JP5964277B2 - 試料中の抗体含量を判定する方法 - Google Patents
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Description
そのため、一般の従来のものは、ユーザーにとって実用的ではない。
溶液により複数の炭素磁気ビーズ(Magnetic Beads)が供給され、
それに抗原(Antigen)/抗体(Antibody)が添加され、
上記抗原/抗体が上記磁気ビーズに吸着または結合し、
磁界により上記磁気ビーズを容器の底に集中させ、
また、残りの反応していない抗原/抗体とその溶液をニードル(Needle)で吸い上げ、
純粋な抗原/抗体を有する磁気ビーズだけのものが形成され、
そして、試料を上記抗原/抗体を有する磁気ビーズの溶液に添加して、
上記試料の抗体(Antibody)/抗原(Antigen)と上記抗原/抗体とを特異性反応させて、
上記磁気ビーズに吸着或いは結合させ、
その後、磁界でそれらを容器の底に集中させ、
吸着または結合していない試料中の他の物質を分離させ、
上記抗体を結合した磁気ビーズの溶液において、更に、二次抗体が添加されて、
上記二次抗体が吸着または結合された磁気ビーズを指標としてマークして、
続きの放射免疫測定法(Radioimmunoassay, RIA)や化学発光免疫測定法(Chemiluminescence Immunoassa,CLIA)、酵素結合免疫測定法(Enzyme−Linked ImmunosorbentAssay,ELISA)或いはイムノPCR法(Immuno PCR)の測定を行い、また、上記二次抗体が吸着や結合された後、同じように、磁界でそれらを容器の底に集中させ、吸着または結合していない二次抗体が分離され、
放射免疫測定法を行うことにより、上記二次抗体にヨウ素−125放射性同位体が結合され、上記ヨウ素−125から放射したガンマ線(Gamma Ray, γ−ray)により、上記ガンマ線の強度を検知して、上記試料中の抗体含量を判定し、
化学発光/酵素結合免疫測定法を行う時、上記二次抗体に化学発光/酵素結合酵素を結合させ、上記化学発光/酵素結合酵素を化学発光基質(Chemiluminescence Substrate)/酵素結合基質に作用させ、上記光子の発光強度/酵素結合吸光値を検知して、上記試料中の抗体含量を判定し、
イムノPCR法を行う時、上記二次抗体にビオチン(Biotin)を結合させ、また、一つの核酸分子にもビオチンを結合させ、ストレプトアビジン(Streptavidin)で上記核酸分子と上記二次抗体とが結合され、Tag酵素でPCR反応させて信号を拡大し、分離プロセスにより核酸分子を分離して、上記試料中の抗体含量を判定する。
図のように、本発明に係る試料中の抗体含量を判定する方法は、少なくとも次のステップを含む。
(A)磁気ビーズに抗原を結合するステップ11:
図2のように、溶液20が収納された容器2に対して、複数の磁気ビーズ(Magnetic Beads)3を供給し、また、それに抗原(Antigen)/抗体(Antibody)40を添加し、上記抗原40が上記磁気ビーズ3に吸着または結合する。
上記磁気ビーズ3が樹枝状ナノ炭素キャリア構造で、球体のナノ粒子(Nanoparticle)31、上記ナノ粒子31の表面に分布した結合用官能性分子32及び上記ナノ粒子31内に分布した磁性物質33を備える。
(B)磁性吸着清浄ステップ12:
図3のように、上記容器2の下方に磁石(Magnet)21がセットされ、磁界で磁気ビーズ3を集中させ、また、残りの反応していない抗原/抗体40とその溶液20をニードル(Needle)5で吸い上げ、純粋な抗原/抗体40を有する磁気ビーズ3を形成する。
(C)磁気ビーズに抗体を結合するステップ13:
図4のように、試料4を上記抗原/抗体40を有する磁気ビーズ3の溶液20に添加し、上記試料4中の抗体(Antibody)/抗原(Antigen)41と上記抗原40とが特異性反応して、上記磁気ビーズ3に吸着や結合され、その後、ステップ(B)のように、磁界でそれらを集中させて、吸着または結合していない試料4中の他の物質を分離させる。
(D)磁気ビーズに二次抗体を結合するステップ14:
図5のように、上記抗体41を結合した磁気ビーズ3の溶液20に、更に、二次抗体42を添加することにより、上記二次抗体42が吸着や結合された磁気ビーズ3を指標としてマークして、続きのステップ(E)やステップ(F)或いはステップ(G)の測定に利用する。
上記二次抗体42に、それぞれ、放射性同位体(Isotope)や酵素或いは核酸分子(DNA)の三種類の異なる信号分子6を結合することができる。
(E)放射免疫測定ステップ15:
図6のように、放射免疫測定法(Radioimmunoassay, RIA)を行い、上記二次抗体42にヨウ素−125放射性同位体6aを結合させ、上記ヨウ素−125から放射したガンマ線(Gamma Ray, γ−ray)で、上記ガンマ線の強度を検知して上記試料4中の抗体41含量を判定する。
(F)化学発光/酵素結合免疫測定ステップ16:
図7のように、化学発光免疫測定法(Chemiluminescence Immunoassa, CLIA)/酵素結合免疫測定法(Enzyme−Linked Immunosorbent Assay,ELISA)を行い、上記二次抗体42に化学発光/酵素結合酵素6bを結合させ、上記化学発光/酵素結合酵素6bを化学発光基質(Chemiluminescence Substrate)/酵素結合基質に作用させ、上記光子の発光強度/酵素結合吸光値を検知して、上記試料4中の抗体41含量を判定する。
(G)イムノPCRステップ17:
図8のように、イムノPCR法(Immuno PCR)を行い、上記二次抗体42にビオチン(Biotin)61cを結合させ、また、核酸分子6cにもビオチン61cを結合させ、ストレプトアビジン(Streptavidin)62cで上記核酸分子6cと上記二次抗体42とが結合され、それから、Tag酵素でPCR反応させて信号を拡大し、分離プロセスにより核酸分子6cを分離して、上記試料4中の抗体41含量を判定する。
上記方法による信号と比べると、上記放射免疫測定法の方が大幅に拡大され、より良い正確度が得られるだけでなく、既存の自動化血清免疫測定器に合わせて使用すると、より良い便利性が得られる。
ステップ(A) 炭素磁気ビーズに抗原を結合する11
ステップ(B) 磁性吸着清浄12
ステップ(C) 炭素磁気ビーズに抗体を結合する13
ステップ(D) 炭素磁気ビーズに二次抗体を結合する14
ステップ(E) 放射免疫測定15
ステップ(F) 化学発光/酵素結合免疫測定16
ステップ(G) イムノPCR17
2 容器
20 溶液
21 磁石
3 炭素磁気ビーズ
31 ナノ粒子
32 結合用官能性分子
33 磁性物質
4 試料
40 抗原/抗体
41 抗体/抗原
42 二次抗体
5 ニードル
6 信号分子
6a 放射性同位体
6b 化学発光/酵素結合酵素
6c 核酸分子
61c ビオチン
62c ストレプトアビジン
7a ガンマ線検知器
7b 光電子増倍管検知器
7c ゲル電気泳動
(従来部分)
8 容器
9 抗原
Claims (12)
- 臨床の場で大量のサンプルを生体外で定量測定することによる癌腫診断や治療の評価に適用される、試料中の抗体含量を判定する方法であって、
少なくとも、
(A)球体の炭素ナノ粒子(Nanoparticle)、前記炭素ナノ粒子の表面に分布する結合用官能性分子、および上記前記炭素ナノ粒子内に分布する磁性物質と、を有する樹枝状ナノ炭素キャリア構造である磁気ビーズを用意し、前記磁気ビーズ(Magnetic Beads)を含む溶液を入れた容器を用意し、それに抗原(Antigen)を添加し、前記抗原が前記磁気ビーズに吸着または結合する、ステップと、
(B)上記容器の下に磁石をセットし、前記抗原が吸着または結合した前記磁気ビーズを上記容器の底に集中させ、反応していない残りの抗原とその溶液をニードル(Needle)で吸い上げて、抗原を有する磁気ビーズだけのものが得られる、ステップと、
(C)上記抗原が吸着または結合した磁気ビーズの溶液に、試料を添加して、上記試料中の抗体(Antibody)と、前記磁気ビーズに吸着または結合している上記抗原とを特異性反応させて、前記磁気ビーズに抗体を吸着または結合させ、その後、磁石を上記容器の下にセットし、抗体を吸着または結合させた前記磁気ビーズを上記容器の底に集中させ、抗体を吸着または結合していない試料中の他の物質と、抗体を吸着または結合させた前記磁気ビーズとを分離させる、ステップと、
(D)上記抗体を吸着または結合した磁気ビーズの溶液に、更に、二次抗体を添加して、この二次抗体を前記抗体を吸着または結合させた前記磁気ビーズに吸着または結合させ、その後、前記二次抗体を吸着または結合させた前記磁気ビーズを、磁界で前記容器の底に集中させ、吸着または結合していない二次抗体を分離する、ステップと、を含み、さらに、
上記二次抗体が吸着又は結合した磁気ビーズを指標としてマークして、次のステップ(E)、ステップ(F)およびステップ(G)のうちのいずれか一つの測定を実行し、
ステップ(E)は、上記二次抗体にヨウ素−125放射性同位体を結合させ、放射免疫測定法(Radioimmunoassay, RIA)により、上記ヨウ素−125から放射したガンマ線(Gamma Ray, γ−ray)で上記ガンマ線の強度を検知して上記試料中の抗体含量を判定し、
ステップ(F)は、上記二次抗体に、化学発光/酵素結合酵素を結合させ、上記化学発光/酵素結合酵素を化学発光基質(ChemiluminescenceSubstrate)/酵素結合基質に作用させ、化学発光免疫測定法(Chemiluminescence Immunoassa, CLIA)や酵素結合免疫測定法(Enzyme−LinkedImmunosorbent Assay,ELISA)により、上記光子の発光強度/酵素結合吸光値を検知して、上記試料中の抗体含量を判定し、
ステップ(G)は、上記二次抗体にビオチン(Biotin)を結合させ、また、一つの核酸分子にもビオチンを結合させ、ストレプトアビジン(Streptavidin)で上記核酸分子と上記二次抗体とが結合され、イムノPCR法(Immuno PCR)により、Tag酵素でPCR反応させて信号を拡大し、分離プロセスにより核酸分子を分離して、上記試料中の抗体含量を判定する、
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。 - 請求項1に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記試料は、癌腫病者の血清である
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。 - 請求項2に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記癌腫は、鼻咽頭癌である
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。 - 請求項1に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記抗体は、Anti−EBV IgAである
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。 - 請求項1に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記二次抗体は、Anti−Human IgAである
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。 - 請求項1に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記ステップ(F)においては、化学発光/酵素結合酵素が、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(Horse RadishPeroxidase,HRP)やアルカリホスファターゼ(AlkalinePhosphatase, AP)である
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。 - 請求項1に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記ステップ(F)においては、自動化血清免疫測定器で、化学発光/酵素結合免疫測定法を行う
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。 - 請求項1に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記ステップ(F)においては、光電子増倍管(Photomultiplier Tube, PMT)検知器で、光子の発光強度/酵素結合吸光値を検知する
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。 - 請求項1に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記ステップ(G)の分離プロセスは、ゲル電気泳動(Gel Electrophoresis)である
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。 - 請求項1に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記結合用官能性分子は、酸及びアルカリによって処理されて、電離放射線によって照射されることにより形成された官能基を有する
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。 - 請求項10に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記官能基は、カルボキシル基(−COOH)やアミノ基(−NH2)、チオール基(−SH)、ヒドロキシ基(−OH)、アルデヒド基(−COH)或いはエステル基(−COO−)である
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。 - 請求項1に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記磁性物質は、鉄やコバルト、ニッケル及び四三酸化鉄(Fe4O3)の磁石粉(Magnet)である
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。
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