＸ酵素はそれ自体でプロスタグランジンを合成し、炎症を生じる。全体として見ると、ＮＳＡＩＤはプロスタグランジンの常時合成を妨げ、疼痛を軽減または排除する。ＮＳＡＩＤの一般例をいくつか挙げれば、アスピリン、イブプロフェンおよびナプロキセンである。より新しい特異的ＣＯＸ阻害剤は、同様の作用様式を持つと思われるが、従来のＮＳＡＩＤと一緒には分類されない。

３．ＩｍＳＡＩＤは、抗炎症特性を含む多様な生物学的特性を有することが見出された。ＩｍＳＡＩＤは、炎症性応答の増幅を担う免疫細胞である炎症細胞の活性化および遊走を変化させることによって働く（非特許文献３）。ＩｍＳＡＩＤは、抗炎症薬の新規カテゴリーに相当し、ステロイドホルモンまたは非ステロイド系抗炎症薬とは関連がない。

特許文献３は、ＮＳＡＩＤと、ヒアルロン酸、その薬学上許容される塩、その断片および／またはそのサブユニットから選択されるヒアルロン酸製剤とを含む、有効量の組成物の投与を含む、アフタ性潰瘍の治療方法を開示している。しかしながら、この特許文献は使用するＮＳＡＩＤが低用量であることを強調しておらず、一方で、メサラミンはＮＳＡＩＤに属さない。

粘膜は、大部分は内肺葉起源の内膜であり、上皮に覆われ、吸収（消化管）ならびに分泌（消化管および気道）に含まれる。それらは、外部環境および内臓器官に曝される体腔の内面であり、鼻孔、口、唇、眼瞼、耳、生殖器領域、および肛門などのいくつかの身体領域で皮膚に隣接している。粘膜および腺から分泌された粘着性の高粘度流体は、粘液と呼ばれる。粘膜という用語は、それらが体内で見出される場所をさし、全ての粘膜が粘液を分泌するわけではない。

結膜炎とは、結膜（眼の最外層、および眼瞼の内表面）の炎症をさす。

耳炎は、ヒトおよび他の動物両方における、耳の炎症または感染に関する一般用語である。

鼻炎は、鼻粘膜の炎症と定義され、くしゃみ、鼻詰まり、鼻のかゆみ、および鼻漏の任意の組合せからなる複合症状を特徴とする。眼、耳、鼻および喉が関与する場合もある。特許文献４は、少なくとも１つの酸性グリコサミノグリカンを含む、鼻炎の治癒的局所処置のための医薬組成物を開示している。しかし、この発明はまた、局所適用に好適で粘膜の血管収縮薬作用または腫脹減退作用を有する少なくとも１つの交感神経様作用薬、またはその生理学上許容される塩もしくは誘導体も含む。この特許文献には、低用量の薬物を必要に応じてＨＡと組み合わせて使用できるという技術概念は開示されていない。

口腔粘膜は、口腔の粘膜上皮である。口腔潰瘍は、口腔内部の開いた傷口、または、まれではあるが、口唇上もしくは口周囲の粘膜もしくは上皮における裂け目である。潰瘍は、ひと度生じると、炎症および／または二次感染により維持され得る。

気管支炎は、気管から肺へ空気流を運ぶ気道である気管支の、粘膜の炎症である。気管支炎は急性および慢性の２つのカテゴリーに分類でき、病因、病理、および療法がそれぞれ異なる。特許文献５は、ＣＤ４４に結合できる多糖による呼吸器系病態の治療法を開示している。しかしながら、関与し得るのはただ１種類のＨＡのみであり、従来技術ではＨＡと薬物の組合せは開示されておらず、低用量の薬物が使用されるという記載もほとんどない。

粘膜は、消化管壁の最内層であり、内腔、すなわち管内の開放空間を取り囲んでいる。この層は、食物塊と直接接触し、消化における重要なプロセスである吸収、消化、および分泌を担う。

一般に消化性潰瘍として知られ、ＰＵＤまたは消化性潰瘍性疾患としても知られる、消化性潰瘍は、通常酸性である消化管領域の潰瘍であり（０．５ｃｍ以上の粘膜びらんと定義される）、従って、激しい疼痛を引き起こす。また、潰瘍は、アスピリン、プラビックス（クロピドグレル）、イブプロフェン、および他のＮＳＡＩＤ（非ステロイド系抗炎症薬）などの薬物により引き起こされるか、または悪化する場合がある。

メサラミンは、メサラジンまたは５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）としても知られ、消化管潰瘍性大腸炎および軽度〜中等度のクローン病の炎症を処置するために使用される抗炎症薬である。メサラミンは、消化管に局所的に作用する腸特異的アミノサリチル酸薬であり、消化管にその主要な作用を持ち、それにより全身性副作用がほとんどない。サリチル酸の誘導体としてのメサラミンはまた、代謝の潜在的傷害性副産物であるフリーラジカルを捕捉する抗酸化薬であると考えられる。メサラミンはスルファサラジンの活性部分であると考えられ、スルファラジンは代謝されてスルファピリジンとメサラミンとなる（非特許文献４）。メサラミンは、経口摂取用に錠剤または顆粒として、また、直腸投与用に直腸坐剤、懸濁液または浣腸として調剤される。３種類の市販のメサラミン薬の規定治療有効用量をここに挙げておく。潰瘍性直腸炎（活動期、慢性）および直腸Ｓ状結腸炎（活動期潰瘍）を有する成人用の直腸保留浣腸：就寝時に４ｇｍの直腸保留浣腸ＱＤ（８時間保持）を３〜６週間（Ｃｏｌａｓａ（登録商標））。軽度〜中等度の活動期潰瘍性大腸炎の処置の場合、成人における通常用量は４００ｍｇ錠２個を１日３回服用、総１日用量２．４グラム、６週間（Ａｓａｃｏｌ（登録商標））である。軽度〜中等度の活動期潰瘍性大腸炎の緩解誘導および全身処置に関する推奨用量は、１ｇ（ＰＥＮＴＡＳＡ ２５０ｍｇカプセル４個またはＰＥＮＴＡＳＡ ５００ｍｇカプセル２個）を１日４回、総１日用量４ｇである。管理下の治験での処置期間は最大８週間であった（ＰＥＮＴＡＳＡ（登録商標））。好ましい実施形態では、薬物はステロイドとしてのプレドニゾロンである。プレドニゾンの初期用量は処置する病態および患者の年齢によって異なる。開始用量は５〜６０ｍｇ／日であってよく、多くの場合、処置する病態の応答に基づいて調節する（Ｐｒｅｄｎｅｓｏｌ（登録商標））。好ましい実施形態では、薬物はＮＳＡＩＤとしてのナプロキセンである。関節リウマチ、骨関節炎および強直性脊椎炎の場合、２５０〜５００ｍｇのナプロキセンが１日２回経口投与され、限定された期間、ナプロキセン塩基１．５ｇ／日に引き上げてもよい（Ｎａｐｒｏｓｙｎ（登録商標））。

分子間相互作用に関して、分子間力はまず、水素結合と非共有結合に分類される。水素結合は本来、本質的に静電気的なものであるが、水素結合のエネルギーは分極、交換反発、電荷移動および混合からさらなる寄与へと分解され得る。水素結合は水素原子と、窒素、酸素またはフッ素などの電気的陰性原子との間の引力である。水素結合は、強い静電気的双極子−双極子相互作用として記載される場合が多い。生物系で最も一般的な水素結合は、酸素原子と窒素原子が関わるものである。

別の種類の分子間相互作用として、非共有結合的結合は、超分子化学において主要なタイプの超分子間相互作用である。非共有結合的結合は大分子の三次元構造の維持に極めて重要であり、多くの生体プロセスに関与し、大分子同士は一時的にではあるが特異的に互いに結合する。このような力は、（１）双極子−双極子力、（２）イオン−双極子力、（３）双極子−誘起双極子力またはデバイ力、および（４）一時的な双極子−誘起双極子力またはロンドン分散力、の４タイプからなる。分子相互作用は本来、基本的に静電気的なものであり、クーロンの法則によって表すことができる。クーロンの法則は、（１）電子が原子核に結合する力、（２）原子が分子中の原子に結合する力、および（３）分子が液体および固体中の分子に結合する力を厳密に表す。このような力の詳細な記載は、一般的な化学知識であるので、本明細書には記載しない。

ベルギー特許第９０４，５４７号明細書 国際公開第８７／０５５１７号 米国特許第６，１５９，９５５号明細書 米国特許出願第２００５０１０７３３０号明細書 米国特許出願第２００３０１７１３３２号明細書

Delpech, B. et al., 1997. Hyaluronan: fundamental principles and applications in cancer. J. Intern. Med. 242, 41-48 Teder P, et al., 2002, Resolution of lung inflammation by CD44. Science Bao F, John SM, Chen Y, Mathison RD, Weaver LC. The tripeptide phenylalanine-(D) glutamate-(D) glycine modulates leukocyte infiltration and oxidative damage in rat injured spinal cord. Neuroscience., 2006, 140(3):1011-22; Epub on 2006 Apr 3 Lippencott's Illustrated Reviews: Pharmacology, 4th Ed. Finkel, Cubeddu and Clark

本発明の目的は、必要とする抗炎症薬が低用量であり、従って、炎症関連障害に罹患している被験体に組成物を投与した際に起こる上記薬物の副作用が少ない、炎症関連障害の治療または予防に使用するための組成物を提供することである。

よって、本発明は、哺乳動物またはヒトにおける炎症関連障害の治療または予防に使用するための組成物であって、
その規定治療有効用量よりも低用量の、炎症の治療に好適な薬物と
ヒアルロン酸（ＨＡ）またはＨＡ混合物
とを含み、それにより、上記組成物を上記炎症関連障害に罹患している哺乳動物またはヒトに投与するとともに、送達ビヒクルとして使用される上記ＨＡまたはＨＡ混合物が上記薬剤を炎症組織に特異的に送達する組成物を提供する。

本発明のその他の目的、利点および新規な特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面と共に理解すれば、より明らかとなる。

本発明のシナリオは、炎症表面に結合するヒアルロン酸（ＨＡ）の量が非炎症領域における量よりも多いという本発明者らの以前の試験結果に基づくものである。さらに、本発明の結果は、ＨＡを、炎症および／またはアレルギーの処置に好適な薬物、好ましい実施形態ではメサラミンを運ぶための送達ビヒクルとすることができることを示す。ＨＡとメサラミンの間の詳細な機構はまだあまり明らかになっていないが、本発明の結果は、ＨＡとメサラミンを含む組成物が結腸においてそのメサラミン濃度を持続できることを証明する。以下、このシナリオを詳細に説明する。

二糖単位の繰り返しに基づくＨＡは直鎖構造を形成している（図１）。しかしながら、高平均分子量ＨＡでは、ＨＡとアミンの反応により、直鎖ＨＡ高分子のカルボン酸基は、同じまたは他のＨＡ高分子のジ／トリ／ポリアミンと反応してアミド結合を形成し、分子間または分子内架橋を形成する。この反応のために、初めのコイル状のＨＡ構造は、全体が球状のナノ粒子に変わる（米国特許第７，８７９，８１８号参照）。本発明の好ましい実施形態では、ＨＡ混合物は、低平均分子量ヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）および高平均分子量ヒアルロン酸（ＨＭＷＨＡ）を含む、平均分子量の異なる少なくとも２種類のＨＡを含むように設定された。分子量の異なるＨＡは、異なるレオロジー、粘着性、組織足場としての機能、および溶液中での分解特性を有する。

ＨＡａｓｅにより触媒されるＨＡ加水分解は、ＨＡ長鎖と短鎖の間のバランスの制御に関与していると考えられている。短鎖ＨＡは短すぎて安定な複合体を形成できないと思われ、長鎖ＨＡは、おそらく立体障害のために、複合体形成においては困難に直面する。

本発明によれば、１種類のＨＡが単純かつ定型の状況に使用される従来の技術とは対照的に、好ましい実施形態では、本発明者らにより提供される特殊なＨＡ混合物も含まれる。この特殊なＨＡ混合物は、少なくともＬＭＷＨＡとＨＭＷＨＡを含む。平均分子量が１５０万Ｄａよりも小さいＨＡはＬＭＷＨＡとして分類され、好ましい平均分子量範囲は５万Ｄａ〜１５０万Ｄａの間であり、より好ましい平均分子量範囲は１０万〜１５０万Ｄａの間であり、最も好ましい平均分子量範囲は１０万〜５０万Ｄａの間である。平均分子量が１５０万Ｄａより大きいＨＡはＨＭＷＨＡとして分類され、好ましい平均分子量範囲は１５０万〜５００万Ｄａの間であり、最も好ましい平均分子量範囲は１５０万〜３５０万Ｄａの間である。好ましい実施形態では、ＬＭＷＨＡの平均分子量は、ＨＭＷＨＡの平均分子量と少なくとも５０万Ｄａ異なる。ＨＡの一般的な化学構造は、図１のように表される。

本発明による組成物の他の好ましい実施形態には、限定されるものではないが、塩形態のＨＡの重量で１：１（ｗ／ｗ）のＬＭＷＨＡとＨＭＷＨＡの混合物が含まれ、また、ＬＭＷＨＡとＨＭＷＨＡの比のより好ましい実施形態としては、臨床目的によって重量で２０：８０〜８０：２０の間に調整できる。ＬＭＷＨＡのＨＭＷＨＡに対する比がより大きいＨＡ混合物は、処置の迅速化により有用であり得るが、これに対して、ＨＭＷＨＡのＬＭＷＨＡに対する比がより大きければ、分解速度が遅くなって治療効果を延長できる。

本明細書で用いられる用語「粘膜」は、限定されるものではないが、眼の粘膜、耳の粘膜、鼻の粘膜、口腔の粘膜、気道の粘膜、消化管の粘膜、尿路の粘膜、および生殖管の粘膜を含む。炎症関連障害の好ましい実施形態には、限定されるものではないが、急性炎症性疾患、慢性閉塞性肺疾患、小児脂肪便症、結膜炎、耳炎、アレルギー性鼻炎、歯肉炎、アフタ性潰瘍、気管支炎、胃食道逆流疾患（ＧＥＲＤ）、食道炎、胃炎、腸炎、消化性潰瘍、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、腸管の炎症もしくはアレルギー、尿道炎、膀胱炎、膣炎、直腸炎、好酸球性胃腸炎、または関節リウマチが含まれる。消化性潰瘍のより好ましい実施形態には、限定されるものではないが、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、食道潰瘍およびメッケル憩室潰瘍が含まれる。ＩＢＤのより好ましい実施形態には、限定されるものではないが、クローン病および潰瘍性大腸炎が含まれる。ＩＢＳのより好ましい実施形態には、限定されるものではないが、小児脂肪便症、フルクトース吸収不良、軽度感染症、ジアルジア症などの寄生虫感染、機能性慢性便秘および慢性機能性腹痛が含まれる。本発明の結果は、ＨＡが正常結腸組織よりも損傷結腸組織において明らかに多く吸収されることを示している（Ｐ＜０．０１、図２）。損傷結腸組織において吸収された３種類の平均分子量のＨＡ間の違いを比較すると、損傷結腸組織による３５０ＫＤａのＨＡの吸収の蛍光指数が、他の２つの平均分子量（２ＭＤａおよび１ＭＤａ）のＨＡよりも明らかに高かった。さらに、同等の正常結腸組織または損傷結腸組織による１ＭＤａのＨＡの吸収の蛍光指数は、２ＭＤａのＨＡよりも高かった。この結果は、即時の創傷治癒と組織のさらなる損傷からの保護を提供する低分子量ＨＡの、迅速な拡散と被覆効果を説明する。

本発明の組成物の他の好ましい実施形態には、眼、耳、口、鼻、気道、消化管または局所使用のための投与形を調剤するための賦形剤を含むＨＡまたはＨＡ混合物が含まれる。経口投与形のより好ましい実施形態は、固体投与形、限定されるものではないが懸濁液を含む溶液、限定されるものではないが制御放出錠を含む錠剤、および限定されるものではないが腸溶コーティングカプセルを含むカプセル剤からなる群から選択される。消化管投与形のより好ましい実施形態は、固体投与形、灌流、浣腸、坐剤、および限定されるものではないが懸濁液を含む溶液からなる群から選択される。局所投与形のより好ましい実施形態は、灌流、浣腸、坐剤、スプレー、吸入、および点滴剤からなる群から選択される。

本発明によれば、本発明の炎症の処置に好適な薬物には、ステロイド、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、メサラミンおよびその誘導体が含まれる。

アレルギー性鼻炎または気管支炎を処置する好ましい実施形態は、抗ヒスタミン薬、抗アレルギー薬、抗うっ血薬、ステロイドまたは抗喘息薬を含む本発明の組成物を、それを必要とする被験体に投与することにより実施できる。腸炎を処置する好ましい実施形態は、抗生物質または抗痙攣薬を含む本発明の組成物を、それを必要とする被験体に投与することにより実施できる。消化性潰瘍を処置する好ましい実施形態は、凝血薬、抗生物質、制酸薬、Ｈ２遮断薬、カリウム水素イオンポンプ遮断薬（ＰＰＩ）、細胞保護薬、または粘膜保護薬を含む本発明の組成物を、それを必要とする被験体に投与することにより実施できる。ＩＢＤを処置する好ましい実施形態は、ステロイド、免疫抑制薬、抗生物質、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）および誘導体、または抗炎症薬を含む本発明の組成物を、それを必要とする被験体に投与することにより実施できる。

ＩＢＳを処置する好ましい実施形態は、抗アレルギー薬、抗痙攣薬、抗下痢薬、神経破壊薬、トランキライザー、麻薬性鎮痛薬、抗鬱薬、またはセロトニンアンタゴニストを含む本発明の組成物を、それを必要とする被験体に投与することにより実施できる。より好ましい実施形態では、本発明の組成物中の薬物には、抗ヒスタミン薬、抗アレルギー薬、抗炎症薬、免疫抑制薬、またはそれらの組合せが含まれる。

経口製剤の好ましい実施形態（例えば、腸溶コーティング錠）では、腸溶コーティングは、胃におけるより強い溶解および消化耐性を与え、小腸および結腸に到達後は、腸溶コーティングが溶解し、本明細書のＨＡが放出され、炎症結腸（上行結腸または横行結腸の領域）で保護膜を形成する。

座剤製剤の好ましい実施形態では、本明細書の組成物を含有する座剤を肛門に挿入してよく、上記組成物は直腸内で溶解し、結腸の他の領域（例えば、下行領域）に拡散し、炎症結腸で保護膜を形成する。

灌流製剤の好ましい実施形態では（例えば、浣腸）、本明細書の組成物中のＨＡまたはＨＡ混合物は主要有効成分であり、賦形剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液または懸濁液製剤））と混合され、そのまま使用されるか、またはソフトチューブの中に入れられ、結腸内に上記組成物が注入される。上記組成物は結腸に挿入され、結腸の他の領域（例えば、下行領域）に拡散し、炎症結腸で保護膜を形成し、上記薬物により炎症を治療する。

本明細書で使用された組成物により処置される被験体の、より好ましい実施形態は、哺乳動物である。被験体の最も好ましい実施形態は、ヒトである。

本発明の組成物は、本来の物理的または化学的力によって形成される。ＨＡと本発明の薬物の間の分子間は、キレーション、静電気的相互作用または粘着である可能性が最も高い。キレーションとは、多座（多重結合）配位子と単一の中央原子との間における２以上の別個の配位結合の形成または存在である。通常、これらの配位子は有機化合物である。分子の相互作用は全て、本来は本質的に静電気的なものであるが、静電気的相互作用は通常、特に、イオン化された化学実体の存在のため、また、これらの原子、原子団、または分子の電気的陰性および電気的陽性の特性のためである、原子および／または原子団および／または分子の間の引力または反発力のいずれをも表す。粘着とは、それらを「直接的接触」に持ち込ませ得る異分子種間の任意の誘因プロセスである。粘着は、異質な粒子および／または表面が相互に付着する傾向である。

好ましい実施形態では、前記薬物は、上述のＨＡもしくはＨＡ混合物に封入するか、または上述のＨＡもしくはＨＡ混合物でコーティングしてポリマーまたは球状封入体を形成してもよい。このような場合、ＨＡ自体か添加する賦形剤のいずれかが一定の量の薬物を保持し、その薬物を炎症領域で機能させることができる。

本発明の最大の寄与は、薬物の治療用量を有意に引き下げることができる、薬物含有ＨＡ製剤の組成を提供することである。種々の薬物の用量は種々の患者の様々な状況によって異なるので、本発明は代表的な好ましい実施形態を示すに過ぎない。本発明の薬物の好ましい実施形態は、ＩＢＤの処置に関して知られている薬物であるメサラミンである。本発明の結果は、ラットにおいて人為的に誘発されたＩＢＤの炎症を改善するのにほぼ同等の有効性を持ちながら、規定の治療有効用量の４分の１を使用するだけでよいことを示す。より好ましい実施形態において、本発明では規定治療有効用量の８分の１を使用した。別の好ましい実施形態は、ＨＡが好んで炎症領域を認識してそこに付着するというものである（図２）。好ましい実施形態では、少なくとも２種類のＨＡを含有する上述のＨＡ混合物の代わりに１種のみのＨＡを使用する場合、その平均分子量は５万ダルトン〜５００万ダルトンの間である。ＨＡと薬物の間の分子間力の実際の機構はまだあまり明らかになっていないが、本発明は、ＨＡとメサラミンを混合することが、図３に示されるように以下の実施例２の結果により確認され、また、図４および５に示されるように以下の実施例３の結果により確認される、両方の各利点の組合せに寄与し得るという、いくつかの証拠を示した。炎症領域への特異的誘導能（送達ビヒクルとして）を有するＨＡと、低用量の薬物とを組み合わせるという技術概念、また、特に、ＨＡ自体が炎症治療能を有するということも、本発明以前には全く開示されていなかった。よって、本発明は、薬物用量を節減し、その薬物の効果を炎症領域に集中させるための賢明かつ容易で簡単な方法を提供する。本発明の好ましい実施形態は、このＨＡの特徴によって粘膜組織に働きかけるというものである。好ましくは、本発明は、薬物の用量および／または必要量を低減し、従って、薬物のコストを低減する。

本発明の別の好ましい実施形態は、炎症および／またはアレルギー関連障害を治療または予防するための方法であって、それを必要とする哺乳動物またはヒトに、炎症および／またはアレルギーの処置に好適な、規定治療有効用量より低用量の薬物とヒアルロン酸（ＨＡ）の組成物を投与することを含み、上記ＨＡは、特に炎症組織に上記薬物を送達するための送達ビヒクルとして使用される、方法を提供する。

本発明によれば、炎症および／またはアレルギーの処置に好適な薬物はステロイド、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、免疫選択性抗炎症性誘導体（ＩｍＳＡＩＤ）またはメサラミンである。

より好ましくは、炎症および／またはアレルギーの処置に好適な薬物は、例えば、限定されるものではないが、メサラミン、５−アミノサリチル酸塩、スルファサラジンおよびオルサラジン、アセクロフェナク、アセメタシン、アセトアミノフェン、アセトアミノサロール、アセチル−サリチル酸、アセチル−サリチル酸−２−アミノ−４−ピコリン酸、５−アミノアセチルサリチル酸、アルクロフェナク、アミノプロフェン、アンフェナク、アンピロン、アンピロキシカム、アニレリジン、ベンダザック、ベノキサプロフェン、ベルモプロフェン、α−ビサボロール、ブロムフェナク、５−ブロモサリチル酸アセテート、ブロモサリゲニン、ブクロキシ酸、ブチブフェン、カルプロフェン、セレコキシブ、クロモグリケート、シンメタシン、クリンダナク、クロピラク、ナトリウムジクロフェナク、ジフルニサル、ジタゾール、ドロキシカム、エンフェナム酸、エトドラク、エトフェナマート、フェルビナク、フェンブフェン、フェンクロジン酸、フェンドサール、フェノプロフェン、フェンチアザク、フェプラジノール、フルフェナク、フルフェナム酸、フルニキシン、フルノキサプロフェン、フルルビプロフェン、グルタメタシン、サリチル酸グリコール、イブフェナク、イブプロフェン、イブプロキサム、インドメタシン、インドプロフェン、イソフェゾラク、イソキセパック、イソキシカム、ケトプロフェン、ケトロラク、ロルノキシカム、ロキソプロフェン、メクロフェナム酸、メフェナム酸、メロキシカム、メサラミン、メチアジン酸、モフェゾラク、モンテルカスト、ナブメトン、ナプロキセン、ニフルム酸、ニメスリド、オルサラジン、オキサセプロール、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、パラセタモール、パルサルミド、ペリソキサール、フェニル−アセチル−サリチル酸、フェニルブタゾン、フェニルサリチレート、ピラゾラク、ピロキシカム、ピルプロフェン、プラノプロフェン、プレドニゾロン、プロチジン酸、レセルベラトール、サラセタミド、サリチルアミド、サリチルアミド−Ｏ−アセチル酸、サリチル硫酸、サリシン、サリチルアミド、サルサレート、スリンダック、スプロフェン、スキシブタゾン、タモキシフェン、テノキシカム、チアプロフェン酸、チアラミド、チクロピジン、チノリジン、トルフェナム酸、トルメチン、トロペシン、キセンブシン、キシモプロフェン、ザルトプロフェン、ゾメピラク、トモキシプロール、ザフィルルカストおよびシクロスポリンである。

本発明による組成物の好ましい実施形態は、それぞれ炎症の処置に好適な薬物を２５０ｍｇ未満の用量で含む、１以上の個別用量単位を含む。

本発明によれば、炎症の処置に好適な薬物の規定治療有効用量は、当技術分野で知られている通りである。例えば、メサラミンの規定治療有効用量は、４ｇ／日である。従って、本発明による組成物の炎症の処置に好適な薬物は、好ましくは４ｇ／日未満、より好ましくは２５０ｍｇ〜４ｇ／日、最も好ましくは２５０ｍｇ〜１ｇ／日の用量である。

本発明を特定の最良の様式に関して説明してきたが、上記説明に照らして当業者には多くの代替形態、改変、および変形が明らかであると理解されるべきである。本明細書で示された、または添付の図面に示された全ての事項は、例示的かつ非限定的なものであると解釈されるべきである。

図１は、ヒアルロン酸の一般化学構造を示す。 図２は、正常結腸組織および損傷結腸組織においてＨＡの親和性を蛍光指数により示す（^*ｐ＜０．０５）。 図３は、Ｃｏｌａｓａ（登録商標）（１ｍｌ溶液中に２０ｍｇのメサラミンを含む浣腸製剤の銘柄）またはＨＡ−メサラミン投与後の、結腸組織生検時メサラミン濃度特性を示す。 図４は、試験１日目から１４日目のラットの平均体重（平均±ＳＤ）により示される、ＩＢＤ処置におけるメサラミンおよびＨＡ−メサラミンの効果の、対照群との比較を示す（^*Ａ群に対してのｐ＜０．０５）。 図５は、試験９日目（Ｄ９）〜１４日目（Ｄ１４）の間のラットの回復率（平均±ＳＤ）により示される、ＩＢＤ処置におけるメサラミンおよびＨＡ−メサラミンの効果の、対照群との比較を示す（^*Ａ群に対してのｐ＜０．０５）。

実施例１：結腸組織におけるＨＡの粘着性（ＩＶＩＳ遺伝子イメージシステム−ビジョン３）
手順：
１． ０．２５ｇの高分子量ヒアルロン酸ナトリウム粉末（ＨＨＡ；分子量：２ＭＤａ；Ｆｒｅｄａ）、および０．２５ｇの低分子量ヒアルロン酸ナトリウム粉末（ＬＨＡ；分子量：０．３５ＭＤａ；Ｆｒｅｄａ）をそれぞれ、５０ｍｌのＰＢＳバッファー（リン酸緩衝生理食塩水）に加え、０．５％溶液を作製した後、粉末が完全に溶解するまで６時間撹拌した。

０．０５ｇのＬＨＡ粉末および０．２ｇのＨＨＡ粉末（比率２：８；ＭＨＡ、中間分子量ヒアルロン酸ナトリウム粉末）を、５０ｍｌのＰＢＳバッファーに加えた後、粉末が完全に溶解するまで６時間撹拌した。

２． 蛍光ＨＡ（ＨＡ−ｆ）を以下のように調製した。（１）０．３９ｇのＭＥＳ遊離酸（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、１００ｍｌのｄｄ水に溶解させた。（２）溶液Ａ：６５ｍｇのフルオレセインアミン粉末（異性体Ｉ、Ｆｌｕｋａ）を、９ｍｌの９５％エタノール溶液に溶解させた後、遮光条件下で１０分間撹拌した。（３）溶液Ｂ：３５９ｍｇのＥＤＣ粉末（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩、Ｓｉｇｍａ）を、９ｍｌのＭＥＳバッファーに溶解させた後、１０分間撹拌した。溶液Ｃ：２１６ｍｇのＮＨＳ粉末（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓｉｇｍａ）を９ｍｌのＭＥＳバッファーに溶解させた後、１０分間撹拌した。（４）３ｍｌの溶液Ａを、５０ｍｌの０．５％ＨＡ溶液中にゆっくりと滴下した後、遮光条件下で１０分間撹拌した。（５）３ｍｌの溶液Ｂと５ｍｌの溶液Ｃを、ステップ（４）の溶液中に別々に滴下した後、遮光条件下で１０分間撹拌した。（６）０．０２ＭのＭＥＳバッファーを、容量が１００ｍｌになるまでステップ（５）の溶液中にゆっくりと加えた後、遮光条件下、室温で２４時間撹拌した。（７）反応後の生成物を、５Ｌのｄｄ水を透析溶液として、透析チューブ（ＭＷ：１２０００〜１４０００）中に注いだ後、透析溶液の蛍光がなくなるまで１２時間ごとに透析溶液を交換しながら、遮光条件下、４℃で５日間撹拌した。（８）透析後の液体を５０ｃｃのプラスチック製遠心管に分注した後、−２０℃の冷蔵庫で一晩保存し、その後、遮光条件下、凍結乾燥装置にて乾燥させた。（９）乾燥したＨＡ−ｆ粉末を、−２０℃の冷蔵庫で保存した。（１０）５０ｍｇのＨＡ−ｆ粉末を、１０ｍｌのＰＢＳバッファーにゆっくりと加えた後、粉末が完全に溶解するまで６時間撹拌した。

３． ７〜８週齢のＳＤ−ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット）の結腸組織を外科用メスで切断した後、ＰＢＳバッファーで洗浄し、その後、３〜４ｃｍの長さに切断して、最終的にＰＢＳバッファーに浸漬した。

４． 損傷結腸組織は、歯ブラシで長手方向に２０回擦ることにより調製した後、ＰＢＳバッファーに浸漬した。

５． 正常結腸組織および損傷結腸組織を１２ウェルプレートに入れた後、１ｍｌの０．５％ＨＡ−ｆ溶液を各ウェルに加え、室温で２時間振盪した。２時間後に、チップを用いて余剰のＨＡ−ｆ溶液を吸い取った後、ＰＢＳバッファーに１０分間浸漬し、その後、ＰＢＳバッファーを除去することを３回繰り返した。

６． 洗浄した結腸組織を、内面組織を上に向けて１２ウェルプレートに入れた後、ＩＶＩＳのドックに配置した（in vivo画像システム、ＸＥＮＯＧＥＮ）。デフォルトパラメーターをＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）に設定し、励起４６５ｎｍ、発光５００ｎｍとし、次に、画像をソフトウエアにより取り込んだ。

７． 表中の値は全て、ｎ回の観測の平均値として表されている。組織学的指数は、スチューデントのｔ検定により分析した。

結果：
蛍光指数を定量し、図２のように配置した。正常結腸組織の蛍光指数を１と定義した。他の結腸組織の試験は、定義された値により較正した。結果は、同じ平均分子量のＨＡは、正常結腸組織よりも、損傷結腸組織において明らかに多く吸収されたことを示した（Ｐ＜０．０１）。損傷結腸組織において吸収された３つの異なる平均分子量のＨＡの間の差を比較すると、損傷結腸組織による３５０ＫＤａのＨＡの吸収の蛍光指数は、他の２つの平均分子量（２ＭＤａおよび１ＭＤａ）の、他の２つのＨＡよりも明らかに高かった。さらに、同等の正常結腸組織または損傷結腸組織による１ＭＤａのＨＡの吸収の蛍光指数は、２ＭＤａのＨＡの蛍光指数よりも高かった。

実施例２：種々のメサラミン製剤の管腔内注入後の結腸組織メサラミン濃度の比較試験
手順：
１． 試験動物：８週齢の雄ＳＰＦ級Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２８０〜３３０ｇ）は、ＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ． Ｌｔｄ．から入手した。

２． 試験サンプル：Ａ：Ｃｏｌａｓａ（登録商標）浣腸（２０ｍｇ／ｍｌ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．Ａｓｉａ）、Ｂ：５ｍｇ／ｍＬメサラミンを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中０．２５％（ｗ／ｗ）のＨＡ混合物（８：２＝２０００ＫＤａ ＨＡ：３５０ＫＤａ ＨＡ）（ＨＡ−Ｍ）。

３． 試験サンプルの管腔内注入：Ｚｏｌｅｔｉｌ ５０により軽く麻酔した後、外科ばさみでラットの腹側切開を行い、結腸を特定し、結腸の２セグメント（各２ｃｍ）を綿糸で結紮し、単離した結腸セグメントの管腔に０．５ｍｌの試験サンプルを注入し、０．５、１、１．５、または２時間後にラットを犠牲にし、結腸セグメントを取り出した。管腔内注入の各時点につき、３個体のラットを使用した。

４． 標本の作製：組織生検をＰＢＳで洗浄して表面の汚染を除去し、秤量し、すぐに液体窒素中で凍結させ、使用まで−８０℃で保存した。生検を破砕し、５０ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄溶液（ｐＨ７．４）を加えた。懸濁液中に挿入したマイクロプローブを用いて、組織細胞の１０秒間の超音波粉砕と、続いての超音波破砕の２０秒の停止とを２５Ｗで合計１０分間行った。ボルテックスにより混合した後、サンプルを室温で３０分間静置してタンパク質を沈降させ、その後、１３０００ｇで３０分間遠心分離を行った。

５． 結腸組織生検におけるメサラミン濃度の分析：メサラミンは超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）により測定した。この方法はバリデート済みである。Ｗａｔｅｒｓ（ＵＫ）ＡＣＱＵＩＴＹシステムおよび蛍光検出器（励起３１５ｎｍ、発光４３０ｎｍ）を用い、データはＥｍｐｏｗｅｒ ２を用いて分析した。Ｗａｔｅｒｓ（ＵＫ）から購入したＡＣＱＵＩＴＹカラム（Ｃ１８、１００×内径２．１ｍｍ、１．７μｍ粒子）をＶａｎ（Ｗａｔｅｒｓ）ガードカラム（Ｃ１８、５×内径２．１ｍｍ、１．７μｍ粒子）で保護した。移動相は、トリエチルアミンを含む０．１Ｍ酢酸（ｐＨ４．３）とアセトニトリル（８５０：１５０）からなった。流速は０．２ｍＬ／分とし、その結果、圧力は５４００ｐｓｉとなり、分析は４０℃で行った。注入容量は５μｌとした。サンプルは、メサラミンの蛍光特性を増強するために無水プロピオン酸を用いて誘導体化した。トリエチルアミンをイオン対薬剤として用いてピークの対称性を改良した。このメサラミン分析のＵＰＬＣ法は、名義直線範囲１０〜１０００ｎｇ／ｍｌでのメサラミンの測定に関してバリデーションを行った。この試験で用いた方法の直線相関係数（Ｒ２）は１．００である。

結果：
Ｃｏｌａｓａ（登録商標）注入後の結腸組織生検におけるメサラミン濃度（中央値）は、注入１時間後にピークがあった。その後、メサラミン濃度は急速に低下した。これに対して、ＨＡ−Ｍは２時間にわたって継続的にメサラミンを放出し、注入２時間後もメサラミン濃度は上昇しており、Ｃｏｌａｓａ（登録商標）の場合よりもずっと高かった（図３）。本発明の結果は、ＨＡ−Ｍは、市販のメサラミン浣腸（Ｃｏｌａｓａ（登録商標））に比べてずっと長くメサラミンの放出を持続したことを示したが、ＨＡ−Ｍが含んでいるメサラミン濃度はＣｏｌａｓａ（登録商標）の４分の１でしかない。

実施例３：炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の炎症の減退に対するＨＡおよびＨＡ−メサラミン（ＨＡ−Ｍ）投与の効果の比較
手順：
１． 試験意図：炎症の減退におけるＨＡおよびＨＡ−Ｍ投与の比較的効果を評価する目的で、ＳＰＦ級ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットにおいて、ＴＮＢＳを用いてＩＢＤを誘発すること。

２． 試験目的：ＨＡ混合物はＬＭＷＨＡとＨＭＷＨＡを含み、ＨＭＷＨＡは２００万Ｄａであり、ＬＭＷＨＡは１００万Ｄａおよび３５万Ｄａであり、混合重量比８：２で混合され、それぞれＣ群およびＤ群に分類され、ＰＢＳ溶液に溶解させて０．０６２５％（ｗ／ｖ）の濃度とした。

３． 方法：（１）試験対象：８週齢のラットを選択し、４群に分けた：Ａ群はＰＢＳで処置し、Ｂ群はＣｏｌａｓａ（登録商標）（２０ｍｇメサラミン／ｍＬ）で処置し、Ｃ群は混合比８：２のＨＭＷＨＡ：ＬＭＷＨＡ（２ＭＤａ：１ＭＤＡ）に相当し、Ｄ群は混合比８：２のＨＭＷＨＡ：ＬＭＷＨＡ（２ＭＤａ：３５０ｋＤａ）に相当した。各群はラット１０個体からなった。（２）動物試験：処置群の全ラットを２日間絶食させ；試験１日目に、直腸を介して１ｍｌのＴＮＢＳ（５０ｍｇ／ｍＬ）を投与するためにラットを麻酔し；試験５日目から８日目、および１０日目から１３日目まで、Ｂ群、Ｃ群およびＤ群において直腸を介して１ｍｌのメサラミンの種々の試験薬（Ｍ）および２種類のＨＡ−Ｍを毎日投与し；試験９日目に各群の半数のラットを犠牲にし、体重変化および炎症面積を観測および記録した。また、残りの半数のラットは１４日目に犠牲にし、体重変化および炎症面積を観測および記録した。対照群の全ラットを２日間絶食させ；試験１日目に、直腸を介して１ｍｌのＴＮＢＳ（５０ｍｇ／ｍＬ）を投与するためにラットを麻酔し；試験５日目から８日目、および１０日目から１３日目まで、Ａ群では直腸を介して１ｍｌのＰＢＳを毎日投与し；試験９日目に、半数のラットを犠牲にし、体重変化および炎症面積を観測および記録した。また、残りの半数のラットは１４日目に犠牲にし、体重変化および炎症面積を観測および記録した。

結果：
１． 炎症指標：本発明では、ＩＢＤの改善を見るための指標として体重変化および平均炎症面積を用いた。
２． 体重変化の傾向は、Ｂ群、Ｃ群およびＤ群が、３日目から１４日目で、ＩＢＤに対して、Ａ群よりも良好な軽減効果を有したことを示した（図４）。特に、１２日目から１４日目では、３つの処置群の全ての体重変化は、Ａ群の場合よりも統計学的有意性が大きかった。また、試験１４日目（Ｄ１４）における炎症の回復率も、対照群よりも３つの処置群で良好であった（図５）。本発明のＨＡ−Ｍ製剤のメサラミン量はＣｏｌａｓａ（登録商標）の規定治療有効用量の４分の１であったので、本発明の結果は、常用量（すなわち、参照薬の通常の投与量）のたった４分の１で、参照薬とほぼ同等の治療効果を達成できることを示した。

Claims (7)

1. 哺乳動物またはヒトにおける粘膜炎症関連障害の治療または予防に使用するための組成物であって、粘膜炎症の処置に好適な薬物と、ヒアルロン酸（ＨＡ）またはＨＡ混合物とを含み、前記薬物はメサラミンまたはその誘導体であり、前記薬物の用量は２５０ｍｇ〜１ｇ／日であり、前記ＨＡ混合物は、低平均分子量ＨＡ（ＬＭＷＨＡ）と高平均分子量ＨＡ（ＨＭＷＨＡ）を含む少なくとも２種類のヒアルロン酸を含み、ＬＭＷＨＡの平均分子量は５万Ｄａ〜１５０万Ｄａの間であり、ＨＭＷＨＡの平均分子量は１５０万Ｄａ〜５００万Ｄａの間であり、ＬＭＷＨＡとＨＭＷＨＡは互いに少なくとも５０万Ｄａ異なり、ＬＭＷＨＡとＨＭＷＨＡの混合重量比は２０：８０〜８０：２０であることを特徴とする、組成物。
2. 前記ＨＡは５万ダルトン〜５００万ダルトンの間の平均分子量（Ｍｗ）であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ＨＡと前記薬物の間に本来の物理的または化学的力を生じさせることにより形成され、前記物理的または化学的力は、前記薬物を収容するためのポリマーまたは球状封入体を形成するためのキレーション、静電気的相互作用または粘着により形成されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
4. 前記粘膜炎症関連障害は胃炎、腸炎、消化性潰瘍、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、腸管の炎症または好酸球性胃腸炎であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
5. 前記粘膜は消化管の粘膜であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
6. 前記組成物を消化管使用のための投与形で調剤するための賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
7. 前記消化管使用のための投与形は固形製剤、灌流、浣腸、坐薬、および懸濁液を含む溶液からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。

Images