JP5984267B2 - 活性型の可溶性シアリルトランスフェラーゼを作製及び精製する方法 - Google Patents
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Description
a)CHO細胞においてシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを発現させ、発現されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを含有する培養培地を回収する工程と、
b)前記細胞培養培地を、(i)少なくとも1回のアフィニティークロマトグラフィー及び/又は1回の混合モードクロマトグラフィー工程と、(ii)少なくとも1回の陰イオン交換クロマトグラフィー及び/又は1回の陽イオン交換クロマトグラフィー工程とに供することにより、前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを該培養培地から精製する工程と、
を含む、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを作製する方法を提供することによって本発明に従って解決される。
i.陰イオン交換クロマトグラフィー;
ii.第1のアフィニティークロマトグラフィー;
iii.第2のアフィニティークロマトグラフィー又は混合モードクロマトグラフィー;
iv.陽イオン交換クロマトグラフィー。
i.陰イオン交換クロマトグラフィー;
ii.第1のアフィニティークロマトグラフィー;
iii.第2のアフィニティークロマトグラフィー又は混合モードクロマトグラフィー;
iv.陽イオン交換クロマトグラフィー。
一実施形態では、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、シアリルトランスフェラーゼシグナルドメインの全て若しくは一部、シアリルトランスフェラーゼ膜貫通ドメインの全て若しくは一部、及び/又はシアリルトランスフェラーゼステムドメインの全て若しくは一部を欠いている切断型シアリルトランスフェラーゼポリペプチドである。好ましくは、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドはシアリルトランスフェラーゼ活性ドメインのみを含む。シアリルトランスフェラーゼポリペプチドはシグナルペプチドを更に含むことができる。
本発明によれば、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドをCHO細胞又は当業者に既知の同等の細胞株で発現する。可溶性シアリルトランスフェラーゼの発現のために各遺伝物質を宿主細胞に導入するのに使用される特定の手法は特に重要ではない。当業者により理解されるように、プロモーターの選択、並びに本発明のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを発現するのに使用される宿主細胞に遺伝物質を導入するための方法及び戦略が当該技術分野で既知である。
本発明の実施形態によれば、作製方法の工程a)を、無血清フェドバッチ培養を使用することにより、及び5×105生存細胞数/mL以上、好ましくは1.5×106生存細胞数/mL以上の所定の細胞密度に達した後、37℃±1℃から32℃±1℃へのインキュベーション温度変化を用いることにより行う。本発明者らは、この温度変化が細胞の生存率を増大させ、それにより細胞を培養物中でより長期間維持することができることを見出している。これにより、より高い生産収率がもたらされる。
本発明の更なる態様によれば、培養培地からのシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの精製を、培養培地を少なくとも1回のアフィニティークロマトグラフィー工程及び/又は混合モードクロマトグラフィー工程と、少なくとも1回の陰イオン交換クロマトグラフィー工程及び/又は陽イオン交換クロマトグラフィー工程とに供することにより行う。
i.酵素を含有する溶液を濃縮し、DNA、宿主細胞タンパク質(HCP)及び発酵培地化合物等の夾雑物の最初の低減をもたらす陰イオン交換クロマトグラフィー、
ii.シアリルトランスフェラーゼ酵素を濃縮し、宿主細胞タンパク質を枯渇させる中間精製工程として用いられる第1のアフィニティークロマトグラフィー、
iii.宿主細胞タンパク質レベルを効果的に低減させるのに用いられる第2のアフィニティークロマトグラフィー又は混合モードクロマトグラフィー、及び
iv.あらゆる残存する宿主細胞タンパク質及び他の夾雑物を取り除くのに用いられる陽イオン交換クロマトグラフィー。
本発明の実施形態によれば、シアリルトランスフェラーゼポリペプチド精製プロセスには、陰イオン交換クロマトグラフィー(AEC)工程が含まれる。
本発明の実施形態によれば、シアリルトランスフェラーゼポリペプチド精製プロセスには、アフィニティークロマトグラフィー工程(好ましくは色素アフィニティークロマトグラフィーである)が含まれる。
本発明の実施形態によれば、シアリルトランスフェラーゼポリペプチド精製プロセスは、先の第II章に記載された第2のアフィニティークロマトグラフィー工程、又は混合モードクロマトグラフィー、好ましくはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む。
本発明の実施形態によれば、シアリルトランスフェラーゼポリペプチド精製プロセスには、陽イオン交換クロマトグラフィー(CEC)工程が含まれる。
さらに、本方法はろ過工程を含むことができる。ろ過プロセスは、当業者によって既知であり、あらゆる一般的な方法を使用することができる。本方法は、本方法の様々な工程で1つ又は複数の限外ろ過プロセスを含むことができる。本方法は、例えば最終的なウイルス除去のためにナノろ過を含むことができる。
別の態様では、本発明は、本発明による方法のいずれか1つにより作製されるシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。
更なる態様では、本発明は治療用タンパク質のグリコシル化のための、特にヒトG−CSF、エリスロポエチン、IFN、hGH、FSH、インスリン又は抗体の糖PEG化のための本発明による方法により作製されたST6GalNacIの使用を含む。
発現カセットは、介在配列の8つのアミノ酸がN末端に付着した、アミノ酸K232でN末端切断したニワトリグリコシルトランスフェラーゼ(α−N−アセチル−ノイラミニル−2,3−β−ガラクトシル−1,3−N−アセチルガラクトサミニドα−2,6−シアリルトランスフェラーゼI)からなるST6GalNAcIポリペプチドの発現のために作製した。発現に用いられる全アミノ酸配列を配列番号6に示す。
EPOシグナル配列(ヒトエリスロポエチンエキソン1(4つのアミノ酸をコードする)、イントロン1、及びエキソン2の一部(27個のアミノ酸:MGVHECPAWLWLLLSLLSL PLGLPVLGをコードする)からなる);
ST6GalNAcI及び介在配列のヌクレオチド配列(配列番号5);
ヒトエリスロポエチンの3’−UTR、285bp;
5’−Not I部位を有する45bpのリンカー(3’−MunI部位はSV40配列の不可欠部分である)。
合成EcST6画分をNotI/MnuI画分として発現ベクターpMOZ−G8にクローニングした。
分泌型のニワトリST6Gal−NAcIの発現のために、チャイニーズハムスター卵巣細胞株を使用した。ST6GalNAcIの作製に用いられる親細胞株は、無血清及び無タンパク質の培地での成長に適しているジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)活性を欠いたチャイニーズハムスター卵巣細胞株(CHO dhfr−)であるCHOSI 4の誘導体である。
CHOSI 4宿主細胞株をCHO dhfr−から誘導した(ATCC番号CRL−9096;DSMZ, Braunschweig, GermanyによるACC126)。
CHOSI 4宿主細胞株は、MAM−PF2培地中の長期培養による無血清及び無タンパク質の既知組成培地中の成長に適していた。
CHOSI 4の形態は円形である。培養物は単一細胞懸濁液として成長させる。
CHOSI 4は血清、タンパク質、ペプチド又は加水分解物を含有しない、無動物成分の既知組成MAM−PF培地での成長に適している。また、細胞株を他の市販の無血清培地中で培養することができる。
CHOSI 4を1週間当たり1:50の総分割比で継代培養する。細胞を初めに1:20で分割し、新たなフラスコに入れ、4日後に初期容量の3/2の新鮮な培地を得る。CHOSI 4は、1日当たり1を超える比成長速度(D>1×d−1)及び撹拌培養系においてバッチモードで2×106細胞数/mL、及びフェドバッチモードで1×107細胞数/mLという細胞密度を示す。
付着因子又はウシ胎仔血清を細胞培養培地に添加することにより、細胞形態が変化し、上皮層へとCHOSI 4細胞が逆戻りする。
Tフラスコ及びスピナーフラスコ内での細胞の解凍及び接種材料の増殖
MCBの単一バイアルを液体窒素の気相中での保管から取り出し、37±1℃の温浴で加温した。細胞を遠心分離により予め加温した新鮮な培養培地の入ったTフラスコ内に回収した。更なる接種材料の増殖は、スピナーフラスコ内での希釈工程及び継代培養工程により、培養培地の容量をバイオリアクター内でのシードとして用いるのに適切な最終容量まで増大することで達成された。
スピナーフラスコ内での細胞の増殖後、接種材料をシードバイオリアクターに移し、新鮮な培地を用いて、容量を10Lの最終実施容量まで増大させた。生産用バイオリアクターでの接種に適切な細胞数が達成されるまで、細胞を3日間シードバイオリアクター内で培養した。
シードバイオリアクター内での成長後、シードバイオリアクターの内容物を無菌状態で生産用バイオリアクターに移し、移した培養物を新鮮な培養培地を用いて最終実施容量まで増殖させた。1.5×106生存細胞数/mL以上の所定の細胞密度に達した後、37℃±1℃から32℃±1℃へとインキュベーション温度を下げた。グルコースレベルは4g/L〜8g/Lの濃度のグルコース溶液を供給することにより、規定の範囲内に維持した。発酵プロセスは生産用バイオリアクター内での培養開始の14日〜17日後に終了させた。
発酵の終了後、滅菌使い捨てバッグでの回収物の深層ろ過により、生産用バイオリアクターの細胞懸濁液から細胞及び残屑を取り除いた。使い捨て深層フィルターを回収物のろ過に用いた。回収物を更なる下流の処理まで2℃〜8℃で保管した。
精製−実施例1
ST6GalNAcIの精製プロセスは、陰イオン交換カラムを用いる捕捉クロマトグラフィー工程から開始した。続く精製工程には、アフィニティークロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、限外ろ過/透析ろ過、陽イオン交換クロマトグラフィー、及び15nmのPlanova(商標)膜に通す最後のナノろ過が含まれていた。クロマトグラフィー工程は勾配クロマトグラフィー系を用いて行い、自動で実行した。UV吸収、導電率、pH、流速及び背圧をクロマトグラフィー工程ごとに好適なソフトウェアにより記録した。
Q−Sepharose Fast Flow樹脂による陰イオン交換クロマトグラフィーを第1のクロマトグラフィー工程として使用し、回収物中でST6GalNAcIを捕捉し、容量を低減した。
Blue Sepharose 6FFは、色素Cibacron Blue(商標)と共有結合的に連結するアガロース樹脂であり、Q−Sepharose溶出液に含有される夾雑物の存在下でST6GalNAcIと優先的に結合させるのに使用した。ST6GalNAcIを25mMのリン酸カリウムバッファー(pH7.5)中の500mMの塩酸L−アルギニンによって溶出した。溶出液をUV吸収プロファイルに基づき回収した。
ヒドロキシアパタイト樹脂での混合モードクロマトグラフィーを、中間工程として使用して、HCP及びDNAのレベルを更に低減した。ST6GalNAcIを5mMのリン酸ナトリウムバッファー(pH6.8)中の1.0MのNaClによって溶出した。溶出液をUV吸収プロファイルに基づき回収した。
ヒドロキシアパタイト溶出液を、30kDaの分子量カットオフ(MWCO)でSartoconスライスモジュールを用いて透析ろ過した。接線流ろ過を実施し、生成物を脱塩及び濃縮して、最終的にバッファーを25mMのリン酸カリウムバッファー(pH6.0)に交換した。
陽イオン交換クロマトグラフィーを最終精製(polishing)工程として用い、残りの残存するHCPを可能な限り全て除去した。特定条件下で、適用されるST6GalNAcIを25mMのリン酸カリウムバッファー(pH6.0)中の250mMのNaClによって溶出した。
SP−Sepharose溶出液を30kDaのMWCOでSartoconスライスモジュールによって透析ろ過した。接線流ろ過を実施し、生成物を脱塩及び濃縮して、バッファーを50mMのBisTris(pH6.5)、100mMのNaCl、5%ソルビトールに交換した。
第1のカラム:陰イオン交換クロマトグラフィー(Q Sepharose FF)
このプロセス工程を陰イオン交換クロマトグラフィーによる、清澄化した(clarified)滅菌ろ過済みのバイオリアクター回収物からのcST6の捕捉に用いる。バイオリアクターからの1000mLの上清をバッファーA(20mMのTris(pH7.6))で1:3に希釈して、omni 25/150 Q Sepharose FFカラムに充填した。cST6を線形NaCl勾配(0−1M、20CV)により溶出した。
このアフィニティークロマトグラフィープロセス工程は、cST6純度を増大するのに重要な中間工程である。Q Sepharose捕捉工程からの画分9〜画分11のプールをバッファーA(10mMのMES(pH6.8)、25%グリセロール)で1:3に希釈して、XK 10/55 CDPアフィニティーカラムに充填した。CDPカラムの過充填を避けるために、充填物を2つの同一のCDP操作に適用した。cST6を線形NaCl勾配(0−1M、10CV)により溶出した。
この陰イオン交換クロマトグラフィーを最終精製工程として用いた。CDP中間工程からのcST6画分のプールをバッファーA(20mMのTris(pH7.6))で1:10に希釈し、Mono Q HR 10/10カラムに充填した。cST6を線形NaCl勾配(0−0.6M、5CV)により溶出した。
第1のカラム:陰イオン交換クロマトグラフィー(Q−Sepharose FF)
Q−Sepharose Fast Flow樹脂による陰イオン交換クロマトグラフィーを第1のクロマトグラフィー工程として使用し、回収物中でST6GalNAcIを捕捉し、容量を低減した。フェドバッチ培養バイオリアクターからの300mLの清澄化した滅菌ろ過済みの上清を精製した。
このアフィニティークロマトグラフィープロセス工程はcST6純度を増大するのに重要な中間工程である。捕捉クロマトグラフィー工程の溶出液(29mL)を希釈し、Blue Sepharoseクロマトグラフィー工程により精製した。
ProSep−PB媒体は孔径を制御したガラスビーズに固定化された合成m−アミノフェニルリガンドで構成されている。
実施例1
実施例1に従って精製したST6GalNAcIの純度を、3つのバッチにおいてクマシー染色したSDS−PAGE(図3を参照されたい)、RP−HPLC、ELISA及び閾値アッセイにより測定した。ST6GalNAcIの比活性をRP−HPLCにより測定した。
実施例2による精製したcST6画分をプールし、クマシー染色したSDS−PAGEにより純度を分析した(図4を参照されたい)。3つの異なるクローンC1、C2及びC3から得られたcST6サンプルプールを、希釈せずに充填し、1:5に希釈して充填し、1:10に希釈して充填した。
実施例3に従って精製したST6GalNAcIの純度を、3つのバッチにおいてクマシー染色したSDS−PAGE、RP−HPLC、ELISA及び閾値アッセイにより測定した。ST6GalNAcIの比活性をRP−HPLCにより測定した。
配列番号6:介在配列を持つ切断型ニワトリST6GalNacI
配列番号7:発現カセットEcST6
Claims (11)
- シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを作製する方法であって、前記シアリルトランスフェラーゼがST6GalNAcIであり、
a)CHO細胞においてシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを発現させ、発現されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを含有する細胞培養培地を回収する工程と、
b)前記細胞培養培地を、(i)少なくとも1回のアフィニティークロマトグラフィー及び/又は混合モードクロマトグラフィー工程と、(ii)少なくとも1回の陰イオン交換クロマトグラフィー及び/又は陽イオン交換クロマトグラフィー工程とに供することにより、前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを該細胞培養培地から精製する工程と、
を含む、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを作製する方法。 - 前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドがシアリルトランスフェラーゼ活性ドメインのみを含む、請求項1に記載の方法。
- 工程a)を、所定の細胞密度に達した後、37℃±1℃から32℃±1℃へのインキュベーション温度変化を適用することにより行う、請求項1または2に記載の方法。
- 工程b)が、(i)2回のアフィニティークロマトグラフィー工程、又は1回のアフィニティークロマトグラフィー工程及び1回の混合モードクロマトグラフィー工程と、(ii)1回の陰イオン交換クロマトグラフィー工程と、(iii)1回の陽イオン交換クロマトグラフィー工程とを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 工程b)を以下の順番で行う、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法:
i.陰イオン交換クロマトグラフィー;
ii.第1のアフィニティークロマトグラフィー;
iii.第2のアフィニティークロマトグラフィー又は混合モードクロマトグラフィー;
iv.陽イオン交換クロマトグラフィー。 - 前記陰イオン交換クロマトグラフィーを、官能基として第四級アンモニウムを保有する樹脂を用いて行う、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のアフィニティークロマトグラフィーを、色素アフィニティークロマトグラフィーを用いて行う、請求項5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合モードクロマトグラフィーを、ヒドロキシアパタイト樹脂を用いて行う、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陽イオン交換クロマトグラフィーをスルホプロピル陽イオン交換材料を含有する樹脂によって行う、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 治療用ポリペプチドのグリコシル化又は糖ペグ化のための、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法により作製されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの使用方法。
- 前記治療用ポリペプチドがヒトG−CSFである、請求項10に記載の使用方法。
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