JP6035361B2 - Ａｃｅ阻害剤の製造方法、及び、そのａｃｅ阻害剤を含む含有物の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）に対して阻害活性を有するＡＣＥ阻害剤の製造方法、及び、そのＡＣＥ阻害剤を含む含有物の製造方法に関する。

高血圧症有病者は収縮期血圧１４０ｍｍＨｇ以上、または拡張期血圧９０ｍｍＨｇ以上、または血圧を下げる薬を服用している者と定義されている。厚生労働省の平成１８年国民健康・栄養調査結果によると、高血圧症有病者は約３，９７０万人と推定され、４０〜７４歳の人のうち男性は約６割、女性は約４割が高血圧症有病者となっている。しかしながら、高血圧には自覚症状がないため、症状がほとんどないままに動脈硬化や虚血性心疾患（狭心症や心筋梗塞）や脳卒中などを引き起こす恐れがある。

高血圧の原因として、レニン‐アンギオテンシン系は重要な因子であると考えられている。このレニン‐アンギオテンシン系は血液量の保持と、血圧を上げる働きにより血液の循環を正常に保とうとする調節機構である。腎臓では血圧や血中ナトリウム濃度によってレニンを分泌する。レニンは血中のアンギオテンシノーゲンに作用し、アンギオテンシンＩ（ＡＩ）を遊離する。ＡＩは血管内皮細胞膜にあるアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によりアンギオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）に変換される。ＡＩＩは強力な血管収縮作用があり、血圧を上昇させる。さらに、ＡＩＩは副腎にも作用してアルドステロンの生成・分泌を促進させ、血圧を上昇させる。従って、降圧剤ではＡＣＥを阻害し、ＡＩＩの産生を抑えるＡＣＥ阻害薬が用いられている。

ＡＣＥに対する阻害活性を持つペプチドとしては、特許文献１に示される大豆タンパク質、特許文献２に示される卵白アルブミンの加水分解物などからの単離により得られているものがある。他にも特許文献３のように米麹及び米麹水抽出物からＡＣＥ阻害活性を持つペプチドが得られたり、特許文献４のように酒粕や米焼酎粕からＡＣＥ阻害活性を持つペプチドが得られているものがある。

特開平７−７０１８０号公報 特開平５−３３１１９０号公報 特開２００８−２４７８８８号公報 特開２００８−３０８４４５号公報

しかしながら、特許文献１や２のように加水分解を伴うものでは、高価な酵素を使用するとともに、酵素の至適ｐＨに合わせるために有機酸や塩酸を加える必要があるため工程が複雑となるので、製造コストの増大及び製造工程の複雑化を招くことになる。特許文献３のように米麹からＡＣＥ阻害活性を持つペプチドを抽出する場合は、米麹の培養に多くの時間が必要となるため、製造に要する時間が長くなり、製造コストの増大を招くことになる。また、特許文献４では、酒粕や米焼酎粕にセルラーゼを作用させる第１工程、その第１工程により得られる混合物から液体画分を除去する第２工程、さらに、第２工程により得られる固形分に中性プロアーゼや酸性プロアーゼを作用させる第３工程を行っているので、工程数も多く、製造工程が複雑となるだけでなく、製造に要する時間が長くなり、製造コストの増大を招くことになる。また、ＡＣＥ阻害剤を製造するに当たり、セルラーゼ、中性プロアーゼや酸性プロアーゼが必要となる。

この実情に鑑み、本発明の主たる課題は、安価な原料を用い、かつ短時間で製造可能なＡＣＥ阻害剤の製造方法、及び、そのＡＣＥ阻害剤を含む含有物の製造方法を提供する点にある。

本発明の第１特徴構成は、酒粕及び焼酎粕の少なくとも一方に水を加えた混合物を、１０〜５００ＭＰａの圧力条件及び３０〜７０℃の温度条件にて酵素を作用させずに加圧処理を行うことで得られるＡＣＥに対して阻害活性を有するＡＣＥ阻害剤の製造方法である点にある。

本特徴構成によれば、酒粕及び焼酎粕は米酒や焼酎製造時の副次産物であるので、原料を安価に取得できる。酒粕及び焼酎粕の少なくとも一方に水を加えた混合物に加圧処理を施すだけで、ＡＣＥに対して阻害活性を有する有効成分を抽出してＡＣＥ阻害剤を製造できるので、その製造工程が簡易なものとなり、しかも、その製造に要する時間も短くなり、製造コストの低減を図ることができる。また、加圧処理を施すことで、ＡＣＥに対して阻害活性を有する有効成分の抽出だけでなく、殺菌も行うことができる。そして、食品として用いられる酒粕及び焼酎粕のみを原料としているので、得られたＡＣＥ阻害剤をそのまま飲食品として用いることもできる。

本発明の第２特徴構成は、前記加圧処理における温度条件を、５０〜７０℃としている点にある。

本特徴構成によれば、このような温度条件にて加圧処理を行うことで、酒粕及び焼酎粕の少なくとも一方からの収率が高く且つＡＣＥ阻害率も高いＡＣＥ阻害剤を得ることができることを実験にて確認できた。

本発明の第３特徴構成は、前記加圧処理に要する時間条件を、１〜４８時間としている点にある。

本特徴構成によれば、このような時間条件にて加圧処理を行うことで、ＡＣＥに対して阻害活性を有する有効成分の抽出と殺菌をより一層効果的に行うことができる。

本発明の第４特徴構成は、前記加圧処理に要する時間条件を、２〜１６時間としている点にある。

本特徴構成によれば、このような時間条件にて加圧処理を行うことで、酒粕及び焼酎粕の少なくとも一方からの収率が高く且つＡＣＥ阻害率も高いＡＣＥ阻害剤を得ることができることを実験にて確認できた。

本発明の第５特徴構成は、前記加圧処理における圧力条件を、２５Ｍｐａ以上としている点にある。

本特徴構成によれば、このような圧力条件にて加圧処理を行うことで、酒粕及び焼酎粕の少なくとも一方からの収率が高く且つＡＣＥ阻害率も高いＡＣＥ阻害剤を得ることができることを実験にて確認できた。

本発明の第６特徴構成は、上述の第１〜５特徴構成の何れか１つに記載のＡＣＥ阻害剤の製造方法にて製造されるＡＣＥ阻害剤を含む含有物の製造方法である点にある。

本特徴構成によれば、ＡＣＥ阻害剤を含有する含有物とすることで、その含有物を高血圧の予防や改善のための物品、例えば、飲食品として用いることができる。

酒粕水抽出物粉末の各濃度における阻害率を示す表 各濃度の阻害率から作製した阻害曲線を示すグラフ 各処理温度における酒粕水抽出物粉末の収率と阻害率を示すグラフ 各処理圧力における酒粕水抽出物粉末の収率と阻害率を示すグラフ 各処理時間における酒粕水抽出物粉末の収率と阻害率を示すグラフ 酒粕水抽出物粉末に含まれる生菌数を示す表

本発明に係る、ＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）に対して阻害活性を有するＡＣＥ阻害剤の実施形態について説明する。

〔ＡＣＥ阻害剤の製造工程〕
ＡＣＥ阻害剤の製造工程について説明する。本工程では、まず、酒粕及び焼酎粕の少なくも一方に等量から１０倍量の水を加え、それをフィルムなどに封入し、適当な加圧装置による加圧処理を行うことで、ＡＣＥに対して阻害活性を有する有効成分の抽出と殺菌をする。そして、加圧処理後の懸濁液から遠心分離や濾過といった公知の方法で清澄液を抽出し、酒粕水抽出物（この酒粕水抽出物がＡＣＥ阻害剤に相当する）とする。また、必要に応じて酒粕水抽出物を公知の方法で濃縮や粉末化することができる。ちなみに、上述の工程では、酒粕及び焼酎粕の少なくも一方に水を加えた混合物に対して加圧処理を行うようにしているが、酒粕と焼酎粕を適宜配合されたものに水を加えた混合物に対して加圧処理を行うようにしてもよい。また、酒粕や焼酎粕には、熟成させた踏み込み粕や、粉末化したものを用いることも可能である。

このように、酒粕または焼酎粕に水を加えた混合物に対して、加圧処理を施すことにより、ＡＣＥに対して阻害活性を有する有効成分の抽出と酒粕や焼酎粕に内在する酵母や麹などの殺菌を同時に行うことが出来るため、製造工程の単純化が可能である。

本工程における加圧処理において、その圧力条件は好ましくは１０〜５００ＭＰａ、より好ましくは２５Ｍｐａ以上としている。また、加圧する時間条件については好ましくは１〜４８時間、より好ましくは２〜１６時間としている。加圧処理において、温度条件は特に限定されないが、好ましくは０〜８０℃、より好ましくは５０〜７０℃としている。

これらの条件で加圧処理を行うことで、高いＡＣＥ阻害率を持つ酒粕水抽出物を高収率で得られるとともに、一層効果的に殺菌も行うことができる。

加圧処理したものを遠心、濾過などで固形物を除くことで酒粕水抽出物を得る。遠心はバッチ式の遠心又は連続式の遠心など、一般的な遠心分離方法を広く用いることができる。濾過は漏斗と濾紙による通常の濾過、ブフナー漏斗を用いた減圧吸引式の濾過など公知の濾過方法を広く用いることができる。

得られた酒粕水抽出物は、限外濾過などで濃縮することもできるし、凍結乾燥やスプレードライで粉末化することもできる。

〔酒粕水抽出物の調製〕
（実施例１）
酒粕５００ｇに対して純水を１０００ｍＬ加えてフィルムに入れ、シーラーで密閉した。フィルムを高圧装置ＳＨＰ１００−５０Ａ（（株）シナダ）に入れ、６０℃、１００ＭＰａ、１８時間の加圧処理を行った。加圧処理液をマイクロ冷却遠心機（（株）久保田製作所）を用いて５，０００ｇ、５分間の遠心分離をして酒粕水抽出物を得た。酒粕水抽出物はさらに凍結乾燥機（（株）宝製作所）を用いて凍結乾燥し、酒粕水抽出物粉末を１１５ｇ得た。この時、酒粕からの収率は２３％であった。

（比較例１）
酒粕５００ｇに対して純水を７００ｍＬ加えて、懸濁した。懸濁液を実施例１と同様の条件で、遠心分離、凍結乾燥を行い、酒粕水抽出物粉末を５ｇ得た。この時、酒粕からの収率は１％であった。

（比較例２）
酒粕５００ｇに対して純水を７００ｍＬ加えてフィルムに入れ、シーラーで密閉した。フィルムを高圧装置に入れ、５０℃、１００ＭＰａ、８時間４０分の加圧処理を行った。加圧処理液を実施例１と同様の条件で遠心分離、凍結乾燥し、酒粕水抽出物粉末を４５ｇ得た。この時、酒粕からの収率は９％であった。

（比較例３）
酒粕５００ｇに対して純水を７００ｍＬ加えてフィルムに入れ、シーラーで密閉した。フィルムを高圧装置に入れ、５０℃、１００ＭＰａ、１２時間の加圧処理を行った。加圧処理液を実施例１と同様の条件で遠心分離、凍結乾燥し、酒粕水抽出物粉末を６９ｇ得た。この時、酒粕からの収率は１４％であった。

実施例１と比較例１〜３の結果より、加圧処理を施していない比較例１では酒粕水抽出物粉末の収率が１％であるのに対して、加圧処理を施した実施例１、比較例２、３では、酒粕水抽出物粉末の収率が顕著に増加していることが明らかである。加圧処理の温度条件を５０℃とした比較例２、３に対して、温度条件を６０℃とした実施例１では、酒粕水抽出物粉末の収率が増加する傾向が見られる。加圧処理の時間条件についても、８時間４０分とした比較例２に対して、時間条件を１２時間とした比較例３では、酒粕水抽出物粉末の収率が増加する傾向が見られる。

このように、加圧処理を施すことにより、酒粕水抽出物粉末の収率が顕著に増加することが明らかであり、また、加圧処理の温度や時間を増やすことによって、収率が増加する傾向があることが分かる。

〔酒粕水抽出物粉末のＡＣＥ阻害活性測定〕
ＡＣＥ阻害活性の測定には、ＡＣＥ ＫＩＴ ― ＷＳＴ（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いた。実施例１で作製した酒粕水抽出物粉末を５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、１．６μｇ／ｍＬ、０．３２μｇ／ｍＬに調製した。各濃度の酒粕水抽出物粉末をキットの各溶液と混和し、４５０ｎｍの吸収波長の差をポジティブコントロール及びネガティブコントロールと比較した。吸収波長の測定には、ＭＴＰ―３１０ Ｌａｂ吸光マイクロプレートリーダ（コロナ電気（株））を用いた。阻害率は（ポジティブコントロール‐サンプルの吸光度）／（ポジティブコントロール‐ネガティブコントロール）×１００で算出した。また、各濃度の阻害率から阻害曲線を作製し、その近似式から算出した阻害率が５０％となる酒粕水抽出物濃度を求めた。反応時のサンプルの終濃度は、調整時のサンプル濃度の１／３であるので、阻害曲線から求めた濃度の１／３をＩＣ５０とした。

図１には、酒粕水抽出物粉末の各濃度における阻害率を示している。この図１から、酒粕水抽出物粉末では、ＡＣＥ阻害活性が確認されたため、高いＡＣＥ阻害活性を有すると考えられる。

各濃度の阻害率から作製した阻害曲線を図２に示している。図２の阻害曲線の近似式から、５０％阻害率を示すサンプル濃度は１７９μｇ／ｍＬと算出された。ＩＣ５０は阻害曲線から求めた濃度の１／３であるため、酒粕水抽出物粉末のＩＣ５０は５９．７μｇ／ｍＬとなる。

〔酒粕水抽出物作製における加圧処理での最適条件の検討〕
清酒粕を凍結乾燥し、粉末化することで得た清酒粕末を用いた実験により、酒粕水抽出物を作製する際の加圧処理における最適な条件を検討したので、以下、これらの各条件の検討について説明する。

〔最適な温度条件の検討〕
（実施例２）
清酒粕末２００ｇに純水１０００ｍＬを加えてフィルムに入れ、シーラーで密閉した。フィルムを高圧装置に入れ、圧力条件を１００ＭＰａとし且つ時間条件を４時間として圧力条件と時間条件を一定条件とした上で、温度条件（処理温度）を３０〜７０℃に変化させて加圧処理を行った。加圧処理液を実施例１と同様の条件で遠心分離、凍結乾燥し、酒粕水抽出物粉末を作製した。各処理温度で得られた酒粕水抽出物粉末はＡＣＥ ＫＩＴ ― ＷＳＴを用いて、２５０μｇ／ｍＬでの阻害率を測定した。

この実施例２における各処理温度での酒粕水抽出物粉末収率と２５０μｇ／ｍＬにおけるＡＣＥ阻害率を図３に示す。処理温度を上昇させると、その処理温度に依存して粉末の収率は上昇した。一方で、ＡＣＥ阻害活性（ＡＣＥ阻害率）に関しては、処理温度が５０℃から上昇し、処理温度が６０℃で最も高くなり、処理温度が６０℃のときに他の温度よりＡＣＥ阻害活性（ＡＣＥ阻害率）が有意に高くなる（Ｐ＜０．０５）。

加圧処理における温度条件としては、０〜８０℃が好ましいが、図３の実験結果から、５０〜７０℃が最適な条件と考えられ、この最適な温度条件にて加圧処理を行うことで、収率が高く且つＡＣＥ阻害率も高い酒粕水抽出物粉末（ＡＣＥ阻害剤）を得ることができ、しかも、殺菌も効果的に行うことができる。

〔最適な圧力条件の検討〕
（実施例３）
清酒粕末２００ｇに純水１０００ｍＬを加えてフィルムに入れ、シーラーで密閉した。フィルムを高圧装置に入れ、温度条件を６０℃とし且つ時間条件を４時間として温度条件と時間条件を一定条件とした上で、圧力条件（処理圧力）を常圧〜１００ＭＰａに変化させて加圧処理を行った。加圧処理液を実施例１と同様の条件で遠心分離、凍結乾燥し、酒粕水抽出物粉末を作製した。各処理圧力で得られた酒粕水抽出物粉末はＡＣＥ ＫＩＴ ― ＷＳＴを用いて、２５０μｇ／ｍＬでの阻害率を測定した。

この実施例３における各処理圧力での酒粕水抽出物粉末収率と２５０μｇ／ｍＬにおけるＡＣＥ阻害率を図４に示す。収率に関しては、７５ＭＰａまで上昇する傾向にあったが、常圧〜１００ＭＰａの範囲ではいずれも有意な差はなかった。ＡＣＥ阻害活性に関しては、２５ＭＰａにおいて常圧のものよりＡＣＥ阻害活性（ＡＣＥ阻害率）が有意に高くなり（Ｐ＜０．０５）、１００ＭＰａで最大となった。

加圧処理における圧力条件としては、１０〜５００ＭＰａが好ましいが、図４の実験結果から、２５ＭＰａ以上が最適な条件と考えられ、この最適な圧力条件にて加圧処理を行うことで、収率が高く且つＡＣＥ阻害率も高い酒粕水抽出物粉末（ＡＣＥ阻害剤）を得ることができる。

〔最適な時間条件の検討〕
（実施例４）
清酒粕末２００ｇに純水１０００ｍＬを加えてフィルムに入れ、シーラーで密閉した。
フィルムを高圧装置に入れ、温度条件を６０℃とし且つ圧力条件を１００ＭＰａとして温度条件と圧力条件を一定条件とした上で、時間条件（処理時間）を０．５〜１６時間に変化させて加圧処理を行った。加圧処理液を実施例１と同様の条件で遠心分離、凍結乾燥し、酒粕水抽出物粉末を作製した。各圧力で得られた酒粕水抽出物粉末はＡＣＥ ＫＩＴ ― ＷＳＴを用いて、２５０μｇ／ｍＬでの阻害率を測定した。

この実施例４における各処理時間での酒粕水抽出物粉末収率と２５０μｇ／ｍＬにおけるＡＣＥ阻害率を図５に示す。収率に関しては、１６時間まで上昇する傾向にあったが、８時間以上では有意な上昇はなかった。ＡＣＥ阻害活性（ＡＣＥ阻害率）に関しては、２時間から上昇し、４時間以上で略一定となり、２時間未満とは有意な差が見られた（Ｐ＜０．０５）。

加圧処理における時間条件としては、１〜４８時間が好ましいが、図５の実験結果から、２〜１６時間が最適な条件と考えられ、この最適な時間条件にて加圧処理を行うことで、収率が高く且つＡＣＥ阻害率も高い酒粕水抽出物粉末（ＡＣＥ阻害剤）を得ることができる。

（比較例４）
比較例１に用いた清酒粕末の２５０μｇ／ｍＬにおけるＡＣＥ阻害率をＡＣＥ ＫＩＴ ― ＷＳＴを用いて求めた。このときの阻害率は４２％であった。

上述の如く、図３〜図５に示すように、実施例２〜４の実験結果から、ＡＣＥ阻害に対して最適な酒粕水抽出物粉末を得るための加圧処理の各条件は、温度条件を６０℃とし、圧力条件を１００ＭＰａとし、時間条件を４時間とする条件が最適であることが明らかとなった。この条件で加圧処理を行うことで作製された酒粕水抽出物粉末の２５０μｇ／ｍＬにおけるＡＣＥ阻害率は約８０％である。よって、比較例４で求めた加圧処理を行っていない清酒粕末のＡＣＥ阻害率（４２％）と比較すると非常に高い効果があると考えられる。さらに、収率を向上させるためには、温度条件を６０℃とし、圧力条件を１００ＭＰａとし、時間条件を８時間以上として加圧処理を行うことが好ましいと考えられる。

〔酒粕水抽出物粉末の生菌数測定〕
生菌数検査には、比較例３で作製した酒粕水抽出物粉末を用いた。一般細菌数検査については、滅菌水で希釈した粉末溶液１ｍＬを３ＭペトリフィルムＡＣプレート（住友スリーエム（株））に塗布し、プレートを３５℃にセットしたインキュベーターで４８時間培養後、コロニー数を計測することにより行った。大腸菌数検査については、滅菌水で希釈した粉末溶液１ｍＬを３ＭペトリフィルムＲＣＣプレート（住友スリーエム（株））に塗布し、プレートを３５℃にセットしたインキュベーターで２４時間培養後、コロニー数を計測することにより行った。カビ・酵母数検査については、滅菌水で希釈した粉末溶液１ｍＬを３ＭペトリフィルムＹＭプレート（住友スリーエム（株））に塗布し、プレートを２５℃にセットしたインキュベーターで５日間培養後、コロニー数を計測することにより行った。

図６は酒粕水抽出物粉末に含まれる生菌数を表している。酒粕水抽出物粉末では大腸菌やカビ・酵母は検出されなかった。一般細菌は検出されたものの数は少なく、食品として用いる場合には問題はないと考えられる。また、カビと酵母が検出されなかったことから、変色や変質の恐れがなく、保存性が向上したと考えられる。

上述の如く、酒粕及び焼酎粕の少なくとも一方に水を加えた混合物を１０〜５００ＭＰａの圧力条件にて加圧処理を行うことで得られる酒粕水抽出物は、ＡＣＥに対して阻害活性を有するＡＣＥ阻害剤であることが言える。しかも、加圧処理を行うことで、ＡＣＥに対して阻害活性を有する有効成分の抽出を効果的に行うことができるとともに、酒粕水抽出物の殺菌も同時に行うことができる。

このような酒粕水抽出物（ＡＣＥ阻害剤）を含有する含有物を高血圧の予防や改善のための飲食品として用いることができる。例えば、粕水抽出物（ＡＣＥ阻害剤）を含有する栄養補助食品、すなわちサプリメントとして用いたり、酒粕水抽出物粉末（ＡＣＥ阻害剤）を各種の飲料に溶かした飲料として用いることができる。

本発明は、安価な原料を用い、かつ短時間で製造可能な各種のＡＣＥ阻害剤、及び、そのＡＣＥ阻害剤を含む各種の含有物に適応可能である。

Claims (6)

1. 酒粕及び焼酎粕の少なくとも一方に水を加えた混合物を、１０〜５００ＭＰａの圧力条件及び３０〜７０℃の温度条件にて酵素を作用させずに加圧処理を行うことで得られるＡＣＥに対して阻害活性を有するＡＣＥ阻害剤の製造方法。
2. 前記加圧処理における温度条件を、５０〜７０℃としている請求項１に記載のＡＣＥ阻害剤の製造方法。
3. 前記加圧処理に要する時間条件を、１〜４８時間としている請求項１又は２に記載のＡＣＥ阻害剤の製造方法。
4. 前記加圧処理に要する時間条件を、２〜１６時間としている請求項３に記載のＡＣＥ阻害剤の製造方法。
5. 前記加圧処理における圧力条件を、２５Ｍｐａ以上としている請求項１〜４の何れか１項に記載のＡＣＥ阻害剤の製造方法。
6. 請求項１〜５の何れか１項に記載のＡＣＥ阻害剤の製造方法にて製造されるＡＣＥ阻害剤を含む含有物の製造方法。

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