JP6027215B2 - セリアック病の処置のための組成物および方法 - Google Patents

セリアック病の処置のための組成物および方法 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、グルテンに感受性である対象、特に、セリアック病およびその診断を有する対象の処置のための組成物および方法、ならびにそれらにおける使用ためのアッセイおよびキットに関する。
発明の背景
小児脂肪便症（coeliac disease）またはセリアックスプルー（celiac sprue、coeliac sprue）としても知られるセリアック病（celiac disease）は、欧州および北米において人口の約１％が罹患する。罹患している人々の多くにおいて、セリアック病は認識されないが、この臨床における看過は、現在、臨床におけるより高い認知により修正されてきている。グルテンフリー食は、現行での唯一のセリアック病のための処置であり、わずか５０ｍｇのグルテン（標準的なパン１スライスの１／１００に相当する）の通常の消化が小腸にダメージを与えるので、小腸の慢性炎症は、グルテンフリー食を摂取する対象において一般的である。小腸の持続的な炎症は、癌、骨粗鬆症および死亡のリスクを増大することが示されている。グルテンは、余りにも広範に、例えば、市販のスープ、ソース、アイスクリームなどにおいて用いられているため、グルテンフリー食を維持することは困難である。
セリアック病は、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０５およびＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２によりコードされるＨＬＡ−ＤＱ２（個体の約９０％を占める）、ＨＬＡ−ＤＱ２の変異体、またはＨＬＡ−ＤＱ８のいずれかを保有する、遺伝的に感受性な個体において発症する。かかる個体は、小麦粉の非水溶性タンパク質、グルテン、ならびにライムギおよびオオムギ中の関連タンパク質から誘導されるペプチドに対して、不適切なＨＬＡ−ＤＱ２および／またはＤＱ８に限定されたＣＤ４＋Ｔ細胞に媒介される免疫応答を惹起する。
全てのグルテンタンパク質はセリアック病において毒性であると考えられている。２００６年に、NCBIの公共データベースであるGenbankは、製パン用コムギ（Triticum aestivum）、オオムギ（Hordein vulgare）およびライムギ（Secale cerale）からのグルテンタンパク質に関する３４５のエントリーを含めた。
小腸Ｔ細胞クローンの既知のエピトープのホモログについて、または、組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）により優先的に脱アミド化されるモチーフおよび／またはタンパク質分解に対して耐性の配列を有し、in vitroでHLA−DQ2に結合すると予測されるか、それが証明されているグルテン配列についての検索に基づいて、予測的アプローチにより、数百の区別し得る推定「毒性」のグルテンペプチドの目録が作成された。
信頼すべき概説は、セリアック病に関するグルテン中に５０程度の「免疫優性」Ｔ細胞エピトープが存在することを報告する。しかし、ホルデインまたはオオムギに対して産生されたＴ細胞は、未だ研究されておらず、高分子量（HMW）グルテニンから誘導されるHLA−DQ2に限定されるＴ細胞エピトープもまだ定義されていない。
セリアック病において原因とみなされる多数のグルテンペプチドにも拘らず、ｔＴＧにより脱アミド化された、プロテアーゼ耐性α−グリアジン３３merのＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（配列番号１；α２−グリアジン５６−８８）：ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（配列番号２）は、ＨＬＡ−ＤＱ２に関連するセリアック病において、（プロテアーゼ耐性グルテンに対して産生された腸Ｔ細胞株についての）最適な刺激ペプチドとして広く認められている。配列番号１中のおよび本開示を通してのＱ残基の下線は、ｔＴＧにより触媒される脱アミド化を受ける、またはｔＴＧにより触媒される脱アミド化に対する感受性を予測するアミノ酸モチーフ、すなわちＱ−−＞Ｅと一致する、グルタミン残基を示す。
このα−グリアジン３３merの（配列番号１；α２−グリアジン５６−８８）は、組み換えα２−グリアジンの消化物（digestate）から回収され、これは、小腸Ｔ細胞のクローンおよび株、ならびにセリアック病に罹患したＨＬＡ−ＤＱ２＋ドナーからのin vivoでのグルテンチャレンジの後での新鮮な末梢血Ｔ細胞を用いて先に同定された、複数の重複するエピトープを組み込む。これらのエピトープは、ＤＱ２−α−Ｉ：ＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（配列番号３）；ＤＱ２−α−ＩＩ：ＰＱＰＥＬＰＹＰＱ（配列番号４）；およびＤＱ２−α−ＩＩＩ：ＰＹＰＱＰＥＬＰＹ（配列番号５）を含む。実際、ＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病患者におけるin vivoでのグルテンチャレンジは、ＮおよびＣ末端の両方において３つのさらなる残基により挟まれた場合に生理活性が最適となるα−グリアジンタンパク質配列中の単一の１１merの配列であるｐ６０−７０ ＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱ（配列番号６）、α−グリアジンｐ５７−７３ ＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号７）、ならびに、ＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）およびＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）を含む、ｔＴＧにより脱アミド化されＱ６５がグルタミン酸で置換されたα−グリアジンｐ５７−７３ ＱＥ６５ ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号８）に対して特異的である末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導する。しかし、何百ものコムギ、ライムギおよびオオムギグルテンタンパク質が存在し、ＤＱ２−α−Ｉ、ＤＱ２−α−ＩＩおよびＤＱ２−α−ＩＩＩのエピトープは、一緒にしても、典型的には、ＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病におけるグルテンの毒性のＴ細胞刺激特性の半分しか占めない。セリアック病に関する追加のエピトープは、WO 01/25793、WO 03/104273およびWO 05/105129において開示される。
Ｔ細胞は、コムギグルテンに密接に関連したタンパク質であるオオムギホルデインまたはライムギセカリン（secalin）に対して産生されたものではないが、オオムギおよびライムギの毒性は、ｔＴＧにより脱アミド化された関連するホルデインおよびセカリンの配列、特に、それぞれ脱アミド化されてＨα９／Ｓα９ ＰＦＰＱＰＥＱＰＦ（配列番号１０；ＤＱ２−ω−Ｉ）となるＰＦＰＱＰＱＱＰＦ（配列番号９）または脱アミド化されてＨα２／Ｓα２ ＰＱＰＥＱＰＦＰＱ（配列番号１２）となるＰＱＰＱＱＰＦＰＱ（配列番号１１）と交差反応性である、コムギグルテン中のエピトープ、特にＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）またはＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）に対して特異的なＴ細胞に帰する。
当該分野における権威の間で、セリアック病においてＴ細胞刺激を誘導する上で、特定のペプチドの優位性、階層および重複性に関して、不一致が存在する。
特定のペプチドの、グルテンのＴ細胞刺激能力に対する一貫性および相対的寄与を理解することは、有用である。それらが一貫してグルテンに対するＴ細胞応答の実質的な割合の原因となるのであれば、優性なＴ細胞刺激性ペプチドは、単独で、または集合的に、抗原特異的治療および診断の開発を可能とする可能性がある。
原理的に、抗原特異的治療は、自己免疫性およびアレルギー性疾患を処置するための魅力的な戦略である。脱感作への全タンパク質に基づくアプローチは、ヒトのアレルギー状態、また、自己免疫および実験動物モデルにおける同種移植片拒絶の処置および予防について有効である。しかし、タンパク質に基づく抗原特異的治療のより広範な適用は、小さくても認識されるアナフィラキシーのリスクにより、および関連する抗原が医薬として好適でない場合があるか、または単に医薬の開発を許容するために十分なほど詳細に理解されていないため、限定されてきた。
病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞により認識される疾患に関連する抗原からの配列を含む短い直鎖状の水溶性ペプチドを用いて、アナフィラキシーのリスクを最少化することができ、製剤の問題を解決することができる。ペプチドに基づく治療用ワクチンは、関連する免疫優性エピトープおよびそれらのコグネイト（cognate）ＣＤ４＋Ｔ細胞が定義されている自己免疫および同種移植片拒絶の近交系マウスモデルにおいて有効である。しかし、ＨＬＡに強く関連するヒト免疫疾患についてすら、薬物の設計および医薬の開発を支持するための十分な信頼性がある病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの同定は、非常に限定されてきた。
多くの場合において、不明確性は、患者において報告されるＴ細胞の応答が、検出の限界上にあり、通常、一次的なまたはリコールのＴ細胞応答であるin vitroでの増殖（expansion）に依存し、しばしば健康なＨＬＡ適合個体においても見出され得るという事実に起因する。これらの技術的挑戦は、治療用ワクチンのためのペプチドの選択は、免疫優性の病原性Ｔ細胞に対するエピトープとしてのそれらの明白な定義ではなく、疾患に関連するＨＬＡ分子に対するin vitroでの結合アフィニティーに基づく傾向があるという妥協をもたらした。さらなる結果は、この様式において設計されたペプチドに基づく化合物は、ペプチドの大規模なカクテルを含む傾向があることである。カクテルが大きい程、製剤化、安定性および有害効果における困難性の可能性が高くなるが、カクテル中のペプチドに対して特異的なＴ細胞もまた、患者における病原性Ｔ細胞に対して一貫して実質的な寄与を行う可能性も高い。
多数の毒性のグルテンペプチドを考慮して、本発明者らは、グルテンに対する個体の免疫応答を調節することが可能な、ペプチドに基づく免疫治療における使用のための最小混合物を選択することができる、最適な非重複性の免疫優性ペプチドのセットを同定することを目指した。本発明者らは、グルテンに対する病原性Ｔ細胞応答を特異的に調節することによりセリアック病の処置において有用な免疫優性ペプチドを同定することを目指し、したがって、セリアック病に対して有効なワクチンを提供することを目指した。同じペプチド混合物はまた、セリアック病における診断および免疫調節治療をモニタリングすることにおいても有用である。
発明の要旨
本発明者らは、免疫治療における剤またはワクチンとして、３または４以上のグルテンペプチドに対するＴ細胞応答を調節するために、およびグルテンに対する耐性をもたらすために、一緒にして用いることができる３つの優性なＴ細胞刺激性ペプチドを同定して、セリアック病の処置を可能にした。したがって、本発明は、一側面において、
ｉ） アミノ酸配列ＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱ（配列番号１３）またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体を含む、第１のペプチド、
ｉｉ） アミノ酸配列ＱＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱＰ（配列番号１４）またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体を含む、第２のペプチド、および
ｉｉｉ） アミノ酸配列ＰＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱＱ（配列番号１６）またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体を含む、第３のペプチド
含む剤を提供する。
配列番号１３（ＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱ）は、２つの重なるエピトープＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（配列番号３）およびＰＱＰＥＬＰＹＰＱ（配列番号４）を含み、配列番号１４（ＱＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱＰ）は、２つの重なるエピトープＰＦＰＱＰＥＱＰＦ（配列番号１０）およびＰＱＰＥＱＰＦＰＷ（配列番号１５；ＤＱ２−ω−ＩＩ）を含み、配列番号１６（ＰＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱＱ）は、エピトープＰＩＰＥＱＰＱＰＹ（配列番号１７；ＤＱ２−Ｈｏｒ−Ｉ）およびまたＱＱＰＩＰＥＱＰＱ（配列番号１９）と交換可能な予測されるエピトープＥＱＰＩＰＥＱＰＱ（配列番号１８）を含む。
一態様において、第１、第２および／または第３のペプチドは、Ｎ末端のアセチル基もしくはピログルタミン酸基および／またはＣ末端のアミド基を含む。より好ましくは、第１、第２および／または第３のペプチドは、Ｎ末端のピログルタミン酸基およびＣ末端のアミド基を含む。
さらなる態様において、第１、第２および／または第３のペプチドは、化合物に抱合している。好適な化合物の例として、限定されないが、アジュバント、ＭＨＣ分子またはその結合断片が挙げられる。
好ましい態様において、各々のペプチドは、別々の分子として提供される。しかし、代替的態様において、第１、第２および第３のペプチドまたは１もしくは２以上のその生物学的に活性な断片もしくは変異体のうちの２または３は、単一のポリペプチド鎖上にある。
さらなる態様において、剤は、配列番号４７、４８、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８９、９０、９１、９２、９５、１０２、１０３、１０４、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３６、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７７、１７８、１７９、１８０、１８３、１８４、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、２０９、２１０からなる群より選択されるアミノ酸配列または任意の１もしくは２以上のその生物学的に活性な断片もしくは変異体を含む、１または２以上の追加のペプチドを含む。
追加のペプチドは、より広範に有効な処置群およびより幅広い処置または診断を可能にする。特に、追加のペプチドの使用により、剤がグルテン消化に対する応答における炎症または損傷を回避し得る可能性を増大させ、セリアック病の対象が正常な食事を摂ることを可能にする。さらに、剤が診断薬として用いられる場合、より多くの標的を有することは有利であり、これは、配列番号４７、４８、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８９、９０、９１、９２、９５、１０２、１０３、１０４、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３６、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７７、１７８、１７９、１８０、１８３、１８４、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、２０９、２１０のリストからの、脱アミド化または野生型の形態であり得るより多くのペプチドを提供することにより達成される。
別の側面において、本発明は、
ｉ） アミノ酸配列ＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱ（配列番号１３）またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体を含む、第１のペプチド、
ｉｉ） アミノ酸配列ＱＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱＰ（配列番号１４）またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体を含む、第２のペプチド
ｉｉｉ） アミノ酸配列ＰＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱＱ（配列番号１６）またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体を含む、第３のペプチド、および
ｉｖ） 随意に、配列番号４７、４８、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８９、９０、９１、９２、９５、１０２、１０３、１０４、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３６、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７７、１７８、１７９、１８０、１８３、１８４、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、２０９、２１０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または任意の１もしくは２以上のその生物学的に活性な断片もしくは変異体を含む、１または２以上の追加のペプチド
をコードする１または２以上のポリヌクレオチドを含む剤を提供する。
１または２以上のペプチドまたはその生物学的に活性な断片もしくは変異体は、１または２以上のポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。したがって、１または２以上のペプチドまたはその生物学的に活性な断片もしくは変異体の少なくとも一部は、単一のポリペプチド鎖として、単一のポリヌクレオチドから転写および翻訳されてもよい。
剤はまた、ペプチドとポリヌクレオチドとの混合物であってもよい。したがって、本発明のさらなる側面において、
ｉ） 本明細書において定義される第１のペプチドまたはそのためのポリヌクレオチド、
ｉｉ） 本明細書において定義される第２のペプチドまたはそのためのポリヌクレオチド、および
ｉｉｉ） 本明細書において定義される第３のペプチドまたはそのためのポリヌクレオチド
を含む剤を提供する。当業者が理解する通り、ペプチドの１または２以上は、定義されたペプチド配列の生物学的に活性な断片もしくは変異体であってもよい。
別の側面において、本発明は、配列番号１６、６９、７３、７５、７８、８０、８７、９１、９２、９５、９６、９８、１００、１０４、１０７、１１３、１１６、１１７、１２３、１３８、１４４、１４７、１４９、１５３、１５５、１５６、１５９、１６１、１６３、１６５、１７９、１８１、１８５、１８７、１８９、１９５、１９６、１９８、２０２、２０４、２０５、２０７、２０９、２１５もしくは２２３の任意の１または２以上において示されるアミノ酸配列、またはさらに１つまたはより多くのそれら任意の生物学的に活性な断片もしくは変異体を含むか、好ましくはこれらからなる、実質的に精製された、および／または組み換えのペプチドを提供する。この側面の好ましい態様において、ペプチドは１９アミノ酸以下の長さである。
上記側面のさらなる好ましい態様において、ペプチドは、アミノ酸配列ＰＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱＱ（配列番号１６）、またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体を含む。
さらなる側面において提供されるのは、少なくとも１つの本発明のペプチドをコードする単離された、および／または外因性ポリヌクレオチドである。
さらなる側面において提供されるのは、本発明の剤、本発明のペプチドおよび／または本発明のポリヌクレオチドならびに薬学的に受容可能なキャリアを含むワクチンである。
一態様において、ワクチンはアジュバントを含む。
別の側面において提供されるのは、本発明の剤、本発明のペプチドおよび／または本発明のポリヌクレオチドを含む、単離された抗原提示細胞である。本発明のために有用な抗原提示細胞の例として、限定されないが、樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球または肝類洞内皮細胞が挙げられる。好ましい態様において、抗原提示細胞は樹状細胞である。
一側面において提供されるのは、グルテンに感受性である対象においてグルテンペプチドに対するＴ細胞応答を調節する方法であって、該方法は、本発明の剤、本発明のペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のワクチンおよび／または本発明の抗原提示細胞の有効量を対象に投与することを含む。
別の側面において提供されるのは、グルテンに感受性である対象においてグルテンペプチドに対する免疫寛容を誘導する方法であって、該方法は、本発明の剤、本発明のペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のワクチンおよび／または本発明の抗原提示細胞の有効量を対象に投与することを含む。
さらなる側面において提供されるのは、セリアック病を処置する方法であって、該方法は、本発明の剤、本発明のペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のワクチンおよび／または本発明の抗原提示細胞の有効量をグルテンに感受性である対象に投与することを含む。
さらなる態様においてなお提供されるのは、グルテンに感受性である対象においてサイトカイン分泌を改変する方法であって、該方法は、本発明の剤、本発明のペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のワクチンおよび／または本発明の抗原提示細胞の有効量を対象に投与することを含む。
一態様において、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の分泌が低下する。別の態様において、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の分泌が増大する。
また提供されるのは、グルテンに感受性である対象においてＴ細胞応答を調節する、免疫寛容を誘導する、セリアック病を処置する、および／またはサイトカイン分泌を改変するための、本発明の剤、本発明のペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のワクチンおよび／または本発明の抗原提示細胞の使用である。
さらなる側面において、本発明は、対象においてセリアック病を診断するための方法を提供し、該方法は、対象からの試料と、本発明の剤、本発明のペプチドおよび／または本発明のワクチンとを接触させること、および、本明細書において定義されるペプチドの１または２以上が前記試料中のＴ細胞に結合するか否かをin vitroで決定すること、ここでＴ細胞への前記ペプチドの１または２以上の結合は前記対象がセリアック病を有するかまたはセリアック病に対して感受性であることを示す、を含む。
また提供されるのは、セリアック病の進行をモニタリングするため、および／またはグルテンに感受性である対象に対する本発明の剤、本発明のペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のワクチンおよび／または本発明の抗原提示細胞の有効量の投与を含む方法の効力を決定するための、上記診断方法の使用である。
別の側面において、本発明は、上気診断方法を行うためのキットを提供し、該キットは、本発明の剤、本発明のペプチドおよび／または本発明のワクチン、およびペプチドの１または２以上のＴ細胞への結合を検出するための手段を含む。キットはまた、使用のための説明を含んでもよい。キットはまた、Ｔ細胞による剤の認識を検出するための手段を含んでもよい。
さらなる側面において、本発明は、本発明の抗原提示細胞を産生するための方法を提供し、該方法は、
ｉ） 抗原提示細胞を得ること、および
ｉｉ） 前記細胞を、本発明の剤、本発明のペプチド、本発明のポリヌクレオチドおよび／または本発明のワクチンとin vitroで接触させること
を含む。
また提供されるのは、本発明の剤、本発明のペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のワクチンおよび／または本発明の抗原提示細胞の、診断または治療における使用である。
別の側面において、本発明は、本発明のワクチンを作製する方法を提供し、該方法は、第１、第２および第３のペプチド、ならびに随意に配列番号４７、４８、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８９、９０、９１、９２、９５、１０２、１０３、１０４、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３６、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７７、１７８、１７９、１８０、１８３、１８４、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、２０９、２１０からなる群より選択される１もしくは２以上の追加のペプチド、または任意の１もしくは２以上のその生物学的に活性な断片もしくは変異体を、薬学的に受容可能なキャリアおよび随意にアジュバントと組み合わせることを含む。
別の側面において、本発明は、組成物または食品が、セリアック病を引き起こす可能性があるか否かを決定する方法を提供し、該方法は、組成物または食品の試料中の本発明の剤、本発明のペプチドおよび／または本発明のポリヌクレオチドの存在を検出することを含む。
さらなる側面において、本発明は、本明細書において定義されるペプチドを切断できるプロテアーゼを同定する方法を提供し、該方法は、ペプチドとプロテアーゼとを、前記ペプチドの特定の切断をもたらしタンパク質分解生成物を生成させる条件下において接触させること、および生成されたタンパク質分解生成物を検出することを含む。
別の側面において提供されるのは、対象に投与された場合のペプチドの半減期および／またはバイオアベイラビリティを改善するための方法であって、該方法は、ペプチドのＮ末端をＮ末端アセチルまたはピログルタミン酸を含むように改変すること、およびペプチドのＣ末端をＣ末端アミドを含むように改変することを含む。
一態様において、ペプチドは、免疫寛容を誘導するために対象に投与されるためのものである。
明らかであるように、本発明の一側面の好ましい性質および特徴は、本発明の多数の他の側面に適用することができる。
明細書全体を通して、用語「含む（comprise）」または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」などのバリエーションは、記述された要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群が含まれることを意味するが、任意の他の要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群が除外されることを意味するものではない。
本発明は、本明細書において以下の非限定的な例により、および添付の図面を参照して、説明される。
図１は、ＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病ドナーがコムギチャレンジを開始した後の第６日に回収されたＰＢＭＣにおいて、IFNγELISpotにより検出された、α−グリアジン５７−７３およびα−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（それぞれ配列番号７および８）の多型に対する、グルテンペプチド特異的Ｔ細胞の相対的頻度を示す。
図２は、多様なＴ細胞エピトープ（配列番号２、４６、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４４）に対する末梢血Ｔ細胞のIFNγELISpot応答を示す。 図３は、ＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病ドナーがコムギ、ライムギまたはオオムギのチャレンジを開始した後の第６日に採取されたＰＢＭＣにおいてIFNγELISpotにより検出されたグルテンペプチド特異的Ｔ細胞の頻度が、応答の明確な階層を明らかにすることを表わす。
図４は、コムギのチャンレンジ後の血中のＴ細胞がグルテンペプチドの高度に一貫性を有する階層に応答したことを示す。 図５は、免疫優性ω−グリアジンペプチド、ＰＱＱＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰＷＱＰ（配列番号５２）の詳細なマッピングを示す。 図６は、包括的ペプチドライブラリー中のペプチドの明確な階層を示す。
図７は、コムギ、オオムギまたはライムギグルテンのチャレンジ後に、Ｔ細胞刺激性ペプチドとして証明されたペプチドの配列、その階層、優位性、および最も活性が高いペプチドに対して産生されたＴ細胞クローンによる認識を示す。 図７は、コムギ、オオムギまたはライムギグルテンのチャレンジ後に、Ｔ細胞刺激性ペプチドとして証明されたペプチドの配列、その階層、優位性、および、最も活性が高いペプチドに対して産生されたＴ細胞クローンによる認識を示す。 図７は、コムギ、オオムギまたはライムギグルテンのチャレンジ後に、Ｔ細胞刺激性ペプチドとして証明されたペプチドの配列、その階層、優位性、および、最も活性が高いペプチドに対して産生されたＴ細胞クローンによる認識を示す。
図８は、Ｔ細胞刺激性ペプチドの階層がセリアック病のドナーがコムギ、オオムギまたはライムギのチャレンジを経験したか否かによって異なることを示す。 図９は、優性なＴ細胞刺激性グルテンペプチドの特定の混合物が、グルテン含有穀物によるin vivoでのチャレンジの後で採取した血液において、実質的により多くの数のＴ細胞を活性化することを示す。
図１０は、NPL001（配列番号２２８）、NPL002（配列番号２２９）およびNPL003（配列番号２３０）（NexVax2）の組み合わせが、腸（腸管膜リンパ節、ＭＬＮ）ならびに脾臓および局所排出性の膝窩リンパ節（ＰＬＮ）において、後肢への皮下投与の後で、NPL001（配列番号２２８）に対して特異的なＴ細胞を活性化することを示す。NPL001特異的Ｔ細胞の増殖は、ペプチドが後肢に送達されているにもかかわらず、３か所の解剖学的部位において極めて類似している。Ｔ細胞の増殖は、用量依存的である。
図１１は、NexVax2（配列番号２２８、２２９および２３０）の繰り返し投与が、脾臓におけるグリアジン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合（Ａ）および数（Ｂ）の減少をもたらすことを示す。
図１２は、NexVax2の繰り返し投与がTreg細胞の誘導をもたらすことを示す。 図１２は、NexVax2の繰り返し投与がTreg細胞の誘導をもたらすことを示す。
図１３は、NexVax2（配列番号２２８、２２９および２３０）の繰り返し投与が、ＩＦＮγおよびＩＬ−１０産生細胞の割合の増大を直接的にex-vivoでもたらすことを示す。 図１４は、グリアジン特異的Ｔ細胞のコグネイト抗原に対する増殖能力が、NexVax2（配列番号２２８、２２９および２３０）の繰り返し投与の後で減少し、ＩＬ−２の存在下において回復することを示す。
図１５は、NexVax2（配列番号２２８、２２９および２３０）により処置されたマウスからのＴ細胞が未処置のグリアジン特異的Ｔ細胞の増殖を抑制可能であることを示す。 図１６は、in vitroでのサイトカイン産生を示す。 図１７は、ワクチン接種プロトコルの投与、食事および採血のためのスケジュールである。
発明の詳細な説明
一般的な技術および定義
他に具体的に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学および生化学における）により一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとして理解されるべきである。
他に示されない限り、本発明において利用される組み換えタンパク質、細胞培養および免疫学の技術は、標準的な手法であり、当業者に周知である。かかる技術は、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons（1984）；J. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press（1989）；T.A. Brown（編）、Essential Molecular Biology: A Practical Approach、第１巻および第２巻、IRL Press（1991）；D.M. Glover and B.D. Hames（編）、DNA Cloning: A Practical Approach、第１~４巻、IRL Press（1995年および1996年）；F.M. Ausubelら（編）、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley−Interscience（1988年、現在までの全てのアップデートを含む）；Ed HarlowおよびDavid Lane（編）、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory,（1988）；ならびにJ.E. Coliganら（編）、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons（現在までの全てのアップデートを含む）などのソースにおける文献を通して記載され説明される。
本明細書において用いられる場合、単数の形態「a」、「an」および「the」は、文脈が他に明確に示さない限り、複数の側面を含む。したがって、例えば、「a peptide」は、単数のペプチド、ならびに２または３以上のペプチドなどを含む。さらに、抗原提示細胞とは、通常、かかる細胞の集団として提供される。
用語「セリアック病」は、小腸の慢性炎症性疾患を指す。疾患は、多様な程度のグルテン感受性により特徴づけられる幅広い状態を包含し、扁平な小腸粘膜（過形成性の絨毛萎縮）により特徴づけられる重篤な形態、ならびに疲労、慢性下痢、栄養の吸収障害、体重減少、腹部膨満、貧血を含むより温和な症状により特徴づけられる他の形態、ならびに骨粗鬆症および腸の悪性腫瘍（リンパ腫および癌腫）についての実質的に増大したリスクを含む。
用語「グルテンに対して感受性である」とは、セリアック病の症状の任意の１または２以上における状態、またはグルテンまたはそのペプチド断片に暴露された対象により不適切なＴ細胞応答が示されることを指す。グルテンに対して感受性でない対象において、グルテンの消化により引き起こされるＴ細胞応答は殆どまたは全くない。対照的に、グルテンに対して感受性の対象においては、グルテンの消化の後でグルテンから誘導されるペプチドに対して、不適切なＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性免疫応答が存在する。
用語「免疫寛容」、「免疫学的寛容」、「寛容」または「脱感作する」とは、ここで、感作した、または過敏性の対象を、対象のグルテンに対する免疫学的反応性を低下させることにより、グルテンに対して感受性をより低くするか、非感受性または非反応性にすることとして定義される。免疫寛容は、例えば、膜表面を、本明細書において定義される寛容を誘導するグルテンの抗原性断片に暴露することにより、生じさせることができる。高用量および低用量の両方の抗原の膜投与は、免疫寛容をもたらし得、ここで、その後の抗原の全身投与に対する免疫反応は低下する。少なくとも２つの免疫寛容の機構が存在し得る。高用量の抗原に対する寛容は、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞の不活化またはクローン欠失により生じると考えられる。対照的に、低用量の抗原に対する寛容は、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）およびＴＧＦβなどの抑制性サイトカインを産生するTreg細胞の刺激により媒介される傍観者（bystander）免疫抑制をもたらす。
用語「免疫寛容を誘導する」とは、本明細書において用いられる場合、グルテンに感受性の対象において、グルテンに対する免疫寛容を生じさせるか、もたらすか、または引き起こすことを指す。
用語「過敏性」とは、ここで、グルテンに対して生理学的に異常に感受性であることとして定義される。
用語「アネルギー」とは、抗原に対するＴ細胞（またはＢ細胞）の、可逆的な非応答性または低応答性の状態を指す。
本明細書において用いられる場合、「Treg」とは、Ｔ細胞のサブクラスであって、その主要な役割が、Ｔ細胞媒介性免疫を免疫反応の間に停止へ導くこと、および胸腺におけるネガティブ選択を逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することであるものを指す。「Treg応答」とは、本明細書において用いられる場合、フォークヘッドファミリー転写因子ＦＯＸＰ３（forkhead box p3）および／またはＭＨＣクラスＩＩ関連タンパク質ＬＡＧ−３を発現するか、および／または高レベルのＩＬ−２受容体アルファ鎖（ＣＤ２５）を発現する、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Treg細胞の集団の分化および増殖により特徴づけられる。また、ＭＨＣクラスＩ限定ＣＤ８＋のＦＯＸＰ３発現Treg細胞のマイナー集団も存在する。末梢循環または脾臓におけるTreg細胞の存在は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋発現の分析により決定することができる。これは、フローサイトメトリーを用いて簡便に達成することができる。さらに、Treg細胞は、末梢血または脾臓に由来する単核細胞におけるＦＯＸＰ３のｍＲＮＡのレベルを、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により決定することにより定量することができる。さらに、in vivoでのTreg応答の誘導は、末梢血またはリンパ節に由来する単核リンパ球からのTreg関連サイトカインの測定により評価することができる。Treg細胞は、典型的には、ＩＬ−１０およびＴＧＦβなどの抗炎症性サイトカインのより高い発現レベルを示し、これらのメディエーターの存在は、フローサイトメトリー、免疫組織化学的染色またはＥＬＩＳＡなどの当該分野において公知の方法により決定することができる。
用語「Ｔ細胞刺激性ペプチド」または「刺激性ペプチド」とは、Ｔ細胞を活性化することができるペプチドまたはエピトープを指す。
用語「活性化する（activate）」または「活性化する（activating）」または「活性化（activation）」とは、Ｔ細胞との関連において、１細胞上のＭＨＣ分子による、第２の（Ｔ）細胞上の適切なＴ細胞受容体へのエピトープの提示と、それと一緒のＴ細胞による共刺激分子の結合により、「Ｔ細胞応答」を惹起することを指す。
本明細書において用いられる場合、「毒性ペプチド」とは、対象におけるＴ細胞の活性化を刺激するペプチドを指す。
用語「増殖（expansion）」とは、本明細書において用いられる場合、Ｔ細胞の活性化の後での、Ｔ細胞集団の増殖（proliferation）および増幅（amplification）を指す。
用語「免疫優性」とは、ペプチド（エピトープ）の、免疫系により最も容易に認識される、したがってＴ細胞応答などの誘導される免疫応答の特異性に最も影響を及ぼすサブユニットを指す。「免疫優性」は、本明細書において、「優性」と交換可能に用いられる場合がある。
本明細書において用いられる場合、用語「Ｔ細胞応答を調節する」とは、グルテンに感受性の対象において、Ｔ細胞応答を調節または調整すること、例えばグルテンに対するＴ細胞応答が低下するまたは和らげられることを指す。
本明細書において用いられる場合、「サイトカイン分泌を改変する」とは、グルテンに感受性の対象によるサイトカインの分泌をいくらか変化させるまたは変更すること、例えば、対象におけるグルテン感受性の効果を低下させるかまたは和らげることを指す。用語は、特定のサイトカインまたはサイトカインの組み合わせの分泌の増大、および特定のサイトカインまたはサイトカインの組み合わせの分泌の低下の両方を包含する。
本明細書において用いられる場合、「エピトープ」とは、免疫系、例えば、Ｔ細胞受容体または主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩもしくはクラスＩＩ、抗体、Ｂ細胞受容体により認識される抗原またはペプチドの部分であって、その部分が高アフィニティー結合に十分であるものを指す。一般に、認識のための直線状エピトープは、少なくとも約７アミノ酸の長さであり、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸またはそれより長くともよい。
用語「ポリエピトープ」とは、単一のポリペプチド鎖中に連結する２または３以上のエピトープ（ペプチド）の存在を指す。
本明細書において用いられる場合、「抗原」および「免疫原」ならびにこれらのバリエーションは、一般に交換可能となるように用いられ、免疫系により認識されるエピトープ含有構造を指す。
用語「グルテン」または「グルテンタンパク質」とは、アルファ（α）、ベータ（β）、ガンマ（γ）およびオメガ（ω）グリアジン、ならびに、コムギ中の高分子量および低分子量（ＬＭＷおよびＨＭＷ）グルテニン、オオムギ中のＢ、ＣおよびＤホルデイン、ライムギ中のβ、γおよびωセカリン、ならびに随意にカラスムギ中のアベニンを包含する。「グルテンペプチド」とは、グルテンタンパク質の１または２以上から誘導されるか、その中に包含されるペプチドである。
用語「グリアジン」とは、グルテンの水性アルコール溶解性の画分を指し、特に、限定的ではないが、コムギ、例えばTriticum aestivumから誘導されるグルテンの画分である。
用語「グルテニン」とは、グルテンの水性アルコールに不溶性の画分を指し、特に、限定的ではないが、コムギ、例えばTriticum aestivumから誘導されるグルテンの画分である。
本明細書において用いられる場合、「ホルデイン」または「オオムギホルデイン」とは、オオムギ、Hordein vulgareから誘導されるグルテンを指す。
本明細書において用いられる場合、「セカリン」または「ライムギセカリン」とは、ライムギ、Secale ceraleから誘導されるグルテンを指す。
本明細書において用いられる場合、「アベニン」または「カラスムギアベニン」とは、カラスムギ、Avena sativaから誘導されるグルテンを指す。
組織「トランスグルタミナーゼ」は、セリアック病における決定的な因子である。なぜならば、これは、グルテン特異的Ｔ細胞応答を促進するからである。組織トランスグルタミナーゼは、グルテンの選択的脱アミド化を引き起こし、これは次いで、ＨＬＡ−ＤＱ２または−ＤＱ８分子に高アフィニティーで結合する一連のグルテンペプチドの産生を引き起こす。その結果引き起こされるＨＬＡ−ＤＱ２ （ＤＱ８）−グルテンペプチド相互作用は、炎症促進性ＣＤ４ Ｔ細胞応答を引き起こす。したがって、用語「脱アミド化」とは、グルタミンのグルタミン酸への転換、またはアスパラギンのアスパラギン酸への転換を指す。本明細書において用いられる場合、脱アミド化とは、特に、グルテン中のグルタミンのグルタミン酸への転換を指し、これはグルテンペプチドがＴ細胞を活性化する傾向を増大させるプロセスである。
用語「ヒト白血球抗原」および「ＨＬＡ」は、ここで、ヒト白血球細胞および血小板における遺伝子的フィンガープリントとして定義され、外来生物に対する身体の免疫系を活性化する上で決定的な役割を果たすタンパク質からなる。ヒトおよび他の動物において、ＨＬＡはまた、「主要組織適合複合体」（ＭＨＣ）としても称される。
本明細書において用いられる場合、用語「剤」とは、ペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの収集物を指す。ペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、同じ組成物（ワクチンなど）中にあっても、異なる組成物またはその組み合わせ中（例えば、本明細書において定義される第１および第２のペプチドが一方の組成物中、第３のものが別の組成物中）にあってもよい。異なる組成物において、これらは、好ましくは、キットなどにおいて、近接している。したがって、本発明の方法は、本発明の剤の個々の成分であるペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを、単一の組成物（ワクチン）において、または異なる組成物もしくはその組み合わせにおいて順次、提供する（例えば対象に投与する）ことを企図する。
用語「対象」とは、対象がヒトであるか哺乳動物種およびまた鳥類の種を含む非ヒト動物であるかにかかわりなく、とりわけ、個体、患者、標的、宿主またはレシピエントを含む。用語「対象」とは、したがって、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、ゴリラ、マーモセット、アフリカミドリザル）、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ）、実験動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ハムスター）、ペット動物（例えば、イヌ、ネコ）、捕獲された野生動物（例えば、キツネ、シカ、狩猟動物）および家禽を含む鳥類の種（例えば、ニワトリ、カモ、アヒル、シチメンチョウ）を含む。しかし、好ましい対象はヒトであり、より好ましくはＨＬＡ−ＤＱ２＋であるヒトである。
ペプチド
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、一般に交換可能となるように用いることができ、生物学的に活性な断片、ホモログを含む変異体および塩を包含する。しかし、用語「ペプチド」は、典型的には、５０アミノ酸未満、より好ましくは２５アミノ酸未満を含む、比較的短い分子を指すように用いられる。
本明細書において定義される各ペプチドの全長は、例えば７〜５０アミノ酸、例えば７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸であってよい。アナフィラキシーの可能性を低減する治療薬において、より短いペプチド、特に２０またはそれより少ないアミノ酸長のものが有用である場合も企図されるが、複数のエピトープを有するより長いペプチドは、in vitroでの機能的なＴ細胞に基づく診断において、複数の短いペプチドと同じくらい効果的である可能性がある。
本明細書において用いられる場合、「生物学的に活性な断片」は、例えば配列番号１３、１４または１６の配列により定義される参照ペプチドよりも少ないアミノ酸からなる。好ましくは、生物学的に活性な断片は、グルテンに感受性の対象において、それが誘導されたペプチドと実質的に同等かまたはより高いＴ細胞応答を生じさせることができる。別の態様において、生物学的に活性な断片は、グルテンに感受性の対象において、それが誘導されたペプチドの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％のＴ細胞応答を生じさせることができる。一態様において、生物学的に活性な断片は、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、および７アミノ酸長以下である。ペプチドの任意のもののいずれかの末端における欠失および／または付加は、特に企図される。
配列番号１３として提供されるペプチドの生物学的に活性な断片の例は、ＰＥＬＰを含むもの（配列番号２３４）であり、これは、Ｔ細胞の認識にとって必須であることが見出されている。
したがって、配列番号１３の好適な７merの断片は：
ＱＰＥＬＰＹＰ（配列番号２３５）；ＰＥＬＰＹＰＱ（配列番号２３６）；ＰＱＰＥＬＰＹ（配列番号２３７）およびＦＰＱＰＥＬＰ（配列番号２３８）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１３の好適な８merの断片は：
ＰＥＬＰＹＰＱＰ（配列番号２３９）；ＱＰＥＬＰＹＰＱ（配列番号２４０）；ＰＱＰＥＬＰＹＰ（配列番号２４１）；ＦＰＱＰＥＬＰＹ（配列番号２４２）およびＰＦＰＱＰＥＬＰ（配列番号２４３）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１３の好適な９merの断片は：
ＰＥＬＰＹＰＱＰＱ（配列番号２４４）；ＱＰＥＬＰＹＰＱＰ（配列番号２４５）；ＰＱＰＥＬＰＹＰＱ（配列番号２４６）；ＦＰＱＰＥＬＰＹＰ（配列番号２４７）；ＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（配列番号２４８）およびＱＰＦＰＱＰＥＬＰ（配列番号２４９）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１３の好適な１０merの断片は：
ＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱ（配列番号２５０）；ＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰ（配列番号２５１）；ＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰ（配列番号２５２）；ＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱ（配列番号２５３）；ＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰ（配列番号２５４）；ＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（配列番号２５５）およびＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰ（配列番号２５６）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１３の好適な１１merの断片は：
ＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱ（配列番号２５７）；ＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰ（配列番号２５８）；ＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱ（配列番号２５９）；ＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰ（配列番号２６０）およびＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（配列番号２６１）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１３の好適な１２merの断片は：
ＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱ（配列番号２６２）；ＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰ（配列番号２６３）；ＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱ（配列番号２６４）およびＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰ（配列番号２６５）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１３の好適な１３merの断片は：
ＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱ（配列番号２６６）；ＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰ（配列番号２６７）およびＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱ（配列番号２６８）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１３の好適な１４merの断片は：
ＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱ（配列番号２６９）およびＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰ（配列番号２７０）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１４として提供されるペプチドの生物学的に活性な断片の例は、ＱＰＥＱＰＦを含むもの（配列番号３１７）であって、これは、Ｔ細胞の認識にとって必須であることが見出されている。
配列番号１４の好適な７merの断片は：
ＱＰＥＱＰＦＰ（配列番号２７１）およびＰＱＰＥＱＰＦ（配列番号２７２）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１４の好適な８merの断片は：
ＱＰＥＱＰＦＰＷ（配列番号２７３）；ＰＱＰＥＱＰＦＰ（配列番号２７４）およびＦＰＱＰＥＱＰＦ（配列番号２７５）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１４の好適な９merの断片は：
ＱＰＥＱＰＦＰＷＱ（配列番号２７６）；ＰＱＰＥＱＰＦＰＷ（配列番号２７７）；ＦＰＱＰＥＱＰＦＰ（配列番号２７８）およびＰＦＰＱＰＥＱＰＦ（配列番号２７９）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１４の好適な１０merの断片は：
ＱＰＥＱＰＦＰＷＱＰ（配列番号２８０）；ＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱ（配列番号２８１）；ＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷ（配列番号２８２）；ＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰ（配列番号２８３）およびＱＰＦＰＱＰＥＱＰＦ（配列番号２８４）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１４の好適な１１merの断片は：
ＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱＰ（配列番号２８５）；ＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱ（配列番号２８６）；ＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷ（配列番号２８７）およびＱＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰ（配列番号２８８）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１４の好適な１２merの断片は：
ＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱＰ（配列番号２８９）；ＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱ（配列番号２９０）およびＱＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷ（配列番号２９１）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１４の好適な１３merの断片は：
ＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱＰ（配列番号２９２）およびＱＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱ（配列番号２９３）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１６として提供されるペプチドの生物学的に活性な断片の例は、ＰＩＰＥＱＰＱを含むもの（配列番号２９４）であって、これは、Ｔ細胞の認識にとって必須であることが見出されている。
配列番号１６の好適な８merの断片は：
ＰＩＰＥＱＰＱＰ（配列番号２９５）およびＱＰＩＰＥＱＰＱ（配列番号２９６）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１６の好適な９merの断片は：
ＰＩＰＥＱＰＱＰＹ（配列番号２９７）；ＱＰＩＰＥＱＰＱＰ（配列番号２９８）およびＥＱＰＩＰＥＱＰＱ（配列番号２９９）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１６の好適な１０merの断片は：
ＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰ（配列番号３００）；ＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹ（配列番号３０１）；ＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰ（配列番号３０２）およびＰＥＱＰＩＰＥＱＰＱ（配列番号３０３）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１６の好適な１１merの断片は：
ＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱ（配列番号３０４）；ＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰ（配列番号３０５）；ＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹ（配列番号３０６）およびＰＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰ（配列番号３０７）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１６の好適な１２merの断片は：
ＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱＱ（配列番号３０８）；ＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱ（配列番号３０９）；ＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰ（配列番号３１０）およびＰＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹ（配列番号３１１）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１６の好適な１３merの断片は：
ＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱＱ（配列番号３１２）；ＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱ（配列番号３１３）およびＰＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰ（配列番号３１４）を含むがこれらに限定されない。
配列番号１６の好適な１４merの断片は：
ＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱＱ（配列番号３１５）およびＰＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱ（配列番号３１６）を含むがこれらに限定されない。
一態様において、剤またはワクチンは、配列番号１３、１４および／または１６のペプチドの１より多くの生物学的に活性なペプチド断片を含む。例えば、配列番号１３のペプチドは、一方はＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）に特異的なＴ細胞により認識され、他方はＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）に特異的なＴ細胞により認識される、２つの別々のペプチドで置換することができる。
Ｔ細胞の認識のために必須である配列番号１３のＰＥＬＰ断片内において、Ｅは、存在しなければならないか、または随意にＤであってもよい。Ｔ細胞の認識のために、他の置換は許されない。したがって、配列番号１３の任意の変異体または断片は、領域ＰＥＬＰまたはＰＤＬＰを含まなければならない。
生物学的に活性な変異体は、定義されたペプチドと１または２以上のアミノ酸が異なるペプチドを含み、これはまた当該分野においてホモログとしても知られる。例えば、変異体は、ペプチドの任意の１または２以上において、１または２以上のアミノ酸置換を含んでもよい。本明細書において用いられる場合、「置換される」または「置換」は、アミノ酸残基の置換、付加、挿入、脱落および／または欠失（例えば変異体はまた断片であってもよい）を含む。特に、これは、本発明の方法におけるそれらの用途を失うか著しく低下することのない保存的置換を有するペプチドを指す。好ましくは、生物学的に活性な変異体は、グルテンに感受性の対象において、それが誘導されたペプチドと実質的に同等かまたはそれより高いＴ細胞応答を生じさせることができる。別の態様において、生物学的に活性な変異体は、グルテンに感受性の対象において、それが誘導されたペプチドの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％のＴ細胞応答を生じさせることができる。
ペプチドの生物学的に活性な変異体は、各々のペプチドの配列を改変し、次いで、生じたペプチドを、免疫応答、例えばＴ細胞の産生を刺激する能力についてアッセイすることにより、同定することができる。
一態様において、本明細書において定義されるペプチド配列と比較した場合に、定義されるペプチドにおいて５以下、好ましくは４以下、より好ましくは３以下、より好ましくは２以下、さらにより好ましくはわずか１のアミノ酸を（置換、欠失または付加により）変化させる。
代替的態様において、特定の配列（変異体）と参照配列（本明細書において定義されるペプチド）との間の同一性のパーセンテージは、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、またはそれより高く、例えば少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い。同一性のパーセンテージは、BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/）およびGAPなどの容易に利用可能なソフトウェアパッケージを使用して決定することができる。
一態様において、第２ペプチドは、アミノ酸配列ＰＱＱＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱＰ（配列番号３２０）、またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体を含む。
別の態様において、第３のペプチドは、アミノ酸配列ＦＰＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱＱ（配列番号３２１）、またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体を含む。
天然のアミノ酸として、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、ヒドロキシプロリン（Ｏおよび／またはＨｙｐ）、イソジチロシン（ＩＤＴ）およびジ−イソジチロシン（ｄｉ−ＩＤＴ）が挙げられる。ヒドロキシプロリン、イソジチロシンおよびジ−イソジチロシンは、翻訳後に形成される。天然のアミノ酸、特に２０の遺伝子によりコードされるアミノ酸の使用は、特に企図される。
置換は、置換されたアミノ酸が、参照配列中の対応するアミノ酸と類似の構造的または化学的特性を有する、保存的アミノ酸置換であってもよい。代わりに、置換は、所望の活性が維持される限りにおいて、非保存的アミノ酸置換であってもよい。
例として、保存的アミノ酸置換は、１つの脂肪族または疎水性のアミノ酸を、例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの、別のものによって置換すること；１つのヒドロキシル含有アミノ酸を、例えば、セリンおよびスレオニンの、別のものによって置換すること；１つの酸性残基を、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸の、別のものによって置換すること；１つのアミド含有残基を、例えば、アスパラギンおよびグルタミンの、別のものによって置き換えること；１つの芳香族残基を、例えば、フェニルアラニンおよびチロシンの、別のものによって置き換えること；１つの塩基性残基を、例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジンの、別のものによって置き換えること；ならびに１つの低分子アミノ酸を、例えば、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン、およびグリシンの別のものによって置き換えることを含む。
かかる保存的置換を表１、好ましい置換の表題の下に示す。かかる置換が機能的活性の変化をもたらさない場合は、より実質的な変化、表１において表示される例示的置換を導入して、生じる変異体を機能的活性について分析してもよい。
ペプチド変異体は、変異誘発または他の化学的方法により生成することができる。アラニンスキャンニングは、重要なアミノ酸を同定するための有用な技術である。この技術において、アミノ酸残基をAlaにより置き換え、ペプチドの活性に対するその効果を決定する。例えば、システイン残基を、ジスルフィド架橋を介した二量体形成を最少化するために置換してもよい。ペプチドのアミノ酸残基の各々を、当該ペプチドの重要な領域を決定するために、この様式において分析する。かかるペプチドを調製するための手段は、当該分野においてよく理解されている。
天然に存在するアミノ酸に加えて、天然に存在しないアミノ酸または修飾アミノ酸もまた企図され、本発明の範囲内である。実際に、本明細書において用いられる場合、「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、およびアミノ酸のアナログ、ならびに各々のＤまたはＬ立体異性体を指す。
天然に存在するアミノ酸のための好適な置換物として用いることができる、通常のものでないおよび／または非天然のアミノ酸の非限定的なリスト、およびそれらの標準的な略号を、表２において示す。
本発明の範囲内に含まれるのは、翻訳または合成の間または後に（例えば、ファルネシル化、プレニル化、ミリストイル化、グリコシル化、パルミトイル化、アセチル化、リン酸化（ホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホスレオニンなど）、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合などにより）修飾されたペプチドを含む剤である。限定されないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学分解、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下における代謝合成などを含む、当該分野において公知の多数の化学修飾方法のいずれかを利用してもよい。
句「保護基」および「ブロッキング基」とは、本明細書において用いられる場合、ペプチドを、特にin vivoにおいて、望ましくない化学反応から保護するペプチドへの修飾を指す。かかる保護基の例として、カルボン酸およびボロン酸のエステル、アルコールおよびアセタールのエーテル、アルデヒドおよびケトンのケタールが挙げられる。好適な基の例として、アシル保護基、例えばフロイル、ホルミル、アジピル、アゼライル、スベリル、ダンシル、アセチル、テイル（theyl）、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニルおよびメトキシスクシニルなど；芳香族ウレタン保護基、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）など；脂肪族ウレタン保護基、例えば例えば、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）または９−フルオレニルメトキシ−カルボニル（ＦＭＯＣ）など；ピログルタミン酸およびアミド化が挙げられる。効力の増大、活性の延長、精製の容易性、および／または半減期の延長を提供する他の多くの修飾は、当業者に公知であろう。
一態様において、１または２以上のペプチドの１または２以上のグルタミン酸残基は、ペプチドに対するｔＴＧ活性により生成することができる。代替的態様において、この反応は、in vivoで、投与の後で生じる。
ペプチドは、１または２以上の修飾を含んでもよく、これは天然の翻訳後修飾であっても、人工の修飾であってもよい。修飾は、アミノ、アセチル、アシル、カルボキシ、ヒドロキシもしくはハロゲン（例えばフッ素）基、または炭水化物基などの化学部分（典型的には水素、例えばＣ−Ｈ結合の置換により）を提供することができる。典型的には、修飾は、ＮまたはＣ末端において存在する。さらに、ペプチドの１または２以上は、ＰＥＧ化されていてもよく、ここで、ＰＥＧ（ポリエチレンオキシ基）は、血流中での増大した寿命期間を提供する。ペプチドの１または２以上はまた、他のタンパク質と、または標的細胞上の特異的部分へのターゲティングを可能にする特異的結合剤と、融合またはキメラタンパク質として組み合わされてもよい。
ペプチド変異体は、ペプチドがアミノ酸側鎖および／またはペプチド骨格のレベルで化学修飾されている状態において得ることができる。
配列番号１３、１４および／または１６を有するペプチドに対して、親ペプチドと比較して、分解に対する耐性を改善するため、または可溶性特性を最適化するため、あるいはバイオアベイラビリティを改善するために、特定の変更を行って、それにより類似のまたは改善された治療、診断および／または薬物動態学的特性を有するペプチドを提供してもよい。好ましいかかる修飾として、Ｎ末端アセチル基またはピログルタミン酸および／またはＣ末端アミドの使用が挙げられる。かかる修飾は、表５において示されており、これらは、遊離のＮおよびＣ末端を有する親ペプチドと比較して、半減期およびバイオアベイラビリティを著しく増大する。Ｎ末端アセチル化およびＣ末端アミド化が、当該分野において治療用ペプチドに関して提案されるのに対して、Ｎ末端ピログルタミン酸の使用は、免疫寛容の誘導に関して、以前には議論されてこなかった。免疫寛容を誘導するために有用な他のペプチドはまた、Ｎ末端アセチルもしくはピログルタミン酸および／またはＣ末端アミドから利益を得ることができ、したがって、さらなる側面において、ペプチドのＮ末端をＮ末端アセチルまたはピログルタミン酸の付加により修飾すること、およびペプチドのＣ末端をＣ末端アミドの付加により修飾することを含む、ペプチドの半減期および／またはバイオアベイラビリティを改善するための方法が提供される。特定の態様において、ペプチドは、配列番号２２８、２２９および／または２３０として提供されるアミノ酸配列を含む。
一態様において、配列番号１３のペプチド変異体は、以下の配列を有する：
ｐｙｒｏＥＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱ−アミド（配列番号２２８；NPL001）；または
Ａｃ−ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱ−アミド（配列番号２３１；NPL030）。
別の態様において、配列番号１４のペプチド変異体は、以下の配列を有する：
ｐｙｒｏＥＱＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱＰ−アミド（配列番号２２９；NPL002）；または
Ａｃ−ＱＱＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱＰ−アミド（配列番号２３２；NPL031）。
別の態様において、配列番号１６のペプチド変異体は、以下の配列を有する：
ｐｙｒｏＥＰＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱＱ−アミド（配列番号２３０；NPL003）；または
Ａｃ−ＦＰＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱＱ−アミド（配列番号２３３；NPL032）。
用語「ｐｙｒｏＥ」は、Ｎ末端ピログルタミン酸を示し、用語「Ａｃ」は、Ｎ末端アセチルを示す。
特定の態様において、剤またはワクチンは、NPL001、NPL002およびNPL003を含む。かかる剤またはワクチンは、本明細書においてNexVax2として記載される。
別の態様において、配列番号１３のペプチド変異体は、配列：
ＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹＰＱ（配列番号６０；Ｗ０１〜Ｅ７）を有する。
別の態様において、ペプチドの任意の１つにおける少なくとも１のグルタミンは、グルタミン酸により置換される。
本明細書において記載される特定のペプチドは、特に、幾何または立体異性体の形態において存在してもよい。本発明は、シス−（Ｚ）およびトランス−（Ｅ）異性体、Ｒ−およびＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、これらのラセミ混合物、およびこれらの他の混合物を含む全てのかかる形態を、本発明の範囲内に該当するものとして企図する。アルキル基などの付加的な不斉炭素原子もまた、置換基において存在してもよい。全てのかかる異性体ならびにこれらの混合物は、本発明において含まれることが意図される。
別の例において、ペプチダーゼによる切断を防止するために、ペプチドの任意の１または２以上は、より安定なペプチドを提供するために、特に感受性のペプチド結合の代わりに、非切断可能なペプチド結合を含んでもよい。かかる非切断可能なペプチド結合は、ベータアミノ酸を含んでもよい。
ある態様において、ペプチドの任意の１または２以上は、例えば解離し易いペプチド結合の代わりに官能基を含んでもよく、これは、適宜、セリン型、システイン型またはアスパラギン酸型のプロテアーゼの阻害を容易にする。例えば、本発明は、ペプチジルジケトンまたはペプチジルケトエステル、ペプチドハロアルキルケトン、ペプチドフッ化スルホニル、ボロン酸ペプチジル、ペプチドエポキシド、ペプチジルジアゾメタン、ホスホン酸ペプチジル、イソクマリン類、ベンゾオキサジン−４−オン類、カルバメート類、イソシアネート類、イサト酸無水物類などを含む。かかる官能基は、他のペプチド分子において提供されており、それらの合成のための一般的経路は公知である。
変異体は、模倣物であってもよい。用語「模倣物」は、それが模倣する分子に対していくらかの化学的類似性を有しており目的の特定の活性（例えば、寛容を誘導する）を保持する物質を指すことを意図する。ペプチド模倣物の使用の背景となる論理的根拠は、タンパク質のペプチド骨格が、主に、アミノ酸側鎖を、Ｔ細胞とＭＨＣ−ペプチド、抗体と抗原、酵素と基質または足場タンパク質（scaffolding protein）とのもののような分子相互作用を容易にするように配向させるために、存在することである。ペプチド模倣物は、天然の分子と類似の分子相互作用を可能にするように設計される。模倣物は、オレフィン類、ホスホネート類、アザ−アミノ酸アナログなどを含む。当業者は、ペプチドの模倣物を設計するための方法を容易に理解し、それらを、本明細書において定義されるペプチドの模倣物を設計するために利用することができるであろう。
ペプチドを、親水性分析により分析してもよく、これは、ペプチドの疎水性および親水性領域を同定し、それにより、結合実験、抗体合成などにおける実験的操作のためのペプチドの設計を助けるために用いることができる。また、二次構造分析を行って、特異的な構造モチーフを採用するペプチドの領域を同定してもよい。操作、翻訳、二次構造予測、親水性および疎水性プロフィール、オープンリーディングフレーム予測およびプロッティング、ならびに配列相同性の決定は、当該分野において利用可能なコンピューターソフトウェアプログラムを用いて達成することができる。限定されないが、Ｘ線結晶学、質量分析およびガスクロマトグラフィー、コンピューターモデリング、旋光分散（ＯＲＤ）または円偏光二色性（ＣＤ）を含む、構造分析の他の方法もまた用いることができる。
ペプチド、断片または変異体は、塩の形態、好ましくは薬学的に受容可能な塩の形態であってもよい。「薬学的に受容可能な塩」として、ペプチドの従来の非毒性塩または４級アンモニウム塩、例えば非毒性の有機または無機酸からのものが挙げられる。従来の非毒性の塩として、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルホン酸、リン酸、硝酸などの無機酸から誘導されるもの；および酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸などの有機酸から調製される塩が挙げられる。
ペプチドは、剤またはワクチンにおいて、別々のペプチドとして、または結合した、例えばポリエピトープ構造において、提供することができる。一態様において、ペプチドは、単一のポリペプチド鎖（ポリエピトープストリング（polyepitope string））において、すなわち、直線状または環状の配置において、提示してもよい。別の態様において、ペプチドは、特にポリリジンなどのデンドリマー骨格に基づく、複数の抗原提示系において提示してもよい。ポリリジン骨格は、エピトープの非直線状の、分枝状配置を提供する。この系は、ペプチドが互いに干渉しないか、潜在性エピトープ（cryptic epitope）へ切断しにくく、それにより完全なＴ細胞応答を誘導することができる、というポリエピトープストリングより有利な点を提供する。
抱合体
ペプチドの１または２以上を、標準的な方法を用いて化合物と抱合させてもよい。ペプチドが抱合することができる化合物の例として、限定されないが、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光化合物、酵素標識、フリーラジカル、アビジン−ビオチン標識、バクテリオファージ標識、対象におけるペプチドの半減期を延長する化合物、アジュバント、ＭＨＣ分子、またはこれらの断片が挙げられる。
化合物は、抱合したペプチドの検出および／または単離を容易にするか、免疫原性を増大させることができる。
「抱合した」とは、本明細書において用いられる場合、共有または非共有結合を介してカップリングしていることを意味する。共有結合が好ましいが、化合物はまた、共有結合なしで、複合体化を介して、例えば水素結合または静電気、疎水性などの相互作用を介して、化合物に結合していてもよい。
典型的な放射性同位元素として、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、および１５２Ｅｕが挙げられる。
典型的な蛍光標識として、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレサミンが挙げられる。
典型的な化学発光化合物として、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル類、イミダゾール類、アクリジニウム塩およびオキサレートエステルが挙げられる。典型的な生物発光化合物として、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンが挙げられる。
典型的な酵素標識として、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼが挙げられる。
一態様において、非特異的リンカーが、化合物と、それが抱合されるペプチドとの間に用いられる。かかるリンカーは、ペプチドの活性に関与しない。むしろ、リンカーは、ペプチドと機能的部分との間のスペーサーとして働き得る。リンカーの使用は、精製または検出を助けるためのものなどの、ペプチドの固定を含む。代わりに、リンカーは、化合物のペプチドへの付着を可能にするものであってもよく、これは、空間的または時間的に、細胞または組織などの特定の標的へのペプチドの特異的送達を可能にする。ワクチンとして用いられる場合、ペプチドの１または２以上を、ペプチドと免疫原性キャリアとの間のスペーサーとして働くかまたはペプチドと免疫原性キャリアとの間のカップリングの改善を可能にして潜在性エピトープの形成を防止するリンカーとカップリングしてもよい。
一態様において、ペプチドの１または２以上は、その免疫原性を増大させるために、当該分野において公知の幾つかの抱合化学のいずれかを用いて、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）またはインフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）などのアジュバント（免疫原性キャリアタンパク質）に、共有結合によりカップリングされる。非特異的リンカーは、ペプチドと免疫原性キャリアとの間に存在することができ、好ましくは、免疫原性キャリアとのカップリングを容易にするために、および／またはペプチドと免疫原性キャリアとの間のスペーサーとして働くために、ペプチドに連結しているかまたは共合成されている。
診断剤として用いられる場合、ペプチドの１または２以上は、好ましくは、先にワクチン接種のために用いられていない免疫原性キャリアに抱合させる。ワクチン接種の成功をモニタリングする場合、これは、診断剤が、ワクチンのキャリア画分に対して形成された抗体と反応することを防ぐ。
一態様において、化合物は、ＭＨＣクラスＩＩ分子またはその結合断片である。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、生物学的試料から精製することができる。代わりに、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、組み換えにより生成してもよい。ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド結合断片は、例えば精製されたかまたは組み換えの完全な分子の酵素切断により、得ることができる。代わりに、ペプチド結合断片を、組み換えにより生成してもよい。好ましい態様において、化合物は、組み換えの２ドメインのＭＨＣクラスＩＩ分子である。
その最も基本的な形態において、２ドメインのＭＨＣクラスＩＩ分子は、哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩ分子のα１およびβ１ドメインを含み、ここで、α１ドメインのアミノ末端は、β１ドメインのカルボキシ末端に結合しており、ここで、ポリペプチドは、α２またはβ２を含まない。２ドメインのＭＨＣクラスＩＩ分子は、共有または非共有相互作用により、本明細書において定義されるペプチドと結合する。ある態様において、ペプチドは、クラスＩＩ分子のβ１ドメインのアミノ末端と共有結合している。２ドメインのＭＨＣクラスＩＩ分子はまた、蛍光標識または毒素などの検出可能な標識を含んでもよい。検出可能な標識または毒素がＭＨＣ分子と直接的な様式において（すなわち、無作為に付着するのではなく）共有結合する場合、それは、一般に、アミノ末端に結合したペプチド抗原との干渉を最少化するために、分子のカルボキシ末端に結合する。
in vitroで、２ドメインのＭＨＣクラスＩＩ分子を、Ｔ細胞を検出して定量するため、およびＴ細胞の機能を調節するために用いてもよい。したがって、選択されたペプチドをロードされたかかる分子は、そのペプチドに対して特異的であるＴ細胞の集団を検出し、モニタリングし、定量するために用いることができる。２ドメインのＭＨＣクラスＩＩ分子／ペプチド抱合体はまた、グルテン特異的Ｔ細胞のアネルギーを誘導し、セリアック病に関連する症状を緩和するために用いることができる。代わりに、かかる分子は、より直接的に疾患を引き起こすＴ細胞を殺傷する毒素と抱合させてもよい。好適な毒素として、タンパク質毒素（例えば、リシン、ジフテリア、およびシュードモナス毒素）、化学療法剤（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、メトトレキサート、細胞毒、およびアンチセンスＲＮＡ）、細胞毒性Ｔ細胞表面分子に対する抗体、リパーゼ、ならびに「硬（hard）」放射、例えばベータ放射を放出する放射性同位元素が挙げられる。
組み換えＭＨＣクラスＩＩβ１α１分子の設計
哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖タンパク質のアミノ酸配列、ならびにこれらのタンパク質をコードする核酸は、当該分野において周知であり、GenBankを含む多数のソースから利用可能である。
典型的には、α１ドメインは、成熟α鎖の残基１〜９０付近を含むものと考えられる。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質のα１ドメインとα２ドメインとの間のネイティブなペプチドリンカー領域は、考慮される特定のα鎖に依存して、α鎖のアミノ酸７６付近からアミノ酸９３付近に広がる。したがって、α１ドメインは、α鎖のアミノ酸残基１〜９０付近を含み得るが、当業者は、このドメインのＣ末端カットオフが必ずしも正確に定義されず、例えば、α鎖のアミノ酸残基７０〜１００の間の任意の点において生じ得ることを理解するであろう。α１ドメインの組成はまた、哺乳動物種および問題の特定のα鎖に依存して、これらのパラメーターの外で変化してもよい。
同様に、β１ドメインは、成熟β鎖の残基１〜９０付近を含むものと考えられる。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質のβ１ドメインとβ２ドメインとの間のリンカー領域は、考慮される特定のβ鎖に依存して、β鎖のアミノ酸８５付近からアミノ酸１００付近に広がる。したがって、β１タンパク質は、アミノ酸残基１〜１００付近を含み得るが、当業者は、このドメインのＣ末端カットオフが必ずしも正確に定義されず、例えば、β鎖のアミノ酸残基７５〜１０５の間の任意の点において生じ得ることを理解するであろう。
組み換え分子中に含めるために特定のドメインの配列を選択する場合、ドメイン全体を含めることが好ましい。このことが確実になされるために、ドメインの配列を、リンカーの一部、または隣接するドメインの一部までもを含むように、伸長させてもよい。α１およびβ１ドメイン中のアミノ酸の正確な数は、哺乳動物の種に依存して、ならびに種内の遺伝子のクラスの間で変化する。特定のドメインのアミノ酸配列を選択する場合に重要であるのは、アミノ酸の数に基づく正確な構造的定義よりも、むしろドメインの機能の維持である。さらに、当業者は、選択されるドメインの全アミノ酸配列よりもいくらか少ないものが利用される場合にもドメインの機能が維持されることを、理解するであろう。例えば、α１ドメインのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかにおけるアミノ酸の数は、ドメインの機能に影響を及ぼすことなく減らすことができる。しかしながら典型的には、ドメイン配列のいずれかの末端から減らされたアミノ酸の数は、１０以下であり、より典型的には５以下である。同様に、α１およびβ１ドメインは、ドメインの機能が維持されることを前提として、天然に存在する形態と比較して、１または２以上のアミノ酸配列のバリエーションを含んでもよい。
特定の選択されたドメインの機能的活性は、ペプチドをロードした（loaded）ＭＨＣクラスＩＩβ１α１分子の背景において評価することができる。例えば、特定のβ１ドメインを試験するために、それを機能的なα１ドメインに結合させて、結果として生じるＭＨＣクラスＩＩβ１α１分子にペプチドがロードされ、抗原特異的Ｔ細胞に結合する能力および／または、Ｔ細胞増殖などの抗原特異的Ｔ細胞の機能を阻害する能力について試験される。
これらのドメインをコードする核酸分子は、ＰＣＲによる増幅などの標準的な手段により生成することができる。これらのドメインをコードするオープンリーディングフレームを増幅するためのプライマーを設計するための標準的なアプローチを用いることができる。これらのドメインの増幅のために好適なライブラリーとして、例えば、疑問になる哺乳動物の種から調製したｃＤＮＡライブラリーが挙げられる。かかるライブラリーは、市販されているか、標準的な方法により調製することができる。したがって、例えば、β１およびα１ポリペプチドをコードするコンストラクトを、４つのプライマーを用いるＰＣＲにより生成することができる：β１コード領域の５’および３’末端に対応するプライマーＢ１およびＢ２、ならびにα１コード領域の５’および３’末端に対応するプライマーＡ１およびＡ２。α１およびβ１ドメインのコード領域のＰＣＲ増幅の後で、これらの増幅された核酸分子を、各々、標準的なクローニングベクター中にクローニングするか、または分子を一緒にライゲーションして、次いで好適なベクター中にクローニングすることができる。２つのコード領域の簡便なクローニングを容易にするために、制限酵素エンドヌクレアーゼ認識部位をＰＣＲプライマー中に設計してもよい。例えば、プライマーＢ２およびＡ１は、各々、増幅された断片が、増幅および選択された制限酵素による消化の後で、容易に一緒にライゲーションされ得るように、好適な部位を含んでもよい。さらに、プライマーＢ１およびＡ２は、各々、選択されるベクターのポリリンカー部位中へのクローニングを容易にするために、制限酵素切断部位を含んでもよい。２つのドメインのコード領域のライゲーションは、コード領域が作動可能に連結される、すなわち、オープンリーディングフレームが維持されるように、行われる。増幅されたコード領域が別々にクローニングされる場合、断片を、クローニングベクターから逐次放出させ、ライゲーションの準備としてゲルで精製してもよい。
ある態様において、ペプチドリンカーは、β１ドメインとα１ドメインとの間で提供される。典型的には、このリンカーは、２〜２５アミノ酸の長さであり、各々のドメインがそのネイティブな立体配置へと自由に折りたたまれるように、ドメイン間の可橈性を提供するように働く。リンカー配列は、ＰＣＲプライマーをリンカー配列をコードするように設計することにより、簡便に提供することができる。したがって、上記の例において、リンカー配列は、Ｂ２もしくはＡ１プライマーのうちの一方、またはこれらのプライマーの各々の組み合わせによりコードされてもよい。
変異体ＭＨＣドメインのポリペプチドは、例えば部位特異的変異誘発またはＰＣＲにより、当該ドメインをコードする分子のヌクレオチド配列を操作することにより、生成することができる。
抗原性ペプチドのＭＨＣクラスＩＩβ１α１分子への遺伝連鎖
ＭＨＣクラスＩＩβ１α１分子は、本明細書において定義されるペプチドと組み合わせて用いられる。ＭＨＣクラスＩＩβ１α１分子は、ペプチドのＭＨＣ分子への共有結合によるものを含む、多数の方法においてペプチドで「ロードされる」。このことは、発現されるペプチドがＭＨＣクラスＩＩβ１α１分子のβ１のＮ末端に連結するように、選択されるペプチドをコードする核酸配列をＭＨＣ分子をコードするコンストラクトの５’末端に作動可能に連結することにより、簡便に達成することができる。この結果を得る一つの簡便な方法は、ペプチドをコードする配列を、ＭＨＣコード領域を増幅するために用いられるＰＣＲプライマー中に組み込むことである。典型的には、リンカーペプチド配列をコードする配列は、抗原性ペプチドをコードする分子とＭＨＣポリペプチドをコードする分子との間に含められる。抗原をＭＨＣ ポリペプチドに連結させるために、リンカーは、抗原性ペプチドがＭＨＣポリペプチドのペプチド溝中にフィットするために十分な長さであるべきである。
この抗原性ペプチドのＭＨＣ分子への連結のための遺伝子系は、異なる抗原性ペプチドを有する多数のＭＨＣ分子が生成される場合に特に有用である。記載された系は、ＭＨＣコード領域の５’末端において（すなわち、ＭＨＣクラスＩＩβ１α１分子のβ１の５'末端において）ユニークな制限酵素切断部位が含まれる発現ベクターの構築を可能にする。かかるコンストラクトと組み合わせて、各々の抗原コード領域が選択された制限酵素についての部位により挟まれた、抗原性ペプチドをコードする配列のライブラリーを作製する。特定の抗原のＭＨＣ分子中への包含を、次いで、単純に（ａ）抗原コード領域を選択された制限酵素により放出させること、（ｂ）ＭＨＣコンストラクトを同じ制限酵素により切断すること、および（ｃ）抗原コード領域をＭＨＣコンストラクト中へライゲーションすることにより行う。この様式において、短時間において、多数のＭＨＣ−ポリペプチドコンストラクトを作製し、発現させることができる。
空のβ１α１およびα１α２分子の抗原ローディング
ＭＨＣクラスＩＩβ１α１分子が、空（empty）の形態において（すなわち、結合する抗原性ペプチドなしで）発現され精製された場合に、抗原性ペプチドを、標準的な方法を用いて、分子中にロードすることができる。かかる方法は、精製されたＭＨＣ分子と精製されたペプチドの調製物との単純な共インキュベーション（co-incubation）を含む。
例として、空のＭＨＣクラスＩＩβ１α１分子（１ｍｇ／ｍｌ；４０ｕＭ）を、１０倍のモル濃度過剰なペプチド（１ｍｇ／ｍｌ；４００ｕＭ）と共に、室温で２４時間インキュベーションすることにより、ロードすることができる。その後、ＰＢＳに対する４℃で２４時間の透析により、過剰な未結合ペプチドを取り除くことができる。当該分野において公知のことであるが、ＭＨＣクラスＩＩβ１α１分子へのペプチド結合は、放射性標識されたペプチドを用いるシリカゲル薄相クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により定量することができる。かかる定量に基づいて、所望の結果を得るために、ローディングを変化させる（例えば、ペプチドの過剰なモル濃度またはインキュベーションの時間を変化させる）ことができる。
ポリヌクレオチド
用語「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」は、一般に交換可能に用いられ、生物学的に活性な断片およびホモログを含む変異体を包含する。
剤の各構成要素であるポリヌクレオチドの全長は、例えば、２１〜１５０ヌクレオチド、例えば２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ヌクレオチドであってよい。
核酸分子の「生物学的に活性な断片」は、参照ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のものよりも少ないヌクレオチドからなり、少なくとも約２１ヌクレオチドの長さを有し、少なくとも約３５ヌクレオチドの長さを有してもよい。
用語「生物学的に活性な変異体」および「生物学的に活性な断片」は、本明細書において定義されるペプチドに関して上で記載されるものと類似の意味を有する。
「生物学的に活性な変異体」は、参照ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチドの配列を含み得る。同一性のパーセンテージは、BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/）およびGAPなどの容易に利用可能なソフトウェアパッケージを用いて決定することができる。
代わりに、または加えて、「生物学的に活性な変異体」は、低ストリンジェンシー条件下において、参照ペプチドをコードするヌクレオチド配列（またはその相補的形態）にハイブリダイズしてもよい。本明細書において「低ストリンジェンシー」への言及は、ハイブリダイゼーションのための少なくとも約０〜少なくとも約１５％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩、ならびに、洗浄条件のための少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩を指す。一般に、低ストリンジェンシーは、約２５〜３０℃から約４２℃までである。温度は変化させることができ、ホルムアミドを置き換えるために、および／または代替的なストリンジェンシー条件を与えるために、より高い温度を用いてもよい。中程度または高ストリンジェンシーなどの代替的なストリンジェンシー条件は、必要である場合に適用することができる。本明細書において「中程度のストリンジェンシー」への言及は、ハイブリダイゼーションのための少なくとも約１６％ｖ／ｖ〜少なくとも約３０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩、ならびに、洗浄条件のための少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩を指す。本明細書において「高ストリンジェンシー」への言及は、ハイブリダイゼーションのための少なくとも約３１％ｖ／ｖ〜少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩、ならびに、洗浄条件のための少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩を指す。
一般に、洗浄は、Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％において行われる。しかし、二本鎖核酸分子のＴｍは、ミスマッチ塩基対の数が１％増加するごとに１℃低下する。ホルムアミドは、これらのハイブリダイゼーション 条件において随意に選択される。
特に好ましいストリンジェンシーのレベルは、以下の通り定義される：低ストリンジェンシーは、２５〜４２℃において、６×ＳＳＣバッファー、０．１％ｗ／ｖのＳＤＳであり；中程度のストリンジェンシーは、２０〜６５℃において、２×ＳＳＣバッファー、０．１％ｗ／ｖのＳＤＳであり；高ストリンジェンシーは、少なくとも６５℃において、０．１×ＳＳＣバッファー、０．１％ｗ／ｖのＳＤＳである。
生物学的変異体は、参照ポリヌクレオチドと１または２以上のヌクレオチドが異なるポリヌクレオチドを含む。例えば、変異体は、１または２以上の天然に存在するヌクレオチドの、アナログ（モルホリン環など）、メチル化ヌクレオチド、非荷電性結合などのヌクレオチド間修飾（例えば、メチルホスホネート類、ホスホトリエステル類、ホスホアミデート類、カルバメート類など）、荷電性結合（例えば、ホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類など）、ペンデント（pendent）部分（例えば、ポリペプチド）、介入物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、および修飾結合（例えば、α−アノマー核酸など）による置換を含んでもよい。
ペプチドの１または２以上をコードするポリヌクレオチドは、ベクター中で提供されてもよい。
本明細書において定義されるペプチドの１または２以上をコードするポリヌクレオチドは、当該分野において周知の技術を用いて、ペプチドの組み換え産生のために用いてもよい。代わりに、ポリヌクレオチドは、対象をグルテンに対して免疫／寛容化するために用いてもよい。
本発明における使用のためのポリヌクレオチドは、コドン使用の縮重を配慮しながら、ペプチドの１または２以上から誘導することができるＤＮＡ配列を含む。これは、当該分野において周知であり、異なる発現宿主におけるコドン使用の知識も同様であり、これは、ペプチドの組み換え発現を最適化する上で有用である。
ポリヌクレオチドがペプチドの１または２以上の組み換え産生のために用いられる場合、ポリヌクレオチドは、ペプチド単独についてのコード配列を含んでも、リーダー配列または分泌配列、プレ−またはプロ−もしくはプレプロ−タンパク質配列、リンカーペプチド配列、または他の融合ペプチド部分をコードするものなどの他のコード配列とのリーディングフレームについてのコード配列を含んでもよい。例えば、融合ペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコードされていてもよい。ある態様において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Qiagen, Inc.）中で提供されるようなヘキサ−ヒスチジンペプチド、またはＨＡタグ、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである。ポリヌクレオチドはまた、転写される非翻訳配列、スプライシングまたはポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡを安定化させる配列などの、非コード５’および３’配列を含んでもよい。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本明細書において定義される剤および／またはペプチドは、ＡＰＣを、例えば、第１、第２および第３のペプチド、それらの１もしくは２以上の生物学的に活性な断片もしくは変異体、および／またはそれらの１または２以上をコードするポリヌクレオチドでロードすることにより、送達することができる。
好ましくは、ＡＰＣは、対象のＭＨＣ表現型と共有するＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ−リンパ球および肝類洞内皮細胞からなる群より選択される。例えば、ＡＰＣは、ＨＬＡ−ＤＱ２（例えば、ＨＬＡ ＤＱＡ１＊０５およびＨＬＡ ＤＱＢ１＊０２）および／またはＨＬＡ ＤＱ８を発現してもよい。この目的のために使用されるＡＰＣは、ローディングの後でそれらが送達されるべき対象から単離されたものであっても、アロが一致する（allo-matched）対象から得たものであってもよい。
ＡＰＣを「ロードする」とは、ＡＰＣをペプチド、それらの１もしくは２以上の生物学的に活性な断片もしくは変異体、またはそれらの１または２以上をコードするポリヌクレオチドとインキュベートまたはトランスフェクトすることを意味する。ＡＰＣをロードすることは、脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクションなどの、従来の核酸トランスフェクション方法を用いて達成することができる。
ペプチド生成
ペプチドは、任意の好適な様式において調製することができる。例えば、ペプチドは、組み換えにより、および／または合成により生成することができる。
ペプチドは、市販のペプチド合成機を用いる自動化された手順による合成を含む、標準的な化学技術により合成することができる。一般に、ペプチドのアナログは、固相ペプチド合成方法により調製され、これは、各々の保護されたアミノ酸残基を、Ｃ末端アミドを有するペプチドを得るためのジシクロヘキシルカルボジイミドによる活性化により、樹脂、好ましくは４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂の支持体へカップリングすることを含み得る。代わりに、クロロメチル樹脂（メリフィールド樹脂）を用いて、Ｃ末端に遊離のカルボン酸を有するペプチドを得てもよい。最後の残基を付着させた後で、保護されたペプチド−樹脂を、フッ化水素で処理して、ペプチドを樹脂から切断し、ならびに側鎖官能基を脱保護する。粗生成物を、ゲルろ過、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、分配クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより、さらに精製してもよい。
所望の場合、および上記概説したように、剤のペプチド中に、合成の間または発現の間に、他の分子へのまたは表面への結合を可能にする多様な基を導入することができる。例えば、チオエステルを作るためにシステインを、金属イオン錯体へ結合させるためにヒスチジンを、アミドまたはエステルを形成させるためにカルボキシル基を、アミドを形成させるためにアミノ基を用いることなどができる。
ペプチドはまた、無細胞翻訳系を用いて生成することができる。網状赤血球ライセートおよびコムギ胚芽抽出物などの標準的な翻訳系は、ＲＮＡを鋳型として用いる。一方、「カップリングされた（coupled）」および「結合された（linked）」系は、ＤＮＡの鋳型を用いて開始し、これがＲＮＡへ転写され、次いで翻訳される。
代わりに、ペプチドは、宿主細胞を、１または２以上のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトすることにより、生成することができる。
組み換え産生のために、ペプチドの１または２以上をコードする配列を含む組み換えコンストラクトを、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストリン媒介性トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入（transduction）、スクレイプローディング（scrape loading）、弾丸導入（ballistic introduction）または感染などの従来の方法により、宿主細胞中に導入する。
ペプチドの１または２以上を、例えば、哺乳動物細胞（例えば、COS、CHO、BHK、293 HEK、VERO、HeLa、HepG2、MDCK、W138もしくはNIH 3T3細胞）、酵母（例えば、SaccharomycesもしくはPichia）、細菌（例えば、E. coli、P. pastorisもしくはB. subtilis）、昆虫細胞（例えば、Sf9細胞中のバキュロウイルス）、または他の細胞などの好適な宿主細胞において、適切なプロモーターの制御下において、従来の技術を用いて、発現させてもよい。好適な宿主株のトランスフェクション、および宿主株の好適な細胞密度への増殖の後で、細胞を遠心分離により収集して、物理的または化学的手段により破壊し、生じる粗抽出物を、ペプチドまたはその変異体のさらなる精製のために保持する。
好適な発現ベクターとして、例えば、染色体の、非染色体の、および合成のポリヌクレオチド、例えばＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから誘導されたベクター、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、カナリアポックスウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルスＤＮＡが挙げられる。ポリヌクレオチドは、当該分野において公知の従来の手順により、発現ベクター中へ導入することができる。
１または２以上のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現制御配列、すなわちｍＲＮＡ合成を指揮するプロモーターに作動可能に連結していてもよい。かかるプロモーターの代表例として、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、E. coliのｌａｃまたはｔｒｐ、ファージラムダＰＬプロモーター、および原核もしくは真核細胞において、またはウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターが挙げられる。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含んでもよい。
発現ベクター はまた、複製起点、および、形質転換細胞、すなわち異種性ポリヌクレオチドを発現する細胞の選択を可能にするためのE. coliのアンピシリン耐性遺伝子などの選択マーカーを含んでもよい。ペプチドの１または２以上をコードする核酸分子を、翻訳開始および終結配列とインフレーム（in frame）で、ベクター中に組み込んでもよい。
ペプチドの１または２以上は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣを含む周知の方法により、組み換え細胞培養物から（すなわち、細胞または培養培地から）回収して精製することができる。単離および／または精製の間にペプチドが変性した場合、活性な立体配置を再生するために、タンパク質をリフォールディングするための周知の技術を用いることができる。
グリコシル化されたペプチドを生成するために、組み換え技術を用いることが好ましい。グリコシル化されたペプチドを生成するために、組み換え技術において、ＣＯＳ−７およびＨｅｐ−Ｇ２細胞などの哺乳動物を用いることが好ましい。
ペプチドをまた、より長いペプチドの切断により、特に食品抽出物から、調製してもよい。
ペプチドの薬学的に受容可能な塩は、塩基または酸部分を含むペプチドから、従来の化学的方法により合成することができる。一般に、塩は、遊離の塩基または酸を、化学量論的な量のまたは過剰な、所望の塩を形成する無機または有機酸または塩基と、好適な溶媒中で反応させることにより、調製される。
ワクチンおよび投与
本発明はまた、第１、第２および第３のペプチド、それらの１もしくは２以上の生物学的に活性な断片もしくは変異体、および／またはそれらの１または２以上をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを提供する。また提供されるのは、本発明のペプチドおよび／または本発明のポリヌクレオチドを含むワクチンである。
本明細書において用いられる場合、用語「ワクチン」とは、グルテンに感受性の対象に対象のグルテンに対する応答を調節するために投与することができる、ペプチドを含むかまたはペプチドをコードする組成物を指す。ワクチンは、対象のグルテンに対する免疫学的反応性を低下させることができる。好ましくは、ワクチンは、グルテンに対する寛容を誘導する。
ワクチンの対象への投与により、グルテン特異的エフェクターＴ細胞の集団、例えばグルテン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のクローン欠失により、またはその後のグルテン（またはそのペプチド）への暴露に対する前記Ｔ細胞の応答性が低くなるか好ましくは非応答性になるような前記Ｔ細胞の不活化（アネルギー）により、寛容を誘導することができる。
代わりに、または加えて、ワクチンの投与により、対象のサイトカイン分泌プロフィールを改変する（例えば、減少したＩＬ−４、ＩＬ−２、ＴＮＦαおよび／またはＩＦＮγの増加、および／またはＩＬ−１０の低下をもたらす）ことができる。ワクチンは、ＩＬ−１０および／またはＴＧＦβを産生し、それによりグルテン特異的エフェクターＴ細胞を抑制する、サプレッサーＴ細胞の亜集団、例えばTreg細胞を誘導することができる。
本発明のワクチンは、グルテンに対する感受性を発達させることができる、例えばＨＬＡ−ＤＱ２および／またはＨＬＡ−ＤＱ８遺伝子を保有すると診断された対象の予防的処置、および／またはグルテンに感受性である対象、例えばセリアック病を有する対象の進行中の処置のために、用いることができる。多様な自己免疫およびモデル免疫条件、例えば実験的アレルギー性脳炎についての、免疫優性ペプチドの予防的活性を支持する相当量の動物のデータが存在する。
本明細書において用いられる場合、用語「処置」は、疾患もしくは状態の進行を、抑止、阻害、遅延、もしくは逆転させること、または、疾患（例えばセリアック病）もしくは状態の臨床的症状を、緩和もしくは予防することを含む。
投与されるべきワクチン（または剤、ペプチド、ポリヌクレオチドおよび／またはＡＰＣ）の量は、「有効量」として言及される。用語「有効量」は、適切なまたは十分な条件下において投与した場合に、所望の治療的または生理学的効果を提供するために十分な量を意味する。単一の、または複数の用量を投与してもよい。望ましくない効果、例えば副作用が、所望の治療効果と共に、しばしば現れる。したがって、医師は、適切な「有効量」を決定する上で、潜在的なリスクに対する潜在的な利益のバランスをとる。必要とされる正確な量は、種、年齢、サイズおよび対象の一般的状態、投与の様式などに依存して、対象ごとに異なるであろう。したがって、正確な「有効量」を特定することは不可能である場合がある。しかし、任意の個々のケースにおける適切な「有効量」は、当業者により、寛容的な実験のみを用いて決定することができる。
ワクチン（または剤、ペプチド、ポリヌクレオチドおよび／またはＡＰＣ）は、対象における、グリアジン、セカリン、ホルデイン、グルテニンおよび随意にアベニンタンパク質により代表されるような、コムギ、オオムギおよびライムギ、好ましくはコムギ、オオムギ、ライムギおよびカラスムギに対するＴ細胞応答を改変する。したがって、本発明にしたがって処置された対象は、好ましくは、少なくともコムギ、ライムギ、オオムギおよび随意にカラスムギを、通常はセリアック病の症状をもたらすであろう顕著なＴ細胞応答なしに、食べることができる。
本発明の剤の此処の成分を、同じ組成物において投与しても、異なる組成物またはそれらの組み合わせにおいて（例えば、第１および第２の本明細書において定義されるペプチドを１つの組成物において、第３のペプチドを別の組成物において）投与してもよい。異なる組成物中である場合、それらは、同時に投与しても、逐次投与してもよい。
剤またはワクチンは、薬学的に受容可能なキャリアを含んでもよい。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、対象、特に哺乳動物、ことさらヒトに投与された場合に、アレルギー性、毒性、または他の有害反応をもたらさない、分子的実体および組成物を指す。薬学的に受容可能なキャリアは、固体または液体であってよい。薬学的に受容可能なキャリアの例として、限定されないが、本発明の活性剤の活性に影響を及ぼさない、希釈剤、賦形剤、溶媒、界面活性剤、懸濁剤,緩衝化剤、潤滑剤、アジュバント、ビヒクル、乳化剤、吸収剤、分散媒、コーティング剤、安定化剤、保護コロイド、粘着剤、増粘剤、チキソトロピック剤、浸透剤、封鎖剤（sequestering agent）、等張剤および吸収遅延剤が挙げられる。
キャリアは、従来用いられているもののうちのいずれであってもよく、可溶性および活性剤との反応性の欠失などの物理化学的考慮によってのみ、ならびに投与の経路により、限定される。本発明のために好適なキャリアとして、従来用いられているもの、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、ラクトース、リンガー溶液、緩衝化溶液、ヒアルロナン、グリコール類、デンプン、セルロース、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。リポソームもまたキャリアとして用いることができる。
医薬組成物を製造するための技術は、当該分野において公知であり、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１６版、Mack Publishing Company（1980年）により例示される。
用語「アジュバント」は、一般に、１または２以上の本明細書において定義されるペプチドの免疫原性を増強するように設計された免疫刺激性物質を指す。好ましくは、アジュバントは、Ｔｈ１応答をもたらさず、さらに、免疫寛容を促進し、および／または炎症を低減する。好適なアジュバントとして、１）アルミニウムベースの鉱物塩アジュバント、例えばＡｌ（ＯＨ）３ゲルまたはリン酸アルミニウムであるが、カルシウム、鉄または亜鉛の塩であってもよい；および２）デキサメタゾン（Kang et al., 2008）が挙げられる。
投与は、経口で、局所（経皮）で、非経口で、吸入スプレーにより、または直腸で、従来の非毒性の薬学的に受容可能なキャリアを含む投与単位製剤におけるものであってよい。用語「非経口」とは、本明細書において用いられる場合、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、結膜下、腔内（intracavity）、経皮および皮下注射、肺もしくは鼻腔への投与のためのエアロゾル、または注入、例えば浸透圧ポンプによる投与を含む。
本発明の活性化合物は、経口での使用のために好適な形態、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性の懸濁液、分散可能な散剤もしくは顆粒、乳液、ハードもしくはソフトカプセル、またはシロップもしくはエリキシル剤であってもよい。経口での使用を意図される組成物は、医薬組成物の製造のための当該分野において公知の方法に従って調製され、かかる組成物は、薬学的に上品かつ美味な製剤を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤からなる群より選択される１または２以上の剤を含む。
錠剤
活性成分を薬学的に受容可能な賦形剤との混合物において含む錠剤はまた、公知の方法により製造することができる。用いられる賦形剤は、例えば、（１）炭酸カルシウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性な希釈剤；（２）コーンスターチまたはアルギン酸などの造粒剤および崩壊剤；（３）スターチ、ゼラチンまたはアラビアゴムなどの結合剤、ならびに（４）ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの潤滑剤であってよい。錠剤を、コーティングしても、胃腸管における崩壊および吸収を遅延させ、それによりより長期にわたる持続的作用をもたらすために、公知の技術によりコーティングしてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間的遅延材料を用いてもよい。それらはまた、制御放出のための浸透圧治療用錠剤を形成するために、コーティングしてもよい。
一部の場合において、経口での使用のための製剤は、ハードゼラチンカプセルの形態であってもよく、ここで活性成分は、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンなどの不活性な固体の希釈剤と混合される。それらはまた、活性成分が、例えばピーナッツ油、流動パラフィンまたはオリーブ油などの水性または油性の溶媒と混合されている、ソフトゼラチンカプセルの形態であってもよい。
水性懸濁液
水性懸濁液は、通常、活性剤量を、水性懸濁液の製造のために好適な賦形剤との混合物において含む。かかる賦形剤は、（１）カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアラビアゴムなどの懸濁剤；または（２）Ｃ２〜Ｃ１８脂肪酸のＰＥＧエステル、Tween 80またはポリエチレンオキシドソルビタンモノラウレート、Brijまたはポリオキシエチレンアルコール、Triton-Xまたはポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフェニルエーテル、Triton-N、およびTriton A-20または４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノール、ホルムアルデヒドおよびオキシランとのポリマー、DECON、トリスまたは２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールおよびCremophor ELなどの分散剤もしくは湿潤剤を含み得る。
水性懸濁液はまた、１または２以上の保存剤、例えば、エチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート；１または２以上の着色剤；１または２以上の香味剤；および、スクロース、アスパルテームまたはサッカリンなどの１または２以上の甘味剤を含み得る。
油性懸濁液
油性懸濁液は、活性成分を、植物油、例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油、オメガ３脂肪酸を含む魚油中、または流動パラフィンなどの鉱物油の中に懸濁することにより、製剤化することができる。油性懸濁液は、増粘剤、例えばミツロウ、固形パラフィンまたはセチルアルコールを含んでもよい。甘味剤および香味剤を、美味な経口製剤を提供するために添加してもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加により保存することができる。
分散可能な散剤および顆粒
分散可能な散剤および顆粒は、水性懸濁液の製造のために好適である。それらは、活性成分を、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１または２以上の保存剤との混合物中に提供する。好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤は、既に先に述べたものにより例示される。追加の賦形剤、例えば、上記の甘味剤、香味剤および着色剤もまた存在してもよい。
乳液
医薬組成物はまた、水中油型乳液の形態におけるものであってもよい。油相は、オリーブ油またはラッカセイ油などの植物油であっても、流動パラフィンなどの鉱物油であっても、これらの混合物であってもよい。好適な乳化剤として、アラビアゴム、トラガカントガム、大豆、レシチン、ポリオキシエチレンオキシドソルビタンモノラウレート（Tween 80）が挙げられる。乳液はまた、甘味剤および香味剤を含んでもよい。
シロップおよびエリキシル剤
シロップおよびエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、アスパルテームまたはスクロースとともに製剤化してもよい。かかる製剤はまた、粘滑薬、保存剤、香味剤および着色剤を含んでもよい。
注射剤（injectable）
医薬組成物は、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液の形態であってよい。この懸濁液は、上記の好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて公知の方法に従って製剤化することができる。無菌注射用製剤は、非毒性の非経口で受容可能な希釈剤または溶媒中の懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であってよい。使用することができる受容可能なキャリアの中には、水、リンガー溶液および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の硬化油は、溶媒または懸濁媒として従来用いられている。この目的のために、合成のモノ−またはジ−グリセリドを含む、任意の無菌の（bland）硬化油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の製剤において使用できる。
非経口投与のために好適な組成物として、限定されないが、水性および非水性の無菌注射溶液が挙げられる。皮下投与のための適切な送達機構として、限定されないが、インプラント、デポー剤、注射（needle）、カプセル、または浸透圧ポンプが挙げられる。
持続放出組成物
持続放出組成物を製造することができる。持続放出製剤の好適な例として、固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形した物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例として、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸との共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、LUPRON DEPOTＴＭ（乳酸−グリコール酸子ポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射可能ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸共重合体などのポリマーは、分子を１００日間を超えて放出することができるが、特定のハイドロゲルは、タンパク質をより短い期間放出する。
活性剤を、例えば、従来の技術によるまたは界面重合によるマイクロカプセル製剤、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド状薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて、封入してもよい。
持続放出のためのマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン（ｒｈＩＦＮ）、インターロイキン−２およびMN rgp120について、成功裏に行われてきた。これらのタンパク質の持続放出製剤は、その生体適合性および広範な生分解性特性のためにＰＬＧＡポリマーを用いて開発された。ＰＬＧＡ、乳酸およびグリコール酸の分解製品は、ヒトの体内において速やかに除去される。さらに、このポリマーの分解性は、その分子量および組成に依存して、数カ月から数年まで調整することができる。
遺伝子治療
さらなる態様において、対象への投与を目的として、１または２以上の本明細書において定義されるペプチドをコードするポリヌクレオチドを、組み換え発現ベクター中に挿入する。
用語「組み換え発現ベクター」とは、１または２以上のペプチドをコードする核酸の挿入または組み込みにより操作された、当該分野において公知のプラスミド、ウイルスまたは他のビヒクルを指す。かかる発現ベクターは、宿主における挿入された遺伝子配列の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含む。発現ベクターは、典型的には、複製の起点、プロモーター、ならびに形質転換細胞の表現型による選択を可能にする特定の遺伝子を含む。
一態様において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から誘導されたものであり、十分なレベルの本明細書において定義されるペプチドの発現を誘導することができる、構成的なまたは調節可能なプロモーターを含む。好ましくは、ウイルスベクターは、WO 93/24641において記載されるものなどの、ＡＡＶの逆位末端反復配列を含む。好ましい態様において、ウイルスベクターは、pTR-UF5プラスミドのポリヌクレオチド配列を含む。pTR-UF5プラスミドは、pTR.sub.BS-UF/UF1/UF2/UFBシリーズのプラスミド（Zolotukiin et al., 1996; Klein et al., 1998）の改変バージョンである。
目的とする発明について有用なプロモーターとして、例えば、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター（ＣＭＶ）、ヒト伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１）、核内低分子ＲＮＡプロモーター（Ｕ１ａおよびＵ１ｂ）、α−ミオシン重鎖プロモーター、サルウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）、アデノウイルス主要後期プロモーター、β−アクチンプロモーター、およびＣＭＶエンハンサー／β−アクチンプロモーターを含むハイブリッド調節エレメントが挙げられる。これらのプロモーターは、広範な哺乳動物細胞において活性であることが示されている。
プロモーターは、１または２以上の本明細書において定義されるペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと作動可能に連結する。「作動可能に連結する」により、プロモーターエレメントが、コード配列に対して、コード配列の発現を生じさせることができるように位置していることが意図される。
また本発明のベクターによる使用のために企図されるのは、誘導性かつ細胞型特異的なプロモーター、例えば、Tet−誘導性プロモーター（Clontech, Palo Alto, Calif.）およびVP16-LexAプロモーター（Nettelbeck et al., 1998）である。
所与のプロモーターからの転写のレベルを増大させるために機能することができる転写エンハンサーエレメントもまた、ベクター中に含めることができる。エンハンサーは、一般に、プロモーター配列に対して３’または５’のいずれかの向きにおいて配置される。天然のエンハンサーに加えて、合成のエンハンサーを本発明において用いてもよく、例えば、筋特異的エレメント、血清応答因子結合エレメント（ＳＲＥ）、筋細胞特異的エンハンサー因子−１（ＭＥＦ−１）、筋細胞特異的エンハンサー因子−２（ＭＥＦ−２）、転写エンハンサー因子−１（ＴＥＦ−１）およびＳＰ−１を含む（Li et al., 1999; Deshpande et al., 1997; Stewart et al., 1996; Mitchell and Tjian, 1989; Briggs et al., 1986; Pitluk et al., 1991）、Spc5-12から誘導されたエレメントから無作為に組み立てられた合成エンハンサーを、ベクター中に用いてもよい。
遺伝子治療方法は、患者の細胞または組織のex vivoまたはin vivoでの処置により行うことができる。ベクターを、当該分野において公知の方法を用いて、好適な細胞、細胞株または組織中に導入する。ウイルス粒子およびベクターは、細胞または組織中に、in vitroまたはin vivoで導入することができる。企図される方法として、トランスフェクション、形質導入、注入および吸入が挙げられ、例えば、ベクターを、目的のベクターを含むリポソームを用いて、ベクター単独による直接トランスフェクション、エレクトロポレーションにより、または微粒子銃（particle bombardment）により、細胞に導入することができる。
投与
活性物質を投与単位形態において製剤化することは、投与の容易性および投与の均一性のために特に有用である。「投与単位形態」とは、本明細書において用いられる場合、処置されるべき対象のための単位投与に適した物理的に分離した単位を指す。各々の単位は、必要とされる医薬用キャリアとの関連において所望の治療効果をもたらすために計算された予め決定された量の活性剤を含む。投与単位形態についての詳細は、活性剤の特有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに目的の処置のための活性剤を配合のする技術における限定要因により決定され、これらに依存する。代わりに、組成物は、複数用量形態において提示してもよい。
投与単位の例は、密封されたアンプルおよびバイアルを含み、使用の直前に無菌の液体キャリアの添加のみを必要とする凍結乾燥状態において保存することができる。
剤またはワクチンはまた、容器、パック、またはディスペンサー中に、投与のための説明書と共に含めることができる。
投与される実際の量（または用量もしくは投与量）ならびに投与の速度および時間経過は、処置される状態の性質および重篤度に依存する。処置の処方箋、例えば、投与量、タイミング、頻度などの決定は、一般的な医師または専門家（ヒトの医師、獣医師または医科学者を含む）の責任の範囲内であり、典型的には、処置されるべき障害、対象の状態、送達の部位、投与の方法、および医師に知られる他の要因を考慮する。技術およびプロトコルの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences,、第１８版（1990）（Mack Publishing, Company, Easton, PA, U.S.A.）において見出すことができる。用量、投与頻度、期間、投与の経路および維持療法の必要性は、他のペプチド免疫治療薬についての基準に基づくことができる。
有効量は、１分間、１時間、１日、１週間または１カ月あたり、ｎｇ／体重１ｋｇ〜ｇ／体重１ｋｇで測定することができる。
本発明の剤またはワクチンのin vivoでの投与が用いられる場合、通常の投与量は、１日あたり、約１０ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／哺乳動物の体重１ｋｇ、またはそれより多く、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／ｄａｙ〜１０ｍｇ／ｋｇ／１日で、投与の経路に依存して、変化し得る。特定の投与量および送達の経路についての指導は、文献において提供される。
剤またはワクチンの毒性および治療効力は、標準的な薬学的手順により、細胞培養または実験動物において、ＩＣ５０および最大耐用量を決定することにより、決定することができる。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒトのために好適な範囲を処方するために用いることができる。
診断および処置の効力
本明細書において定義されるペプチドはまた、診断剤としても有用である。
一例において、グルテン寛容を、本明細書において定義されるペプチドに暴露された、刺激された細胞、例えばTreg細胞から分泌されるＩＬ−１０および／またはＴＧＦβを測定することによりアッセイする。Treg細胞は、大量のＩＬ−１０およびＴＧＦβを産生する能力により特徴づけられる。ＩＬ−１０は、免疫抑制に関与する主要なサイトカインの一つであると考えられ、抑制の標的は、エフェクター細胞におけるＩＬ−２の転写制御であると考えられる。
別の例において、グルテン寛容を、刺激された細胞、例えば、グルテン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞から分泌されるＩＦＮγを測定することによりアッセイする。
診断試験は、全血またはそこから単離された、および／または分画された細胞を用いてin vitroで行ってもよい。
一例において、細胞は、先にペプチドの１または２以上に（単独で、あるいはＭＨＣ分子もしくはその断片、またはペプチドをロードしたＡＰＣと組み合わせて）暴露されている。別の例において、細胞は、ペプチドとの（単独での、あるいはＭＨＣ分子もしくはその断片、またはペプチドをロードしたＡＰＣと組み合わせての）共インキュベーションにより、in vitroで刺激される。
剤の直接的なＴ細胞媒介性の効果は、末梢血または組織（例えば小腸）から単離された細胞を利用する機能的アッセイにより、モニタリングすることができる。コグネイトＴ細胞の下流でのペプチド投与の効果は、免疫細胞の型、組織、生体液（例えば、血漿、腸分泌物、尿または糞便）を用いてアッセイすることができる。
一般に、コグネイトＴ細胞により認識されたペプチドの生物学的効果は、用量レジメン、投与の様式、および、ペプチドが修飾されているかまたは免疫学的特性を有する別の化合物、例えばアジュバントと共投与されるか否かに依存して、炎症促進性であるかまたは免疫寛容誘発性であるかのいずれかである。ペプチドに基づく治療用ワクチンにおける使用のために選択されたこれらのおよび他のペプチドは、一般に、短く（＜２９アミノ酸）、水溶性であり、自然免疫効果を有さず、病原性Ｔ細胞の実質的な特性により認識される。Ｔ細胞媒介性疾患および他のヒト疾患の動物モデルにおける観察に基づいて、初回投与の後に、コグネイトＴ細胞の活性化が起こる。しかし、剤の繰り返しの投与は、Ｔ細胞のアネルギーおよび／または寛容を誘導すると予測される。進行中の定期的なペプチド投与は、グルテンに対する寛容を維持し、小腸における炎症を抑制し、炎症促進性グルテン特異的Ｔ細胞を全身的に阻害することが予測される。
したがって、治療成功の重要なマーカーは、計画的なグルテン消化の後での、小腸における炎症の不在である。グルテン消化の後での正常なまたは炎症した腸組織を予測する可能性がある免疫の代替的マーカーは、免疫活性化、炎症または寛容に関連する可溶性または細胞結合型タンパク質または低分子を測定するための、純粋な、または粗の、免疫細胞、生体液または組織試料の混合物を利用する、広範囲のアッセイを含む。これらのアッセイは、げっ歯類、ヒトにおける免疫疾患、特にセリアック病に精通した免疫学者、免疫組織学者および医師に周知である。より具体的には、セリアック病およびグルテンにより誘導される免疫の活性を評価するマーカーは、小腸の組織学、血清ＩｇＡおよびＩｇＧ特異的グリアジン（タンパク質またはペプチド）、ならびにｔＴＧを含む多様な宿主タンパク質が含まれる。
セリアック病のペプチド免疫治療をモニタリングする上での使用のために、またはセリアック病の診断のために適している、セリアック病における免疫の一般的な、および特異的なマーカーとして、以下が含まれる：
（ａ）血液または組織から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞に対するペプチドの直接的効果は、ex vivo／in vitroで、ペプチドにより刺激されたサイトカイン放出、Ｔ細胞増殖、またはin vivoで変化する場合があるＣＤ４＋Ｔ細胞マーカーの決定により、モニタリングすることができる。
（ｂ）ぺプチドまたはグルテンに対して特異的な個々のＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度および表現型は、一般に、細胞の直接的な計数により、例えばＦＡＣＳ分析により、評価することができる。通常ではグルテンフリー食に従っているセリアック病を有する患者におけるグルテンの経口消化は、ペプチドおよびグルテンに対して特異的なＴ細胞を刺激することが一般的に知られている。グルテンチャレンジなどの臨床試験を、血液または他の組織において誘導されるＴ細胞を評価するために用いてもよい。次いで、単離されたＴ細胞の表現型を、新鮮なまま、またはin vitroでの短期増殖の後で、評価することができる。Ｔ細胞のアッセイは、ＭＨＣ−ペプチド複合体、抗原により刺激された細胞内サイトカイン、または抗原により活性化されたＴ細胞上で誘導される他の細胞表面マーカーに依存し得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞の機能的状態は、多様な細胞表面および細胞内マーカー、例えば、ＣＤ２５およびＣＤ６９を含む活性化マーカー、または「寛容」および調節性Ｔ細胞の機能のマーカー、例えば、ＧＩＴＲおよびＦＯＸＰ３の存在と相関する。ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３などのサイトカインの産生、およびＩＬ−１７の産生は、古典的なＴｈ１、Ｔｈ２またはＴｈ１７の炎症促進性免疫応答について、炎症促進性であると考えられる。対照的に、ＩＬ−１０およびＴＧＦβの分泌は、免疫寛容誘発性の免疫応答に関連する。炎症促進性免疫応答のマーカーが低下すること、および／または免疫寛容誘発性の免疫応答のマーカーが強化されることが予測される。
（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するペプチドの効果はまた、細胞の混合物、例えば、全血、ＰＢＭＣ、組織から単離された単核細胞を用いて、またはペプチドと共にインキュベートされた組織を用いて、測定することができる。個々のまたは複数のタンパク質またはサイトカインおよびケモカインなどの関連する免疫もしくは疾患関連タンパク質をコードするＲＮＡを、ペプチドとの短期のインキュベーションの後で評価してもよい。患者に対するグルテンもしくはそのペプチドの投与の前および／もしくは後でのＰＢＭＣを用いるIFNγELISpotなどのアッセイ、またはＰＢＭＣを用いるケモカインおよびサイトカインの多重アッセイは、患者からのペプチド特異的Ｔ細胞の生物学的効果を検出することができる。ペプチドの治療効果は、炎症促進性免疫応答に関連するマーカーから、免疫寛容に関連するマーカー（例えばＩＬ−１０）へのシフト、およびＩＦＮγなどの炎症促進性マーカーの一般的な減少により示される。
（ｄ）組織に対するペプチドの効果は、現実的であり得る。機能的アッセイは、ＰＰＤ（精製タンパク質誘導体）の皮内適用および２４〜７２時間後の注射部位における発赤の直径の評価を伴う結核のためのMantoux試験におけるもののように、遅延型過敏を評価するためのペプチドの皮膚への直接的適用の形態をとり得る。ペプチドはまた、同じ様式において評価するために、他の粘膜および皮膚部位に適用してもよい。診療において、ペプチドおよび穀物のいずれから誘導されたタンパク質により刺激された免疫応答も、セリアック病において重要である。例えば、選択されるペプチドを用いる免疫治療が、ペプチドに対して特異的なＴ細胞により刺激される免疫応答の抑制をもたらすのみならず、「寛容」が「感染性」であり、また他のグルテンから誘導されるペプチドおよびグルテン自体に対する炎症促進性免疫の抑制をももたらすことが予測される。したがって、ペプチド治療の効果はまた、セリアック病において、上記のアッセイにおけるペプチドの代わりに多様な穀物（コムギ、ライムギ、オオムギ）から誘導されるグルテンを用いて、モニタリングすることができる。実際、ネコに感受性の喘息のためのペプチド治療は、治療用ペプチドが誘導された元の全タンパク質抗原を利用する皮膚試験などによりモニタリングされている（Oldfield et al., 2002）。
（ｅ）最終的に、ペプチド免疫治療の臨床的効果は、グルテンに暴露された組織の組織学的試験により評価する。これは、典型的には小腸であるが、実験的設定においては口腔および直腸の粘膜もまた評価され、原理的には食道および結腸などの他の部位においても評価され得る。これらの部位からの組織は、直接的な可視化により、典型的には内視鏡生検により、採取することができる。内視鏡による直接的な可視化はまた、粘膜の外観によってセリアック病を診断するために用いられてきた。、絨毛萎縮症は、標準的な内視鏡および拡大カプセル内視鏡により評価することができる。したがって、ペプチドの寛容誘発性効果は、胃腸管における顕微鏡的な組織損傷の検出により簡便に評価することができる。
（ｆ）ペプチドもしくは他のグルテンペプチドに特異的な免疫グロブリン、またはセリアック病に関連する自己抗原は、疾患の活性、および、ペプチド自体の治療効果を損ない得るオプソニン化活性に関する、グルテン免疫のマーカーを提供する。
（ｇ）ペプチドもしくはグルテンに特異的なＩｇＥ、または末梢血好塩基球によるヒスタミン放出などの、アナフィラキシーに関連するマーカーの存在はまた、ペプチド免疫治療の合併症および治療を調整または停止する必要性を予測するために用いることができる。
食品試験
本発明はまた、組成物または食品がセリアック病を引き起こすことができるか否かを決定する方法を提供し、該方法は、組成物または食品試料中の本発明の剤、本発明のペプチドおよび／または本発明のポリヌクレオチドの存在を検出することを含む。典型的には、これは、結合アッセイを用いることにより行うことができ、ここで、１または２以上の本明細書において定義されるペプチドに特異的な様式において結合する１または２以上の化合物を、組成物と接触させ、ペプチド／化合物複合体の形成を検出して、ペプチドの存在を確認するために用いる。一例において、化合物は抗体である。任意の好適なフォーマットの結合アッセイを用いることができる。典型的には、アッセイは、非競合的なサンドウィッチ型ＥＬＩＳＡにおいて、グルテンペプチドに対するモノクローナル抗体を利用する。食品試料は、まず抽出し、随意に希釈し、次いでアッセイにおいて試験する。
組成物または食品は、典型的には、グルテンを発現する植物からの材料を含む。かかる材料は、収穫された産物（例えば種）などの植物の部分であってよい。材料は、小麦粉またはグルテンを含む食品などの植物材料の加工製品であってもよい。好適な結合アッセイにおける食品材料の加工および試験は、慣用的である（例えば、Kricka, 1998を参照）。組成物または食品材料を、化合物と接触させる前に、ｔＴＧで処置してもよい。
一態様において、組成物または食品材料を、脱アミド化または非脱アミド化形態における、本明細書において定義されるペプチドに特異的である、少なくとも２、３、５、１０またはそれより多くの抗体と接触させる。好ましくは、抗体は、プロテアーゼ耐性である配列に対するものであり、コムギにおけるα、β、γおよびωグリアジンならびにＬＭＷおよびＨＭＷグルテニン、オオムギにおけるＢ、ＣおよびＤホルデイン、ライムギにおけるβ、γおよびωセカリン、ならびに随意にカラスムギにおけるアベニンの検出を可能にする。
本明細書において定義されるペプチド／エピトープに対する抗体は、食品中のグルテンの検出および／または定量のためのアッセイにおける使用のためのキットの形態において提供してもよい。
プロテアーゼ同定
本発明はまた、本明細書において定義されるペプチドを切断することができるプロテアーゼを同定する方法を提供し、該方法は、ペプチドを、プロテアーゼと、該ペプチドの特異的切断をもたらしタンパク質分解生成物を生成するための条件下において接触させること、および該タンパク質分解生成物を検出することを含む。一例において、タンパク質分解生成物は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＥＬＩＺＡまたはウェスタンブロットを用いて検出する。さらなる例において、ペプチドを、蛍光ドナーと消光アクセプターとの間の分子内共鳴エネルギー転移を可能にするために、蛍光ドナーおよび消光アクセプターに融合させる。切断の際に、ドナーとアクセプターとは分離し、ドナーの蛍光放出の検出を可能にする。典型的には、ペプチドは、蛍光ドナーと消光アクセプターとを、約１００オングストローム未満の距離で分離する。蛍光ドナーは、ペプチドのＣ末端に結合することができ、消光アクセプターは、ペプチドのＮ末端に結合することができ、逆もまた然りである。
例
例１：免疫優性ペプチドの決定
対象
志願者は、年齢１８〜７０歳の成人であり、厳密にグルテンフリー食に従っている。全ての志願者がＨＬＡ ＤＱＡＢ１＊０５およびＨＬＡ ＤＱＢ１＊０２の両方をコードする遺伝子を保有することを、末梢血ＤＮＡの配列特異的プライマー混合物を用いたＰＣＲにより決定した（Bunce et al., 1995; Olerup et al., 1993; Mullighan et al., 1997）。セリアック病を有する志願者を、ESPGAN基準に基づいて診断した（Report of Working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition, 1990）。グルテンチャレンジを経験しているセリアック病を有する対象は、少なくとも１カ月の間グルテンフリー食を摂取し、順守することを要求された（陽性ｔＴＧ−ＩｇＡまたはＥＭＡは例外であった）。健康なＨＬＡ ＤＱ２（筋内膜ＩｇＡ陰性）は、グルテンチャレンジを開始する前に４週間、厳密にグルテンフリー食に従った。
３日間のグルテンチャレンジ
コムギチャレンジ：朝食および昼食に、Sainsburyの「standard white sandwich bread」（ＵＫ−パイロット（Pilot）ライブラリーを評価するため）またはBaker's Delightの「white bread block loaf」のいずれかの５０ｇの２切れ。
オオムギチャレンジ：粒状のオオムギ（Ward McKenzie, Altona, Australia）をリゾットとして調理したもの（１日あたり乾燥重量１５０ｇ）。リゾットの分量は、朝食、昼食および夕食用に当量の分量に分けた。
ライムギチャレンジ：１日あたり乾燥重量１００ｇのライムギ粉の、マフィンの形態における、朝食時に開始して毎日消費。原料のライムギ粉は、Long Ashton Research Station（英国）において「隔離」して育て、その後手作業で製粉したライムギから、または、Biodynamicのライムギ粉（Eden Valley Biodynamic Farm, Dumbleyung, Australia）からのものであった。
コムギ、オオムギおよびライムギチャレンジの組み合わせ：２５ｇの小麦粉（White Wings, Goodman Fielder, Australia）、２２ｇのオオムギ粉（Four Leaf Milling, Tarlee, South Australia）および２２ｇのライムギ粉（Four Leaf Milling, Tarlee, South Australia）からなる２のマフィンを毎日食した。
抗原
合成ペプチド（純度＞７０％）を、Research Genetics（USA）、Mimotopes（Australia）またはPepscan（Netherlands）から購入した。モルモット肝臓ｔＴＧ（Sigma T5398）による脱アミド化は、先に記載された通りであった（Anderson et al., 2000）。ペプチド（２ｍｇ／ｍｌ）またはグリアジン（Sigma G3375）を、４時間、３７℃で、１０倍過剰量において、炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８）中のキモトリプシン（Sigma C3142）またはトリプシン（Sigma T1426）と共に、または５％酢酸（ｐＨ２．５）中のペプシン（Sigma P6887）と共に、インキュベートし、次いで、ＮａＯＨでｐＨ７に中和し、最後に、１５分間煮沸した。プロラミンタンパク質濃度を、ＢＣＡ法（Pierce, USA）により決定した。ホルデインおよびセカリンの画分を、他の穀物から隔離されて育てたライムギおよび大麦の手作業で製粉した粉を用いて調製し、公開された方法（Tatham, A.S., Gilbert, S.M., Fido R.J., and Shewry, R. Extraction, separation, and purification of what gluten proteins and related proteins of barley, rye, and oats. In: Marsh M, ed., Celiac disease methods and protocols. Totowa: Humana (2000) pp55-73）に従って分画した。
ペプチドライブラリー
コムギ、オオムギおよびライムギグルテンペプチドのライブラリーを、アラインメントおよび系統学（「パイロット」ライブラリー、配列表、表３および４を参照）により、または、NCBI Genbankにおいて２００６年に、グリアジン、グルテニン、ホルデインおよびセカリンについて、それらのゲノムコード（野生型）配列（「包括的（Comprehensive）」ライブラリー）、もしくは野生型およびin silicoでのｔＴＧ脱アミド化配列（「検証（Verification）」ライブラリー）の両方において、エントリーに適用された、カスタム化されたアルゴリズムを用いて、規定の脱アミド化モチーフ（Beissbarth, et al., 2005）に従って、設計した。
ELISpotアッセイ
９６ウェルプレート（MSIP−S45−10; Millipore, Bedford, MA）を用いるIFNγELISpotアッセイ（Mabtech, Sweden）を、グルテンチャレンジを開始した６日後における０８００時と正午との間に採取された末梢血からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて、先に記載したとおり行った。簡単に述べると、ELISpotプレートを、ＰＢＳで希釈した１：１００の濃度（５０μｌ／ウェル）の無菌のキャプチャー抗サイトカイン抗体でコーティングし、ホイルで包んで一晩４℃に置いた。使用の前に、各プレートを３回無菌ＰＢＳで洗浄し、２時間３７℃での１０％のＦＣＳ（５０μｌ／ウェル）を含むＲＰＭＩの添加により非特異的結合をブロッキングした。５×の濃度での抗原を各ウェルに添加し（２５μｌ）、その後、完全培地（１００μｌ）中に懸濁した新たに単離したＰＢＭＣを添加し、一晩（１６〜２０時間）３７℃で５％のＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。細胞および培養培地を、次いで廃棄し、プレートを、冷たい蒸留水で１回、次いで０．０５％のTween-20（Sigma P2287, St Louis, USA）を含むＰＢＳで３回、およびＰＢＳで３回洗浄した（各洗浄は２００μｌ／ウェル）。０．５％のＦＣＳ（５０μｌ／ウェル）を含むＰＢＳ中で希釈されたビオチン化抗サイトカインｍＡｂ（１：１０００）を、２時間室温でインキュベートした。ウェルを、ＰＢＳで６回洗浄し（２００μｌ／ウェル）、ストレプトアビジン−ＡＬＰ（１：１０００）を添加し（５０μｌ／ウェル）、１時間室温でインキュベートした。洗浄の後でＢＣＩＰ−ＮＢＴ発色剤基質を添加し（５０μｌ／ウェル）、スポットを発色させた。スポットが初めに可視化したとき、冷水下における洗浄により、発色を停止させた。個々のウェルにおけるスポット形成単位（ＳＦＵ）の数を、コンピューター支援ビデオ画像分析（AID ELISpot Reader System, AID Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Germany）により計数した。結核菌精製タンパク質誘導体（PPD RT49）（５μｇ／ｍｌ）および／または破傷風トキソイド（ＣＳＬ）（１０の光形成単位／ｍｌ）を、陽性対照の抗原とした。
Ｔ細胞クローンの単離
ＰＢＭＣを、ヘパリン処置した全血から、Leucosepチューブ中でFicoll-Paque Plusを用いて単離した。固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）を、小腸生検から、まず試料をＰＢＳ中１ｍＭのＤＴＴで処置し、その後、３７℃での３０分間の２．４Ｕ／ｍＬのディスパーゼＩＩ中での２回のインキュベーションにより、単離した。次いで生検を刻み、３７℃で１時間、２Ｕ／ｍＬのリベラーゼブレンザイム（Liberease Blendzyme）３およびＲＰＭＩ中でインキュベートした。ＰＢＭＣおよびＬＰＭＣを、ＰＢＳ中で３回洗浄した。典型的には、０．５〜１×１０６のＬＰＭＣを回収し、２０００ラドで照射した１．５〜３×１０６の自己ＰＢＭＣと混合した。
ＰＢＭＣおよびＬＰＭＣを、先に記載される通り（Mannering et al., 2003; Mannering et al., 2005）、０．１μＭのＣＦＳＥで染色し、９６ウェルプレート中に、２×１０５細胞／ウェルでプレートした。ペプチドおよびタンパク質抗原をそれぞれ３２μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬで用いた。７〜１０日後に、ＣＤ４＋の増殖をフローサイトメトリー（FACSAria, BD）により測定した。ＣＤ４＋ＣＦＳＥｄｉｍＰＩ−細胞を、培地中に２×１０５のＰＢＭＣ（2000ラドで照射したもの）、２×１０４のＪＹ−ＥＢＶ（５０００ラドで照射したもの）、２０Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ−２、５ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ−４および３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を含む、９６ウェルプレートの単一のウェル中に選別した。細胞に、７日間ごとに２週間、ＩＬ−２の最終濃度が２０Ｕ／ｍＬ、ＩＬ−４が５ｎｇ／ｍＬとなるように、サイトカインを含む培地を与えた。第２５日において、増殖するクローンを同定して、２０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２および５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４を含む４８ウェルプレート中で増殖させた。３Ｈ−チミジン増殖アッセイまたはIFNγELISpotにより、抗原特異性を決定した。１５ｍｌの培地中に３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３と５×１０７のＰＢＭＣ（２０００ラドを照射したもの）および５×１０６のＪＹ−ＥＢＶ（５０００ラドを照射したもの）とを含む培養フラスコ中で、特異的クローンのラージスケール増殖を行った。２４時間後に、ＩＬ−２を５０Ｕ／ｍＬの最終濃度まで添加した。第３日において、増殖物を洗浄し、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含有する２５ｍｌの培地中に再懸濁した。第７日において、細胞を半分に分けて、５０Ｕ／ｍＬの最終濃度でＩＬ−２を含む１２．５ｍｌの培地で満たした。増殖させた細胞を、第１０日において、３Ｈ−チミジン増殖アッセイまたはIFNγELISpotにより、抗原特異性について試験した。
Ｔ細胞クローンの特徴づけ
増殖させた抗原特異的クローンを、IOTest Beta Mark（Beckman Coulter）を用いてクロナリティーについて試験した。陰性クローンがクローンされたことをＴＣＲ Ｖβ鎖のＰＣＲにより確認した。ＨＬＡによる限定を、抗ＨＬＡ−ＤＲ（１０μｇ／ｍｌ、クローンＬ２４３）およびＨＬＡ−ＤＱ（１０μｇ／ｍｌ、クローンＳＰＶＬ３）抗体により決定した。コグネイト抗原に対するクローンによるＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＩＬ−１７の分泌を、ＨＬＡ ＤＱ２＋ＨＬＡ ＤＱ８−ドナーからの照射ＡＰＣ（２０００ラド）を利用するELISpotアッセイにおいて決定した。配列番号２２８、２２９および２３０（それぞれNPL001、NPL002およびNPL003）のリジンスキャニングを、これらのペプチドに特異的なクローンを使用するELISpotまたは増殖アッセイにおいて行った。
データ分析
ELISpot応答は、ＳＦＵが、培地のみよりも４倍大きく、かつ１０ＳＦＵ／ウェルよりも大きい場合に、有意であるとみなした。増殖アッセイは、刺激インデックス（ＳＩ）が３よりも大きい場合に有意であるとみなした。ＳＦＵまたはＳＩを、試験された最も反応性が高いペプチド、ペプチドプールまたはカクテルのパーセンテージとして表わすことにより、データセットを、ドナー間またはクローン間の可変性について正規化した。反応性ペプチドおよびペプチドプールに、少なくとも１つのペプチドまたはプールに応答するドナーの応答を正規化したものの平均値と等価の、０〜１００の「スコア」を割り当てた。
例２：in vivoグルテンチャレンジにより誘導された新鮮なポリクローナルＴ細胞を用いた主要な優性ペプチドの決定
先の研究において、グルテン特異的Ｔ細胞が、ＨＬＡ ＤＱ２＋セリアック病ドナーが経口でのグルテンチャレンジを開始した６日後の血液中でピークに達することが示されている。第６日において、セリアック病ドナーからのＰＢＭＣの、ＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）およびＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）エピトープを含むｔＴＧ処置グリアジン（５００μｇ／ｍｌ）およびα−グリアジンｐ５７−７３ ＱＥ６５（配列番号８）の至適濃度に対するIFNγELISpot応答は、有意に相関していた（ｒ＝０．８０、ｐ＜０．０００１）。１７merに対するIFNγELISpot応答の中央値は、ｔＴＧ処置グリアジン（５００μｇ／ｍｌ）に対するものの５１％であった（ｎ＝１７、範囲：０〜１５５％）。しかし、α−グリアジンｐ５７−７３ ＱＥ６５（配列番号８）は、必ずしも常に免疫優性ではなかった。IFNγELISpot応答は、３／１７のドナーにおけるｔＴＧ処置グリアジンに対するもの（Anderson et al., 2005）の５％未満と等価であった。
これらの観察に基づくと、α−グリアジンｐ５７−７３ ＱＥ６５（配列番号８）に付加的なグルテンペプチドならびにエピトープ配列番号４および／または５を含むペプチドはまた、in vivoグルテンチャレンジにより誘導されたＴ細胞の実質的集団を刺激する筈である。本発明者らは、α−グリアジンｐ５７−７３ ＱＥ６５（配列番号８）ならびに配列番号４および／または５のエピトープを含むペプチドを用いるペプチドに基づく免疫治療が、疾患に関連するグルテン特異的Ｔ細胞集団の十分な大部分を、単独で一貫して標的とする確信がなかった。本発明者らは、α−グリアジンｐ５７−７３ ＱＥ６５（配列番号８）ならびに配列番号４および／または５を含むペプチドのいずれも部分アゴニストであること、ならびに、配列番号８、４および／または５に関する配列が実質的により多くのＴ細胞を刺激するか、または免疫優性エピトープを含む追加のペプチドが、コムギ、オオムギまたはライムギにより発現されるグルテンタンパク質の中に存在することを仮説立てた。
相同性の検索
α−グリアジンｐ５７−７３ ＱＥ６５（配列番号８）のコアとなる５つのアミノ酸であるＰＥＬＰＹ（配列番号２２）に対する全ての置換は、グルテンチャレンジにより誘導される末梢血Ｔ細胞によるその認識を無効にする。
SwissProtおよびTremblデータベースを、配列ＰＥＬＰＹ（配列番号２２）および相当する野生型配列ＰＱＬＰＹ（配列番号２３）を有する１７merをコードする穀類遺伝子について検索した。１３のコムギα−グリアジン１７merはＰＱＬＰＹを有し、１つは８〜１２位にＰＱＬＳＹを有するもの（配列番号２４）を見出したが、配列ＰＥＬＰＹを有するものはなかった。図１に関して、ELISpot応答は、Ｔ細胞エピトープＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）、ＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）およびＤＱ２−α−ＩＩＩ（配列番号５）を有する多様な１７merのから示され、これは、α−グリアジンファミリーのタンパク質のうちの多型性が高い領域に由来する。８人のセリアック病ドナー（コムギグルテンチャレンジを開始した６日後）からのＰＢＭＣの、核配列配列ＰＱＬＰＹ（配列番号２３）またはＰＱＬＳＹ（配列番号２４）を各々が含む１４の天然に存在するα−グリアジン１７merに対する、正規化したIFNγELISpot応答を図１に示す。１７merを、ｔＴＧによる前処理をして、もしくはしないで、または９位のグルタミン（Ｑ９）をグルタミン酸（Ｅ９）と置換して評価した。データを、α−グリアジンｐ５７−７３ ＱＥ６５（２５μｇ／ｍｌ）に対するものに対して正規化した、ドナーのELISpot応答の平均値±ＳＥＭとして表わす。
α−グリアジンｐ５７−７３ ＱＥ６５（配列番号８）と、Ｃ末端においてセリンがプロリンまたはロイシンで置換されていることによってのみ異なる２つの１７merは、ｔＴＧにより前処理された場合に、または９位におけるグルタミンをグルタミン酸に置換した場合に、配列番号８と同程度に活性であった。ＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）と、ＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）またはＤＱ２−α−ＩＩＩ（配列番号５）のいずれかとの両方を含む１７merは、最大数のＴ細胞を刺激した。これらの知見は、腸のＴ細胞クローンのパネルが１１のうち５つの構造的に区別し得る組み換えα−グリアジンを認識したが、ＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）、ＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）またはＤＱ２−α−ＩＩＩ（配列番号５）を含むもののみであったというArentz-Hansenら（2000年）により報告されたものと一致した。幾つかの他のα−グリアジンｐ５７−７３の脱アミド化された多型は、弱い活性であり、Arentz-Hansenら（2000年）により研究されたものの中に存在しなかったＰＱＰＱＰＦＬＰＱＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号２５；Ｗ０９）は、ｔＴＧにより前処理されたかまたは９位にグルタミン酸を有する場合（ＰＱＰＱＰＦＬＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号２６））に、ＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）およびＤＱ２−α−ＩＩＩ（配列番号５）を含む１７merとほぼ同程度に活性であった。先のα−グリアジンｐ５７−７３ ＱＥ６５の置換スキャニングに基づいて、本発明者らは、コア配列ＰＱ［ＩＬＭＰ］［ＰＳＴ］（配列番号２７）を有するホモログについて、より許容的な検索を行った（Anderson et al., 2006）。
１２のグリアジン、グルテニン、ホルデインおよびセカリン配列を合成したが、一つのみ（ω−グリアジンペプチド、ＡＡＧ１７７０２（１４１−１５７））が、培地単独よりも活性であった。このω−グリアジンペプチド、ＰＱＱＰＦＰＱＰＱＬＰＦＰＱＱＳＥ（配列番号２８；ＡＡＤ１７７０２（１４１−１５７））は、ｔＴＧにより前処理された場合または９位にグルタミン酸を有する場合（ＰＱＱＰＦＰＱＰＥＬＰＦＰＱＱＳＥ（配列番号２９））に、α−グリアジンｐ５７−７３ ＱＥ６５の３２±６％活性であった（２５μｇ／ｍｌ；平均値±ＳＥＭ、ｎ＝５ドナー）。
腸クローンおよびin vivoグルテン誘導末梢血ポリクローナルＴ細胞のためのエピトープ
次に本発明者らは、腸Ｔ細胞クローンについて報告されたエピトープを含む脱アミド化された１５merを評価した：ＧＬＩＡ−２０ ＰＦＲＰＱＱＰＹＰＱ（配列番号３０）をその脱アミド化形態ＰＦＲＰＥＱＰＹＰＱ（配列番号３１）において、ＤＱ２−γ−Ｉ ＰＱＱＳＦＰＱＱＱ（配列番号３２）をその脱アミド化形態ＰＱＱＳＦＰＥＱＥ（配列番号３３）において、ＤＱ２−γ−ＩＩ ＩＱＰＱＱＰＡＱＬ（配列番号３４）をその脱アミド化形態ＩＱＰＥＱＰＡＱＬ（配列番号３５）において、ＤＱ２−γ−ＩＩＩ ＱＱＰＱＱＰＹＰＱ（配列番号３６）をその脱アミド化形態ＥＱＰＥＱＰＹＰＥ（配列番号３７）において、ＤＱ２−γ−ＩＶ ＳＱＰＱＱＱＦＰＱ（配列番号３８）をその脱アミド化形態ＳＱＰＥＱＥＦＰＱ（配列番号３９）において、Ｇｌｕ ５ ＱＩＰＱＱＰＱＱＦ（配列番号４０）をその脱アミド化形態ＱＩＰＥＱＰＱＱＦ（配列番号４１）において、およびＧｌｔ−１５６ ＰＦＳＱＱＱＱＳＰＦ（配列番号４２）をその脱アミド化形態ＰＦＳＥＱＱＥＳＰＦ（配列番号４３）において、ならびにまた、ＤＱ２−γ−Ｖ ＬＱＰＱＱＰＦＰＱＱＰＱＱＰＹＰＱＱＰＱ（配列番号４４）、およびα−グリアジンｐ３１−４９ ＬＧＱＱＱＰＦＰＰＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ（配列番号４５）（０．１〜１００μｇ／ｍｌの範囲にわたって）。８／９のＨＬＡ ＤＱ２セリアック病ドナーにおいて、脱アミド化グリアジンに対するIFNγELISpot応答を検出した（中央値２３、範囲１３〜１５３ＳＦＵ／１０×１０６ＰＢＭＣ）。図２は、ＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）およびＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）を含む（５μＭ）、１７位にロイシンを有する脱アミド化α−グリアジンｐ５７−７３ ＱＥ６５の変異体、ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＬ（配列番号４６）、ならびに、ＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）およびＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）およびＤＱ２−α−ＩＩＩ（配列番号５）の重複するタンデムリピートを含む３３merのＬＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（配列番号２；脱アミド化α２−グリアジン５６−８８）（５μＭ）に対して応答した７人のドナーを示す。至適濃度（５０μＭ）において、１７merと３３merとにより刺激されたIFNγELISpot応答の間の差異は、有意ではなかった。１人のドナーは、脱アミド化ＤＱ２−γ−ＩＶ（配列番号３９）を含む１５merに対して応答したが、他の９のエピトープのいずれも、コムギグルテンチャレンジの６日後に採取されたＰＢＭＣにより認識されなかった。
本発明者らは、ＨＬＡ ＤＱ２＋セリアック病を有する殆どの個体において、ＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）、ＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）または関連するＤＱ２−α−ＩＩＩ（配列番号５）のエピトープを含むペプチドは、グルテンのin vivoでのＴ細胞刺激活性に実質的に寄与するが、他の多くの公開されたグルテンエピトープは、in vivoでのグルテン暴露の後で血中で誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞により認識されるペプチドに殆ど一貫して寄与しないことを結論付けた。逆に、グルテンタンパク質の少数のみしか、機能的アッセイにおいて体系的に評価されていないために、強力なＴ細胞刺激活性を有するかもしれない他の配列が見逃されてきた可能性がある。コムギ、ライムギおよびオオムギからのグルテンにおけるＴ細胞エピトープの候補を、セリアック病と関連するグルテン特異的Ｔ細胞応答へのそれらの寄与について包括的に評価するための、新たなアプローチが必要であった。
包括的Triticum aestivumグリアジンペプチドライブラリー
2001年において、T. aestivumのα−、γ−およびω−グリアジンタンパク質について、Genbankに１１１のエントリーがあった。各ポリペプチドに跨って１０〜１２アミノ酸が重複する１５〜２０merのペプチドによるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープマッピングへの古典的アプローチにより、合成およびスクリーニングのためには非実用的に大きなライブラリーが作製されている。しかし、ClustalWによる系統学的分析およびグリアジン配列のアラインメントは、グリアジンの各系統学的サブファミリー間の実質的な配列類似性を示す（Anderson, 1991）。ポリペプチドのアラインメントおよび体系的であるがコンピューター支援ではない設計は、１２アミノ酸が重複する６５２のメンバーの２０merのライブラリーが、１１１のグリアジンのエントリー（したがってGenbankに存在するもの）の中のユニークな１２merを包含するのに十分であることを示した（表３を参照）。ｔＴＧにより前処理された、またはされていない８つまでのペプチドの８３のプールに分けられたこのライブラリーは、グルテンチャレンジ（各プールについて１ウェル）の前および６日後に、一晩のIFNγELISpotアッセイにおける１００ｍｌの血液からのＰＢＭＣを用いてスクリーニングするために実用的であった。次いで、第７日における１００ｍｌの血液のさらなる採取物を、発見の検証および陽性プール中の個々のペプチドを評価するために用いた。
グリアジンペプチドプールへのＴ細胞応答の疾患特異性
初期研究において、パイロットグリアジンライブラリーを、長期間グルテンフリー食（ＧＦＤ）を摂取するＨＬＡ−ＤＱ２＋ＤＱ８−のセリアック病ドナー（ｎ＝９）、およびセリアック病を有する志願者において、末梢血Ｔ細胞を誘導可能なグルテンチャレンジには十分に長い４週間ＧＦＤを摂取した、健康なＨＬＡ−ＤＱ２＋ＤＱ８−の志願者（ｎ＝９）からの血液中のＩＦＮγ分泌性Ｔ細胞の頻度を測定するために、一晩のELISpotアッセイを用いて評価した（Anderson et al., 2005）。健康なドナーの中で、８３のプールのうちの３つに対する応答の増大が、グルテンチャレンジの後で、統計学的有意に達した（ｐ＜０．０５、Wilcoxonの対応のある順位和検定）が、一貫しておらず、弱く、そして脱アミド化により影響を受けなかった（図３を参照）。
９人のセリアック病の対象のうち、グルテンチャレンジを開始した６日後に、１０ＳＦＵ／ウェルを超え培地のみにより惹起されるもの（「バックグラウンド」）よりも４倍より大きな応答を刺激した少なくとも１つのペプチドプールを有する、７人の「レスポンダー（responder）」が存在した。９人のセリアック病ドナーにおける第６日におけるＳＦＵを第０日と比較すると、グルテンチャレンジの後で健康なドナーによっても弱く認識された１つのプール（プール２０）を含む、３４のプールに特異的なＴ細胞の優位な誘導（ｐ＜０．０５、片側Wilcoxon対応のある順位和検定）が存在した。セリアック病ドナーの間で、ｔＴＧ前処置は、キモトリプシンで前処置されたグリアジン、およびまた試験したペプチドプールのうちの１１を認識する末梢血Ｔ細胞の頻度を増大させた（ｐ＜０．０５、片側Wilcoxon対応のある順位和検定）。
全グリアジン特異的Ｔ細胞集団に対するプール（または後の実験においてはペプチド）の一貫性および相対的寄与に基づいた階層を定義するために、０〜１００の「スコア」を、第６日または第７日における「バックグラウンド」より高い「レスポンダー」のIFNγELISpot（ＳＦＵ／ウェル）応答の平均に基づいて計算し、任意のプール（またはライブラリーペプチド）に対するそれらの最大応答のパーセンテージとして表わした。
全８３のｔＴＧ処置プールから、１８（２２％）が、第６日において１０を超える「スコア」を有し、全てが、第０日と第６日との間で応答の有意な誘導と関連していた。一方、５／９および７／１２のプールは、第６日においてそれぞれ５〜１０または１〜５のスコアであり、第０日と第６日との間で応答の有意な誘導と関連していた。他の６つのプールは、応答の有意な誘導と関連したが、１未満のスコアを有した。その後のペプチドライブラリーの分析の間、プールまたはペプチドについての５以上の「スコア」を、Ｔ細胞応答について「陽性」とみなし、さらなるマッピングの理由とするための任意のカットオフ値として設定した。
また、プールの殆ど４分の１が陽性であり、逆重畳積分が必要であったことから、グリアジンペプチドのプールを利用することが、相対的に不十分であることもこの初期実験から明らかであった。その後の実験において、プールではなく個々のペプチドを評価した。単一の３００ｍｌの血液採取物からのＰＢＭＣを用いて可能な限り多くのペプチドをスクリーニングすることを可能とするために、（ｔＴＧ処置はELISpot応答の低下と関連したことがないので）全てのペプチドをｔＴＧ処置し、ライブラリーを第６日と第０日のみにおいてスクリーニングした。
４／７の「レスポンダー」において、ＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）、ＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）および／またはＤＱ２−α−ＩＩＩ（配列番号５）のエピトープを含む２０merを有するα−グリアジンのプール１０または１２が最も活性が高く、他の３人のレスポンダーにおいて、ω−グリアジンプール８１が最も活性が高かった。全体的には、α−グリアジンプール１２は、最も高いスコア（７８）を有し、次点はω−グリアジンプール８１（７２）であった。プール７〜１３、４２〜５３、６８および７８〜８２からの個々のｔＴＧ処置されたペプチドを、５／７のレスポンダーから第７日において採取されたＰＢＭＣを用いて評価した（図４を参照）。
全てのケースにおいて、各プールからの幾つかのペプチドが反応性であった。ＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）およびＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）および／またはＤＱ２−α−ＩＩＩ（配列番号５）のエピトープを含むペプチドは、グリアジンの２０merのライブラリー中で最も活性が高い５つであることが確認されたが、プール８０および８１からの４つのω−グリアジン２０merは、最も活性が高いα−グリアジン２０merの５３〜６５％の活性であった。ω−グリアジン２０merの４つ全ては、ＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）および／またはＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）に相同な配列を含んだ。すなわち、ＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰＷ（配列番号４７；Ｗ０３；Ｂ０１）、ＰＦＰＱＰＱＱＰＩＰＶ（配列番号４８；Ｗ０４）、ＱＰＦＰＱＰＱＬＰＦＰＱ（配列番号４９；Ｗ０６）、これは配列番号２８において含まれ、３つは、脱アミド化されてＥＱＰＥＱＰＦＰＱ（配列番号５１）となった場合に、ＤＱ２−γ−ＶＩＩエピトープＱＱＰＱＱＰＦＰＱ（配列番号５０）特異的な腸Ｔ細胞クローンにより認識されることが報告される配列を含む。
図５は、脱アミド化ＰＱＱＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰＷＱＰ（配列番号５２）（先にWO 2005/105129において記載される通り）の免疫原性領域を詳細にマッピングするための、コムギチャレンジ後のセリアック病ドナーからのＰＢＭＣのIFNγELISpot応答を示す。配列番号５２にわたる組織トランスグルタミナーゼ処置された１５merは、各ドナーについて最も活性が高い１５merのパーセンテージとして表わされる（平均値＋ＳＥＭ、ｎ＝８）（Ａ）。配列番号５２のＴ細胞刺激活性は、殆ど完全に、ＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）およびＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）のホモログを含む脱アミド化された配列、ＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰＷ（配列番号４７）に起因する。図５Ｂは、コムギチャレンジ後のセリアック病ドナーからのＰＢＭＣのIFNγELISpot応答をＱ３ Ｅ１０変異体に対する個々のドナーの最大の応答に対して正規化して示す（平均値＋ＳＥＭ、ｎ＝６）。ＱＰＱＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰＷＱＰ（配列番号５３）中のＱ１０のＱＰＱＱＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱＰ（配列番号５４）への脱アミド化は、最適な免疫原性を運搬するために十分であり、二重に脱アミド化された配列、ＱＰＥＱＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱＰ（配列番号５５；Ｗ０３−Ｅ７）は、同等の生理活性を有する。図５Ｃは、コムギ（ｎ＝７）、オオムギ（ｎ＝９）、またはライムギチャレンジ（ｎ＝１０）後のセリアック病ドナーからのＰＢＭＣのIFNγELISpot応答を、個々のドナーについて最も活性が高いリジン置換１５merに対して正規化して示す（平均値＋ＳＥＭ）。NPL002の中心のＰＱＰＥＱＰＦ配列（配列番号２７２）のリジン置換：ｐｙｒｏＥＱＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱＰ−アミド（配列番号２２９）（３２μｇ／ｍｌ）は、このペプチドの生理活性を無効にした。ＨＬＡ ＤＱＡ１＊０５ ＤＱＢ１＊０２ホモ接合体およびヘテロ接合体からのＰＢＭＣの抗ＨＬＡ−ＤＱとのプレインキュベーションは、このペプチドに対する一晩のIFNγELISpot応答を無効にしたが、抗ＨＬＡ−ＤＲはそうではなかった（データ非表示）。
初期実験において観察されたペプチドの階層を、１３人のさらなるＨＬＡ−ＤＱ２＋８−ドナーからのコムギチャレンジの６日後のＰＢＭＣを用いて、パイロットグリアジンライブラリー中の全ての６５２の個々の２０merを別々に評価することにより検証した（図４を参照）。やはり、ＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）およびＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）および／またはＤＱ２−α−ＩＩＩ（配列番号５）を含む２０merの間の活性に明確な差異は存在せず、このことは、新鮮なポリクローナルＴ細胞は、ＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）についてはほとんど特異的ではないが、ＤＱ２−α−ＩＩＩ（配列番号５）についてはそうでないこと、または逆も然りであることを示唆している。
６人のＨＬＡ−ＤＱ２＋８＋セリアック病ドナーからの、コムギチャレンジを開始した後の第６日にちにおけるＰＢＭＣを、パイロットグリアジンライブラリー中の６５２の個々の２０merの各々に対してスクリーニングした（図４を参照）。ＨＬＡ−ＤＱ２＋８−セリアック病ドナーにおいて最も活性が高かったα−グリアジンペプチドはまた、グルテンチャレンジの後の４人のＨＬＡ−ＤＱ２＋８＋セリアック病ドナーにおいても最も活性が高かった。
６人のＨＬＡ−ＤＱ２＋８＋セリアック病ドナーからの、３日間の純粋なライムギによるチャレンジを開始した後の第６日におけるＰＢＭＣを、パイロットグリアジンライブラリー中の６５２の個々の２０merの各々に対してスクリーニングした（図４を参照）。Ｔ細胞刺激性グリアジン２０merの階層は、コムギによるチャレンジのあとで観察されたものと、厳密には異なる。一晩のIFNγELISpotアッセイにより測定された、ライムギチャレンジの後での血中のＴ細胞は、ＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）、ＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）、またはＤＱ２−α−ＩＩＩ（配列番号５）のエピトープを含む２０merをほとんど認識しない。代わりに、ＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰＷ（配列番号４７）およびＱＰＦＰＱＰＱＱＰＩＰＶ（配列番号４８）を含むω−グリアジン２０merは、免疫優性である。
この観察は、脱アミド化されたコムギグルテンまたはグリアジンに対してin vitroで産生されたＴ細胞クローンは、Vaderら（2003年）により報告されるように、その免疫優性グリアジンペプチドの認識においてしばしば無差別であり得るが、in vivoグルテンチャレンジにより誘導された新鮮なポリクローナルＴ細胞は、密接に関連した配列間の区別を行うことを示唆した。したがって、Vaderら（2003年）による、オオムギおよびライムギからのホルデインおよびセカリンのＴ細胞刺激活性が、配列ＰＦＰＱＰＱＱＰＦ（配列番号９）およびＰＱＰＱＱＰＦＰＱ（配列番号１１）の脱アミド化変異体がＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）およびＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）のホモログである実質的な原因であったという結論は、ライムギによるチャレンジの後のセリアック病ドナーからの新鮮なＰＢＭＣを用いては確認されなかった。さらに、ライムギチャレンジによりin vivoで誘導された、優性な配列ＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰＷ（配列番号４７）およびＰＦＰＱＰＱＱＰＩＰＶ（配列番号４８）に対して特異的なＴ細胞の実質的な割合は、ＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）、ＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）、またはＤＱ２−α−ＩＩＩ（配列番号５）のエピトープを認識しなかった。
さらに、免疫優性α−およびω−グリアジンペプチドに対して特異的なＴ細胞と比較した場合、グリアジン特異的Ｔ細胞クローンについて報告されている多数のエピトープに対して特異的なＴ細胞は、コムギチャレンジの第６日における血液中に存在する全体的なグリアジン特異的Ｔ細胞集団に殆どまたは全く寄与しない（図２を参照）。したがって、本発明者らは、腸Ｔ細胞の株およびクローンについてin vitroで先に報告された免疫優性およびグルテンエピトープの関連性は、in vivoグルテンチャレンジの後のセリアック病ドナーから新たに単離された血液中のポリクローナルＴ細胞の一晩のアッセイにより測定されたものと頻繁に異なることを結論付けた。
次いで、本発明者らは、ＨＬＡ−ＤＱ２＋８−セリアック病ドナーにおける、製パン用小麦（T. aestivum）、オオムギおよびライムギからの全てのグルテンタンパク質に対するＴ細胞刺激性ペプチドの階層を確認して拡大することに努めた。NCBI Genbankにおいて増えてゆく数のグルテンタンパク質を扱うために、およびＬＭＷグルテニン、ＨＭＷグルテニン、ホルデインおよびセカリンについてのペプチドライブラリーを設計するために、本発明者らは、例えば２０merのより長いペプチド中では、例えば１２merの、全てのユニークな配列を収容するための最小のサイズのカスタムライブラリーを設計するための新規のアルゴリズムを開発した（Beissbarth, T., et al., 2005）。２０merのライブラリーは、コムギグルテンを２つの３００ｍｌの血液試料からのＰＢＭＣと共に、ならびにホルデインおよびセカリンを各々単一の３００ｍｌの血液採取物と共に、評価することを可能にする。全てのユニークな１２merを含むGenbankの、２００３年６月において存在する、T. aestivumのグリアジン（１０８エントリー、４４６５のユニークな１２merの候補エピトープを含む、７２１の２０mer）、ＬＭＷグルテニン（７７エントリー、６４５の２０mer、３９４５の１２merの候補）およびＨＭＷグルテニン（５５エントリー、７８６の２０mer、４７９９の１２merの候補）、H. vulgareのホルデイン（５９エントリー、４１６の２０mer、２６７２の１２merの候補）、ならびにS. cerealeのセカリン（１４エントリー、１５５の２０mer、９５７の１２merの候補）についての、ポリペプチドエントリーにおける全てのユニークな１２merを含む、包括的な２０merのライブラリーを、スクリーニンググレードのPepsetsとして設計および合成した（表３を参照）。
３日間のコムギチャレンジを開始した後第６日において採取したＨＬＡ−ＤＱ２＋８−セリアック病ドナーからのＰＢＭＣを、ｔＴＧ処置グリアジンライブラリーならびにＬＭＷグルテニンライブラリーの半分（ｎ＝２０）およびＬＭＷグルテニンライブラリーおよびＨＭＷグルテニンライブラリーの後半（ｎ＝２６）をスクリーニングするために用いた。オオムギチャレンジを開始した６日後における２１人のセリアック病ドナーからのＰＢＭＣを、ホルデインライブラリーをスクリーニングするために用い、ライムギチャレンジを開始した６日後における１９人のさらなるドナーからのＰＢＭＣを、セカリンライブラリーをスクリーニングするために用いた。ｔＴＧ処置されたPepsetライブラリーペプチドに対するIFNγELISpot応答は、コムギチャレンジの後で２７／４６のドナーにおいて、オオムギチャレンジの後で１２／２１、およびライムギチャレンジの後で８／１９において、バックグラウンドレベルよりも高かった。
「第２ラウンド」のライブラリーにおける詳細なマッピングのための２０merの選択を容易にするために、本発明者らは、マイクロアレイデータの分析に用いられる期待値最大化（ＥＭ）アプローチを適用した（Beissbarth et al. (2005)）。すべての個々のドナーのデータセットを、ＥＭアルゴリズムにより分析し、各２０merに対するIFNγELISpot応答を説明するための変数λおよびｐを導いた。変数λは、ELISpot応答の相対的強度を説明し、変数ｐは、応答するドナーの割合を説明する。積λｐが、各穀類についての最も活性が高い第１ラウンドのライブラリーペプチドの少なくとも５％であった場合、各々の第１ラウンドのライブラリーの２０merを、第２ラウンドのライブラリーにおいて詳細にマッピングした。
第２ラウンドのライブラリーを、選択された２０merを９つの重複する１２merへ縮小することにより設計した。任意の１２merが７位にグルタミンを組み込み、それがｔＴＧについて定義された脱アミド化モチーフ（ＱＸ１ＰＸ３またはＱＸ１Ｘ２［Ｆ，Ｙ，Ｗ，Ｉ，Ｌ，Ｖ］、ここでＸ１およびＸ３はプロリンではない）に適合する場合、１６merを設計し、これにより、７位にグルタミンを有する１２merを、−１位と１３位においてネイティブな残基により、−２位と１４位においてグリシンにより挟む。この戦略により、任意の潜在的な９merのＨＬＡ−ＤＱ２−ペプチド−結合配列において、中心の、潜在的に脱アミド化されたグルタミン残基が、アンカーの４、６または７位において適応されることが可能になる。選択される２０merが７位においてグルタミンを有する１２mer配列を含まない場合、１２残基が重複する２つの１６merを合成した。ｔＴＧに媒介される脱アミド化に感受性な中心のグルタミン残基を有する幾つかの第２ラウンドの１６merもまた、グルタミンをグルタミン酸により置き換えて合成した（in silico脱アミド化）。
コムギ第２ラウンドのライブラリーは、５５１の１６mer（１１３のグルタミン酸置換された１６merを含む）からなり、これは、コムギチャレンジの後の３４人のセリアック病ドナー（２６人のレスポンダーを含む）からのＰＢＭＣを用いて試験し、オオムギライブラリーは、８９の１６merを有し、９のグルタミン酸で置換されたものを含み、これは、オオムギチャレンジの後の１０人のセリアック病ドナー（８人のレスポンダーを含む）からのＰＢＭＣを用いて試験し、ライムギライブラリーは、６４の１６merを有し、１１のグルタミン酸で置換されたものを含み、これは、ライムギチャレンジ後の１１人のセリアック病ドナー（１１人のレスポンダーを含む）からのＰＢＭＣを用いて試験した。
刺激性ペプチドの階層は、各々の穀類について明確に示された（図６を参照）。グリアジンのパイロットライブラリー中の６５２の２０merと包括的ライブラリー中の２７２３の２０merとを組み合わせたものの中で、３４（１％）が≧３０のスコアを有し、３００（９％）が≧５のスコアを有したが、一方、２１１１は、０のスコアを有した。ｔＴＧ処置された第１ラウンドの２０merであって≧５のスコアを有する３００のうちの１７１（５７％）は、≧５のスコアを有する第２ラウンドのｔＴＧ処置された１６merをもたらし、これらの第２ラウンドの１６merの間で、８９のユニークな配列が存在した（図７を参照）。第２ラウンドにおけるこれらの８９の確認されたＴ細胞刺激性配列は、グリアジンから誘導された３２個、ＬＭＷグルテニンから誘導された１個、ＨＭＷグルテニンから誘導された４個、ホルデインから誘導された３０個、セカリンから誘導された２９個を含み、５個は２種の穀類においてプロラミンファミリーに共通であり、１個は全３種の穀類において３種のプロラミンファミリーにおけるものであった。
すべての８９の確認されたＴ細胞刺激性１６merは、プロリンおよび／またはグルタミンを含んでいた。
第２ラウンドのペプチドのｔＴＧによる脱アミド化の後の生理活性は、ｔＴＧに対して感受性であると予測されるグルタミン酸がグルタミン残基を置き換えている合成ペプチドと同じであった（データ非表示）。
脱アミド化のための要件の例外は、密接に関連しているが稀に認識されるＨＭＷグルテニン１６merＷ２１ ＱＧＱＱＧＹＹＰＩＳＰＱＱＳＧＱ（配列番号９１）、Ｗ２２ ＱＧＱＰＧＹＹＰＴＳＰＱＱＩＧＱ（配列番号９２）、Ｗ２４ ＰＧＱＧＱＳＧＹＹＰＴＳＰＱＱＳ（配列番号９５）、およびＷ２９ ＧＱＧＱＳＧＹＹＰＴＳＰＱＱＳＧ（配列番号１０４）、ならびにグリアジンＷ３６ ＱＹＥＶＩＲＳＬＶＬＲＴＬＰＮＭ（配列番号１１６）であった。ペプチドを、それらがそのドナーについての各々のライブラリーにおいて最も活性なペプチドの応答の少なくとも７０％を惹起した場合に、特定のセリアック病ドナーについて「優性」であるとみなした。コムギ、ライムギおよびオオムギの第２ラウンドにおいて、対応するグルタミン酸置換配列（配列番号４７、４８、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８９、９０、９１、９２、９５、１０２、１０３、１０４、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３６、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７７、１７８、１７９、１８０、１８３、１８４、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、２０９、２１０）を有する１０の１６merおよび３１の１２merは、少なくとも１のドナーにおいて優性であったが、一方、４の１６merおよび２１の１２merのみ（対応するグルタミン酸置換変異体を有するもの）が、ドナーの１０％より多くにおいて優性であった（配列番号４７、４８、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、８０、８１、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３６、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７９、１８０、１８３、１８４、１８７、１８８、１９１、１９２）。スコアが最も高かった第２ラウンドのコムギグルテン、ホルデインおよびセカリンから誘導された１６merは、５０％より多くにおいて優性であり、全体として、８０％より多くのドナーにより認識された。
刺激性ペプチドの階層および優位性は、消費される穀類により著しく異なった（図８を参照）。配列モチーフＱＱＰＦＰＱＰＥＱＰ（Ｆ，Ｉ）Ｐ（Ｗ，Ｌ，Ｙ，Ｑ）（Ｑ，Ｓ）を共有するペプチドの刺激能力は、いかなる穀類に対しても特異的ではなかった。ω−グリアジン１７merＷ０３−Ｅ７ ＱＰＥＱＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱＰ（配列番号５５）は、一貫してこのファミリーの最も活性が高いものであった。これはグルテンにおいて普遍的に優性なＴ細胞刺激性ペプチドである。ほかのペプチドは、ほぼ１種の穀類についてのみ優性であった。例えば、α−グリアジン１７merＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＰ（配列番号２２５；ＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）およびＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）を含む配列番号６２（Ｗ０２−Ｅ７）を含む）は、コムギグルテンチャレンジ後にのみ、ホルデイン１６merＢ０８−Ｅ７ ＰＱＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱＱＰ（配列番号３１８；配列番号１２７（Ｂ０６−Ｅ７）を含む）は、オオムギグルテンチャレンジの後でのみ、セカリン配列ＱＰＦＰＱＱＰＥＱＩＩＰＱＱ（配列番号３２３；配列番号１９０（Ｒ１１−Ｅ７）を含む）は、ライムギグルテンチャレンジの後でのみ、優性であった。モチーフＱＰＦＰ（Ｗ，Ｌ，Ｙ，Ｖ，Ｉ）ＱＰＥＱＰＦＰＱを含む他のペプチドは、オオムギまたはライムギチャレンジの後で、コムギグルテンチャレンジよりも相対的に強力な応答を惹起した。優性なＴ細胞刺激性ペプチドの「穀類特異性」は、Ｔ細胞クローンに基づく交差反応性の決定への古典的アプローチを補完する、Ｔ細胞認識の重複性についての機能的定義を提供する。
セリアック病ドナーからの生検またはＰＢＭＣから、優性な脱アミド化ペプチドに対してＴ細胞クローンを産生させた。Ｔ細胞クローンのサイトカインプロフィールは、Ｔｈ１またはＴｈ０であり、全てがＨＬＡ−ＤＱ２限定的であった。最小コア配列を、親ペプチドのリジンスキャン（lysine scan）を用いて決定した。NPL001（配列番号２２８）に対して産生されたＴ細胞クローンは、ＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）またはＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）に対して特異的であり、NPL002（配列番号２２９）に対して産生されたものは、ＤＱ２−ω−Ｉ ＰＦＰＱＰＥＱＰＦ（配列番号１０）またはＤＱ２−ω−ＩＩ ＰＱＰＥＱＰＦＰＷ（配列番号１５）に対して特異的であった。NPL003（配列番号２３０）に対して産生された単一のＴ細胞クローンは、ＤＱ２−Ｈｏｒ−Ｉ ＰＩＰＥＱＰＱＰＹ（配列番号１７）に対して特異的であり、配列番号１８９、ｐｙｒｏＥＱＰＦＰＥＱＰＥＱＩＩＰＱＱＰ−アミド（配列番号２２６；ＮＰＬ００４）の完全に脱アミド化された変異体であった（コアの９merは決定されていない、ＤＱ２−ＳＥＣ−Ｉ）。脱アミド化グリアジンに対して産生されたさらなるクローンは、Ｗ１１−Ｅ７ ＱＡＦＰＱＰＥＱＴＦＰＨ（配列番号７４）に対して特異的であった（９merのコアは決定されていない）。クローンの各々を、第２ラウンドのｔＴＧ処置グリアジン／グルテニン、ホルデインおよびセカリンライブラリー、また、T. aestivumのグリアジン、H. vulgareのホルデインおよびS. cerealeのセカリンによりそれらの野生型配列においてコードされin silico脱アミド化（ｔＴＧ脱アミド化モチーフによりグルタミン酸がグルタミンを置き換えている）を有する全てのユニークな１０merを含むさらなる検証用１８merライブラリー（表３を参照）に対して、スクリーニングした。優性刺激性ペプチドに対するクローンの交差反応性はほとんど存在しなかったが、準優性な（sub-dominant）グルテンペプチドの多くについてのペプチド認識の実質的な重複性が存在した。全体として、４つの優性Ｔ細胞刺激性ペプチド、Ｗ０２−Ｅ７、Ｗ０３−Ｅ７、Ｂ０８−Ｅ２Ｅ７およびＲ１１−Ｅ４Ｅ７（それぞれ、配列番号６２、５５、３１９、３２２）において存在する６つのエピトープ、ＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）、ＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）、ＤＱ２−ω−Ｉ（配列番号１０）、ＤＱ２−ω−ＩＩ（配列番号１５）、ＤＱ２−Ｈｏｒ−Ｉ（配列番号１７）およびＤＱ２−Ｓｅｃ−Ｉ（配列番号２２６）に対して特異的な１１個のクローンは、２２／３７のグリアジン／グルテニン、２６／３０のホルデインおよび２２／２９のセカリン配列を認識し、図７において刺激性ペプチドとして確認された。
コムギ、オオムギおよびライムギ粉の等量の混合物から作られたマフィンによるグルテンチャレンジの後でＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病ドナーから採取したＰＢＭＣを用いるIFNγELISpotアッセイを、Ｗ０２−Ｅ７、Ｗ０３−Ｅ７、Ｂ０８−Ｅ２Ｅ７およびＲ１１−Ｅ４Ｅ７（それぞれ、配列番号６２、５５、３１９、３２２）に対して特異的なＴ細胞の相対頻度を比較するために、非定型の希少な優性なグリアジンペプチドＷ３６（配列番号１１６）およびＡｖ−α９Ａ ＱＹＱＰＹＰＥＱＥＱＰＩＬＱＱ（配列番号３２３；図９Ａを参照）のカラスムギアベニンホモログと共に用いた。至適濃度におけるＷ０２−Ｅ７、Ｗ０３−Ｅ７、Ｂ０８−Ｅ２Ｅ７のモル等量混合物（配列番号６２、５５、３１９；カクテル２）に対する応答は、６つのペプチドの混合物と異ならなかったが、Ｗ０２−Ｅ７（配列番号６２）および／またはＷ０３−Ｅ７（配列番号５５）より明確に大きかった。カクテル２（５０μＭ）をコムギ、オオムギまたはライムギグルテンのチャレンジのいずれかの後で評価する場合、これは、それぞれ、ｔＴＧ処置されたグリアジン、ホルデインまたはω−セカリン（３２０μｇ／ｍｌ）の至適濃度により刺激されたものの少なくとも３分の２と同等のIFNγELISpot応答を刺激した（図９Ｂ、ＣおよびＤを参照）。
それらの化学的安定性を改善するため、およびエキソペプチダーゼに対する耐性を高めるために、ペプチドを、「キャップされた」Ｎ−ピログルタミン酸、Ｃ−アミドの酢酸塩として合成した：ｔＴＧにより脱アミド化されると予測される部位においてグルタミン酸を有する、NPL001（配列番号２２８）、NPL002（配列番号２２９）およびNPL003（配列番号２３０）の１５merまたは１６mer。実際に、キャッピングはペプチドの半減期を、成体ラットにおいて０．１ｍｌ中０．９ｍｇのボーラス皮内注射の後の遊離ペプチドNPL033、NPL038、およびNPL034 （配列番号１３、３２０および３２１）について１０〜１２分間から、、Ｎ−ピログルタミン酸およびＣ−アミド化（配列番号２２８、２２９および２３０）によっては２６〜２８分間まで、Ｎ−アセチル化およびＣ−アミド化（配列番号２３１、２３２、および２３３）によっては１９〜２４分まで延長した（表４を参照）。曲線分析の下の面積により測定されるバイオアベイラビリティもまた、Ｎ−ピログルタミン酸またはＮ−アセチルの付加、およびＣ−アミド化のキャッピングにより、３４倍までも実質的に増大した。
本発明者らの発見は、NPL001（配列番号２２８）、NPL002（配列番号２２９）およびNPL003（配列番号２３０）中に存在するエピトープを含むペプチドが優性、非重複性であり、グルテンのＴ細胞刺激活性の実質的な割合に一貫して寄与するという概念を支持する。したがって、これら３つのペプチドまたはこれらの中にあるエピトープは、ＨＬＡ−ＤＱ２に関連するセリアック病に一貫して適用可能な、ペプチドに基づく治療用ワクチンの設計または機能的診断において、決定的である可能性がある。
これらの発見は、希少な抗原特異的Ｔ細胞の増殖に依存するin vitroアプローチが、しばしば、急性の疾患の再活性化の後にin vivoで関連するエピトープへと必ずしも翻訳されないことを強調する。実際に、本研究において同定された非重複性の優性なＴ細胞刺激性ペプチドの大部分は、Ｔ細胞のクローンおよび株を利用する機能的研究において先には記載されていない。病原性抗原によりin vivoで誘導されたＴ細胞を用いる包括的エピトープマッピングは、先には行われておらず、この研究は、免疫のヒトの疾患に関連するエピトープをマッピングするための、in vitroアプローチによる初めての真の検査を提供する。先行技術は、非重複性の優性なＴ細胞刺激性ペプチドが、ペプチドに基づく免疫治療のために、最大数の患者において標的化されたＴ細胞の数を最大とするように、また一方では処方を単純化するためにペプチドの数を最小化するように、選択される様式について記載しない。
しかし、追加のペプチドが、コムギ、オオムギまたはライムギのチャレンジの後で、この混合物のＴ細胞刺激能力およびドナーのＴ細胞応答の一貫性を増大させる可能性がある。最高の「スコア」を有するがＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）、ＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）、ＤＱ２−ω−Ｉ（配列番号１０）、ＤＱ２−ω−ＩＩ（配列番号１５）またはＤＱ２−Ｈｏｒ−Ｉ（配列番号１７）に対して特異的なＴ細胞クローンにより認識されないグルテンペプチドは、この混合物のＴ細胞刺激能力をさらに増大させる可能性が最も高い。ペプチド混合物によって一貫して標的化されるグルテン特異的Ｔ細胞の割合を増大させることは、ＨＬＡ−ＤＱ２＋８−セリアック病のための治療または診断上の有用性をおそらく改善するが、また、処方を複雑化させ、化学的安定性を損ない、有害効果の可能性を高めるかもしれない。
一方、NPL001（配列番号２２８）は、単一のペプチドにより置換することができ、これは、例えば、ＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）に対して特異的なＴ細胞クローン、およびまたＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）に対して特異的なＴ細胞クローンにより認識される、配列ＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹＰＱ（配列番号６０；Ｗ０１−Ｅ７）を含む。代わりに、NPL001（配列番号２２８）は、２つの別々のペプチドにより置換することができ、一方はＤＱ２−α−Ｉ（配列番号３）に対して特異的なＴ細胞クローンにより認識され、他方は、ＤＱ２−α−ＩＩ（配列番号４）に対して特異的なＴ細胞クローンにより認識される。同じ原理を、NPL002（配列番号２２９）およびNPL003（配列番号２３０）に対しても適用することができる。これは、処方および安定性を改善するためには有利かもしれない。
例３：マウスモデルにおけるNexVax2
グルテンを消費しながら臨床におけるグルテンに対する寛容およびセリアック病の寛解を誘導するための、ペプチドに基づく治療用ワクチンの最適な投与および用量レジメンは、知られていない。しかし、任意のペプチドに基づく治療薬の必須の特性は、標的器官においてin vivoでコグネイトＴ細胞を活性化する能力であろう。
NPL001（配列番号２２８）とコグネイトＴ細胞との間のin vivoでの相互作用は、NPL001に対して特異的な３×１０６のＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞を移入（transfer）された、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に機能的ＨＬＡ−ＤＲ３および−ＤＱ２を発現する（しかし、マウスＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しない）トランスジェニックのBlack-6マウスを開発することによりモデル化されている（Chen Z., et al., 2006）。ドナーマウス（ＨＨ８−１）は、Ｔ細胞上にNPL001特異的Ｔ細胞受容体およびヒトＣＤ４が発現していることについてトランスジェニックであり、また、ＡＰＣ上にＨＬＡ−ＤＲ３ ＤＱ２を発現する。ＨＨ８−１マウスにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞の全体で９６％がクローナルであり、NPL001に対して特異的である（結果非表示）。
５０μｌの生理食塩水中のNPL001、NPL002およびNPL003の等モル量混合物の皮下投与（後足踵関節における）の４日後に、脾臓、腸排出性腸管膜リンパ節（ＭＬＮ）および局所排出性膝窩リンパ節（ＰＬＮ）を採取する。単離された単核細胞を、ｈＣＤ４、ならびにＨＨ８−１のＮＰＬ００１特異的Ｔ細胞上に発現するＴ細胞受容体α−およびβ−鎖（Ｖα８およびＶβ８）について染色する。移入されたＣＦＳＥ標識細胞を、１または２以上の分裂を経験したＣＦＳＥｐｏｓ細胞の％として測定し、これをＣＦＳＥ染色の希釈率として示す。図１０は、NPL001に対して特異的なＴ細胞の用量依存的増殖が、０．９〜３０μｇの皮下投与の後で観察され、最大半量の応答が５μｇで達成されることを示す。これらにより、または９００μｇもの高い用量によっても、Ｔ細胞がＴｈ１の表現型を有しNPL001による刺激によりＩＦＮγを分泌するにも拘らず、臨床的な毒性は観察されなかった。
このマウスモデルは、（ｉ）原理証明、（ｉｉ）作用の機構、および（ｉｉｉ）NexVax2治療用ワクチン（生理食塩水中のNPL001、NPL002およびNPL003の等モル量混合物）の投与の後での寛容の誘導のための用量レジメンの最適化の実証を可能にする能力を有する。先のマウスでの研究において、本発明者らは、NexVax2の単一の用量、または関連するペプチド成分NPL001が、in vivoで生理活性であることを実証した。NPL001の投与は、第１ｂ相ヒト臨床試験において投与される最大用量において、養子移入モデルにおいてＨＨ８−１のグリアジン特異的Ｔ細胞の増殖を誘導する。トランスジェニックNPL001特異的Ｔ細胞の活性化についての用量応答を、次いで決定した。この予備データに基づいて、NexVax2治療用ワクチンがグリアジン特異的Ｔ細胞応答を調節する能力および作用の機構に、生物学的に関連するマウスモデルにおいて取り組むことができる。
研究の目的は、免疫学的寛容を誘導するために設計されたレジメンを用いる治療用ワクチン、NexVax2、の繰り返し投与が、グリアジン特異的ＴＣＲ−Ｔｇマウスモデルにおいてグリアジン特異的Ｔ細胞応答を調節することができるか否かを決定することである。
以下の表５のとおりに、動物を同定し、実験群に割り当てて処置した。
皮内／皮下投与の経路を、これがヒトにおいて意図される投与の経路であるものとして選択した。投与量を、養子移入モデルにおける全てのグリアジン特異的Ｔ細胞の刺激をもたらすもの（１０μｇ）から、先の研究（Nexpep3）においてＣＦＳＥ標識グリアジン特異的ＴＣＲ−ＴｇＴ細胞の増殖をもたらさなかった低用量（０．３μｇ）まで、用量−応答範囲をカバーするように選択した。
全てのペプチドは、GMPグレードであった。製剤は、Nexpep Pty Ltdにより製造され、ペプチドの濃度は、純度について調整した。NexVax2は、各々が生理食塩水中６ｍｇ／ｍｌの３種のペプチド（NPL001、NPL002およびNPL003）からなる。
記述した用量は、NexVax2中の各ペプチドの量であり、合計のペプチド濃度ではない（すなわち、１０μｇのNexVax2は、１０μｇのNPL001、１０μｇのNPL002および１０μｇのNPL003を含む）。NPL001は、生理食塩水中６ｍｇ／ｍｌで提供された。ペプチドを、注射の前に、−８０°Ｃで保存した。
動物および管理
全ての実験を、メルボルン大学動物倫理委員会（University of Melbourne Animal Ethics Committee）AEC登録番号第0707287号の承認により行った。
１４個体のＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおけるメスＨＨ８−１および４ｈＣＤ４．ＩＡＥ−／−．ＤＲ３．ＤＱ２トランスジェニックマウスを用いた。全てのマウスを、メルボルン大学の微生物学および免疫学科動物施設（Department of Microbiology and Immunology Animal Facility）において飼育した。マウスは、Specialty Feeds Pty Ltd（Perth Western Australia）により供給されたグルテンフリー食（ＳＦ０７−０３６）で飼育した。各動物を、動物施設のプロトコルに従って耳パンチにより番号付けし、これは、研究中の各動物を個々に識別し、動物の番号に対応した。動物は個々に、または４個体のマウスまでの群において、ステンレススチールの格子状の上面と固い底面とを有するケージ内に収容した。鉋屑を床敷きとして使用し、ティッシュペーパーを営巣材料として供給した。各ケージに、酸性水を含む水ボトルと、グルテンフリーのマウスの餌を含むフードホッパー（food hopper）とを供給した。部屋を２１°Ｃ〜２４°Ｃに維持した。相対的湿度についての範囲は３７〜５８％であった。１２時間の明暗周期を実施し（明期時間０７００〜１９００）、最低でも１時間当たり１５回の空気交換を行った。
NexVax2を、無菌生理食塩水中で２００μｇ／ｍｌまで希釈し、アリコートに分注し、使用のために−８０°Ｃで保存した。各処置について、アリコートを解凍して無菌生理食塩水中で希釈した。メスＨＨ８−１マウスの群（ｎ＝２）に、生理食塩水中で希釈したNexVax2の設定された用量（１０μｇ、３μｇ、１μｇおよび０．３μｇ）または生理食塩水のみを含む５０μｌ側腹部において皮下注射した。マウスに毎日１４日間注射した。１個体のマウスに、処置レジメンの最終日において、１０μｇのNexVax2の単一の用量を与えた。
注射部位における腫脹または過敏、有害な全身性応答（猫背または毛羽立った外見、嗜眠、震戦、瀕死）について、マウスを毎日モニタリングした。あらゆる兆候の開始、強さおよび期間を記録した。
血液試料を、ペプチドの投与の前に後眼窩洞から採取し、実験の完了の際にＣＯ２安楽死の後で心臓穿刺により採取した。血液を、４℃で一晩貯蔵し、血餅を除去し、遠心分離の後で血清を収集した。血清を、必要である場合には将来的な分析のために−８０℃で保存した。
最終ペプチドの投与３日後に、マウスをＣＯ２安楽死により死亡させ、脾臓を採取した。７０μｍのナイロンメッシュの細胞濾過器を通して篩いにかけることにより、単一細胞の懸濁液を調製した。赤血球細胞を、トリス塩化アンモニウム溶解により、脾臓から取り除いた。ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotech）を使用説明書に従って用い、ネガティブディプリーション（negative depletion）により、ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。同じプロトコルを用いて、グリアジン特異的Ｔ細胞を、４個体の未処置のＨＨ８−１マウスの脾臓から濃縮した。３個体のｈＣＤ４．ＩＡＥ−／−．ＤＲ３−ＤＱ２トランスジェニックマウスの脾臓から、ＡＰＣを調製した。単一細胞の懸濁液を、上記のとおり調製した。脾臓細胞をＡＰＣとして用いる前に、ガンマ照射した（２，２００ラド）。
細胞を、抗体染色およびＦＡＣＳ分析によりフェノタイピングした。グリアジン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＴＣＲ Ｖα８．３およびヒトＣＤ４による染色により同定し、抗ＣＤ２５および抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体により表面を染色した。ＦｏｘＰ３染色キット（eBiosciences）を使用説明書に従って用い、細胞内ＦｏｘＰ３発現を決定した。試料をＦＡＣＳ固定液（ＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒド、２％グルコース）中で固定し、LSR II（BD Bioscience）においてフローサイトメトリーにより分析した。ＩＦＮγおよびＩＬ−１０産生Ｔ細胞を、ＰＭＡ／イオノマイシンによる刺激の後での細胞内サイトカイン染色により同定した。
簡単に述べると、処置マウスからの１×１０６の脾臓細胞を、６時間、５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシンを含むかまたは含まない完全ＤＭＥＭ（１０％の過熱不活化したウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、非必須アミノ酸、５０μＭの２−メルカプトエタノール、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ）および５μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ中で培養した。細胞を、次いで、表面分子（ＴＣＲ Ｖβ８．３およびヒトＣＤ４）について染色し、洗浄し、次いで１％パラホルムアルデヒド／３０分により固定し、２回洗浄し、次いで、０．２％のサポニンを含むＰＢＳ中で希釈した抗ＩＦＮγまたは抗ＩＬ−１０抗体と共にインキュベートした。試料を、ＴＣＲ Ｖβ８．３＋、ヒトＣＤ４＋リンパ球に対してゲーティングしたLSR II（BD Bioscience）においてフローサイトメトリーにより分析した。
各マウスからの２×１０４の精製されたＴ細胞を、３組、丸底９６ウェルプレートにおいて、２μｇ／ｍｌのNPL001の存在下または不在下において、３×１０５のガンマ照射されたＡＰＣを含む完全ＤＭＥＭ中で、３７°Ｃ／５％ＣＯ２において培養した。７２時間の培養の後で、上清を回収し、サイトカイン分泌の分析のために‐８０℃において保存した。
試料を、マウスＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦαおよびＩＦＮγの存在について、細胞数測定ビーズアレイフレックスセット（CBA, BD Bioscience）により、使用説明書に従って、試験した。試料を、FACS Canto（BD Biosciences）においてフローサイトメトリーにより分析し、データをFCAP Arrayソフトウェア（BD Bioscience）を用いて分析した。
培養脾臓細胞からの上清を、適切に、および１：１０希釈において試験した。サイトカインの濃度を、２５００〜１０ｐｇ／ｍｌで希釈した提供される標準物質に対して決定した。
NexVax2処置ＨＨ８−１マウスからの２×１０４の精製されたＣＤ４Ｔ細胞を、照射された同系の脾臓細胞（２，２００ラド、３×１０５／ウェル）と共に、３組のアッセイにおいて、０、０．０２、０．２、２または１０μｇ／ｍｌのNPL001ペプチドの存在下において培養した。抑制アッセイのために、２×１０４の未処置のＨＨ８−１のＣＤ４Ｔ細胞（レスポンダー）を、同等の数（１：１）のNexVax2処置マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞、用量決定されたNPL001ペプチドおよび照射された同系の脾臓細胞（２，２００ラド、３×１０５／ウェル）と共に、３組のアッセイにおいて、培養した。別のアッセイにおいて、未処置のレスポンダーを、NexVax2処置マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞と共に、１：１、３：１および９：１のレスポンダー：サプレッサー比で、最適以下の濃度のNPL001ペプチド（０．２μｇ／ｍｌ）およびＡＰＣの存在下において、培養した。
Ｔ細胞の増殖を、９６時間の培養のうちの最後の２４時間の間の１μＣｉの３Ｈ−チミジンの添加により測定した。結果を、カウント毎分（ｃｐｍ）として、プロットした各３組の平均および標準偏差を表すエラーバーと共に記録する。
ＲＮＡを、NexVax2処置マウスからの５×１０５〜２×１０６の精製されたＴ細胞から、RNAeasy plus（商標）ＲＮＡ抽出キット（QIAGEN）を使用説明書に従って用い、抽出した。必要である場合には、ＲＮＡを、将来的な分析のために−８０°Ｃで保存した。
処置の後で見えているあらゆる有害応答について、マウスを毎日モニタリングした。観察期間の間に、予定されていない死亡はなかった。観察期間の間に、あらゆる動物において、注目される全身性の有害兆候は存在しなかった。全てのマウスは、外見上健康を維持し、観察可能な活性または外見の低下はなかった。生理食塩水中のペプチドまたは生理食塩水のみにより免疫されたマウスにおいて、注射の部位における局所の炎症は観察されなかった。
表現型分析
ペプチド免疫治療は、胸腺により誘導されるまたはde novo生成されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋の調節性Ｔ（Treg）細胞により媒介される、末梢の寛容の誘導と関連付けられている。さらに、かかる誘導は、ＩＬ−１０分泌ペプチドにより誘導されたTreg細胞の産生と関連する。NexVax2の繰り返し投与の、脾臓のグリアジン特異的Ｔ細胞の数および表現型に対する効果を決定した。脾臓におけるグリアジン特異的Ｔ細胞を、ＴＣＲ Ｖβ８．３およびＣＤ４の発現により同定した。リンパ球ゲートにおけるグリアジン特異的Ｔ細胞の割合および脾臓あたりの全数を決定した。NexVax2の繰り返し投与が脾臓におけるグリアジン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合（Ａ）および数（Ｂ）の減少をもたらすことを示す、図１１を参照。ＨＨ８−１グリアジン特異的ＴＣＲトランスジェニックマウスに、示した量のNexVax2を毎日１４日間皮下注射した。脾臓を、最後の注射の３日後に採取し、処理して、トランスジェニックのＴ細胞を同定するための抗体（Ｖβ８．３およびｈＣＤ４）で染色した。トランスジェニックのＴ細胞の合計数を、全細胞の脾臓細胞数から計算した。ドットは、個々のマウスを示す。
試験した最大用量（１０μｇ）における複数用量のNexVax2による処置は、グリアジン特異的Ｔ細胞の割合と数の両方の、約５０〜６５％の明らかな減少をもたらした。これは、抗原に誘導された細胞死またはこれらの細胞の脾臓から遠方への動員（recruitment）のいずれかを示唆する。
NexVax2の繰り返し投与がTreg集団を誘導するか否かを決定するために、グリアジン特異的Ｔ細胞を、ＴＣＲ Ｖβ８．３およびＣＤ４の発現により同定し、ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３（図１２Ａを参照）またはＣＤ２５およびＧＩＴＲ（図１２Ｂを参照）を発現するものの割合を決定した。図１２は、NexVax2の繰り返し投与がTreg細胞の誘導をもたらすことを示す。ＨＨ８−１のグリアジン特異的ＴＣＲトランスジェニックマウスに、示した量のNexVax2を、毎日１４日間皮下注射した。脾臓を最後の注射の３日後に採取し、処理して、ＴＣＲ Ｖα８．３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３およびＧＩＴＲに対する抗体で染色した。グリアジン特異的な、ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３（Ａ）またはＣＤ２５およびＧＩＴＲ（Ｂ）を発現するＣＤ４リンパ球のＦＡＣＳプロットを示す。１０μｇまたは３μｇのNexVax2の複数用量での処置は、脾臓における、用量依存的な様式における、グリアジン特異的Treg細胞の割合の増加をもたらした。糖質コルチコイド誘導ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）は、ＣＤ２５＋Treg細胞において優性に発現する。染色により、グリアジン特異的Ｔ細胞のＣＤ２５＋集団がＧＩＴＲを共発現したことが明らかとなった。ＧＩＴＲ＋細胞のパーセンテージは、NexVax2投与の後で、ＣＤ２５の発現に比例して増大した。
非特異的活性化に対する応答において直接的にex-vivoでＩＦＮγまたはＩＬ−１０を産生する能力を有するグリアジン特異的Ｔ細胞の割合を決定した。脾臓細胞を、ＰＭＡ／イオノマイシンと共に、またはこれらなしで、ブレフェルジンＡの存在下において培養した。グリアジン特異的Ｔ細胞によるＩＦＮγおよびＩＬ−１０の産生を、フローサイトメトリーにより決定した。図１３は、NexVax2の繰り返し投与が、直接的にex vivoでＩＦＮγおよびＩＬ−１０産生細胞の割合の増加をもたらすことを示す。ＨＨ８−１マウスに、毎日、生理食塩水中１０、３、１もしくは０．３μｇのNexVax2、または生理食塩水のみを１４日間、または１０μｇのNexVax2の単一の投与を第１４日に、皮下注射を行った。最後の注射の３日後、マウスを安楽死させ、脾臓のＩＦＮγ（Ａ）またはＩＬ−１０（Ｂ）を発現するＴＣＲ Ｖβ８．３／ｈＣＤ４＋細胞の割合を、ＰＭＡ／イオノマイシンの存在下または不在下における６時間のインキュベーションの後で、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリーにより決定した。ドットは個々のマウスを表し、破線は、未処置のＨＨ８−１マウスにおけるサイトカイン陽性細胞の割合を示す。
１０μｇのNexVax2の繰り返し投与は、ＩＦＮγ産生グリアジン特異的Ｔ細胞の割合の増加、および、ＩＬ−１０産生グリアジン特異的Ｔ細胞の少量であるが一貫した増加をもたらした。１または３μｇのNexVax2の繰り返し投与は、各群において試験した２個体のマウスの一方におけるＩＦＮγ産生Ｔ細胞の頻度の増大をもたらした。
ペプチドに対する増殖性応答
NexVax2の繰り返し投与の後でのグリアジン特異的Ｔ細胞の増殖能力を、これらの細胞がアネルギー性の表現型を有するか否かを決定するために試験した。in vitroでの増殖の不具合は、ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Treg細胞とＩＬ−１０産生ペプチドに誘導されたTreg細胞との両方の不具合である。この増殖する能力の低下は、ＩＬ−２の培養への添加により逆転することができる。
精製されたＣＤ４＋脾臓のＴ細胞を、ｈＣＤ４．ＩＡＥ−／−．ＤＲ３．ＤＱ２トランスジェニックマウスからのガンマ照射されたＡＰＣの存在下において培養し、段階的な濃度のコグネイトペプチドNPL001の存在下において培養した。増殖を、４日間の培養の最後の２４時間の３Ｈ−チミジンの取り込みにより測定した（図１４Ａ）。図１４は、グリアジン特異的Ｔ細胞のコグネイト抗原に対する増殖能力は、NexVax2の繰り返し投与の後で低下し、ＩＬ−２の存在下において回復することを示す。ＨＨ８−１マウスに、毎日、生理食塩水中１０、３、１もしくは０．３μｇのNexVax2、または生理食塩水のみの皮下投与を１４日間、または１０μｇのNexVax2の単一の投与を第１４日に与えた。最後の注射の３日後、マウスを安楽死させ、ＣＤ４＋Ｔ細胞を精製し、NPL001ペプチドおよび照射されたＡＰＣと共に、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下または不在下において培養した。７２時間後に、ウェルを、１μＣｉの３Ｈ−チミジンで２４時間パルスし、プレートを採取して計数した。
Ａ． 示された用量のNexVax2で処置されたマウスの０．２μｇ／ｍｌのNPL001ペプチドに対する増殖性応答
Ｂ． 未処置および１０μｇのNexVax2繰り返し投与のNPL001に対する増殖性の用量応答
エラーバーは、３組の培養の標準偏差を表す。
抗原未処置の生理食塩水処置マウスからのＴ細胞は、NPL001に対する応答において良好に増殖したが、一方、NexVax2処置マウスからのＴ細胞は、NPL001に応答する能力の実質的な低下を示し、これは最適以下（sub-optimal）のペプチド濃度（０．２μｇ／ｍｌ）において特に明らかであった。１０μｇのNexVax2による繰り返し投与は、０．２μｇ／ｍｌのNPL001に対する増殖性応答の９０〜９７％の減少をもたらした。増殖の減少は用量依存的であり、投与された最も低い用量（０．３μｇ）ですら、最適以下のペプチド濃度において、２０〜３７％の増殖の減少をもたらした。培養への１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の添加は、ペプチドの不在下において、低レベルの増殖を誘導した（バックグラウンドの約２倍）が、ペプチドの存在下において、NexVax2処置マウスからのＴ細胞の非応答性の状態は逆転し、その結果、ペプチド処置マウスの応答が生理食塩水処置された対照と同等になった。
NexVax2 投与に対する応答における増殖の不具合は、広範囲の用量にわたって観察された（図１４Ｂを参照）。これは、最大用量のNexVax2（１０μｇ）の投与の後で、特に明らかであり、より低いNexVax2の用量での処置の後では、特に最大ペプチド刺激に対する応答において、効果が低かった（データ非表示）。
未処置のＨＨ８−１のＴ細胞の活性化の抑制
観察された増殖の不具合は、アネルギー性の表現型の結果である可能性があり、その場合、Ｔ細胞それら自体が抗原刺激に対して感受性が低くなってきているか、または、Treg集団の存在に起因する。したがって、in vitroでの培養において、NexVax2による処置が、未処置のグリアジン特異的Ｔ細胞のNPL001ペプチドに対する増殖性応答を抑制することができるTreg集団を産生する能力を評価した。
図１５は、NexVax2で処置されたマウスからのＴ細胞が未処置のグリアジン特異的Ｔ細胞の増殖を抑制することができる。ＨＨ８−１マウスに、毎日生理食塩水中１０、３、１もしくは０．３μｇのNexVax2、または生理食塩水のみを１４日間、または１０μｇのNexVax2の単一の投与を第１４日において皮下で与えた。最後の注射の３日後、処置マウスからの精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞（サプレッサー）は、未処置のＨＨ８−１マウス（レスポンダー）からのＴ細胞、NPL001ペプチドおよび照射されたＡＰＣと共に共培養した。７２時間後に、ウェルを、１μＣｉの３Ｈ−チミジンで２４時間パルスし、プレートを採集して計数した。図１５Ａにおいて、１０μｇのNexVax2×１４処置マウス（左パネル）または生理食塩水処置マウス（右パネル）からのＴ細胞を、同等数の未処置のＨＨ８−１のＣＤ４＋Ｔ細胞および用量決定されたNPL001ペプチドで共培養した。図１５Ｂにおいて、未処置のＨＨ８−１のＴ細胞の一定数（２×１０４）を、用量決定された数の（２×１００００、６．６×１０００、２．２×１０００）とNexVax2処置Ｔ細胞、および０．２μｇ／ｍｌのNPL001と共培養した。未処置のレスポンダーの増殖の阻害の平均を、各処置群における２個体のマウスから計算した。エラーバーは、３組の培養の標準偏差を表す。
NexVax2処置マウスからの精製されたＴ細胞を、未処置のＨＨ８−１のグリアジン特異的Ｔ細胞と１：１の比で、設定された用量のNPL001（図１５Ａ）の存在下において、または１：１、３：１もしくは９：１のレスポンダー：サプレッサー比で、０．２μｇ／ｍｌのNPL001の存在下において共培養した（図１５Ｂ）。１０μｇまたは３μｇのNexVax2の繰り返し投与による処置の後で、１：１のレスポンダー：サプレッサー比において、広範囲の刺激性ペプチド濃度にわたって、レスポンダー細胞の増殖の抑制を観察した。この結果は、調節性集団の存在を示す。フェノタイピングが、１０または３μｇのNexVax2により処置されたマウスにおいてのみ、グリアジン特異的Treg細胞の割合の増大を示したこと、および、Treg細胞が全グリアジン特異的集団の７〜１８％を含むことから、観察された未処置のＨＨ８−１のＴ細胞の増殖の阻害は、予測の範囲内である。
in vitroでの培養の後でのサイトカインプロフィール
免疫の調節は、レスポンダー細胞のサイトカインプロフィールを変化させ得る。
例えば、鼻内でのペプチドの投与は、ＩＬ−１０分泌ペプチドにより誘導されたTreg細胞を産生することが示された。段階的な量のNexVax2の繰り返し投与により処置された、グリアジン特異的ＴＣＲトランスジェニックマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生のプロフィールを、in vitroでの培養の後で、２μｇ／ｍｌのNPL001および照射された同系のＡＰＣの存在下または不在下において、試験した。第３日からの上清を採取して、Ｔｈ１関連サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２およびＴＮＦα）ならびにＴｈ２関連サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）の産生について評価した（図１６）。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、毎日、生理食塩水中１０、３、１もしくは０．３μｇのNexVax2、または生理食塩水のみの皮下投与を１４日間、または１０μｇのNexVax2の単一の投与を第１４日において与えられたＨＨ８−１マウスの脾臓から精製した。３×１０４のＣＤ４Ｔ細胞を、２μｇのNPL001（■）の存在下において、またはペプチドなし（□）で、３×１０００００のガンマ照射されたＡＰＣと共に培養した。上清を７２時間において採取し、細胞計数ビーズアレイにより、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２、ＴＮＦα）ならびにＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５ ＩＬ−６およびＩＬ−１０）の産生について試験した。結果は、処置群における２個体のマウスのサイトカイン産生の平均を示す。ＩＬ−１２、ＩＬ−４またはＩＬ−５のいずれも、培養の上清において検出されなかった。１０μｇのNexVax2の繰り返し投与を受けたマウスの培養物から、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの産生の著しい減少が観察された。このサイトカイン産生の減少は、培養中のNPL001ペプチドに対する増殖性応答の減少を、密接に反映する。加えて、１０μｇのNexVax2の繰り返し注射を受けたマウスからのＴ細胞は、in vitroでのペプチド刺激の後で、３．５倍のＩＬ−１０量の増大をもたらした。このことは、これらのマウスにおけるＩＬ−１０産生Treg 表現型への潜在的に傾いていることを示唆する。
この実験は、免疫学的寛容を誘導するために設計されたレジメンを用いる治療用ワクチンNexVax2の繰り返し投与が、グリアジン特異的Ｔ細胞受容体トランスジェニックマウスモデルにおいてグリアジン特異的Ｔ細胞応答を調節することができるか否かを決定するために設計した。NexVax2を、生理食塩水中のペプチドの皮下注射を介して、連続する１４日にわたって投与した。この処置は、第一に、脾臓におけるグリアジン特異的Ｔ細胞の数の明らかな減少をもたらした。残りのＴ細胞は、それらのコグネイト抗原に対する増殖性応答の減少を示した。これは、ＩＬ−２の存在下において逆転され、このことは、「アネルギー性」の表現型、またはTreg集団の存在を示唆する。この減少した増殖性応答は、培養中で産生されるＴｈ１サイトカインの量の減少、およびＩＬ−１０産生の増大を伴う。グリアジン特異的ＩＬ−１０産生細胞の増大はまた、ＦｏｘＰ３＋、ＧＩＴＲ＋Treg細胞の合計数および割合の増加と共に、直接的にex-vivoでも観察された。共培養実験において、処置マウスからのＴ細胞は、NPL001ペプチドに応答する未処置のグリアジン特異的Ｔ細胞の増殖性応答を抑制することができた。
試験された最大用量（一日当たり１０μｇ、連続する１４日間）におけるNexVax2の繰り返し投与は、処置されたグリアジン特異的Ｔ細胞受容体トランスジェニックマウスからのグリアジン特異的Ｔ細胞の応答の調節を示した。
結果は、生物学的に関連するＴＣＲトランスジェニックマウスモデルを用いて、生理食塩水中のNexVax2ペプチドの皮下投与が免疫優性グリアジンペプチドに対するＴ細胞を調節することができることの証拠を提供する。
例４：ヒトセリアック病のためのNexVax2 ワクチン
NexVax2ワクチンを、セリアック病を有するヒト患者への投与のためにＧＭＰ形態において調製した。
長期の厳密なグルテンフリー食後の、セリアック病を有するHLA−DQ2＋志願者におけるNexVax2の安全性、耐容性および生理活性を決定するためのＩ相の研究
目的
この研究の第１の目的は以下であった：
・皮内で３週間にわたり投与されたNexVax2の毎週の注射の安全性および耐容性を評価すること
この研究の第２の目的は以下であった：
・セリアック病志願者における３週間の投与の後でのNexVax2の生理活性を、Ｔ細胞の頻度およびサイトカイン放出により評価されるＴ細胞応答の測定を通して決定すること。
・セリアック病志願者における３週間の投与の後でのNexVax2の生理活性を、グルテンチャレンジ後の症候性応答の測定を通して決定すること。
・セリアック病志願者における単一の皮内注射の後でのNexVax2の薬物動態学を測定すること
・セリアック病志願者における３週間の投与の後での、NexVax2に対して特異的な抗体の誘導を測定すること
研究の設計
セリアック病志願者における、皮内注射を介して毎週投与された場合の、NexVax2の安全性、耐容性および生理活性の、Ｉ相、単一施設、プラセボ対照型、用量漸増型の研究。
セリアック病患者は、９回の外来患者来診に通うことを求められた。これは、NexVax2の皮内注射を受けるための３回の８時間の来診（３週間にわたって）および標準的なグルテンチャレンジを経験するための３回の６時間の来診を含んだ。
志願者は、第１回目の注射の日から約２５日間、研究対象となった。
研究集団
欧州小児消化器病学、肝臓病学および栄養学学会（European Society of Paediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition）の診断基準（Walker-Smith et al., 1990）に従ってセリアック病の診断を有し、厳密なグルテンフリー食に従う個人であって、ＨＬＡ−ＤＱ２をコードする遺伝子（ＤＱＡ１＊０５およびＤＱＢ１＊０２）を保有するが、ＨＬＡ−ＤＱ８をコードする遺伝子（ＤＱＡ１＊０３およびＤＱＢ１＊０３０２）を保有しない者
NexVax2のための試験的処方
注射のためのNexVax2は、Nexpep Pty Ltd.により供給される０．９％の正常な生理食塩水の無菌溶液中の、NPL001、NPL002およびNPL003の各々の等モル量（１００μｌあたり０．１５９μモル、約３ｍｇ／ｍｌ）の混合物を含んだ。
プラセボの処方
Nexpep Pty Ltd.により供給される無菌の正常生理食塩水０．９％
研究の処置
コホート１： ２人のセンチネル（sentinel）を含み、第１、８および１５日目において、１人には９μｇのNexVax2を皮内注射により投与し、１人にはプラセボを投与し、さらなる６人の対象の、５人には９μｇのNexVax2を投与し、１人にはプラセボを投与した。
コホート２： コホート１と同様であったが、対象に３０μｇのNexVax2を投与した。
コホート３: コホート１と同様であったが、対象に９０μｇのNexVax2を投与した。
コホート４：コホート１と同様であったが、対象に６０μｇのNexVax2を投与した。
投与、食事および血液採取のスケジュール
研究の薬物投与の前夜の深夜からの絶食の後で、用量の投与、食事、薬物動態評価、グルテンチャレンジおよび血液採取についてのスケジュール（０８００時間を投与時間と仮定して）を、図１７に示した。
評価
・安静時心拍数、半仰臥位（semi-supine）収縮期／拡張期血圧、呼吸数および体温をモニタリングした：スクリーニング時に；通常０７００時間において、第１、８および１５日目において処置を受ける前に、および投与の４時間後に；ならびに第２２、２３および２４日目においてグルテンチャレンジを受ける前に、ならびに第２５日目において研究の終了時に
・NexVax2特異的Ｔ細胞の頻度を計数するためのＰＢＭＣのＩＦＮγELISpotアッセイのための血液試料を、第１、６、１５、２０および２５日目（研究の終了）に採取した。
・NexVax2に対する応答におけるＰＢＭＣのサイトカイン放出を決定するためのBioplex分析のための血液試料を、第１、６、１５、２０および２５日目（研究の終了）に採取した。
・ＰＢＭＣを、第１、６、１５、２０および２５日目（研究の終了）に採取し、後のＴ細胞の機能のアッセイのために凍結した。
・NexVax2に対して特異的な抗体の評価のために、血清を第１および２０日目に採取した。
・薬物動態サンプリングのための血液試料を、第１５日目に、ならびに投与前に、ならびに投与の１５、３０、４５、６０、７５、９０分、２時間および３時間後に採取した。
・臨床検査測定（生化学、尿検査および血液学）を行った：スクリーニング時に；投与の前の第１、８および１５日目において、ならびに投与の４時間後において；ならびにグルテンチャレンジ前の第２０および２２日目において、ならびにグルテンチャレンジ後および第２５日目（研究の終了）において
・妊娠（尿）検査を、スクリーニング時に、投与の前の第１、８および１５日目に、ならびにグルテンチャレンジ前の第２０、２１および２２日目に、ならびに研究の終了時（第２５日）に行った。
・尿の依存性薬物検査を、スクリーニング時に、ならびに投与の前の第１、８および１５日目に行った。
・ＥＣＧを行った：スクリーニング時に；通常０７００時間において、第１、８および１５日目において処置を受ける前に、ならびに投与の４時間後に、；ならびにグルテンチャレンジを受ける前の第２０、２１および２２日目に、ならびに第２５日目に研究の終了時に
データ分析
スクリーニング、コンプライアンスおよび安全性のデータ
人口統計学を、作表してまとめる。基線および追跡調査における物理的試験（身長および体重を含む）ならびに基線における医学／外科学的病歴データを列記する。すべての臨床的安全性および耐容性のデータを各対象について列記する。
検査室の正常な範囲外の検査値を、別に列記し、臨床的意義についてコメントを付す。関連する繰り返しの値を、一緒に列記する。バイタルサイン測定（安静時心拍数、半仰臥位収縮期／拡張期血圧、呼吸数、体温）およびＥＧＧパラメーターを作表してまとめる。
耐容性データ
処置により発現した有害イベントを列記してまとめる。本研究において報告される全ての有害イベントをMedDRAを用いて暗号化する。
免疫学的アッセイ
本発明者らは、NexVax2の単一の処置が、ＰＢＭＣ中のNexVax2特異的Ｔ細胞の頻度を増大させ、単核細胞によるサイトカインおよびケモカインの分泌を増大させるであろうと考える。
本発明者らは、NexVax2の繰り返しの（毎週３週間の）注射の後で採取されたＰＢＭＣが、処置の前よりも低い頻度のNexVax2特異的Ｔ細胞を有するであろうと考える。
本発明者らは、プラセボ処置セリアック病志願者と比較して、NexVax2の繰り返しの（毎週３週間の）注射が、コムギのパンによる経口での３日間のグルテンチャレンジを開始した６日後に採取されたＰＢＭＣにおける、NexVax2に対して特異的なＴ細胞の頻度およびNexVax2により刺激されたサイトカイン分泌を減少させるであろうと考える。
通常のデータは、片側のWilcoxonの対応のある順位和検定により分析する。正規分布したデータを、対応のあるｔ検定により分析する。ｐ値＜０．０５を、優位とみなす。
具体的な態様において示される通り、より広く記載されるとおりの本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明に対して多数のバリエーションおよび／または改変が行われえることが、当業者により理解される。本態様は、したがって、全ての点において、説明的なものであるとみなされるべきであり、限定するものとみなされるべきではない。
本願は、US 61/118,643からの優先権を主張し、US 61/118,643の全内容は本明細書において参考として組み込まれる。
本明細書において議論および／または引用される全ての刊行物は、本明細書においてその全体が参考として組み込まれる。
本明細書において含まれてきた文書、行為、材料、デバイス、物品などのあらゆる議論は、本発明についての南洋を提供することのみを目的とする。これは、、それが本願の各請求項の優先日の前に存在したためにこれらの事項のいずれかまたは全てが先行技術の基礎の一部を形成するかまたは本発明に関連する分野における一般的知識であったことを承認するものとして理解されるべきではない。
参考文献
Anderson, Plant Mol. Biol. (1991) 16:335−337
Anderson et al., Nature Medicine (2000) 6:337−342
Anderson et al., Gut (2005) 54:1217−1223
Anderson et al., Gut (2006) 55:485−91
Arentz−Hansen et al., J. Exp. Med. (2000) 191:603−612
Beissbarth et al., Bioinformatics (2005) 21 Suppl. 1:i29−37
Briggs et al., Science (1986) 234:47−52
Bunce et al., Tissue Antigens (1995) 46:355−367
Chen et al., J. Immunol. (2006) 168(6):3050−6
Deshpande et al., J. Biol. Chem. (1997) 272(16):10664−10668
Li et al., Nat. Biotechnol. (1999) 17(3):241−245
Kang et al., J. Immunol. (2008) 180:5172−6
Kricka, Biolumin. Chemilumin. (1998) 13:189−93
Klein et al., Exp. Neurol. (1998) 150:183−194
Mannering et al., J. Immunol. Methods (2003) 283:173−83
Mannering et al., J. Immunol. Methods (2005) 298:83−92
Mitchell and Tjian, Science (1989) 245:371−378
Mullighan et al., Tissue Antigens (1997) 50:688−692
Nettelbeck et al., Gene Ther. (1998) 5(12)1656−1664
Oldfield et al., Lancet (2002) 360:47−53
Olerup et al., Tissue Antigens (1993) 41:119−134
Pitluk et al., J. Virol. (1991) 65:6661−6670
Stewart et al., Genomics (1996) 37(1):68−76
Vader et al., Gastroenterology (2003) 125:1105−1113
Walker−Smith et al., Arch. Dis. Child (1990) 65:909−911
Working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition (Report of), Arch. Dis. Child (1990) 65:909−11
Zolotukiin et al., J. Virol. (1996) 70(7):4646−4654

Claims (36)

  1. 以下：
    ｉ） アミノ酸配列ＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（配列番号３）またはアミノ酸配列ＰＱＰＥＬＰＹＰＱ（配列番号４）を含む第１のペプチド、
    ｉｉ） アミノ酸配列ＰＦＰＱＰＥＱＰＦ（配列番号１０）またはアミノ酸配列ＰＱＰＥＱＰＦＰＷ（配列番号１５）を含む第２のペプチド、および
    ｉｉｉ） アミノ酸配列ＰＩＰＥＱＰＱＰＹ（配列番号１７）またはアミノ酸配列ＥＱＰＩＰＥＱＰＱ（配列番号１８）またはアミノ酸配列ＱＱＰＩＰＥＱＰＱ（配列番号１９）を含む第３のペプチド
    を含む剤。
  2. 第２ペプチドが、アミノ酸配列ＰＱＱＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱＰ（配列番号３２０）を含み、および／または、第３のペプチドが、アミノ酸配列ＦＰＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱＱ（配列番号３２１）を含む、請求項１に記載の剤。
  3. 第１、第２および／または第３のペプチドが、Ｎ末端アセチル基またはピログルタミン酸基、および／または、Ｃ末端アミド基を含む、請求項１に記載の剤。
  4. 第１、第２および／または第３のペプチドが、Ｎ末端ピログルタミン酸基およびＣ末端アミド基を含む、請求項３に記載の剤。
  5. 第１、第２および／または第３のペプチドが、化合物に抱合している、請求項１に記載の剤。
  6. 化合物が、アジュバント、または、ＭＨＣ分子もしくはその結合断片である、請求項５に記載の剤。
  7. 第１、第２および第３のペプチドの２つまたは３つが、単一のポリペプチド鎖上にある、請求項１に記載の剤。
  8. 配列番号４７、４８、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８９、９０、９１、９２、９５、１０２、１０３、１０４、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３６、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７７、１７８、１７９、１８０、１８３、１８４、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、２０９および２１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、１または２以上の追加のペプチドを含む、請求項１に記載の剤。
  9. 以下：
    ｉ） アミノ酸配列ＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（配列番号３）またはアミノ酸配列ＰＱＰＥＬＰＹＰＱ（配列番号４）を含む第１のペプチド、
    ｉｉ） アミノ酸配列ＰＦＰＱＰＥＱＰＦ（配列番号１０）またはアミノ酸配列ＰＱＰＥＱＰＦＰＷ（配列番号１５）を含む第２のペプチド、および
    ｉｉｉ） アミノ酸配列ＰＩＰＥＱＰＱＰＹ（配列番号１７）と、アミノ酸配列ＥＱＰＩＰＥＱＰＱ（配列番号１８）またはＱＱＰＩＰＥＱＰＱ（配列番号１９）とを含む第３のペプチド
    を含む、請求項１に記載の剤。
  10. 第１、第２および／または第３のペプチドの各々が、独立して、７〜５０アミノ酸長である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の剤。
  11. 第１、第２および／または第３のペプチドの各々が、２０以下のアミノ酸長である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の剤。
  12. 第１、第２および／または第３のペプチドの各々が、１１アミノ酸長である、請求項１０に記載の剤。
  13. 第１、第２および／または第３のペプチドの各々が、１４アミノ酸長である、請求項１０に記載の剤。
  14. 第１、第２および／または第３のペプチドの各々が、１５アミノ酸長である、請求項１０に記載の剤。
  15. 第１、第２および／または第３のペプチドの各々が、１６アミノ酸長である、請求項１０に記載の剤。
  16. 第１、第２および／または第３のペプチドの各々が、１７アミノ酸長である、請求項１０に記載の剤。
  17. 第１、第２および／または第３のペプチドの各々が、１８アミノ酸長である、請求項１０に記載の剤。
  18. 以下：
    ｉ） アミノ酸配列ＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱ（配列番号１３）およびＮ末端および／またはＣ末端の改変からなる第１のペプチド、
    ｉｉ） アミノ酸配列ＱＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱＰ（配列番号１４）およびＮ末端および／またはＣ末端の改変からなる第２のペプチド、および
    ｉｉｉ） アミノ酸配列ＰＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱＱ（配列番号１６）およびＮ末端および／またはＣ末端の改変からなる第３のペプチド
    を含む剤。
  19. 以下：
    ｉ） アミノ酸ｐｙｒｏＥＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱ−アミド（配列番号２２８）からなる第１のペプチド、
    ｉｉ） アミノ酸ｐｙｒｏＥＱＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱＰ−アミド（配列番号２２９）からなる第２のペプチド、および
    ｉｉｉ） アミノ酸ｐｙｒｏＥＰＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱＱ−アミド（配列番号２３０）からなる第３のペプチド
    を含む剤。
  20. ｉ） アミノ酸配列ＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（配列番号３）またはアミノ酸配列ＰＱＰＥＬＰＹＰＱ（配列番号４）を含む第１のペプチド、
    ｉｉ） アミノ酸配列ＰＦＰＱＰＥＱＰＦ（配列番号１０）またはアミノ酸配列ＰＱＰＥＱＰＦＰＷ（配列番号１５）を含む第２のペプチド、および
    ｉｉｉ） アミノ酸配列ＰＩＰＥＱＰＱＰＹ（配列番号１７）またはアミノ酸配列ＥＱＰＩＰＥＱＰＱ（配列番号１８）またはアミノ酸配列ＱＱＰＩＰＥＱＰＱ（配列番号１９）を含む第３のペプチド
    をコードする１または２以上のポリヌクレオチドを含む組成物。
  21. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の剤または請求項２０に記載の組成物、および、薬学的に受容可能なキャリアを含む、ワクチン。
  22. アジュバントを含む、請求項２１に記載のワクチン。
  23. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の剤、および、１または２以上のペプチドのＴ細胞への結合を検出するための手段を含む、キット。
  24. 請求項１〜２０のいずれか一項に記載のペプチドまたはポリヌクレオチド（単数または複数）を含む、単離された抗原提示細胞。
  25. 樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球または肝類洞内皮細胞である、請求項２４に記載の抗原提示細胞。
  26. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の剤、請求項２０に記載の組成物、請求項２１もしくは請求項２２に記載のワクチン、請求項２３に記載のキット、および／または、請求項２４に記載の抗原提示細胞の有効量を含む、診断または治療における使用のための組成物。
  27. グルテンに感受性である対象において、Ｔ細胞応答を調節する、免疫寛容を誘導する、セリアック病を処置するための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の剤、請求項２０に記載の組成物、請求項２１もしくは請求項２２に記載のワクチン、および／または、請求項２４に記載の抗原提示細胞の有効量を含む、組成物。
  28. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の剤、請求項２０に記載の組成物、請求項２１もしくは請求項２２に記載のワクチン、および／または、請求項２４に記載の抗原提示細胞の有効量を含む、グルテンに感受性である対象においてグルテンペプチドに対する免疫寛容を誘導するための組成物。
  29. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の剤、請求項２０に記載の組成物、請求項２１もしくは請求項２２に記載のワクチン、および／または、請求項２４に記載の抗原提示細胞の有効量を含む、セリアック病を処置するための組成物。
  30. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の剤、請求項２０に記載の組成物、請求項２１もしくは請求項２２に記載のワクチン、および／または、請求項２４に記載の抗原提示細胞の有効量を含む、グルテンに感受性である対象においてサイトカイン分泌を改変するための組成物。
  31. （ａ）グルテンに感受性である対象において、Ｔ細胞応答を調節する、
    （ｂ）グルテンに感受性である対象において、免疫寛容を誘導する、
    （ｃ）グルテンに感受性である対象において、セリアック病を処置する、または
    （ｄ）グルテンに感受性である対象において、サイトカイン分泌を改変する
    ための医薬製造のための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の剤、請求項２０に記載の組成物、請求項２１もしくは請求項２２に記載のワクチン、および／または、請求項２４に記載の抗原提示細胞の使用。
  32. 対象からの試料を、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の剤、請求項２０に記載の組成物、請求項２１もしくは請求項２２に記載のワクチン、請求項２３に記載のキット、および／または、請求項２４に記載の抗原提示細胞と接触させることを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の第１、第２および第３のペプチドの１または２以上が、対象からの試料中のＴ細胞に結合するか否かをin vitroで決定するための方法。
  33. セリアック病の進行をモニタリングするための、請求項３２に記載の方法の使用。
  34. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の剤、請求項２０に記載の組成物、請求項２１もしくは請求項２２に記載のワクチン、および／または、請求項２４に記載の抗原提示細胞の効力を決定するための、請求項３２に記載の方法の使用。
  35. 請求項２１もしくは２２に記載のワクチンを製造する方法であって、第１、第２および第３のペプチドを、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせることを含む、前記方法。
  36. 組成物または食品がセリアック病を引き起こす可能性があるか否かを決定する方法であって、他の組成物または食品の試料中の請求項１〜１９のいずれか一項に記載の剤の存在を検出することを含む、前記方法。
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Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0212885D0 (en) * 2002-06-05 2002-07-17 Isis Innovation Therapeutic epitopes and uses thereof
CA2564521C (en) 2004-04-28 2017-04-11 Btg International Limited Epitopes related to coeliac disease
US10105437B2 (en) * 2004-04-28 2018-10-23 Btg International Limited Epitopes related to coeliac disease
DK2977053T3 (en) 2008-11-30 2017-10-09 Immusant Inc COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR TREATMENT OF CELLIA
US9517257B2 (en) 2010-08-10 2016-12-13 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Erythrocyte-binding therapeutics
US9850296B2 (en) 2010-08-10 2017-12-26 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Erythrocyte-binding therapeutics
CN108117586A (zh) 2010-08-10 2018-06-05 洛桑聚合联合学院 红细胞结合性治疗剂
WO2012100070A2 (en) * 2011-01-20 2012-07-26 Immunosciences Lab, Inc. Methods and apparatus for detection of gluten sensitivity, and its differentiation from celiac disease
ITRM20110487A1 (it) * 2011-09-19 2013-03-20 Consiglio Per La Ricerca E La Speri Mentazione In Peptidi aventi effetto protettivo nei confronti della attività infiammatoria del peptide 31-43 della a-gliadina nella malattia celiaca.
ES2402286B1 (es) * 2011-09-29 2014-03-04 Universidad De Valladolid Péptido inmunogénico del gluten y sus aplicaciones.
WO2013119845A1 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Vibrant Holdings, Llc Substrates, peptide arrays, and methods
RU2669346C2 (ru) 2012-06-21 2018-10-10 Норсвестерн Юниверсити Частицы, конъюгированные с пептидами
US10006909B2 (en) 2012-09-28 2018-06-26 Vibrant Holdings, Llc Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis
US10286376B2 (en) 2012-11-14 2019-05-14 Vibrant Holdings, Llc Substrates, systems, and methods for array synthesis and biomolecular analysis
EP2928500B1 (en) 2012-12-04 2019-03-06 Phosphorex Inc. Microparticles and nanoparticles having negative surface charges
IL292823B2 (en) 2013-03-13 2023-11-01 Cour Pharmaceuticals Dev Company Secondary vaccine particles for the treatment of inflammation
US20160041148A1 (en) * 2013-03-14 2016-02-11 Immusant,Inc. Placebo-controlled gluten challenge method
EP2994480A4 (en) * 2013-05-08 2017-05-17 JM Biologicals Compositions and methods for the production of gluten free food products
DK3033102T4 (da) 2013-08-13 2024-02-26 Univ Northwestern Peptidkonjugerede partikler
US10449228B2 (en) 2013-09-10 2019-10-22 Immusant, Inc. Dosage of a gluten peptide composition
US20160238590A1 (en) * 2013-09-20 2016-08-18 Immusant, Inc. Compositions and methods related to oat sensitivity
US10946079B2 (en) 2014-02-21 2021-03-16 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Glycotargeting therapeutics
US10953101B2 (en) 2014-02-21 2021-03-23 École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) Glycotargeting therapeutics
JP6744227B2 (ja) 2014-02-21 2020-08-19 エコール・ポリテクニーク・フェデラル・ドゥ・ローザンヌ（ウペエフエル）Ｅｃｏｌｅ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｆｅｄｅｒａｌｅ ｄｅ Ｌａｕｓａｎｎｅ （ＥＰＦＬ） 糖標的化治療剤
US10046056B2 (en) 2014-02-21 2018-08-14 École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) Glycotargeting therapeutics
WO2015164717A1 (en) * 2014-04-24 2015-10-29 Immusant, Inc. Methods of diagnosis and treatment of celiac disease in children
CA2960655C (en) * 2014-09-10 2024-03-19 Vibrant Holdings, Llc Peptide microarrays and novel biomarkers for celiac disease
CA2962933A1 (en) 2014-09-29 2016-04-07 Immusant, Inc. Use of hla genetic status to assess or select treatment of celiac disease
EP3221344A2 (en) * 2014-11-21 2017-09-27 Immusant Inc. Peptides for use in treatment and diagnosis of type 1 diabetes
KR101736744B1 (ko) 2014-12-03 2017-05-17 주식회사 한국유전자정보연구원 셀리악병 진단용 프라이머 세트와 이를 이용한 셀리악병 진단방법
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US20180250359A1 (en) * 2015-08-30 2018-09-06 Diamyd Medical Ab Combination therapy using gliadin and gamma aminobutyric acid
CA3008892A1 (en) 2015-12-23 2017-06-29 Cour Pharmaceuticals Development Company Inc. Covalent polymer-antigen conjugated particles
WO2017143346A1 (en) 2016-02-18 2017-08-24 Cour Pharmaceuticals Development Company, Inc. Process for the preparation of tolerizing immune-modulating particles
US11820833B2 (en) * 2016-06-05 2023-11-21 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Peptides that inhibit binding of EPCR to its ligand to treat inflammation
US20190224276A1 (en) 2016-06-28 2019-07-25 Immusant, Inc. Escalating dosage schedules for treating celiac disease
CA3049624A1 (en) * 2017-01-12 2018-07-19 Probi Ab Probiotic compositions and uses thereof
US10538808B2 (en) 2017-05-26 2020-01-21 Vibrant Holdings, Llc Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing
WO2018232176A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 The University Of Chicago Compositions and methods for inducing immune tolerance
CA3080716A1 (en) * 2017-10-30 2019-05-09 Immusant, Inc. Dosing regimens for celiac disease
JP6568193B2 (ja) 2017-12-19 2019-08-28 ホーユー株式会社 エピトープ
BR112020016221A2 (pt) * 2018-02-08 2020-12-15 Cour Pharmaceuticals Development Company, Inc. Tratamento da doença celíaca com partículas tolerogênicas
CN113227124A (zh) * 2018-10-31 2021-08-06 味之素株式会社 具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐
WO2020181272A1 (en) * 2019-03-06 2020-09-10 Cue Biopharma, Inc. Antigen-presenting polypeptides with chemical conjugation sites and methods of use thereof
JP7374687B2 (ja) 2019-09-26 2023-11-07 三和酒類株式会社 ペンタペプチド化合物
EP4061403A4 (en) * 2019-11-19 2023-12-27 Spark Therapeutics, Inc. SECRETABLE PROTEIN-INDUCED IMMUNE TOLERANCE AND TREATMENT OF AUTOIMMUNE, ALLERGIC AND OTHER DISEASES AND DISORDERS
IL307722A (en) 2021-04-16 2023-12-01 Cour Pharmaceuticals Dev Company Inc A method of monitoring the existence of immunological tolerance
EP4337667A1 (en) 2022-07-21 2024-03-20 Antiva Biosciences, Inc. Compositions and dosage forms for treatment of hpv infection and hpv-induced neoplasia

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4740371A (en) 1984-09-17 1988-04-26 International Institute Of Cellular And Molecular Pathology Treatment of allergy
JP2642112B2 (ja) 1986-03-06 1997-08-20 コモンウエルス サイエンテイフイック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼイシヨン 細胞性免疫応答検出用インビトロ分析
FR2615622B1 (fr) 1987-05-19 1994-05-06 Ire Medgenix Sa Dosage plasmatique de monokines
US5547669A (en) 1989-11-03 1996-08-20 Immulogic Pharma Corp Recombinant peptides comprising T cell epitopes of the cat allergen, Fel d I
US5674978A (en) 1990-09-21 1997-10-07 The Regents Of The University Of California Peptides derived from glutamic acid decarboxylase
US5998366A (en) 1990-09-21 1999-12-07 The Regents Of The University Of California Method for ameliorating glutamic acid decarboxylase associated autoimmune disorders
IL105153A (en) 1992-03-25 1999-12-22 Immulogic Pharma Corp Therapeutic compositions comprising peptides derived from human t cell reactive feline protein
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
WO1996006630A1 (en) 1994-08-26 1996-03-07 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for modulating a t cell response
JPH10505356A (ja) 1994-09-02 1998-05-26 イミユロジク・フアーマシユーチカル・コーポレーシヨン ヒトへの投与のための組成物および方法、抗原特異的免疫応答のダウンレギュレーションを行うことが可能なペプチド
US6759234B1 (en) 1994-09-02 2004-07-06 Immulogic Pharmaceutical Corporation Compositions and methods for administering to humans, peptides capable of down regulating an antigen specific immune response
US5750356A (en) 1996-05-31 1998-05-12 Anergen, Inc. Method for monitoring T cell reactivity
EP0905518A1 (en) 1997-09-23 1999-03-31 Academisch Ziekenhuis Leiden Peptides specific for gluten-sensitive T-cells and use thereof
US6300308B1 (en) 1997-12-31 2001-10-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for inducing autoimmunity in the treatment of cancers
GB9923306D0 (en) 1999-10-01 1999-12-08 Isis Innovation Diagnostic and therapeutic epitope, and transgenic plant
US6667160B2 (en) 2000-03-15 2003-12-23 Kenneth D. Fine Method for diagnosing immunologic food sensitivity
US8110218B2 (en) 2000-11-30 2012-02-07 The Research Foundation Of State University Of New York Compositions and methods for less immunogenic protein-lipid complexes
EP1241476A1 (en) 2001-03-12 2002-09-18 Mabtech AB Diagnosis of metal allergy through cytokine release by T-cells in vitro
US7094555B2 (en) 2001-04-05 2006-08-22 Benaroya Research Institute At Virginia Mason Methods of MHC class II epitope mapping, detection of autoimmune T cells and antigens, and autoimmune treatment
EP1377604B1 (en) 2001-04-12 2014-12-31 Academisch Ziekenhuis Leiden Methods and means for use of hla-dq restricted t-cell receptors and hla-dq-binding prolamine-derived peptides
FI20010868A0 (fi) 2001-04-25 2001-04-25 Markku Maeki Menetelmä ja välineet gluteenin indusoimien tautien havaitsemiseksi
EP1453539B1 (en) 2001-12-05 2008-11-19 Circassia Limited Immunotherapeutic methods and systems
EP1332760A1 (en) 2002-02-04 2003-08-06 Academisch Ziekenhuis Leiden Novel epitopes for celiac disease and autoimmune diseases, methods for detecting those and novel non-antigenic food compounds
US7320788B2 (en) 2002-02-14 2008-01-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enzyme treatment of foodstuffs for Celiac Sprue
ES2361993T5 (es) 2002-02-14 2014-12-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Tratamiento con enzimas de productos alimenticios para celiaquía
US7462688B2 (en) * 2002-05-14 2008-12-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Peptides for diagnostic and therapeutic methods for celiac sprue
AU2003234597A1 (en) 2002-05-14 2003-12-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Drug therapy for celiac sprue
US7202216B2 (en) 2002-05-14 2007-04-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Drug therapy for celiac sprue
GB0212885D0 (en) * 2002-06-05 2002-07-17 Isis Innovation Therapeutic epitopes and uses thereof
AU2002952834A0 (en) 2002-09-16 2002-12-05 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research A method of treating an autoimmune disease
AU2002952548A0 (en) 2002-11-08 2002-11-21 Cellestis Limited Diagnostic assay
AU2003277989B2 (en) 2002-11-08 2010-04-22 QIAGEN Australia Holding Pty. Ltd. Diagnostic assay for measuring a cell mediated immune response
EP1563300B1 (en) 2002-11-20 2012-04-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Diagnostic method for celiac sprue
US7563864B2 (en) * 2004-04-26 2009-07-21 Celiac Sprue Research Foundation Prolyl endopeptidase mediated destruction of T cell epitopes in whole gluten
CA2564521C (en) * 2004-04-28 2017-04-11 Btg International Limited Epitopes related to coeliac disease
GB0409775D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Mabtech Ab Assay
US8053235B2 (en) 2004-10-29 2011-11-08 Benaroya Research Institute At Virginia Mason Methods of generating antigen-specific CD4+CD25+regulatory T cells, compositions and methods of use
EP1937300A4 (en) 2005-08-17 2009-08-12 Multicell Immunotherapeutics I METHOD AND COMPOSITIONS FOR CREATING AND CONTROLLING THE EFFECTOR PROFILE OF T-CELLS BY SIMULTANEOUS LOADING AND ACTIVATION OF SELECTED SUB-GROUPS OF ANTIGEN-PRESENTING CELLS
US20090304754A1 (en) 2005-10-12 2009-12-10 Srebrenka Robic Pegylated glutenase polypeptides
WO2007120834A2 (en) 2006-04-13 2007-10-25 Peptimmune, Inc. Methods for designing and synthesizing directed sequence polymer compositions via the directed expansion of epitope permeability
EP2774621B1 (en) 2007-01-25 2018-01-24 Intrexon Actobiotics NV Treatment of immune disease by mucosal delivery of antigens
ITFE20070003A1 (it) 2007-02-01 2007-05-03 Girolamo Calo' Utilizzo di peptidi ricchi in prolina e glutamina capaci di legarsi alle molecole hla-dq2 e dq8 come "carriers specifici" di agenti capaci di danneggiare o uccidere le cellule che esprimono dette molecole hla nel contesto dell a mucosa enterica di pa
ES2558543T3 (es) 2007-03-16 2016-02-05 Cellestis Limited Un ensayo de respuesta inmunitaria mediada por células y kits para el mismo
EP2659901B1 (en) 2008-04-21 2015-01-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Recombinant deamidated gliadin antigen
AU2009246925A1 (en) 2008-05-16 2009-11-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Non-inflammatory gluten peptide analogues as biomarkers for celiac sprue
CA2731854C (en) 2008-07-25 2020-06-30 Cellestis Limited Measurement of cell-mediated immune response reactivity to detect or monitor a disease or condition
DK2977053T3 (en) 2008-11-30 2017-10-09 Immusant Inc COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR TREATMENT OF CELLIA
WO2011000773A1 (en) 2009-07-02 2011-01-06 Dsm Ip Assets B.V. Testing efficacy for celiac disease
CN102713619B (zh) 2009-12-23 2018-08-10 塞尔雷斯蒂斯有限公司 测量细胞介导免疫反应的试验
WO2011146968A1 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Cellestis Limited A diagnostic assay
US20110311536A1 (en) 2010-06-11 2011-12-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Prevention of type 1 diabetes by treg vaccination with an insulin mimetope
TR201808740T4 (tr) 2011-06-29 2018-07-23 Cellestis Ltd Arttırılmış duyarlılığa sahip hücre aracılı bir immün yanıt tahlili.
US20140248251A1 (en) 2011-07-25 2014-09-04 Daniel C. Adelman Methods and Pharmaceutical Compositions for Treating Celiac Disease and Gluten Intolerance
WO2013036296A1 (en) 2011-09-06 2013-03-14 Selecta Biosciences, Inc. Compositions and methods for producing antigen-specific induced tolerogenic dendritic cells with synthetic nanocarriers
ES2402286B1 (es) 2011-09-29 2014-03-04 Universidad De Valladolid Péptido inmunogénico del gluten y sus aplicaciones.
EP3171171B1 (en) 2011-12-05 2018-07-18 Bio-rad Laboratories, Inc. Recombinant deamidated gliadin antigen
US20160041148A1 (en) 2013-03-14 2016-02-11 Immusant,Inc. Placebo-controlled gluten challenge method
US10449228B2 (en) 2013-09-10 2019-10-22 Immusant, Inc. Dosage of a gluten peptide composition
US20160238590A1 (en) 2013-09-20 2016-08-18 Immusant, Inc. Compositions and methods related to oat sensitivity
WO2015164717A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 Immusant, Inc. Methods of diagnosis and treatment of celiac disease in children

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HK1162918A1 (en) 2012-09-07
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CA2744787A1 (en) 2010-06-03
NZ593474A (en) 2013-04-26
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WO2010060155A1 (en) 2010-06-03
US20170158743A1 (en) 2017-06-08

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