JP5976288B2 - 抗cs1抗体の治療的使用 - Google Patents
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Description
徴である。自己免疫疾患は、自己抗原を自己として認識するための免疫系の不全である。自己免疫疾患では、免疫が誤って細胞、組織、および器官を標的として自己を攻撃し、最終的に生理系が破壊する。自己免疫および自己免疫疾患は、元来は多因子性であり、遺伝性素因、宿主因子(例えば、免疫調節の脆弱性、抑制性T細胞の欠失、または調節に対するB細胞のポリクローナル刺激)、環境因子、および抗原駆動機構が自己免疫の産生および自己抗原に対する自己抗体の産生に関与する。
炎は、重篤な短期および長期合併症を伴う。最も重篤な短期合併症は、激症潰瘍、中毒性巨大結腸、および穿孔である。重症性長期合併症には、骨粗鬆症および結腸直腸癌が含まれる。
潜在的な標的および診断マーカーの同定のための病状における新規のタンパク質および化合物の役割の解明は、自己免疫疾患患者および癌患者(IBD、SLE、RA、および骨髄腫を罹患した患者が含まれる)の現在の治療の改良に有益である。したがって、これらの疾患(特に、CS1)の治療および診断のための分子標的を本明細書中に提供する。さらに、CS1に結合して中和するアンタゴニスト(抗CS1抗体などの中和抗体が含まれる)を本明細書中に提供する。
血を引き起こし得る)または血小板枯渇(血液凝固障害)などの副作用を有し得る。したがって、通常、抗体が複数の細胞および組織と結合する場合、特に、血小板と結合する場合には、治療薬として抗体を使用することは実現不可能である。本発明は、血小板、赤血球、HuVEC、腎臓細胞、気管支細胞、末梢気道細胞、前立腺細胞、肝細胞、または乳房細胞で有意なCS1タンパク質発現は検出されないという本発明者らの発見に一部基づく。したがって、本発明により、自己免疫疾患および形質細胞性癌(骨髄腫および形質細胞性白血病が含まれる)の治療のための治療薬としての抗CS1抗体の使用実現可能性が証明された。
表1は、CS1モノクローナル抗体のパネルの特異的結合活性を示す結果を提供する。
上記概説の目的にしたがって、本発明は、種々の障害(例えば、自己免疫障害および種々の定義した癌性病態(種々の形態の骨髄腫が含まれる))の新規の治療方法を提供する。このような障害の診断および予後評価方法ならびにこのような病態を調整する組成物のスクリーニング方法も提供する。本発明はまた、前記障害で選択的に発現するマーカーのモニタリングおよびスクリーニングを含む、このような治療の治療有効性をモニタリングする方法を提供する。
用語「CS1タンパク質」または「CS1ポリヌクレオチド」または「CS1関連転写物」は、(1)CS1遺伝子(表2)のヌクレオチド配列もしくはこれと会合する(CS1遺伝子(表2)のヌクレオチド配列またはこれと会合するヌクレオチド配列およびその保存改変変異型によってコードされるアミノ酸配列を含む免疫原に対して惹起された結合パートナー(例えば、ポリクローナル抗体)へのCS1遺伝子(表2)の結合)ヌクレオチド配列に対して、約60%を超えるヌクレオチド配列が同一、65%、70%、75%、80%、85%、90%、好ましくは約92%、94%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上のヌクレオチド配列が同一のヌクレオチド配列と好ましくは少なくとも約25、50、100、200、500、1000、またはそれ以上のヌクレオチド領域を有するか、(3)ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でCS1(表2)およびその保存的改変変異型の核酸配列またはその相補物と特異的にハイブリッド形成するか、(4)CS1遺伝子(表2)のヌクレオチド配列もしくはこれと会合するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、約60%を超えるアミノ酸配列が同一、65%、70%、75%、80%、85%、90%、好ましくは91%、93%、95%、97%、98%、99%、またはそれ以上のアミノ酸配列と好ましくは少なくとも約25、50、100、200、500、1000、またはそれ以上のアミノ酸領域が同一のアミノ酸配列を有する核酸ならびにポリペプチドの多型変異型、対立遺伝子、変異体、および種間ホモログをいう。ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、典型的には、哺乳動物(霊長類(例えば、ヒト)、げっ歯類(例えば、ラット、マウス、ハムスター)、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、または他の哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない)に由来する。「CS1ポリペプチド」および「CS1ポリヌクレオチド」には、天然形態または組換え形態の両方が含まれる。
またはスプライシング(選択的スプライシングが含まれる)の種々の段階の前後であり得る。
ことを意味する。ほとんどの場合、動物からの細胞サンプルの取出しによってこれを行う
が、以前に単離した細胞の使用(例えば、別のヒト、別の時間、および/または別の目的
のために単離)または本発明のインビボでの実施によって行うことができる。治療または
結果の経緯を有する記録用の組織または材料は特に有用である。
444−2448の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WIのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、またはマニュ
アルアラインメントおよび目視(例えば、Ausubelら(eds.1995 and
supplements)Current Protocols in Molecular Biology Wileyを参照のこと)によって行うことができる。
5、10、20、30、40、40、70、90、110、150、170など)であり得る。
一である。2つの核酸配列が実質的に同一である別の目安は、2つの分子またはその相補物がストリンジェントな条件下で互いにハイブリッド形成することである。2つの核酸配列が実質的に同一であるさらに別の目安は、同一のプライマーを使用して配列を増幅することができることである。
は修飾ペプチド骨格を有し得るが、天然に存在するアミノ酸のいくつかの基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、あるアミノ酸の一般的な化学構造と異なるが、別のアミノ酸と同様に機能する構造を有する化合物をいう。
1つまたは複数の炭素環式糖を含む核酸も核酸の1つの定義に含まれる(Jenkinsら(1995)Chem.Soc.Rev.pp 169−176を参照のこと)。いくつかの核酸アナログは、Rawls(page35,June 2,1997)C & E Newsに記載されている。
。
ターは、プロモーターに操作可能に連結された転写されるべき核酸を含む。
よってコードされる。
体(例えば、Lanzavecchiaら,Eur.J.Immunol.17,105(1987))および一本鎖(例えば、Hustonら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85,5879−5883(1988)およびBirdら,Science,242,423−426(1988)(本明細書中で参考として援用される))が含まれる)で存在し得る(一般に、Hoodら,”Immunology”,Benjamin,N.Y.,2nd ed.(1984),and Hunkapiller and Hood,Nature,323,15−16(1986)(本明細書中で参考として援用される)を参照のこと)。
数の天然のヒト免疫グロブリン配列の対応部分と実質的に同一である。例えば、Queenら,米国特許第5,5301,101号;同第5,585,089号;同第5,693,762号;および同第6,180,370号(これらおよび他の米国特許/特許出願全体が、本明細書中で参考として援用される)を参照のこと。
配列番号2は、全長野生型ヒトCS1のアミノ酸配列を示す。「機能的に活性な」CS1フラグメントまたは誘導体は、抗原活性、免疫原性活性、天然の細胞基質に結合する能力などの全長野生型CS1タンパク質に関連する1つまたは複数の機能活性を示す。CS1タンパク質、誘導体、およびフラグメントの機能活性を、当業者に公知の種々の方法によってアッセイすることができる(Current Protocols in Protein Science,Coliganら,eds.,John Wiley & Sons,Inc.,Somerset,New Jersey(1998))。本明細書中の目的のために、機能的に活性なフラグメントには、結合ドメインなどのCS1ポリペプチドの1つまたは複数の構造ドメインを含むフラグメントが含まれる。PFAMプログラムを使用して、タンパク質ドメインを同定することができる(Bateman A.ら,Nucleic Acids Res.27:260−2(1999))。
識コントロール抗体との細胞/抗体混合物をインキュベートする。試験アッセイでは、試験抗体の存在下での標識抗体の反応性の有意な減少は、実質的に同一のエピトープを認識する試験抗体の指標である。
上記のように、実質的な核酸および/またはアミノ酸配列の相同性または表2のCS1配列への結合によってCS1配列を最初に同定する。このような相同性は、全核酸またはアミノ酸配列に基づくことができ、一般に、相同性プログラムまたはハイブリッド形成条件のいずれかを使用して決定する。典型的には、mRNA上の結合配列は、同一分子上に見出される。
1つの実施形態では、例えば、CS1タンパク質をコードするCS1核酸を使用して、CS1タンパク質を発現させ、その後下記の診断アッセイ用の試薬の開発に使用することができる種々の発現ベクターを作製する。タンパク質を発現するための発現ベクターおよび組換えDNA技術は周知である(例えば、Ausubel,前出およびFernandez and Hoeffler(eds.1999)Gene Expression Systems Academic Pressを参照のこと)。発現ベクターは、自律複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。一般に、これらの発現ベクターには、CS1タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された転写および翻訳調節核酸が含まれる。用語「調節配列」は、特定の宿主生物中での作動可能に連結されたコード配列の発現に使用されるDNA配列をいう。原核生物に適切な調節配列には、例えば、プロモーター、任意選択的にはオペレーター配列、およびリボゾーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを使用することが公知である。
本明細書中で決定したところ、天然に存在する配列のアミノ酸変異型もCS1タンパク質の1つの実施形態に含まれる。好ましくは、変異型は、好ましくは野生型配列の約75%を超えて相同であり、より好ましくは約80%超、さらにより好ましくは約85%超、最も好ましくは90%超が相同である。いくつかの実施形態では、相同性は約93〜95%または98%もの高さである。核酸に関しては、この文脈における相同性は、配列類似性または同一性を意味し、同一性が好ましい。核酸相同性について上記で概説のように、標準手異な技術を使用してこの相同性を決定する。
(CS1抗体)
本発明のCS1抗体は、CS1タンパク質に特異的に結合する。本明細書中の「特異的に結合する」は、抗体が、タンパク質に少なくとも0.1mM、より通常には少なくとも約1μM、好ましくは少なくとも約0.1μMまたはそれ以下、最も好ましくは0.01μMまたはそれ以下のKdで結合することを意味する。特異的標的に結合するが関連配列に結合しない選択性もたいてい重要である。
1つの態様では、自己免疫障害または癌(例えば、骨髄腫)の表現型における異なる細胞状態についての遺伝子のRNA発現レベルを決定する。発現プロフィールを得るために、正常組織(例えば、障害を罹患していない)および罹患組織の遺伝子の発現レベル(および、いくつかの場合、以下に概説のように、予後に関する障害の重症度の変化について)を評価する。特定の細胞状態または発生時点の遺伝子発現プロフィールは、本質的に、細胞の状態の「フィンガープリント」である。2つの状態は、同様に発現した特定の遺伝子を有し得るが、多数の遺伝子の評価により、細胞状態を反映する遺伝子発現プロフィールを同時に作製可能である。異なる状態の細胞の発現プロフィールの比較により、これらの各状態での遺伝子の重要な情報(遺伝子の上方および下方制御が含まれる)が得られる。次いで、組織サンプルが正常組織または罹患組織の遺伝子発現プロフィールを有するかどうかを診断または確認することができる。これにより、関連病態の分子診断が得られる。
(炎症性腸疾患)
炎症性腸疾患の病理学的プロセスの調査のためのインビボ実験モデルは開発されている。Sartor RB,Aliment.Pharmacol.Ther.11:89−96(1997)。例えば、炎症性腸疾患遺伝子が破壊されているか、炎症性腸疾患遺伝子が挿入されているノックアウトトランスジェニックマウスを作製することができる。相同組換えによるマーカー遺伝子または他の異種遺伝子のマウスゲノム中の内因性炎症性腸疾患遺伝子部位への挿入によってノックアウトトランスジェニックマウスを作製することができる。このようなマウスを、内因性炎症性腸疾患遺伝子の炎症性腸疾患遺伝子の変異体との置換または内因性炎症性腸疾患遺伝子の変異(例えば、発癌物質への曝露)によって作製することもできる。
骨髄腫の病理学的プロセスの調査のためのインビボ実験モデルは開発されている。Sartor RB,Aliment.Pharmacol.Ther.11:89−96(1997)。例えば、骨髄腫遺伝子が破壊されているか、骨髄腫遺伝子が挿入されているノックアウトトランスジェニックマウスを作製することができる。相同組換えによるマーカー遺伝子または他の異種遺伝子のマウスゲノム中の内因性骨髄腫遺伝子部位への挿入によってノックアウトトランスジェニックマウスを作製することができる。このようなマウスを、内因性骨髄腫遺伝子の骨髄腫遺伝子の変異体との置換または内因性骨髄腫遺伝子の変異(例えば、発癌物質への曝露)によって作製することもできる。
(自己免疫疾患の治療)
1つの態様では、本発明は、白血球を本明細書中に記載のCS1のアンタゴニストに接触させる工程を含む、白血球の増殖、付着、分化、活性化、および/または同時活性化を減少させる方法に関する。
骨髄腫細胞を骨髄腫タンパク質のアンタゴニスト、好ましくは抗体または他のアンタゴニスト(本明細書中に記載のCS1抗体など)と接触させる工程を含む、骨髄腫細胞の増殖減少させるための治療方法も含まれる。例えば、抗体を、インビトロ(骨髄腫細胞を培養する細胞培養環境へのアンタゴニストの添加など)、エキソビボ、またはインビボ(例えば、被験体へのアンタゴニストの投与)で骨髄腫細胞と接触させることができる。別の態様では、本発明は、有効量の骨髄腫タンパク質アンタゴニストを被験体に投与する工程を含む、骨髄腫細胞の増殖を減少させる方法を提供する。
アンタゴニスト(例えば、本発明の抗体)の種々の投与方法が存在する。非経口投与が好ましい。抗体を、ボーラスとして患者に静脈内に投与するか、長期間の連続注入によるか、筋肉内、皮下、腹腔内、または脳脊髄内に投与することができる。経口経路、局所経路、吸入経路、または当業者に公知の他の送達手段も本発明に含まれる。
上記で示唆した診断および研究で使用するために、本発明はキットも提供する。診断および研究への適用では、このようなキットには、少なくとも1つの以下を含む:アッセイ試薬、緩衝液、CS1特異的核酸もしくは抗体、ハイブリッド形成プローブおよび/またはプライマー、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ドミナントネガティブなCS1ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、CS1関連配列の分子インヒビターなど。
正常な健常成体の末梢血由来のB細胞サブセット(ナイーブ対記憶細胞+血漿B細胞(plasma B cells))のcDNAサブトラクションライブラリーからCS1を同定した。CS1は、記憶細胞および血漿B細胞の間で優先的に発現する。下記のプロトコールによってサブトラクションライブラリーを作製した。
末梢血単核細胞(PBMC)を、標準的なFicll−hypaque勾配を使用して9人の健常な成人ドナーから単離した。下記の標準的な陰性選択プロトコールによりPBMCからB細胞を単離した。精製マウス抗ヒトCD2、CD3、CD4、CD14、CD16、CD56、CD66、およびグリコホリンAの抗体カクテル中でPBMCをインキュベートした。インキュベーションおよび洗浄後、ヤギ抗マウス磁性Dynalビーズを、7〜10ビーズ/細胞で添加した。その後、上清中の富化B細胞を遊離するために標準的なDynal磁性ホルダーを使用して抗体結合細胞を単離した。次いで、回収した上清を、RPMI+10%ウシ胎児血清(FBS)で洗浄した。
Dynal富化B細胞を、IgD−FITC、CD38−cychrome、CD19−APC、およびCD27−PEで染色し、その後標準的な染色プロトコールで染色した。ナイーブB細胞(IgD+CD19+CD38int/−CD27−)対記憶細胞および血漿B細胞(IgD−CD19+CD38int/+CD27+)の2つの個別の集団を、spectra physics社製の空冷アルゴンレーザ(488nm)および635nmのダイオードレーザならびにFITC(530/40nm)、PE(580/30nm)、APC(670/20nm)、およびサイクローム(PE−Cy5)(670/30nm)検出用のフィルターを備えたMoFlo High Performance Flow cytometer−MLSで分取した。分取したB細胞を、純度についてMoFlo cytometerで分析し、97%(記憶細胞および血漿B細胞)および98%(ナイーブB細胞)の純度であることが見出された。分取した細胞を、Trizol中に入れ、−70℃で保存した。
cDNAサブトラクションライブラリーを、標準的なRDA法(representational difference analysis)であるサブトラクションハイブリッド形成プロトコールの使用によって分取B細胞サブセットから作製した。サブトラクションライブラリーは、ナイーブcDNAを2回差し引く場合は記憶細胞+血漿B細胞cDNAライブラリーを含み、記憶+血漿cDNAを2回差し引く場合はナイーブB細胞cDNAライブラリーを含む。標準的な分子生物学技術を使用して、cDNAサブトラクションライブラリーを標準的なプラスミドベクターにライゲーションし、エレクトロコンピテントE.コリ(DH−10B)細胞に形質転換する。形質転換E.コリ細胞を、分泌抗体の存在下でLB寒天プレートにプレートした。1つの細菌コロニー(それぞれ1つの特異的インサートを示す)を、標準的なコロニーPCRを使用して増幅した。
cDNAサブトラクションライブラリーインサートを変性し、2つの同一のナイロンフィルターにブロッティングし、2つの異なる標識された変性プローブ−(記憶+血漿)−(ナイーブcDNA)(2回差し引く)およびナイーブ−(記憶+血漿)cDNA(2回差し引く)と個別にハイブリッド形成した。インサートが2つのプローブのうちの1つに選択的にハイブリッド形成する場合、サブトラクションライブラリーcDNAインサートを陽性と見なした。CS1のcDNAクローンは、(記憶+血漿)−ナイーブcDNAプローブ(2回差し引く)と選択的にハイブリッド形成した。
陽性クローンで形質転換した細菌細胞を成長させ、製造者のプロトコール(Qiagen,Valencia,Calfornia)にしたがって、Qiagen(登録商標)Mini−Prepキット(インビトロ診断調製物)を使用してDNAを単離した。精製プラスミドを配列決定し、DNA配列の同一性を、NCBIデータベース検索によって決定した。
ドットブロット分析によって選択した陽性クローン(CS1が含まれる)の優先的発現を確認した。ナイロンフィルターにスポットして分取したナイーブ対記憶細胞+血漿B細胞から単離した等量の(非サブトラクション)cDNA(20ng)を、陽性クローンのために標識cDNAインサートとハイブリッド形成した。これらのアッセイでは、2つの個別のソート(n=9(健常成体)およびn=10健常成体、それぞれ純度は97%超および98%超)から得た末梢血B細胞サブセットからcDNAを合成した。フィルターを洗浄し、ハイブリッド形成プローブ由来のシグナルをオートラジオグラフィによって検出した。cDNAが分取したナイーブ対記憶細胞+血漿B細胞の両セットを超えて記憶細胞+血漿B細胞cDNAに選択的にハイブリッド形成する場合、クローンを陽性と見なす。図1Aに示すように、データは、血漿および記憶B細胞中でCS1が選択的に発現することを示した。
ドットブロットを、Clontech(Palo Alto,California)から購入し、以下の組織:脾臓、リンパ節、骨髄、小腸、脳、肺、骨格筋、心臓、腎臓、および肝臓から作製したpolyA+RNAから合成したcDNAから調製した。製造者の説明書(Boehringer−Mannheim DIGキット)にしたがって、ドットブロットをジゴキシゲニン(DIG)標識CS1 DNAを使用して探索し、化学発光(アルカリホスファターゼ標識抗DIG抗体およびCDP−Star)によって視覚化した。図1Bに示すように、結果は、CS1は主にリンパ組織(脾臓、リンパ節、骨髄、および小腸−おそらくパイエル板中の残存リンパ球による)で発現し、他の非リンパ器官(脳、肺、骨格筋、心臓、腎臓、および肝臓)では存在しないか発現が低いことを示す。
(ヒト細胞:)
末梢血単核細胞(PBMC)を、標準的なFicoll−hypaque勾配からの単離によって得た。次いで、単離PBMCを、新鮮な培養培地に2×106細胞/mlで再懸濁した。PBMCを、3μg/mlの濃度で3日間フィトヘムアグルチニン(PHA)または10μg/mlの濃度で8日間ヤマゴボウマイトジェン(PWM)で刺激した。非
刺激コントロールPBMCを、いかなる刺激も与えずに調製した。細胞を、10%FBS、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびグルコース添加剤を含むRPMI培地中、37℃の7%CO2中で培養した。
2匹のBalb/cマウスから脾臓を得た。脾臓を、100ミクロンのフィルターに入れた。細胞をばらばらにし、PBSで洗浄し、1,500rpmで10分間遠心分離した。赤血球を、2mlの溶解緩衝液にて37℃で2分間溶解した。細胞を2回洗浄し、10mlの培地に再懸濁し、計数した。非刺激細胞の一部を直接凍結した。残りの細胞を、5μg/mlの濃度のconAで3日間または1μg/mlの濃度のLPSで3日間刺激した。細胞を、10%FBS、抗生物質、およびグルコース添加剤を含むDMEM培地中で培養した。
FITC標識抗ヒトCD19抗体での細胞の染色によって、狼瘡患者および健常な個体の末梢血単核細胞からB細胞を分取した。実施例1に記載のように、MoFLo High Performance Flow Cytometer−MLSで細胞を分取した。RNA分析のために、細胞を滅菌培地に回収した。
細胞を1回洗浄し、Trizol(登録商標)(Life Technologies,Gaithersburg,Maryland)に入れ、製造者のプロトコールにしたがって総RNAを単離した。総RNAを、RNアーゼ無含有DNアーゼ(GenHunter,Nashville,Tennessee)で処理した。DNアーゼ消化RNAを、フェノール/クロロホルムで抽出し、エタノールで一晩沈殿させた。RNAを、75%エタノールで洗浄し、無ヌクレアーゼ水に溶解した。単離RNAを定量し、その完全性をアガロースゲルで分析した。
標準的なTaqman逆転写試薬(Applied Biosystems,Foster City,California)の使用によって、100μlの反応混合物中の狼瘡患者対健常な個体の分取Bリンパ球から総RNA(2μg)を逆転写した。Applied BiosystemsのSYBRグリーンPCRマスターミックスを使用して、PCR反応を準備した。狼瘡患者および健常個体のcDNA中でのCS1の発現レベルを試験するために、CS1プライマーをミックス中に組み込んだ。公開された配列(Genbankアクセッション番号XM−001635、AF390894)からCS1プライマーをデザインした。正規化のコントロールとしてβ−アクチンおよび18SrRNAプライマーを使用した。Applied Biosystemsから購入したPrimer Expressソフトウェアを使用して、プライマーをデザインした。PCR増幅産物は、CS1プライマーについては85bpであり、β−アクチンプライマーについては84bpであり、18SrRNAプライマーについては61bpであった。推奨プロトコールを使用して、Applied BiosystemsのgeneAmp5700SDSでリアルタイムPCRを行った。
標準的なTaqman逆転写試薬(Applied Biosystems)を使用して、100μlの反応混合物中でconA、LPS、および非刺激サンプルから総RNA(2μg)を逆転写した。Applied BiosystemsのSYBRグリーンPCRマスターミックスを使用して、PCR反応を準備した。公開された配列(Genbankアクセッション番号AF467909)から新規のマウスLy9に特異的なプライマーをデザインし、刺激対非刺激cDNAサンプル中の発現レベルを試験するために、混合物に組み込んだ。正規化のために18SrRNAプライマーを使用した。Applied Biosystemsから購入したPrimer Expressソフトウェアを使用して、プライマーをデザインした。PCR増幅産物は、マウスLy9プライマーについては65bpであり、18SrRNAプライマーについては61bpであった。推奨プロトコールを使用して、Applied BiosystemsのGeneAmp5700配列検出システムでリアルタイムPCRを行った。
遺伝子チップを使用して、活性化および非活性化白血球集団の発現プロフィールを決定および分析した。Custom Affymetrix GeneChip(登録商標)オリゴヌクレオチドマイクロアレイにより、約35,000個の固有のmRNA転写物を調査可能である。
Oligotex懸濁液を37℃に加熱し、RNA添加の直前に混合した。溶離緩衝液を70℃でインキュベートした。緩衝液中に沈殿が存在する場合、2×結合緩衝液を65℃に加熱することに留意のこと。Oligotex Handbookの16ページの表2にしたがって、総RNAを、DEPC処理水、2×結合緩衝液、およびOligotexと混合した。混合物を65℃で3分間インキュベートし、その後室温で10分間インキュベートした。
cDNA合成を進行させる前に、mRNAを沈殿させた。いくつかの残存成分またはOligotex精製手順由来の溶離緩衝液は、mRNAの下流の酵素反応を阻害する。
わずか100μgのRNAをRNeasyカラムに添加すればよい。無RNアーゼ水でサンプル体積を100μlに調整し、350μlの緩衝液RLTおよびその後250μlエタノール(100%)をサンプルに添加した。ピペッティング(遠心分離しないこと)によって溶液を混合し、その後サンプルをRNeasyミニスピンカラムに適用した。ミニスピンカラムを、10,000rpm超で15秒間遠心分離した。収率が心配な場合、カラムへの流入を繰り返して再度遠心分離することができる。
・第1のcDNA鎖の合成
出発物質として5μgの総RNAまたは1μgのpolyA+mRNAを使用した。総RNAのために、2μlのSUPERSCRIPT(登録商標)RT(cDNA合成のために逆転写酵素を使用するキット)を使用した(polyA+mRNAのために1μlのSUPERSCRIPT(登録商標)RTを使用する)。第1の鎖合成混合物の最終体積は、20μlにすべきである。RNAの体積は、10μlを超えてはならない。RNAを、1μlの100pmolT7−T24オリゴと70℃で10分間インキュベートした。氷上で、7μlの(4μlの5×第1の鎖の緩衝液、2μlの0.1M DTT、および1μlの10mM dNTP)混合物を添加した。混合物を37℃で2分間インキュベートし、SUPERSCRIPT(登録商標)RTを添加した。
第1の鎖の反応物を氷上においた。
混合物に以下を添加した。
91μl DEPC H20
30μl5×第2の鎖の緩衝液
3μl lOmM dNTP混合物
1μl10U/μlE.コリ DNAリガーゼ
4μl10U/μlE.コリ DNAポリメラーゼ
1μl2U/μlRNアーゼH
2つを超えるサンプルが存在する場合、上記を混合物にすべきである。添加した混合物を、16℃で2時間インキュベートした。
ゲルチューブ中でのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)精製を使用して、cDNAを浄化した。
1.5μlのcDNAを、薄壁PCRチューブにピペッティングした。NTP標識混合物を室温でPCRチューブに添加した。
NTP標識混合物:
2μl T7 1O×ATP(75mM)(Ambion)
2μl T7 10×GTP(75mM)(Ambion)
1.5μl T7 lO×CTP(75mM)(Ambion)
1.5μl T7 lO×UTP(75mM)(Ambion)
3.75μl 10 mM Bio−11−CTP
0.75μl 10 mM Bio−16−UTP
2μl lO×T7転写緩衝液(Ambion)
2μl 10×T7酵素混合物(Ambion)
全反応の最終体積は20μlであった。チューブをPCR機器中、37℃で6時間インキュベートした。
手順については上記を参照のこと。
以下の技術を使用して、約15μgの標識RNAを断片化した。ハイブリッド形成緩衝液のマグネシウムが沈殿する問題のために、断片化反応体積を約10μlの体積に最小化するが、20μlを超えないようにした。
化した。
5×断片化緩衝液:
200mM Tris−酢酸(pH8.1)
500mM KOAc
150mM MgOAc
断片化の前後に標識RNA転写物を分析した。サンプルを65℃で15分間加熱し、転写物のサイズ範囲をほぼ把握するために1%アガロース/TBEゲルで電気泳動を行った。
全実験で使用したEOS HuO3マイクロチップアレイは、ヒトゲノムの第1のドラフトに基づいた既知のエクソンおよびFGENESH推定エクソンを含む46,000個の固有の配列を示す59,680個のプローブセットを含むカスタマイズしたAffymetric GENECHIP(登録商標)オリゴヌクレオチドアレイである。Hu03プローブセットは、完全適合プローブのみからなり、ほとんどのプローブセットは6〜7個のプローブを有する。
200μl(10μgのcRNA)のハイブリッド形成混合物を、チップ上にピペッティングした。複数のハイブリッド形成を行う場合(5チップセットによるサイクリングなど)、300μlまたはそれ以上の最初のハイブリッド形成混合物を作製することを勧める。
ハイブリッド形成混合物:断片化標識RNA(最終濃度50ng/μl)
50pM 948−bコントロールオリゴ
1.5pM BioB
5pM BioC
25pM BioD
100pM CRE
0.lmg/ml ニシン精子DNA
0.5mg/ml アセチル化BSA
上記をl×MESハイブリッド形成緩衝液で300μlにする
フィコエリトリン抱合ストレプトアビジンを使用して、ハイブリッド形成シグナルを視覚化した。
所望のγ分布に実験による強度の累積分布をマッピングするための逆γ関数を使用して、固定γ分布に対する各アレイ由来のプローブレベル強度の適合によって、遺伝子発現データを正規化した。この手順は、1つまたは複数のパラメータよりもむしろ強度の全分布を固定するという点でストリンジェントであること以外は、標準値への各チップの平均およびSDの固定などの他のチップあたりの正規化手順に類似する。チップあたりの正規化の目的は、非生物因子(すなわち、技術上のノイズ)に起因するという想定の下にチップ間の変動を除去することである。任意の平均値300を含む分布が得られるように分布についてのスケールパラメータを選択し、良好なサンプル中で認められる経験分布の典型的な形状を再現するために0.81の形状パラメータを選択した。
ハイブリッド形成反応:
非ビオチン化IVT(RNeasyカラムで精製)から開始する(組織からIVTへのステップについては実施例1を参照のこと)
IVTアンチセンスRNA;4μg: μl
ランダム六量体(1μg/μl): 4μl
H20: μl
全体積: 14μl
−70℃で10分間インキュベートする。氷上に置く。
5×第1の鎖の緩衝液(BRL): 6μl
0.1M DTT: 3μl
50×dNTP混合物: 0.6μl
H20: 2.4μl
Cy3またはCy5 dUTP(1mM): 3μl
SS RT II(BRL): 1μl
全体積: 16μl
−ハイブリッド形成反応物に添加する。
−42℃で30分間インキュベートする。
−1μlSSIIを添加し、さらに1時間静置する。
氷上に置く。
−50×dNTP混合物(25mMの冷dATP、dCTP、およびdGTP、lOmMのdTTP:25μlの各100mM dATP、dCTP、およびdGTP;10μlの100mM dTTP、H20で15μlにする)
RNA分解:
−1.5μl1M NaOH/2mM EDTAを添加し、65℃で10分間インキュベートする。
H20 86μl
10N NaOH 10μl
50mM EDTA 4μl
U−Con30
500μlのTE/サンプルを7000gで10分間スピンし、精製のためにフロースルーを保存する。
−u−con回収物質を500μlの緩衝液PBに懸濁する。
−w/ノーマルQiagenプロトコールを進める。
−1μlの100倍希釈のDNアーゼ/30μl Rxを添加し、37℃で15分間インキュベートする。
−95℃で5分間酵素を変性させる。
−以下を添加する:
Cot−1 DNA: 10μl
50×dNTPs: 1μl
20×SSC: 2.3μl
ピロリン酸ナトリウム: 7.5μl
10mg/mlニシン精子DNA(1μlの10倍希釈物)
最終体積: 21.8μl
−高速吸引で乾燥させる。
−15μlH2Oに再懸濁する。
−0.38μlの10%SDSを添加する。
−95℃で2分間加熱する。
−室温で20分間ゆっくり冷却する。
スライドに置き、64℃で一晩ハイブリッド形成させる。
3×SSC/0.03%SDS:37.5mlの20×SSC+0.75mlの10%SDSを含む250mlのH20で2分間。
1×SSC:12.5mlの20×SSCを含む250mlのH20で5分間。
0.2×SSC:2.5mlの20×SSCを含む250mlのH20で5分間。
スライドを、1000RPMで1分間の遠心分離で乾燥させる。
CS1は白血球中で過剰発現するが、種々の非リンパ組織型では過剰発現しない
CS1の発現プロフィールを評価するために、白血球および他の組織から単離したmRNAを、リアルタイムPCRによって分析した。図2Aに示すように、mRNA発現レベルは、ほとんどの他の正常な成体組織よりも白血球が遥かに高い。ベースラインを超えるCS1発現を示さない他の正常生体組織には、脂肪、副腎、大動脈、大動脈弁、虫垂、冠状動脈、膀胱、骨、骨髄、乳房、気管支、子宮頸部、脳、脊髄、横隔膜、子宮内膜、精巣上体、食道、胆嚢、神経節、心臓、喉頭、唇、肝臓、肺、筋肉、子宮筋層、迷走神経、網、口腔粘膜、卵巣、膵臓、副甲状腺、咽頭粘膜、胎盤、前立腺、網膜、唾液線、皮膚、胃、滑膜、精巣、胸腺、甲状腺、舌、気管、臍帯、尿管、子宮、膣、または静脈が含まれていた。CS1 mRNAは、結腸(2/11)、腎臓(1/20)、小腸(1/3)、脾臓、および扁桃腺(2/4)の選択されたサンプル中で発現した。結果は、CS1は白血球で主に発現し、自己免疫疾患の良好な標的であることを示した。
CS1発現は複数の活性化白血球集団で増加する
CS1発現と白血球の活性化との間の相関を評価するために、複数の活性化および非活性化白血球集団におけるCS1mRNA発現を分析した。図2Bに示すように、対応する非活性化コントロール集団と比較して、活性化B細胞、成熟DC細胞、活性化CD3細胞(低レベルから中程度の増加)、活性化CD4細胞(低レベルの増加)、および活性化CD8細胞(低レベルから中程度の増加、ドナーによる)でCS1発現が増加した。これらの結果は、CS1の過剰発現はいくつかの白血球サブセットの活性化と相関することを示した。
クローニング:)
CS1の細胞外ドメイン(ECD)を、CS1の細胞外ドメイン(CS1 ECD)に隣接するプライマーを使用して、Raji細胞から単離した。PCR産物をゲル精製し、IgG3の定常領域(ヒトFc−γ3)をコードするベクターにライゲーションした。CS1 ECD−Fcγ3を含むプラスミドを大量に精製し、DNA配列決定によって確認した。
50μgのCS1 ECD−Fcγ3プラスミドをFsp1酵素で線状化し、DNAをエタノール中に沈殿させ、洗浄し、500μlの滅菌PBSに再懸濁した。NSO細胞を冷PBSで2回洗浄し、1mlのPBSあたり2×107個を再懸濁した。1×107個の細胞をトランスフェクションに使用した。
CS1−ECDFcγ3融合タンパク質を発現する安定なトランスフェクタントを、グルコース添加剤を含む600mlのDMEM完全培地に5日間拡大した。融合タンパク質を、プロテインG Sepharoseカラムで精製し、1×PBSに対して透析した。CS1 ECD−Fcγ3の還元および非還元形態を、クーマシーによって分析した。CS1 ECDFcγ3を抗HuIgGを使用したウェスタンブロットによっても分析し、N末端配列決定によって確認した。精製CS1−Fc−γ3融合タンパク質を使用してマ
ウスを免役化した。
CS1の細胞外ドメイン(ECD)を、CS1の細胞外ドメインに隣接するプライマーを使用して、Raji細胞から単離した。PCR産物をゲル精製し、細胞表面発現のためのmycタグおよびグリコシルホスファチジルイノシトール結合を発現するベクター(myc−GPIベクター)にライゲーションした。CS1 ECD−myc−GPIを含むプラスミドを大量に精製し、DNA配列決定によって確認した。
50μgのCS1 ECD−myc−GPIプラスミドをFsp1酵素で線状化し、DNAをエタノール中に沈殿させ、洗浄し、500μlの滅菌PBSに再懸濁した。NSO細胞を冷PBSで2回洗浄し、1mlのPBSあたり2×108個を再懸濁した。1×108個の細胞をトランスフェクションに使用した。
(ヒトCS1の免疫原:)
精製組換えヒトCS1 ECD−γ3融合タンパク質を使用して、足蹠を介してBalb/cマウスを免役化した(CS1 ECDは、上記のCS1の細胞外ドメインをいう)。簡単に述べれば、マウスの後足蹠に全体積が25μlの同量のRibiアジュバントを含む10μgのタンパク質で免役化した。足蹠免疫化を、4〜5日間隔で4回行った。
CS1−ECD−γ3で免役化した2匹のマウスを屠殺した。マウスから大腿および仙骨のリンパ節を取出した。組織からリンパ球を単離し、標準的な手順によってハイブリドーマを作製した。簡単に述べれば、リンパ球とマウス骨髄腫細胞株(NSO細胞)との間のポリエチレングリコール(PEG)1500媒介融合によってハイブリドーマを作製した。融合細胞を、107細胞/プレートの密度で96ウェルプレートにプレートした。HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)培地を使用して、融合細胞を選択した。
ハイブリドーマによって分泌された抗体の特異性を、フローサイトメトリー(FACS)ベースのCS1発現細胞への結合アッセイによって決定した。標準的なプロトコールを使用して、FACSアッセイを行った。表面CS1細胞外ドメインを発現するNSO安定トランスフェクタント(2×105)を、50μlのハイブリドーマ培養上清を含む50μlの氷冷PBSに氷上で1時間再懸濁した。強い洗浄後、細胞を、フィコエリトリン抱合ヤギ抗マウスIgG特異的抗体と氷上で1時間インキュベートした。細胞を再度洗浄し、細胞表面結合抗体を、Becton Dickinson FACScanを使用したFACSによって検出した。表1に示すように、抗体:Luc2、Luc3、Lucl5、Luc20、Luc22、Luc23、Luc29、Luc32、Luc34、Luc35、Luc37、Luc38、Luc39、Luc56、Luc60、Luc63、またはLuc90は、CS1でトランスフェクトしたNSO−CS1細胞に強く結合するが、NSO−FcRnには結合しなかった。抗ヒトCS1抗体は、K562およびDaudi細胞(天然のCS1を発現することが公知)に結合したが、陰性コントロールであるJurkat細胞には結合しなかった。データは、産生された抗CS1抗体がCS1と特異的に結合することができることを示す。CS1−γ3融合タンパク質対陰性コントロールであるAR−G3(γ3融合タンパク質)へのLuc抗体の結合のアッセイ(ELISAによる)由来の結果も表に示した。Luc抗体は、CS1−γ3に特異的に結合したが、陰性コントロールAR−γ3融合タンパク質には結合しなかった。
抗体重鎖および軽鎖可変領域を、標準的な技術を使用してクローン化した。簡単に述べれば、1〜5×106個の細胞由来の総RNAを使用し、SMART RACEcDNA増幅キット(BD Biosciences Clontech)を使用してcDNAを調製し、マウス重鎖および軽鎖定常領域に相補的な遺伝子特異的プライマーを使用して、可変領域をPCRで増幅した。
フローサイトメトリー競合アッセイを使用して、15の異なる抗CS1モノクローナル抗体のエピトープ特異性を決定した。表面CS1を発現するNSO安定トランスフェクタント(2×105)を、50μlの抗CS1抗体(Luc23、Luc29、Luc34、Luc35、Luc37、Luc38、Luc63、およびLuc90の対合組み合わせ(pairwise combination)が含まれる)と共に氷上で1時間インキュベートした。並行して、陰性コントロールとしてイソ型コントロール抗体(AIP−13)を使用した。1μg/mlのビオチン化抗CS1モノクローナル抗体(Luc23、Luc34、Luc37、Luc38、Luc63、およびLuc90)を、細胞/抗体混合物と共に氷上でさらに30分間インキュベートした。強い洗浄後、細胞を、フィコエリトリン抱合ストレプトアビジンと氷上で1時間インキュベートした。細胞を洗浄し、細胞表面結合ビオチン化抗体を、Becton Dickinson FACScanを使用したFACSによって検出した。
c23、およびLuc38のエピトープを、CS1二次構造内に「埋め込む」ことができるか、CS1に対する親和性がLuc34抗体の親和性よりも低い可能性がある。
CS1トランスフェクション細胞も、抗CS1抗体での免疫組織学的染色について試験した。10μg/mlの一次モノクローナル抗CS1抗体を、CS1でトランスフェクトした細胞に添加した。次いで、細胞を血清でブロッキングし、ビオチン抗マウスIgとインキュベートした。次いで、アビジン−ペルオキシダーゼを細胞と混合し、AEC(標準的なペルオキシダーゼ試薬)で発色させた。AECによる赤色が陽性染色を示す一方で、試験細胞の核をヘマトキシリン(青色)で対比染色した。データは、CS1トランスフェクション細胞が抗CS1抗体で陽性染色されることを示し、このことは、産生された抗CS1抗体が細胞表面上に発現したCS1に結合することができることを示す(図5A)。したがって、抗CS1抗体は、溶液中の末梢血細胞表面上の発現の検出だけでなく、組織切片(例えば、患者のリンパ節または組織生検)の分析で典型的に使用される免疫組織化学(IHC)による検出での使用に適切である。
産生されたLuc抗体を使用して、FACS分析によってCS1タンパク質発現をさらに試験した(図6)。標準的なFicoll Hypaque濃度勾配手順によって、健常な個体および狼瘡患者からPMBCを単離した。以下の標準的な手順に示すように、抗体でPMBCを染色した。PBMCのヤマゴボウマイトジェン(PWM)活性化のために、100倍希釈のPWMをPBMCに添加し、その後7%CO2中に37℃で8日間おいた。PWM刺激細胞を採取し、抗体染色前に洗浄した。本明細書中で使用したマウス抗CS1抗体は、Luc90(IgG2b)、Luc63、Luc38、および他の産生抗CS1 Luc抗体である。イソ型コントロール抗体は、イソ型適合マウスIgG抗体であった。
、CS1発現パターンが有意である。データにより、抗CS1抗体が適切な候補治療抗体であることが示唆される。
この実施例は、マウス抗CS1モノクローナル抗体Luc63(MuLuc63)のヒト化を記載する。本質的にQueen,C.ら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029−10033(1989))にしたがって、MuLuc63のヒト化を行った。第1に、それぞれMuLuc63VHおよびVLアミノ酸配列と相同性の高いヒトVHおよびVLセグメントを同定した。次に、CDRの構造維持に重要なフレームワークアミノ酸を含むCDR配列を、選択したヒトフレームワーク配列にグラフティングした。得られたヒト化モノクローナル抗体(HuLuc63)は、マウス骨髄腫細胞株NSOで発現した。ヒト化HuLuc63抗体は、ELISAアッセイにおいて70.1ng/mlのEC50値で組換えヒトCS1に結合し、これは同一アッセイにおけるMuLuc63について測定した66.1ng/mlと類似し、HuLuc63がヒトCS1に対する結合親和性が保持されていることを示す。
TRIzol試薬(Life Technologies,Inc.,Rockville,MD)を使用して、約5×107個のMuLuc63産生ハイブリドーマ細胞から総RNAを抽出した。供給者のプロトコールにしたがってSMART RACE cDNA増幅キット(BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA)を使用して、二本鎖cDNAを合成した。SMART RACE DNA増幅キットに含まれるマウスγ鎖およびκ鎖のC領域にそれぞれアニーリングする3’プライマーおよび5’ユニバーサルプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、重鎖および軽鎖の可変領域cDNAを増幅した。VHPCRについて、3’プライマーは、配列5’−AGCTGGGAAGGTGTGCACAC−3’(配列番号51)を有する。VLPCRについて、3’プライマーは、配列5’−TTCACTGCCATCAATCTTCC−3’(配列番号52)を有する。VHおよびVLのcDNAを、配列決定のためにpCR4Blunt−TOPOベクター(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)にサブクローン化した。製造者の説明書にしたがって、蛍光ジデオキシ鎖ターミネーター(Applied Biosystems,Foster City,CA)を使用したPCRサイクル配列決定反応によってDNA配列決定を行った。
HuLuc63V領域のデザイン
Queen,C.ら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029−10033(1989))に概説のように、抗体V領域をヒト化した。第1に、コンピュータプログラムABMODおよびENCAD(Levitt,M.,J.Mol.Biol.168:595−620(1983))の支援の下でMuLuc63可変領域の分子モデルを構築した。次に、ヒト抗体のcDNA配列についての相同性検索に基づいて、ヒトVH配列E55 3−14(Cuisinier et al,Eur.J.Imm.23:110−118(1993))およびJセグメントJH1(Ravetch,J.V.ら,Cell 27:583−591(1981))を、HuLuc63重鎖可変領域のフレームワークが得られるように選択した。HuLuc63軽鎖可変領域については、cDNAのVL配列III−2R(Manheimer−Lory et al,J.Exp.Med.174:1639−1652(1991))を使用した。MuLuc63のVHとアクセプターヒトフレームワークとの間のフレームワークアミノ酸の同一性は、81.6%であった(71/87.)、一方MuLuc63のVLとアクセプターヒトフレームワークとの間の同一性は、76.3%であった(61/81)。
HuLuc63のVHおよびVLをそれぞれコードする遺伝子を、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナル、および哺乳動物発現ベクターへのその後のクローニングに適切な制限酵素を含むミニエクソンとしてデザインした。VHおよびVLミニエクソンのスプライスドナーシグナルは、それぞれ対応するヒト生殖系列JH6およびJK4配列に由来していた。HuLuc63のVHおよびVLミニエクソン中のシグナルペプチド配列は、それぞれ対応するMuLuc63のVHおよびVL配列に由来していた。Luc63のVHおよびVL遺伝子のヌクレオチド配列を、推定アミノ酸配列とともに表5および6に示す。
組織培養細胞の一過性トランスフェクションによってHuLuc63 IgG1/κ抗体を産生した。ヒト胚腎臓細胞株293−H(Invitrogen,Carlsbad,CA)を、10%FBS(HyClone,Logan,UT)および非必須アミノ酸(Invitrogen)を含むDMEM(BioWhittaker,Walkersville,MD)で維持した。標準的な培地(DMEM+10%FBS+非必須アミノ酸)を使用して、トランスフェクションの前日に、1×106細胞/ウェルで6ウェルプレートに2.5mlの体積で293−H細胞をプレートした。トランスフェクションの当日に、ウェルあたり4μgのプラスミドDNAを、250μlのハイブリドーマ−SFM(H−SFM,Invitrogen)で希釈した。ウェルあたり10μlのリポフェクタミン2000試薬(LF2000,Invitrogen)を、250μlのH−SFMで希釈した。希釈DNAを希釈LF2000と組み合わせ、20分間インキュベートして、DNA−LF2000複合体を形成した。500μlのDNA−LF2000複合体を各ウェルに添加し、プレートを前後に傾けることによって混合した。細胞を5日間インキュベートし、その後分析のために上清を回収した。
ヒトCS1に対するMuLuc63およびHuLuc63の親和性を、直接結合ELISAによって分析した。96ウェルELISAプレート(Immulon 4 HBXプレート、Thermo Labsystems,Franklin,MA)のウェルを、100μlの1μg/ml可溶性ヒトCS1−ヒトFcγ3融合タンパク質を含むPBSにて室温で一晩コーティングした。洗浄緩衝液での洗浄後、ウェルを150μlのSuperblockブロッキング緩衝液にて室温で30分間ブロッキングした。一過性に発現したHuLuc63抗体または精製MuLuc63抗体を、ELISA緩衝液で適切に希釈し、ELISAプレートに適用した(100μl/ウェル)。ELISAプレートを室温で1時間インキュベートし、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄した。次いで、ELISA緩衝液で1000倍希釈した100μlのHRP抱合ヤギ抗ヒトCκ抗体またはHRP抱合ヤギ抗マウスCκ抗体(共にsouthern Biotech)を、HuLuc63およびMuLuc63プレートの各ウェルにそれぞれ添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄緩衝液での洗浄後、100μlのABTS基質(KPL)を各ウェルに添加した。ウェルあたり100μlの2%シュウ酸の添加によって発色を停止させた。VERSAmaxマイクロプレートリーダーを使用して、415nmでの吸光度を読み取った。ELISA結合実験の結果を図7に示す。MuLuc63およびHuLuc63は、ヒトCS−1−Fcγ3に濃度依存様式で結合する。コンピュータソフトウェアGraphPad Prism(GraphPad Software Inc.,SanDiego,CA)を使用して得たHuLuc63のEC50値は70.1ng/mlであった。これは、muLuc63について得られた66.1ng/mlのEC50値と類似しており、マウス抗CS1モノクローナル抗体MuLuc63のヒト化が成功したことを示し、HuLuc63はヒトCS1に対する高い結合親和性を保持した。ヒト化Luc63可変領域モデルを図8に示す。
(CS1は非刺激細胞と比較して刺激T細胞およびB細胞で高度に発現する:)
CS1の発現を決定するために、ヤマゴボウマイトジェン(PWM)およびフィトヘムアグルチニン(PHA)刺激を使用して末梢血Bリンパ球およびTリンパ球を刺激するためのインビトロアッセイを準備した。刺激を行わない非刺激コントロール末梢血単核細胞を並行して調製した。PolyA+mRNAを単離し、標準的な技術を使用して、これらのサンプルからcDNAを合成した。CS1特異的オリゴヌクレオチドプライマー(上記を参照のこと)を使用したPCRによってCS1遺伝子を増幅し、Biorad GelDoc2000を使用して発現を定量した。シグナル強度をコントロールヒトβ−アクチンに対して正規化した。リアルタイムPCR分析は、非刺激細胞と比較して、CS1が活性化末梢血B細胞で約23倍上方制御され、活性化末梢血Tリンパ球で約30倍上方制御されることを示した(図9)。
健常な個体と比較した狼瘡患者のCS1発現を評価するために、CD19+細胞の細胞分取によって、狼瘡患者対健常成体のプールから末梢血Bリンパ球を単離した。PolyA+mRNAを単離し、標準的な技術の使用によってcDNAを合成した。CS1に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用したリアルタイムPCRによってS1発現を評価した。リアルタイムPCRデータは、CS1が健常な個体と比較して狼瘡患者由来のBリンパ球で約2倍上方制御されることを示した。β−アクチンでの正規化により、CS1遺伝子は、健常な個体のcDNAと比較して狼瘡患者のBリンパ球のcDNAで2.3倍に増加した。18S rRNAプライマーで正規化した場合、CS1は各cDNAサンプ
ルで1.8倍に増加した(図10)。
新規のマウスLy9は、ヒトCS1の推奨されるオルソログである(Tovarら,Immunogenetics 54:394−402(2002))。活性化B細胞および活性化T細胞での新規のマウスLy9の発現を、リアルタイムPCRを使用して試験した。データは、新規のマウスLy9が活性化B細胞および活性化T細胞中で上方制御されることを示した。
IBD組織(クローン病および潰瘍性大腸炎の両方)対正常組織におけるIBDモジュレータータンパク質の発現を、上記のマイクロチップアレイで決定した。オリゴヌクレオチドマイクロアレイを、複数の組織由来のcRNAを使用して調査した。より詳細には、インビトロ転写アッセイ(IVT)によって、9つのIBDおよび9つの適合隣接正常腸標本ならびに24個の結腸上皮サンプルからcRNAを作製した。遺伝子の発現レベルと正比例する平均蛍光強度(AI)によって、オリゴヌクレオチドマイクロアレイへのcR
NAハイブリッド形成を測定した。
(CS1タンパク質の発現パターン:)
産生されたLuc抗体を使用して、FACS分析によってCS1タンパク質発現をさらに試験した。細胞株を、抗CS1 Luc90.H1抗体またはマウスIgG2bイソ型コントロール抗体と氷上で30分間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、フィコエリトリン(PE)抱合抗マウスIgを細胞に添加し、氷上で30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、FACS Caliber(Becton Dickinson)でのフローサイトメトリーによって分析した。Luc90.H1抗体由来のシグナルを重複
した太線として示したヒストグラムプロットを図13に示す。下線は、陰性コントロール(非染色細胞、二次抗体(一次抗体を含まない抗マウスIg−PE)、またはイソ型コントロール抗体)を含む。これらのデータは、ARH−77白血病株細胞、CESSおよびIM9 Bリンパ芽球腫細胞株、ならびにL363、LP1、およびOPM2骨髄腫細胞株でCS1が発現することを示す。
多発性骨髄腫患者由来の骨髄サンプルを、CD138−PE、CD45PerCP、Luc90−FITC、および/またはIgG2b−FITC(イソ型コントロール抗体)で染色し、上記で詳述するようにFACSによって分析した(実施例5を参照のこと)。ゲーティングした細胞は以下である:ゲートR1はリンパ球を含み(「R1」)、ゲートR2は単球を含み(「R2」)、ゲートR3は顆粒球を含み(「R3」)、ゲートR4は赤血球を含み(「R4」)、ゲートR5は形質細胞を含み(「R5」)、ゲートR6は芽球を含む(「R6」)。図15は、CS1が多発性骨髄腫患者由来の形質細胞(例えば、CD138+細胞)で発現することを示す。
正常成体由来の末梢血単核細胞を、標準的なFicoll勾配によって単離し、10μg/mlのヤマゴボウマイトジェン(GIBCO/BRL,England,the United Kingdom)とインキュベートし、1mlの総体積で24ウェルプレート中にプレートした。100μg/mlまたは10μg/mlのモノクローナル抗体(マウス抗ヒトCS1(Luc63)またはマウスIgGイソ型コントロール)をサンプルウェルに添加した。細胞および抗体を、7%CO2中にて37℃で8日間インキュベートした。培養物由来の上清を単離し、IgMを上記のようにELISAによってアッセイした。図16に示すように、100μg/mlまたは10μg/mlの抗体Luc63(それぞれPwLuc100およびPwLuc10)は、100μg/mlまたは10μg/mlのイソ型コントロール(それぞれPwIg100およびPwIg10)または抗体を含めずに(Pw(−))インキュベートした細胞によるIgM分泌と比較して、末梢血単核細胞のIgM分泌を減少させた。
(活性化末梢血B細胞:)
末梢血単核細胞の細胞培養物由来の上清を上記に詳述のように単離し、ELISAによってアッセイした。Immulon−1プレートを、100μlの1μg/mlマウス抗ヒトIgMモノクローナル抗体(カタログ番号05−4900、Zymed Laboratories,Inc.,South San Francisco,California)を含むPBSでコーティングした。プレートをELISA緩衝液(「EB」=PBS+0.1%BSA+0.05%Tween20)で1時間ブロッキングした。(EBでの)種々の希釈率の培養上清を100μl/ウェルで添加した。上清および標準的なヒトIgM(カタログ番号009−000−012,Jackson Laboratory,Bar Harbor,Maine)を、室温で1〜2時間インキュベートした。捕捉ヒトIgMを、製造者のプロトコールにしたがって、ヤギ抗ヒトIgM−HRPポリクローナル抗体(カタログ番号2020−05,Southern Biotech Association,Birmingham,Alabama)およびHRP基質で発色させた。結合したIgMを、標準的なELISAプレートリーダーにおける分光測光法(405nm OD)によって視覚化した。図17に示すように、狼瘡患者のPBMCの分泌IgM量は、イソ型コントロールと比較して、抗CS1抗体(Luc90H1)での処理によって減少した。陽性コントロールである抗CD2抗体(GLO1)は、抗CS1が抗CD2抗体よりもさらによりIgM抗体産生を減少させることを示した。
健常な成体および自己免疫疾患(狼瘡)患者由来の末梢血B細胞によるIgG産生を、IgM産生と同一の方法で分析した。図18に示すように、抗CS1抗体(Luc90H.1)での処置から9日後の健常な成体の末梢血単核細胞による全産生は、IhG2bイソ型コントロールと比較して約23%減少した。抗CS1抗体(Luc90H.1)での処置から9日後の狼瘡患者の末梢血単核細胞によるIgGの全産生は、IgG2bイソ型コントロールと比較して約56%減少した。表3AおよびBは、多数の作製した抗CS1抗体によるIgG産生の阻害をまとめている。表3Aに示すように、Luc90.H1は、リポ多糖またはヤマゴボウマイトジェンで活性化したPBMCによるIgG産生を約40%減少させた。Luc34.1は、ヤマゴボウマイトジェンで活性化したPBMCによるIgG産生を約38%減少させた。表3Bに示すように、Luc90.H1は、健常な成体および成熟B細胞株(IM9細胞)のPBMCのIgG産生を約48%減少させた。Luc34.1は、健常な成体のPBMCのIgG産生を約53%減少させた。Luc63.2は、PBMCおよびIM9細胞のIgG産生を約47%減少させた。これらの実験から、Luc90H.1、Luc34.1、およびLuc63.2が最良の機能的抗体であることが明らかである。エピトープマッピングから、Luc90およびLuc63は、非重複エピトープを有する。
(SCID−HuPBMCマウスモデル)
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、標準的なFicoll−paque(Amersham Biosciences)密度勾配によって単離し、2×107PBMC/mlでリン酸緩衝化溶液(PBS)に再懸濁した。再懸濁したPBMC(1ml)を、C.B−17SCIDマウスに腹腔内(i.p.)注射した。PBMC注射から2〜3週間後、マウスから血清サンプルを採取し、ELISAによってヒトIgGについてアッセイした。グラフティングしたマウス(血清中に1μg/mlを超えるヒトIgGを産生する)を、治療群に無作為に分け、マウス抗ヒトCS−1モノクローナル抗体(Luc90.H1またはLuc63.2.22)、マウスイソ型コントロール抗体(それぞれIgG2bまたはIgG2a)、またはPBSで処置した。マウスに200μgの抗体を含む500μlPBSを3〜4日毎に3回または4回投与した。マウス血清を、標準的なプロトコールを使用したELISAによってヒトIgGについて分析した。
抗CS1抗体はインビボでのヒトIgG産生を減少させた
データは、本発明の抗CS1抗体がSCID−HuPBMC導入モデルにおけるヒト免疫グロブリン産生を実質的に減少させることを示した。図19Aに示すように、Luc90.H1が早くも4日目にPBSおよびイソ型コントロールにおけるIgG産生の減少を保持した(第1の抗体投与での治療から4日後)。この減少は、7週間(32日目)の試験期間を通して維持された。例えば、18日目では、ヒトIgG産生は、IgG2bイソ型コントロールでは225%増加し、PBSコントロールでは181%増加する一方で、ヒトIgG産生はLuc90H.1処置で14%減少した。Luc90H.1は、コントロール群でのヒトIgG産生の181〜225%の増加をなくすだけでなく、IgG産生をさらに14%減少させた。25日目で、Luc90H.1は、コントロール群でのヒトIgG産生の3倍増加をなくすだけでなく、ヒトIgG産生をさらに24%減少させた。
(エフェクター細胞の調製:)
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)(エフェクター細胞)を、標準的な密度Ficoll−Paque(Amersham Biosciences)勾配を使用して、全血から単離した。細胞を洗浄し、1%ウシ血清アルブミン(BSA)を補足したRPMI培地に再懸濁した。
細胞表面CS−1を発現する安定なトランスフェクタント細胞(標的細胞)を洗浄し、1%BSAを補足したRPMI培地に再懸濁した。100,000細胞/ウェルの細胞を50μlの全体積でプレートした。種々の濃度のマウス抗ヒトCS−1モノクローナル抗体(Luc90.H1またはLuc63.2.22)またはイソ型コントロール抗体(そ
れぞれマウスIgG2bまたはIgG2a)を、100μlの最終体積で標的細胞に添加し、室温で30分間インキュベートした。
上清に含まれる乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性を決定するために、細胞傷害性検出キット(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)に含まれる100μlの反応混合物を各ウェルに添加し、サンプルを15〜25℃で30分間までインキュベートした。このインキュベーション期間に、マイクロタイタープレートを遮光した。ELISAリーダーを使用して490nmのサンプルの吸光度を測定した。
実験は、抗CS1抗体であるLuc63.2およびLuc90がPBMC(エフェクター細胞)の存在下でCS1を発現する細胞の抗体由来細胞傷害性(ADCC)を誘導することを示した。図20に示すように、Luc90は投与量依存性様式で細胞傷害性を誘導する。50μg/mlのLuc90は、標的細胞の細胞傷害性をほぼ50%誘導した。Luc63.2は、一般に、10〜50μg/mlの用量範囲で標的細胞の細胞傷害性を60〜80%誘導した。2つのさらなるドナーを使用して行った実験から類似の結果が得られた。
(Luc90可変領域cDNAのクローニング)
マウス可変領域(配列番号3および4)を、標準的な方法によって、Luc90ハイブリドーマ細胞株からクローン化した。簡単に述べれば、総RNAを抽出し、供給者のプロトコールにしたがって、SMART 5’−RACEcDNA増幅キット(BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA)を使用して二本鎖cDNAを合成した。配列決定のために、可変領域cDNAのPCRフラグメントを、pCR4Blunt−TOPOベクター(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)にクローン化した。各重鎖および軽鎖についていくつかのプラスミドクローンを配列決定した。典型的なマウス重鎖および軽鎖の可変領域に相同な固有の配列を同定した。
各Luc90のVHおよびVLをそれぞれコードする遺伝子を、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナル、Kozak開始配列、および哺乳動物発現ベクターへのその後のクローニングに適切な制限酵素を含むミニエクソンとしてデザインした。VH遺伝子またはVL遺伝子のいずれかを含むTOPOベクターから、PCRのための適切な制限部位および相補物を含むようにプライマーをデザインした。PCR増幅フラグメントを、Qiaquick PCR精製キット(Qiagen)によって精製し、MluIおよびXbaIで消化した。Luc90VH遺伝子をpHuHCgl.D(野生型)またはpHuHCgl.D.AA(BS変異体)にサブクローン化して、プラスミドpChiHuHCgl.D−MuLuc90VHおよびpChiHuHCgl.D.AA−MuLuc90VHをそれぞれ作製した。BS変異体は、Fc受容体への結合がなくなるように、IgG1のCH2領域中に2つのアミノ酸が変化している(L234A/L235A)(Xuら,(2000)Cell Immunol.200:16−26)。Luc90VL遺伝子をpVkにサブクローン化してプラスミドpChiVk−MuLuc90VLを作製した。重鎖および軽鎖の遺伝子を1つのプラスミドから発現することができるように、単一のプラスミド発現ベクターを作製した。重鎖ベクターをEcoRIで消化して全重鎖領域を除去し、軽鎖ベクター中の単一のEcoRI部位にサブクローン化した。BS変異重鎖をpChiVk−MuLuc90VLベクターフラグメントと組み合わせてプラスミドpChiLuc90−BSKを作製し、野生型重鎖をpChiVk−MuLuc90VLベクターにサブクローン化してプラスミドpChiLuc90−glKを作製した。
pChiLuc90−glKおよびpChiLuc90−BSKベクターでのSp2/0細胞の安定なトランスフェクションによって、キメラLuc90IgGl/κ野生型およびBSを産生した。pChiLuc90−glKベクターでのYB2/0細胞の安定なトランスフェクションによって、低フコース抗体を産生した。ミコフェノール酸培地で陽性クローンを選択し、ELISAによってスクリーニングした。野生型クローンAH4、BS変異体HG12、および低フコースクローン5E4を、高発現について選択し、2%低Igウシ胎児血清を含むGibcoハイブリドーマ無血清培地に馴化させた。精製用の回転ボトル中で2リットルの培養物を成長させた。標準的なプロテインGアフィニティカラムクロマトグラフィによって抗体を精製した。
試験被験体への抗体の腹腔内注射によって、骨髄腫マウス腫瘍をインビボにて抗CS1抗体で処置した。図22に示すように、抗CS1抗体の処置(Luc63およびLuc90)により、イソ型コントロール処置動物と比較して腫瘍サイズが減少する。この研究では、1×107個の骨髄腫細胞(L363骨髄腫細胞株)を、CB.17SCIDマウスに腹腔内注射した。2週間後、腫瘍サイズが約80mm3に達した時に、マウスを無作為に群あたり8匹で4群に分けた。マウスを抗CS1抗体(Luc63またはLuc90)またはイソ型コントロール抗体(マウスIgG2aまたはマウスIgG2b)で処置した。マウスに8回投与でマウスあたり200μgの抗体を1週間に3回投与した。結果は、抗CS1抗体で処置したマウスがイソ型コントロール抗体処置マウスと比較して腫瘍体積を有意に減少させたことを示す。研究25日目(5回投与後)までに、Luc63処置マウスの平均腫瘍サイズは、IgG2aイソ型コントロール抗体処置マウス(平均腫瘍サイズは約800mm3)と比較して約100mm3である。Luc90処置マウスの平均腫瘍サイズは、IgG2bイソ型コントロール抗体処置マウス(平均腫瘍サイズは約950mm3)と比較して約400mm3である。抗CS1 Luc63で処置したマウスでは、処置から2.5週間後までに測定可能な腫瘍は認められず、腫瘍形成性細胞の排除に対するこの抗体の顕著な効果を示す。
Claims (10)
- モノクローナルアンタゴニスト抗CS1抗体を含む、多発性骨髄腫を治療するための医薬組成物であって、前記モノクローナル抗CS1抗体は、配列番号1によってコードされるタンパク質に結合する、前記医薬組成物。
- コンジュゲート化合物を含有する、多発性骨髄腫を治療するための医薬組成物であって、前記コンジュゲート化合物は、エフェクター部分に連結されているモノクローナルアンタゴニスト抗CS1抗体を含み、前記モノクローナル抗CS1抗体は、配列番号1によってコードされるタンパク質に結合する、前記医薬組成物。
- 前記モノクローナル抗CS1抗体は、ヒト化されている、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 前記モノクローナル抗CS1抗体は、配列番号1によってコードされるタンパク質を発現する細胞について、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を誘導する、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 前記モノクローナル抗CS1抗体は、IgG1である、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 前記モノクローナル抗CS1抗体は、低レベルのフコースを有するか、フコースを欠く、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 1つ以上の免疫抑制薬および免疫調節薬の後に投与される、または1つ以上の免疫抑制薬および免疫調節薬と組み合わせて投与される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 免疫調節薬の後に投与される、または免疫調節薬と組み合わせて投与される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記エフェクター部分は、細胞傷害性薬剤である、請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記エフェクター部分は、化学療法薬、抗生物質、または放射性同位体である、請求項2に記載の医薬組成物。
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