JP5990059B2

JP5990059B2 - ＳｔＡＲ発現抑制剤

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Publication number: JP5990059B2
Application number: JP2012173180A
Authority: JP
Inventors: 高良井上; 一ノ瀬　進; 進一ノ瀬
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2012-08-03
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2016-09-07
Anticipated expiration: 2032-08-03
Also published as: JP2014031339A

Description

本発明は、皮脂分泌抑制効果を奏するＳｔＡＲ発現抑制剤、皮脂分泌抑制等に関する。

皮膚や頭皮の皮脂腺から分泌される皮脂は、皮膚や毛髪の保護のために重要であり、皮膚の水分維持に寄与し、また細菌感染を防ぐ役割も果たしている。しかし、過剰な皮脂分泌は、脂漏性皮膚炎、ニキビ、酒さ（赤ら顔）、フケ、脱毛、更には臭いなどの原因となる。
皮脂の分泌に影響を与える主な因子として、アンドロゲンやエストロゲン等のステロイドホルモン関連因子、ＰＰＡＲ等の核内受容体、サブスタンスＰ等の神経ペプチド等が知られているが、中でも皮脂腺細胞ではアンドロゲン合成系が活発に働いていることが報告されており(非特許文献１)、ステロイドホルモン関連因子との関係は重要視されている。

一方、ＳｔＡＲ（steroidogenic acute regulatory protein）は、ステロイドホルモン合成の律速段階にあたるステップに関わる因子として知られ（非特許文献２）、ＳｔＡＲによりコレステロールのミトコンドリア外膜から内膜への移行が促進され、ミトコンドリア内膜に存在するＣＹＰ１１Ａ１によりコレステロールはプレグネノロン（pregnenorone）に転換され、アンドロゲン、エストロゲン、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイドといった以後のステロイド合成が行われることが明らかにされている。

また、ＳｔＡＲのノックアウトマウスでは、血中のステロイドホルモン濃度が著しく低下しており、生後間もなく副腎皮質不全で死亡することが報告され（非特許文献３）、さらに、アンドロゲンの合成器官である精巣のライディッヒ細胞においても、ＳｔＡＲがテストステロンの合成に中心的な役割を果たしていることが報告されている（非特許文献４）。また最近、本発明者らは、皮膚におけるＳｔＡＲの発現量が、皮膚組織中のテストステロン濃度と正相関することを報告している（非特許文献５）
したがって、ＳｔＡＲの発現を制御することによって、テストステロンの合成量を制御することが可能であると考えられ、ＳｔＡＲの発現の抑制は、皮脂分泌の抑制、毛髪や体毛の伸長を制御可能であると考えられる。

ホウトウ（Ｐａｕｌｏｗｎｉａｆｏｒｔｕｎｅｉ（Ｓｅｅｍ．）Ｈｅｍｓｌ．）は、ゴマノハグサ科の植物で、鼻炎、結膜炎、やけど等の治療に用いられており、ラクンタイ（ＣｒｉｎｕｍａｓｉａｔｉｃｕｍＬ．ｖａｒ．ｓｉｎｉｃｕｍＢａｋ．）は、ヒガンバナ科の植物で、皮膚潰瘍、捻挫、骨折等の治療に古くから使用され、最近では保湿効果、美白効果、中性脂肪蓄積抑制効果を有することが報告されている（特許文献１）。また、ハチセンカ（Ｈｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｓｅｒｉｇｅ）は、ユキノシタ科の植物で、抗マラリア作用等を有することが知られている。

しかしながら、これらの植物とＳｔＡＲの発現抑制、皮脂分泌抑制、育毛との関係については全く知られていない。

特開２０１０−２１５５６６号公報

J Invest Dermatol 116 793-800 Annu. Rev. Physiol. (2001). 63, 193-213 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94, 11540-11545 J. Androl. (2001) 22, 149-156. 第84回日本内分泌学会学術総会学会要旨集

本発明は、ＳｔＡＲ発現を抑制し、皮脂の過剰分泌を抑制することが可能な、ＳｔＡＲ発現抑制剤、皮脂分泌抑制剤等を提供することに関する。

本発明者は、皮脂分泌におけるＳｔＡＲの機能について、研究を進めた結果、ＳｔＡＲの発現を抑制することにより、皮脂の蓄積が有意に抑制されることを明らかにした（参考例１）。そして、ＳｔＡＲのプロモーター配列を利用した転写活性評価系を構築し、ＳｔＡＲの発現を抑制する素材について探索したところ、ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカに優れたＳｔＡＲ発現抑制作用があり、これらが過度の皮脂分泌に起因する疾患や症状、頭髪に対する育毛等のために利用できることを見出した。

すなわち、本発明は、次の（１）〜（５）に係るものである。
（１）ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とするＳｔＡＲ発現抑制剤。
（２）ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とする皮脂分泌抑制剤。
（３）ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とするニキビ予防又は改善剤。
（４）ホウトウ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とする育毛剤。
（５）ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とするアンドロゲン合成抑制剤。

本発明のＳｔＡＲ発現抑制剤等は、ＳｔＡＲの発現抑制し、皮脂分泌抑制効果を発揮することから、過度の皮脂分泌に起因する、脂漏性皮膚炎、ニキビ、酒さ（赤ら顔）、フケ、脱毛、更には臭い（皮脂の臭い）などの予防又は改善、或いは頭髪（頭頂部）に対する育毛、男性型脱毛症の予防又は改善、体毛やひげなどに対する抑毛効果を発揮し得る医薬品、医薬部外品、化粧品として、或いはこれらへ配合するための素材又は製剤として有用である。

ＳｔＡＲの発現抑制と皮脂蓄積との関係を示す図。ＳｔＡＲの発現と毛髪密度の関係を示す図。（ａ）頭頂部及び側頭部における毛髪密度、（ｂ）頭頂部及び側頭部におけるＳｔＡＲの染色強度。各植物抽出物のＳｔＡＲ発現抑制効果を示す図。

本明細書において、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処理行為を含まない概念である。

本明細書において、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転、疾患、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。

本明細書において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。

本明細書において、「ＳｔＡＲ発現抑制」とは、ＳｔＡＲ（steroidogenic acute regulatory protein）のｍＲＮＡ発現及びタンパク質発現を抑制することを意味し、ＳｔＡＲのプロモーター活性を抑制することが包含される。

本明細書において、ホウトウとは、ゴマノハグサ科キリ属のＰａｕｌｏｗｎｉａｆｏｒｔｕｎｅｉ（Ｓｅｅｍ．）Ｈｅｍｓｌ．（和名：ココノエギリ、キリ）を指し、ラクンタイとは、ヒガンバナ科ハマオモト属のＣｒｉｎｕｍａｓｉａｔｉｃｕｍＬ．ｖａｒ．ｓｉｎｉｃｕｍＢａｋ．（和名：ハマオモト）を指し、ハチセンカとは、ユキノシタ科アジサイ属のＨｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｓｅｒｉｇｅ（和名：アジサイ）を指す。

斯かる植物は、いずれの任意の部位、例えば全草、葉、茎、芽、花、蕾、木質部、樹皮、地衣体、根、根茎、仮球茎、球茎、塊茎、種子、果実、菌核若しくは樹脂等、又はそれらの組み合わせを使用することができるが、ホウトウは花、ラクンタイは葉、ハチセンカは枝葉をそれぞれ用いるのが好ましい。
斯かる植物は、そのまま又は乾燥・粉砕等して用いることができる。また、上記部位は、そのまま抽出工程に付されてもよく、又は粉砕、切断若しくは乾燥された後に抽出工程に付されてもよい。該抽出物は天然成分由来であり安全性も高い。

抽出物を得る抽出手段は、具体的には、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の手段を用いることができる。抽出時間を短縮する場合には、攪拌を伴う固液抽出が望ましい。この固液抽出の好適な条件の一例としては、１００〜４００ｒ／ｍｉｎで１〜３０分間の攪拌が挙げられる。
抽出物の酸化を防止するため、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、いわゆる非酸化的雰囲気下で抽出する手段を併用してもよい。

抽出のための溶剤には、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができる。溶剤の具体例としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；及び超臨界二酸化炭素；ピリジン類；油脂、ワックス等その他オイル類等の有機溶剤；ならびにこれらの混合物が挙げられる。好適には、水、アルコール類、アルコール−水混合液、炭化水素類が挙げられ、アルコール−水混合液、炭化水素類がより好ましい。アルコール類としては炭素数１〜５のアルコール類が好ましく、エタノールがより好ましい。炭化水素類としてはヘキサンが好ましい。

抽出のための溶剤としてアルコール−水混合液を使用する場合には、アルコール類と水との配合割合（容量比）としては、０．００１〜１００：９９．９９９〜０が好ましく、５〜９５：９５〜５がより好ましく、２０〜８０：８０〜２０がさらに好ましく、３０〜７０：７０〜３０がさらにより好ましく、４０〜６０：６０〜４０がなお好ましい。エタノール水溶液の場合、エタノール濃度が４０〜６０容量％であることが好ましい。

溶剤の使用量としては、それぞれの植物（乾燥質量換算）１ｇに対して１〜１００ｍＬ、更に８〜５０ｍＬが好ましく、抽出時間としては、１分間〜１００日間が好ましく、１分間〜３日間がより好ましい。このときの抽出温度は、０℃〜溶媒沸点、より好ましくは２０〜１００℃、さらに好ましくは４０〜９０℃である。

斯くして得られる植物抽出物は、抽出液や画分をそのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、或いは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製したものでもよい。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、水・エタノール混液、水・プロピレングリコール混液、水・ブチレングリコール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
また、植物の抽出物は市販品を使用することもできる。

本発明の植物の抽出物は、食品上・医薬品上許容し得る規格に適合し本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよく、さらに得られた粗精製物を公知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。精製手段としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。

後記実施例で示すとおり、本発明の植物又はそれらの抽出物は、ＳｔＡＲの発現を抑制する作用を有する（実施例１）。皮脂腺細胞において、ＳｔＡＲの遺伝子発現を抑制（ｓｉＲＮＡ）した場合、皮脂の蓄積は有意に抑制されることから（参考例１）、本発明の植物又はそれらの抽出物は、皮脂分泌抑制作用を有すると云え、実際に、ハムスター皮脂腺細胞において、皮脂蓄積量を抑制する作用を有することが確認された（実施例２）。
したがって、本発明の植物又はそれらの抽出物は、過度の皮脂分泌に起因する疾患や症状、例えば、脂漏性皮膚炎、ニキビ、酒さ（赤ら顔）、フケ、脱毛、更には臭いなどの予防又は改善に有効である。
また、皮膚におけるＳｔＡＲの発現量は、皮膚組織中のテストステロン濃度と正相関する（前記非特許文献３）。テストステロンは毛の伸長と密接に関与することが知られており(Dermatol. Ther. 2008; 21: 314-328. )、頭髪や体毛、ひげといった毛の成長を制御する（Mol Cell Endocrinol (2002) 198, 89-95）。また、本発明者らは、ＳｔＡＲの発現量が異なる頭頂部と側頭部の頭皮における毛の密度が、ＳｔＡＲの発現が高い部位（頭頂部）では低いことを明らかにしている（参考例２）。
したがって、ＳｔＡＲの発現を抑制することによってテストステロンの生合成を抑制でき、当該毛の成長を制御できると考えられる。すなわち、ＳｔＡＲの発現抑制作用を有する本発明の植物又はそれらの抽出物は、テストステロン合成抑制剤ともなり得、頭髪（頭頂部）に対する育毛、男性型脱毛症の予防又は改善、体毛、ひげなどに対する抑毛等の効果を有すると考えられる。

以上より、本発明の植物又はその抽出物は、ＳｔＡＲの発現抑制のために、或いは皮脂分泌抑制のために、或いはニキビの予防又は改善のために、或いは育毛のために、或いはテストステロン合成抑制のために使用することができる。当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。

また、本発明の植物又はそれらの抽出物は、ＳｔＡＲ発現抑制剤、皮脂分泌抑制剤、ニキビの予防又は改善剤、育毛剤、テストステロン合成抑制剤（以下、ＳｔＡＲ発現抑制剤等）として使用することができ、さらにこれらの剤を製造するために使用することができる。このとき、当該ＳｔＡＲ発現抑制剤等には、本発明の植物又はそれらの抽出物を単独で、又はこれ以外に、必要に応じて適宜選択される製剤担体等の許容されるものを使用してもよい。

当該ＳｔＡＲ発現抑制剤等は、それ自体、ＳｔＡＲ発現抑制、皮脂分泌抑制、ニキビの予防又は改善、育毛、テストステロン合成抑制の各効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、化粧料、食品又は飼料であってもよく、又は当該医薬品、医薬部外品、化粧料等に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。食品としては、ＳｔＡＲ発現抑制、皮脂分泌抑制果等の生理機能をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した飲食品、機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用食品等を包含する。

上記医薬品（医薬部外品も含む）は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、例えば注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与又は錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与が挙げられる。
このような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、本発明の植物又はそれらの抽出物を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。

これらの投与形態のうち、好ましい形態は経口投与であり、製剤中の本発明の植物又はそれらの抽出物の含有量（抽出物の乾燥物換算）は、一般的に０．００００１〜１０質量％とするのが好ましく、０．０００１〜１質量％とするのがより好ましい。

上記食品の形態は、固形、半固形又は液状であり得、例えば、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
種々の形態の食品を調製するには、本発明の植物又はそれらの抽出物を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。当該食品中の本発明の植物又はそれらの抽出物の含有量（抽出物の乾燥物換算）は、一般的に０．０１〜１００質量％とするのが好ましく、０．１〜１００質量％とするのがより好ましく、更に好ましくは１〜１００質量％とするのが好ましい。

上記医薬品等の投与量又は摂取量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与又は摂取の場合成人１人当たり、本発明の植物又はそれらの抽出物（乾燥物換算）として、１日あたり０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇとすることが好ましく、特に０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇとするのが好ましい。

上記化粧料（医薬部外品も含む）の形態は、皮膚外用剤、洗浄剤、メイクアップ化粧料等とすることができ、使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の化粧料は、本発明の植物及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種と、皮膚化粧料に配合され得る、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤（例えば、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、ビタミン類等）、香料、樹脂、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせることにより調製することができる。

当該化粧料の全量中の、本発明の植物又はそれらの抽出物の含有量は、抽出物の乾燥物換算で、通常０．０００１〜２０質量％であり、０．００１〜１０質量％が好ましく、０．０１〜５質量％がより好ましい。

上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とするＳｔＡＲ発現抑制剤。
＜２＞ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とする皮脂分泌抑制剤。
＜３＞ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とするニキビ予防又は改善剤。
＜４＞ホウトウ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とする育毛剤。
＜５＞ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とするテストステロン合成抑制剤。

＜６＞ＳｔＡＲ発現抑制剤を製造するための、ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物の使用。
＜７＞皮脂分泌抑制剤を製造するための、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物の使用。
＜８＞ニキビ予防又は改善剤を製造するための、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物の使用。
＜９＞育毛剤を製造するための、ホウトウ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物の使用。
＜１０＞テストステロン合成抑制剤を製造するための、ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物の使用。
＜１１＞ＳｔＡＲ発現抑制に使用するための、ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物。
＜１２＞皮脂分泌抑制に使用するための、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物。
＜１３＞ニキビ予防又は改善に使用するための、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物。
＜１４＞育毛に使用するための、ホウトウ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物。
＜１５＞テストステロン合成抑制に使用するための、ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物。
＜１６＞ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を投与又は摂取するＳｔＡＲ発現抑制方法。
＜１７＞ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を投与又は摂取する皮脂分泌抑制方法。
＜１８＞ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を投与又は摂取するニキビ予防又は改善方法。
＜１９＞ホウトウ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を投与又は摂取する育毛方法。
＜２０＞ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を投与又は摂取するテストステロン合成抑制方法。
＜２１＞非治療的な方法である前記＜１６＞〜＜２０＞のいずれか１に記載の方法。
＜２２＞前記＜１＞〜＜２１＞において、植物の使用部位は、好適には、ホウトウは花、ラクンタイは葉、ハチセンカは枝葉である。
＜２３＞前記＜１＞〜＜２１＞において、植物抽出物を得るための抽出溶剤は、好適には、水、アルコール系（アルコール類及び／又は多価アルコール類）溶剤、又は水−アルコール系混合溶剤である。ここで、アルコール類としてはメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールがより好ましく、エタノールがさらに好ましく、また、多価アルコール類としてはブチレングリコールがより好ましい。
＜２４＞前記＜１＞〜＜２１＞において、植物抽出物を得るための抽出溶剤は、好適にはアルコール−水混合液であり、さらに好適には、アルコールの濃度が５％（ｖ／ｖ）以下、２０％（ｖ／ｖ）以上、３０％（ｖ／ｖ）以上、４０％（ｖ／ｖ）以上、そして６０％（ｖ／ｖ）以下、７０％（ｖ／ｖ）以下、８０％（ｖ／ｖ）以下、９５％（ｖ／ｖ）以下である。
＜２５＞前記＜１＞〜＜２１＞において、植物抽出物は、好適には、植物体１質量部に対して８質量部以上５０質量部以下の抽出溶剤を用い、４０℃以上９０℃以下にて１分間以上３日間以下抽出されるものである。

参考例１皮脂分泌におけるＳｔＡＲの機能
１．細胞培養
ハムスターの耳介部由来の皮脂腺培養細胞Ｈａ−ＳＥ（クラボウ社）は、増殖状態を保つために皮脂腺細胞増殖用培地（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＢＧ；添加剤としてヒトｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）を用いて増殖させ、その後、分化を誘導（皮脂合成を促進）するために皮脂腺細胞分化誘導培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＢＤ；添加剤としてインスリン）を用いて培養を行った。

２. ｓｉＲＮＡ処理
Ｈａ−ＳＥを6−ｗｅｌｌｐｌａｔｅに１．０×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、４８時間後（９０％コンフルエント）にＳｔＡＲの遺伝子発現をノックダウンするために、ｓｉＲＮＡを製品添付のプロトコールに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）を用いて細胞に導入した（２０ｎＭｓｉＲＮＡ, ５μｌＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）。設計したｓｉＲＮＡの配列は表１に示した。また陰性Ｃｏｎｔｒｏｌには上記のｓｉＲＮＡと等量のＳｔｅａｌｔｈＲＮＡｉＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌＤｕｐｌｅｘｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を細胞に導入した。導入２４時間後に分化誘導培地であるＨｕｍｅｄｉａ−ＢＤに培地を交換し、培養を継続した。

３. ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ
導入３日後に細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｋｉｔ (ＱＩＡＧＥＮ社)を用いて、添付のマニュアルに従いＲＮＡ抽出を行った。１μｇのＲＮＡを鋳型にして、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、添付のマニュアルに従いｃＤＮＡ合成を行った。ＴａｑＭａｎR ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ、Ｔａｑｍａｎプローブ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて内在性Ｃｏｎｔｒｏｌである１８ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡの発現を定量した。一方でＳＹＢＲR ＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、及び表２に示したｐｒｉｍｅｒを用いて、ＳｔＡＲの発現量を定量した。ＳｔＡＲの発現量を１８ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡの発現量で補正し、相対発現量として評価した。

４. 脂質定量
導入１４日後に、オイルレッド染色の強度を指標とした脂質合成測定キット（クラボウ社）を用いて、添付のマニュアルに従い脂質の定量を行った。
５．結果
ＳｔＡＲの発現抑制により皮脂の蓄積が有意に抑制されることが確認された（図１）。

参考例２ＳｔＡＲ発現と毛の関係
１．ヒト頭皮標本
同一個人（男性１０人）より採取した側頭部と頭頂部の皮膚は、適当な大きさに切り分け、１０％のホルマリン溶液に浸漬し、２４時間置いた後、パラフィンで包埋した。

２．ＨＥ染色と毛髪密度の測定
ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックより、それぞれの検体において切片を作成した後に、ＨＥ染色を実施した。ＨＥ染色切片上に存在する毛包数を顕微鏡下で測定し、その数を組織の長さで除いたものを毛髪密度とした。

３．ＳｔＡＲの免疫染色
免疫組織化学にはヒストファインキット(ニチレイ社)を用いた。ＳｔＡＲの抗原賦活化はクエン酸バッファー（２ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸、９ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸三ナトリウム二水和物、ｐＨ６．０）中で２０分間マイクロウェーブ処理を行った。一次抗体原液の希釈率はＳｔＡＲ: １／５００とした。発色はＤＡＢ溶液（１ｍＭＤＡＢ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬｂｕｆｆｅｒ (ｐＨ７．６)、０．００６％過酸化水素）を用いて行い、カウンター染色にはヘマトキシリン溶液を用いた。陰性コントロールには一次抗体の代わりにウサギのＩｇＧを用いた。ＳｔＡＲの染色強度は、Breast Cancer Res. Treat. (2002) 74, 47-53に記載された改変版Ｈ−ｓｃｏｒｅ法を用いて目視評価を行った）。
４．結果
ＳｔＡＲの発現が高い部位は、毛髪密度が低いことが確認された（図２）。

製造例植物抽出物の調製
（製造例１）ホウトウ抽出物の調製
ホウトウ（Ｐａｕｌｏｗｎｉａｆｏｒｔｕｎｅｉ（Ｓｅｅｍ．）Ｈｅｍｓｌ．）の花２００ｇに、１５倍量（３Ｌ）の５０（ｖ／ｖ）％エタノール−水混合溶液を加え、８５℃、３時間で抽出し、不溶物をろ別後、抽出液を得、減圧濃縮し、ホウトウの抽出乾固物を得た。
この抽出固形分を５０（ｖ／ｖ）％エタノールに溶解し、ホウトウの１（ｗ／ｖ）％エタノール抽出物を調製した。

（製造例２）ラクンタイ抽出物の調製
ラクンタイ（ＣｒｉｎｕｍａｓｉａｔｉｃｕｍＬ．ｖａｒ．ｓｉｎｉｃｕｍＢａｋ．）の葉２００ｇに、１５倍量（３Ｌ）の５０（ｖ／ｖ）％エタノール−水混合溶液を加え、８５℃、３時間で抽出し、不溶物をろ別後、抽出液を得、減圧濃縮し、ラクンタイの抽出乾固物を得た。
この抽出固形分を５０（ｖ／ｖ）％エタノールに溶解し、ラクンタイの１（ｗ／ｖ）％エタノール抽出物を調製した。

（製造例３）ハチセンカ抽出物の調製
ハチセンカと（Ｈｙｄｒａｎｇｅａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｓｅｒｉｇｅ）の枝葉１００ｇに、２０倍量（２Ｌ）の５０（ｖ／ｖ）％エタノール−水混合溶液を加え、８５℃、３時間で抽出し、不溶物をろ別後、抽出液を得、減圧濃縮し、ハチセンカの抽出乾固物を得た。
この抽出固形分を５０（ｖ／ｖ）％エタノールに溶解し、ハチセンカの１（ｗ／ｖ）％エタノール抽出物を調製した。

実施例１各抽出物におけるＳｔＡＲ発現抑制作用
（１）ＳｔＡＲのプロモーターアッセイ
ＳｔＡＲのプロモーター領域（−９８０／＋６１）をホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込み、副腎皮質癌細胞株であるＨ２９５Ｒ細胞に導入して過剰発現させた。そこにＳｔＡＲの発現を亢進させる薬剤ｃＡＭＰを添加した条件下で、被験物質を添加しＳｔＡＲのプロモーター活性が抑制された場合において、ルシフェラーゼの活性が減少する評価系を構築した。

＜材料＞
ｐＧＬ４．１０及びｐＲＬ−ＣＭＶは、Ｐｒｏｍｅｇａ社より購入した。
ｐＧＬ４．１０ (ＳｔＡＲ)は、ＳｔＡＲのプロモーター領域（−９８０／＋６１）を以下のプライマーを用いてヒトゲノムより増幅し、ＸｈｏＩとＨｉｎｄIIIで切断したｐＧＬ４．１０に、Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ）を用いてクローニングし、ｐｌａｓｍｉｄを構築した。
プライマー配列：
Ｆｏｗａｒｄ：GCTCGCTAGCCTCGAGTCTCTACTGCCTGGTAAACACC（配列番号６）
Ｒｅｖｅｒｃｅ：CCGGATTGCCAAGCTTTCATGTTGCGCATGTGTCTGTA（配列番号７）

＜評価方法＞
Ｈ２９５Ｒ細胞を９６−ｗｅｌｌｐｌａｔｅに１１．０×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、その１２時間後に培養液（５％チャコール処理血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）を交換し、ｐＧＬ４．１０（ＳｔＡＲ）、及びｐＲＬ−ＣＭＶをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）を用い、製品添付のプロトコールに従い細胞に導入した。導入２４時間後に、ｃＡＭＰ溶媒（終濃度２５μＭ）、及び製造例１〜３で調製した各植物抽出物（０．５％（ｖ／ｖ）、１．０％（ｖ／ｖ）)のいずれかを添加し、さらに２４時間培養を行った。ホタルルシフェラーゼ（ＳｔＡＲのプロモーター活性の指標）、及びウミシイタケルシフェラーゼ（ｐｌａｓｍｉｄの導入効率の指標）の活性測定には、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ^TM ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、添付のプロトコールに従い実施した。ホタルルシフェラーゼの発光強度をウミシイタケルシフェラーゼの発光強度で除したものを、Ｒｅｌａｔｉｖｅｌｉｇｈｔｕｎｉｔ（ＲＬＵ）として算出した。

＜結果＞
本発明の植物抽出物は、コントロールと比較して７０％以下にＳｔＡＲの発現（ＳｔＡＲのプロモーター活性）を抑制する作用が認められた（図３）。

実施例２皮脂蓄積抑制作用
本発明の植物抽出物の皮脂蓄積抑制効果を確認すべく、ハムスター皮脂腺細胞に対してインスリンを用いて分化誘導し、そこに製造例２及び３で調製した各植物抽出物を添加して皮脂の蓄積をナイルレッド染色の蛍光強度を指標に評価を行った。

＜材料＞
ハムスター皮脂腺細胞はクラボウ社より購入した。

＜評価方法＞
ハムスター初代培養皮脂腺細胞（クラボウ社）を２４−ｗｅｌｌｐｌａｔｅに１×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう播種し、３日間Ｈｕｍｅｄｉａ−ＢＧ（クラボウ社）で培養した後、陰性対照であるＤｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（コントロール）、皮脂蓄積を抑制することが知られているａｌｌｔｒａｎｓｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄ（ａｔＲＡ）、アダパレン（ａｄａｐａｌｅｎｅ）、及び製造例２、３で調製した植物抽出物のいずれかを、それぞれ１（ｖ／ｖ）％となるように添加したＨｕｍｅｄｉａ−ＢＤ（クラボウ社）中で更に３日間培養した。培養後、それぞれのｗｅｌｌをＰＢＳで２回洗浄し、１０μｇ／ｍｌＮｉｌｅＲｅｄ染色液を滴下し３０分３７℃、ＣＯ₂ ５％の条件下で染色した。染色終了後にＰＢＳで２回洗浄し、４８５ｎｍの励起波長を当て、５６５ｎｍの波長の蛍光強度を測定した。

＜結果＞
本発明の植物抽出物は、ハムスター皮脂腺細胞における皮脂の蓄積を抑制した（表１）。

Claims

ホウトウ、ラクンタイ及びハチセンカから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とするＳｔＡＲ発現抑制剤。
ラクンタイ又はその抽出物を有効成分とする皮脂分泌抑制剤。
ラクンタイ又はその抽出物を有効成分とするニキビ予防又は改善剤。
ホウトウ及びラクンタイから選ばれる１種以上の植物又はそれらの抽出物を有効成分とするテストステロン合成抑制剤。