JP5941607B2 - 血液脳関門輸送用融合タンパク質 - Google Patents

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Description

連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、国立衛生研究所の助成金番号Ｒ４４−ＮＳ−４４６５４によって合衆国政府の資金提供を受けた。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
神経障害は、世界中の死亡および身体障害の主要な原因となっている。大きな進歩があったものの、いくつかの側面では、現在の治療の選択肢は未だ限られている。この限界の主な理由の１つは、分子に選択された接近のみ許可するという脳の特殊さである。これは有用な防御機構ではあるが、多くの有益であり得る分子体が中枢神経系（ＣＮＳ）に接近できず、したがって、多くの神経障害またはその他のＣＮＳの症状に治療効果を発揮できないことを意味している。本発明は、血液脳関門を通過する能力が限られている分子体がＣＮＳに接近しやすくするための進歩を示す。
一態様では、本発明は組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる構造に共有結合した神経治療薬を含有する組成物を提供し、この組成物は、末梢投与後、脳内の神経治療薬の濃度を平均して少なくとも約５ｎｇ／グラム上昇させることができる。いくつかの実施形態では、この神経治療薬は、分子量が約４００を上回っている。いくつかの実施形態では、神経治療薬単独では、末梢投与後、治療有効量でＢＢＢを通過しない。いくつかの実施形態では、ＢＢＢを通過できる構造は、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系でＢＢＢを通過する構造である。いくつかの実施形態では、この内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系は、インシュリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体またはＩＧＦ受容体である。いくつかの実施形態では、この内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系は、インシュリンＢＢＢ受容体媒介輸送系である。いくつかの実施形態では、ＢＢＢを通過できる構造は、抗体、例えば、キメラＭＡｂなどのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）である。いくつかの実施形態では、このキメラ抗体は、ヒトに投与された場合に顕著な免疫原反応を回避するのに十分なヒト配列を含有している。いくつかの実施形態では、この神経治療薬は、ニューロトロフィンである。いくつかの実施形態では、ニューロトロフィンは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−４／５、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２およびその他のＦＧＦ、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン、ペルセフィン、インターロイキン類、顆粒球コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ、ネトリン、カルジオトロフィン−１、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミッドカイン、プレイオトロフィン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、セマフォリンまたは幹細胞因子（ＳＣＦ）である。いくつかの実施形態では、ニューロトロフィンは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦは、天然ＢＤＮＦの変種、例えば、２アミノ酸カルボキシル切断型変種である。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦは、ヒトＢＤＮＦである。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦは、配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２の配列と少なくとも約８０％同一である配列を含有する。いくつかの実施形態では、神経治療薬は、ニューロトロフィン、例えば、ＢＤＮＦであり、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる構造は、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系に対するＭＡｂ、例えば、インシュリンＢＢＢ受容体媒介輸送系に対する抗体である。ＢＤＮＦを含有するこれらの実施形態のいくつかでは、ＢＤＮＦは、２アミノ酸カルボキシ切断型ＢＤＮＦである。ＭＡｂを含有するこれらの実施形態のいくつかでは、ＭＡｂはキメラＭＡｂ、例えば、ヒトに投与された場合に顕著な免疫原反応を回避するのに十分なヒト配列を含有しているキメラ抗体である。
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトに投与された場合に顕著な免疫原反応を回避するのに十分なヒト配列を含有している、ヒトインシュリンＢＢＢ受容体媒介輸送系に対するキメラ抗体に共有結合した２アミノ酸カルボキシ切断型ヒトＢＤＮＦを含有する組成物を提供し、この組成物は、末梢投与後、脳内のニューロトロフィンの濃度を平均して少なくとも約５ｎｇ／グラム上昇させることができ、このＢＤＮＦは、配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２の配列と少なくとも約８０％同一である配列を含有する。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦはそのアミノ末端でＭＡｂの重鎖のカルボキシ末端に共有結合している。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦはそのアミノ末端でＭＡｂの軽鎖のカルボキシ末端に共有結合している。いくつかの実施形態では、ＭＡｂの重鎖は、配列番号２４のアミノ酸２０〜４６２と少なくとも約８０％同一である配列を含有する。いくつかの実施形態では、この組成物は、ＭＡｂの重鎖とＢＤＮＦとの間にリンカー、例えば、Ｓ−Ｓ−Ｍをさらに含有する。いくつかの実施形態では、この組成物は、ＭＡｂの軽鎖をさらに含む。いくつかの実施形態では、この軽鎖は、配列番号３６のアミノ酸２１〜２３４と少なくとも約８０％同一である配列を含有する。いくつかの実施形態では、ＭＡｂはグリコシル化されている。
いくつかの実施形態では、本発明は、前記の組成物のいずれかおよび薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる構造に共有結合した神経治療薬を含む組成物であって、末梢投与後、脳内の神経治療薬の濃度を平均して少なくとも約５ｎｇ／グラムに平均して上昇させることができる組成物を含有し、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる第２の構造に共有結合した第２の神経治療薬を含有する第２の組成物をさらに含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、第１および第２の神経治療薬は異なっており、ＢＢＢを通過できる第１および第２の構造は同じ構造である。いくつかの実施形態では、ＢＢＢを通過できる構造は、第１の重鎖および第２の重鎖を含有する抗体である。いくつかの実施形態では、第１の神経治療薬は、抗体の第１の重鎖に共有結合しており、第２の神経治療薬は抗体の第２の重鎖に共有結合している。
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＢＢＢインシュリン受容体に対するキメラＭＡｂに共有結合した薬剤を含有する組成物であって、このＭＡｂが重鎖および軽鎖を含有する組成物を提供する。いくつかの実施形態では、この薬剤は治療薬である。いくつかの実施形態では、この治療薬は、ニューロトロフィン、例えば、ＢＤＮＦである。いくつかの実施形態では、この薬剤は、２アミノ酸カルボキシル末端切断型ＢＤＮＦである。いくつかの実施形態では、ＭＡｂの重鎖は、ＢＤＮＦに共有結合して融合タンパク質を形成しており、この融合タンパク質の配列は、配列番号２４のアミノ酸２０〜４６２を含む配列と少なくとも約８０％同一である第１の配列を含有し、配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２を含む配列と少なくとも約８０％同一である第２の配列をさらに含有し、所望により、第１の配列のカルボキシル末端と第２の配列のアミノ末端との間にペプチドリンカー、例えば、Ｓ−Ｓ−Ｍが存在してもよい。いくつかの実施形態では、ＭＡｂの軽鎖は、配列番号３６のアミノ酸２１〜２３４を含む配列と少なくとも約８０％同一である配列を含有する。いくつかの実施形態では、ＭＡｂはグリコシル化されている。
いくつかの実施形態では、本発明は、血液脳関門を通過できるイムノグロブリンに共有結合したＢＤＮＦを含有し、神経障害を治療するのに有効な量でＢＢＢを通過することができる、神経障害を治療するための組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、（ｉ）ＢＢＢを通過することができる構造に共有結合した（所望により、ペプチドリンカーを介して）（ｉｉ）中枢神経系（ＣＮＳ）で活性のあるペプチドを含有する融合タンパク質であって、前記血液脳関門を通過できる構造および中枢神経系で活性のあるペプチドはそれぞれ、別々の実体としての活性と比較して、平均してそれらの活性の少なくとも約４０％を保持している融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、血液脳関門を通過できる構造は、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送体上でＢＢＢを通過する。いくつかの実施形態では、この内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系は、インシュリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体またはＩＧＦ受容体である。いくつかの実施形態では、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送体は、インシュリン輸送体またはトランスフェリン輸送体である。いくつかの実施形態では、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送体は、インシュリン輸送体、例えば、ヒトインシュリン輸送体である。いくつかの実施形態では、ＢＢＢを通過できる構造は、抗体、例えば、キメラＭＡｂなどのＭＡｂである。いくつかの実施形態では、抗体は、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送体、例えば、インシュリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、もしくはＩＧＦ受容体、または、例えば、インシュリン輸送体もしくはトランスフェリン輸送体、または、例えば、インシュリン輸送体、例えば、ヒトインシュリン輸送体に対する抗体である。いくつかの実施形態では、ＣＮＳで活性のあるペプチドは、神経治療薬である。いくつかの実施形態では、この神経治療薬は、ニューロトロフィンである。いくつかの実施形態では、このニューロトロフィンは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−４／５、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２およびその他のＦＧＦ、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン、ペルセフィン、インターロイキン類、顆粒球コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ、ネトリン、カルジオトロフィン、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミッドカイン、プレイオトロフィン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、セマフォリンまたは幹細胞因子（ＳＣＦ）である。いくつかの実施形態では、このニューロトロフィンはＢＤＮＦである。いくつかの実施形態では、このＢＤＮＦは、切断型ＤＮＦ、例えば、カルボキシル切断型ＢＤＮＦ、例えば、２個のカルボキシル末端アミノ酸が欠如したＢＤＮＦである。
いくつかの実施形態では、本発明は、イムノグロブリンに共有結合した陽イオン治療用ペプチドを含有する組成物であって、この組成物中の陽イオン治療用ペプチドの血清半減期が、陽イオン治療用ペプチド単独の血清半減期よりも平均して少なくとも約５倍長い組成物を提供する。いくつかの実施形態では、この陽イオン治療用ペプチドは、神経治療薬を含有する。いくつかの実施形態では、この神経治療薬は、ニューロトロフィンである。いくつかの実施形態では、このニューロトロフィンは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−４／５、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２およびその他のＦＧＦ、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン、ペルセフィン、インターロイキン類、顆粒球コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ、ネトリン、カルジオトロフィン−１、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミッドカイン、プレイオトロフィン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、セマフォリンまたは幹細胞因子（ＳＣＦ）である。いくつかの実施形態では、このニューロトロフィンはＢＤＮＦである。いくつかの実施形態では、イムノグロブリンは、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系に対する抗体である。
別の態様では、本発明は方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ＢＢＢを通過する構造に共有結合した薬剤が有効量でＢＢＢを通過して輸送される条件下で、ＢＢＢを通過する構造に共有結合した薬剤を個体に末梢から投与することによって、ＣＮＳで活性のある薬剤を末梢循環からＢＢＢを通過して有効量で輸送する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この薬剤は神経治療薬である。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＢＢＢを通過することができる構造に共有結合した神経治療薬を含有する組成物の有効量を個体に末梢から投与することによって、個体、例えばヒトにおけるＣＮＳ障害を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＢＢＢを通過できる構造は、インシュリン受容体に対する抗体を含有し、治療薬はＢＤＮＦを含む。いくつかの実施形態では、投与は、経口、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、直腸、頬膜貫通（ｔｒａｕｓｂｕｃｃａｌ）、鼻腔内、経皮または吸入投与である。いくつかの実施形態では、投与は、静脈内、筋肉内または皮下である。いくつかの実施形態では、ＣＮＳ障害は、急性ＣＮＳ障害、例えば、脊髄損傷、局所脳虚血および全脳虚血である。障害が急性障害である実施形態では、いくつかの実施形態において、組成物を１回だけ投与する。障害が急性障害である実施形態では、いくつかの実施形態において、組成物を１週間に約１回以下の頻度で投与する。いくつかの実施形態では、ＣＮＳ障害は慢性障害である。いくつかの実施形態では、この慢性障害は、慢性神経変性疾患、網膜虚血またはうつ病からなる群から選択される。障害が慢性神経変性疾患であるいくつかの実施形態では、この慢性神経変性疾患は、プリオン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、多発硬化症、横断性脊髄炎、運動ニューロン疾患、ピック病、結節性硬化症、リソソーム蓄積症、カナバン病、レット症候群、脊髄小脳失調症、フリードライヒ失調症、視神経萎縮または網膜変性症である。いくつかの実施形態では、例えば、個体がヒトである場合、個体に、約１から約１００ｍｇの用量の組成物を投与する。
いくつかの実施形態では、本発明は、イムノグロブリンの軽鎖をコードする第１の配列およびイムノグロブリンの重鎖をコードする第２の配列を含有する単一の核酸配列であって、前記第１の配列がさらに、軽鎖に共有結合したペプチドの融合タンパク質として発現されるペプチドをコードするか、または前記第２の配列がさらに、重鎖に共有結合したペプチドの融合タンパク質として発現されるペプチドをコードする核酸配列を提供する。いくつかの実施形態では、第１の配列は、軽鎖に共有結合したペプチドの融合タンパク質として発現されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第２の配列は、重鎖に共有結合したペプチドの融合タンパク質として発現されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、このペプチドは治療用ペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用ペプチドは神経治療用ペプチドである。いくつかの実施形態では、この神経治療用ペプチドは、ニューロトロフィン、例えば、ＢＤＮＦである。ニューロトロフィンがＢＤＮＦであるいくつかの実施形態では、第２の配列は、ＢＤＮＦをコードする核酸をコードする。ニューロトロフィンがＢＤＮＦであるいくつかの実施形態では、ＢＤＮＦは、２アミノ酸カルボキシ切断型ＢＤＮＦである。いくつかの実施形態では、イムノグロブリンはＩｇＧ、例えば、キメラＭＡｂなどのＭＡｂである。いくつかの実施形態では、イムノグロブリンは、輸送系に対する抗体である。いくつかの実施形態では、この輸送系は、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系である。いくつかの実施形態では、この内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系は、インシュリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体またはＩＧＦ受容体である。いくつかの実施形態では、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系は、内在性ＢＢＢ受容体媒介インシュリン輸送系である。いくつかの実施形態では、この内在性ＢＢＢ受容体媒介インシュリン輸送系は、ヒト内在性ＢＢＢ受容体媒介インシュリン輸送系であり、イムノグロブリン重鎖が共有結合したペプチドは、ヒトＢＤＮＦである。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦは、配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２の配列と少なくとも約８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、このＢＤＮＦはアミノ末端がＭＡｂの重鎖のカルボキシ末端に結合している。いくつかの実施形態では、ＭＡｂの重鎖は、配列番号２４のアミノ酸２０〜４６２と少なくとも約８０％同一である配列を含有する。いくつかの実施形態では、この軽鎖は、配列番号３６のアミノ酸２１〜２３４と少なくとも約８０％同一である配列を含有する。いくつかの実施形態では、この配列はさらにＭＡｂの重鎖とＢＤＮＦとの間のペプチドリンカー、例えば、Ｓ−Ｓ−Ｍをコードする核酸配列を含有する。いくつかの実施形態では、この配列はさらに、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含有し、このシグナルペプチドは重鎖に結合している。いくつかの実施形態では、このシグナルペプチドは、配列番号２４のアミノ酸１〜１９と少なくとも約８０％同一である配列を含有する。いくつかの実施形態では、この配列はさらに、別のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含有し、この別のシグナルペプチドは軽鎖に結合している。いくつかの実施形態では、軽鎖に結合したこのシグナルペプチドは、配列番号３６のアミノ酸１〜２０と少なくとも約８０％同一である配列を含有する。いくつかの実施形態では、この配列はさらに、選択可能なマーカーをコードする核酸配列を含有している。いくつかの実施形態では、この選択可能なマーカーは、ＤＨＦＲであり、ＤＨＦＲの配列は、配列番号３８のアミノ酸１〜１８７と少なくとも約８０％同一である。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３３のヌクレオチド５８〜１３８６と少なくとも約８０％同一である第１の配列および配列番号３３のヌクレオチド１３９６〜１７４６と少なくとも８０％同一である第２の配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、この核酸はさらに、配列番号３５のヌクレオチド６１〜７０２と少なくとも約８０％同一である第３の配列を含有する。いくつかの実施形態では、この核酸はさらに、第１のシグナルペプチドをコードする第４の配列および第２のシグナルペプチドをコードする第５の配列を含有する。いくつかの実施形態では、この第４の配列は、配列番号３３のヌクレオチド１〜５７と少なくとも約８０％同一であり、この第５の配列は配列番号３５のヌクレオチド１〜６０と少なくとも８０％同一である。いくつかの実施形態では、この核酸はさらに、選択可能なマーカーをコードする配列を含有している。いくつかの実施形態では、この選択可能なマーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）である。いくつかの実施形態では、ＤＨＦＲをコードする配列は、配列番号３７のヌクレオチド１〜５６１と少なくとも約８０％同一である。
本発明はまた、前述の核酸のいずれかを含有するベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本発明はベクターを含有する細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの真核細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、真核細胞に１本のタンデム発現ベクターを永久的に組み込むことによって、治療薬と融合したイムノグロブリン重鎖または治療薬と融合したイムノグロブリン軽鎖を含有するイムノグロブリン融合タンパク質の製造方法であって、融合タンパク質の遺伝子およびイムノグロブリン軽鎖の遺伝子もしくはイムノグロブリン重鎖の遺伝子を含有する別の遺伝子の両方が、ＤＮＡの１片に組み込まれている方法を提供する。いくつかの実施形態では、この融合タンパク質は治療薬に融合したイムノグロブリン重鎖を含有し、融合タンパク質の遺伝子およびイムノグロブリン軽鎖の遺伝子の両方はＤＮＡの１片に組み込まれている。いくつかの実施形態では、この融合タンパク質は治療薬に融合したイムノグロブリン軽鎖を含有し、融合タンパク質の遺伝子およびイムノグロブリン重鎖の遺伝子の両方はＤＮＡの１片に組み込まれている。いくつかの実施形態では、永久的導入は、タンデムベクターを真核細胞に永久的に統合することによって実現される。いくつかの実施形態では、永久的導入は、タンデムベクターを含有し複製するエピソーム遺伝因子を真核細胞に導入することによって実現する。いくつかの実施形態では、この治療薬は神経治療薬である。いくつかの実施形態では、この方法にはさらに、ＤＮＡの１片に選択可能なマーカーの１種または複数の遺伝子を組み込むことが含まれる。いくつかの実施形態では、この方法にはさらに、ＤＮＡの１片に１種または複数の増幅遺伝子を組み込むことが含まれる。いくつかの実施形態では、イムノグロブリンはＩｇＧである。いくつかの実施形態では、イムノグロブリンはＭＡｂである。いくつかの実施形態では、ＭＡｂはキメラＭＡｂである。いくつかの実施形態では、この方法にはさらに、イムノグロブリン融合タンパク質を発現させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法にはさらに、イムノグロブリン融合タンパク質を精製することを含む。
本明細書で記載した出版物および特許出願は全て、個々の出版物または特許出願がそれぞれ明確に個別に、参考として援用されることが示されるのと同じ範囲で本明細書に参考として援用される。
図の簡単な説明
本発明の新たな特性は、添付した特許請求の範囲に詳細にわたって記載されている。本発明の特性および利点のよりよい理解は、本発明の原理を利用した、例示的実施形態を説明した以下の詳細な説明および添付した図面を参考にすることによって得られるだろう。
図１は、キメラＨＩＲＭＡｂの重鎖（ＶＨ）の可変領域、４領域（ＣＨ、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）からなるヒトＩｇＧ１の定常領域をコードするゲノム断片およびＢＤＮＦ変種（ｖＢＤＮＦ）のｃＤＮＡからなる融合遺伝子をコードする真核発現ベクターの遺伝子操作を示した図である。遺伝子の転写は、ヒトＩｇＧ１プロモーター（ＰＲＯ）によって行われる。このベクターは、融合タンパク質の重鎖（ＨＣ）を生成する。
図２は、修飾された５’−および３’−リンカーを備えたｖＢＤＮＦｃＤＮＡをコードする細菌発現プラスミドの遺伝子操作を示した図である。
図３は、融合タンパク質を生成するタンデムベクター構築における中間体である様々な構造物の大きさを示した臭化エチジウム染色アガロースゲルを示した図である。（Ａ）列１〜２：ＮｒｕＩで消化した図２のプラスミドで、０．４ｋｂのｖＢＤＮＦおよび３．５ｋｂのベクター主鎖を示している。列３：１．４〜０．１ｋｂの範囲の大きさのＭＷ標準物。列４：２３〜０．６ｋｂの範囲の大きさのＭＷ標準物。（Ｂ）列１：０．４ｋｂのｖＢＤＮＦｃＤＮＡは、ポリＡ＋ヒトＵ８７神経膠腫細胞から単離されたＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを使用した、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成される。ＰＣＲプライマー配列を表２に示す。列２および３：パネルＡに示したのと同じ大きさのＭＷ標準物。（Ｃ）列１：ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化した後のクローン４１６。列２：陰性クローン。列３：ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化した後のクローン４００。列４および５：パネルＡで示したのと同じ大きさのＭＷ標準物。（Ｄ）融合タンパク質ＨＣ（列１）およびＬＣ（列２）をコードするＤＮＡの特性のＰＣＲ断片。列３〜４：パネルＡで示したのと同じ大きさのＭＷ標準物。（Ｅ）列１〜４：ＮｈｅＩで消化した後のクローン４２２ａの４種の、異なるが一致しているコピーで、０．４ｋｂの融合タンパク質ＨＣ可変領域（ＶＨ）ｃＤＮＡの遊離が示されている。列５〜６：パネルＡで示したのと同じ大きさのＭＷ標準物。（Ｆ）列１〜４：ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化した後のクローン４２３ａの５種の、異なるが一致しているコピーで、０．７ｋｂの完全なＬＣｃＤＮＡの遊離が示されている。列５〜６：パネルＡで示したのと同じ大きさのＭＷ標準物。（Ｇ）ＰｖｕＩ（列１）およびＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ（列２）によるタンデムベクター（図１２）の制限エンドヌクレアーゼ地図。ＰｖｕＩ（切断１回）によって、約１１ｋｂの予測直線状ＤＮＡバンドが生成した。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる消化によって、融合タンパク質軽鎖（すなわち、１．８ｋｂ）およびＤＨＦＲ（すなわち、１．５ｋｂ）発現カセットの両方が遊離する。約８ｋｂのバンドは、融合タンパク質重鎖発現カセットを含む主鎖ベクターを表す。列３〜４：順番は逆であるが、パネルＡで示したのと同じ大きさのＭＷ標準物。
図４は、融合タンパク質ＨＣのカルボキシル末端とｖＢＤＮＦのアミノ末端との間の融合部位のヌクレオチド（配列番号２１）およびアミノ酸（配列番号２２）を示した図である。ＨＩＲＭＡｂ ＨＣとｖＢＤＮＦとの間の３−アミノ酸リンカーならびにｖＢＤＮＦのカルボキシル末端の新たな終止コドンを示す。
図５は、プラスミド４１６にクローニングされた融合タンパク質ＨＣ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２３）を示した図である。イタリック体：ヒトＩｇＧ１定常領域イントロン。太字：ヒトＩｇＧ１エキソン配列。下線部：ｖＢＤＮＦ。
図６は、融合タンパク質ＨＣのアミノ酸配列（配列番号２４）を示した図である。ＣＨ３領域とｖＢＤＮＦとの間の３−アミノ酸リンカーのように、アミノ酸１９個のシグナルペプチドに下線を引いてある。ＣＨ２内のＮ−結合グリコシル化コンセンサス配列に下線を引いてある。
図７は、融合タンパク質ＨＣの様々なドメインのアミノ酸配列（配列番号２５）を示した図である。
図８は、融合タンパク質ＨＣをコードする、イントロンのない真核発現ベクター、クローン４２２ａの生成を示した図である。融合タンパク質ＨＣ ｃＤＮＡは、クローン４１６を形質移入した骨髄腫細胞から単離されたＲＮＡの逆転写酵素によって生じたｃＤＮＡをＰＣＲすることによって生成した。
図９は、（Ａ）クローン４２２ａに挿入された融合タンパク質ＨＣ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２６）を示した図である。（Ｂ）（配列番号２７および２８）図Ａに示したヌクレオチド配列から推定される融合タンパク質ＨＣのアミノ酸配列を示した図である。シグナルペプチドの配列には下線が引いてある。
図１０は、融合タンパク質ＬＣをコードする、イントロンのない真核発現ベクター、クローン４２３ａの生成を示した図である。融合タンパク質ＬＣ ｃＤＮＡは、キメラＨＩＲＭＡｂ ＬＣのＶＬを含むヒトカッパＬＣ遺伝子のイントロン／エキソン配列をコードする染色体断片由来のＬＣ遺伝子を生成する発現ベクターを形質移入された骨髄腫細胞から単離されたＲＮＡの逆転写酵素によって生成したｃＤＮＡをＰＣＲすることによって生成した。
図１１は、（Ａ）クローン４２３ａに挿入された融合タンパク質ＬＣ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２９）を示した図である。（Ｂ）（配列番号３０および３１）図Ａに示したヌクレオチド配列から推定される融合タンパク質ＬＣのアミノ酸配列を示した図である。シグナルペプチドの配列には下線が引いてある。
図１２は、融合タンパク質のＨＣおよびＬＣ遺伝子をコードするタンデムベクターの構造物を示した図である。ＴＶは、ｃＤＮＡ発現ベクター、ＨＣについてはクローン４２２ａおよびＬＣについては４２３ａ、ならびにマウスＤＨＦＲの発現カセットをコードする細菌発現プラスミドから操作された。
図１３Ａおよび図１３Ｂは、融合タンパク質ＨＣ遺伝子およびＬＣ遺伝子ならびにタンデムベクターに組み込まれたＤＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３２）を示した図である。
図１４は、タンデムベクターヌクレオチド配列分析に基づいて融合タンパク質ＨＣの推定アミノ酸配列を示した図である（配列番号３３および３４）。シグナルペプチド配列には下線が引いてある。
図１５は、タンデムベクターヌクレオチド配列分析に基づいて融合タンパク質ＬＣの推定アミノ酸配列を示した図である（配列番号３５および３６）。シグナルペプチド配列には下線が引いてある。
図１６は、タンデムベクターヌクレオチド配列分析に基づいてＤＨＦＲの推定アミノ酸配列を示した図である（配列番号３７および３８）。
図１７は、バイオリアクターで５０日間一定に維持したＣＨＯ細胞の生細胞および全細胞密度を示した図で、ＣＨＯ細胞は、融合タンパク質をコードするタンデムベクターを永久的に形質移入された。
図１８は、融合タンパク質、（ａ）血液からＢＢＢを通過する輸送を可能にするヒトＢＢＢヒトインシュリン受容体（ＨＩＲ）に結合し、（ｂ）神経保護を導くニューロン上のｔｒｋＢに結合する２機能性分子の構造を示した図である。
図１９は、２次抗体がヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（ｘ軸）またはヒトＢＤＮＦ（ｙ軸）のいずれかに特異的である、２種類の異なる「サンドイッチ」免疫測定法の相関を示した図である。どちらの測定法でも１次抗体はヒトカッパ軽鎖に特異的である。ＣＨＯ細胞調整培地中の融合タンパク質の測定レベルは、抗Ｆｃを使用しても、抗ＢＤＮＦ抗体を使用しても同一である。
図２０は、キメラＨＩＲＭＡｂおよび融合タンパク質の還元（左）および非還元（右）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示した図である。還元条件下では、軽鎖の大きさ、３０ｋＤａは、キメラＨＩＲＭＡｂおよび融合タンパク質と同一であり、融合タンパク質の重鎖の大きさは、ＢＤＮＦが存在するため、キメラＨＩＲＭＡｂ重鎖より約１５ｋＤａ大きい。非還元条件下では、キメラＨＩＲＭＡｂおよび融合タンパク質はそれぞれ、分子量１８０および２００ｋＤａの単一な異種四量体種として移動する。
図２１は、（左図）抗ヒトＩｇＧ１次抗体のウェスタンブロットを示した図である。融合タンパク質およびＨＩＲＭＡｂの重鎖の大きさはそれぞれ、６４ｋＤａおよび５０ｋＤａであり、融合タンパク質またはキメラＨＩＲＭＡｂの軽鎖の大きさは２５ｋＤａである。（右図）融合タンパク質またはＢＤＮＦには反応するが、キメラＨＩＲＭＡｂには反応しない抗ヒトＢＤＮＦ抗体によるウェスタンブロットを示した図である。ＭＷ標準物（ＳＴＤＳ）は、右側に示してある。
図２２は、等電点（ｐＩ）標準物（列１）、キメラＨＩＲＭＡｂ（列２および４）、ＢＤＮＦ（列３）および融合タンパク質（列５）の等電点電気泳動（ＩＥＦ）を示した図である。ＢＤＮＦは、ｐＩ＞１０で強い陽イオンである一方、融合タンパク質のｐＩはキメラＨＩＲＭＡｂのｐＩに近似しており、約８．５で、融合タンパク質の理論的ｐＩに近い。
図２３は、（Ａ）ヒトインシュリン受容体（ＨＩＲ）競合リガンド結合測定法（ＣＬＢＡ）の概略を示した図である。ＨＩＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に［１２５Ｉ］標識マウスＨＩＲＭＡｂを結合させ、図Ｂに示したように、この結合をキメラＨＩＲＭＡｂまたは融合タンパク質のいずれかと競合的に置換させる。（Ｂ）キメラＩＨＲＭＡｂまたは融合タンパク質のいずれかによる、ＨＩＲ ＥＣＤに対する［１２５Ｉ］標識マウスＨＩＲＭＡｂの結合の置換を示した図である。ＨＩＲ ＥＣＤに対するキメラＨＩＲＭＡｂの親和性は高く、ＨＩＲ ＥＣＤに対する融合タンパク質の親和性は、キメラＨＩＲＭＡｂの親和性と有意差があるとはいえない。これらの結果は、キメラＨＩＲＭＡｂ重鎖のカルボキシル末端にｖＢＤＮＦを融合しても、ＨＩＲに対する融合タンパク質の結合を損なわないことを示している。
図２４は、（Ａ）ｔｒｋＢ競合リガンド結合測定（ＣＬＢＡ）の設計。ＰＥＧリンカーの利点は、それによる修飾でＥＬＩＳＡウェルに対する陽イオンＢＤＮＦの非特異的結合（ＮＳＢ）が排除され、それによってシグナル／ノイズ比の高い測定が得られることである。ｔｒｋＢ ＥＣＤへのＢＤＮＦ−ＰＥＧ２０００−ビオチンの結合は、アビジンおよびビオチンペルオキシダーゼを使用したペルオキシダーゼ系によって検出された。（Ｂ）ｔｒｋＢ ＥＣＤへのＢＤＮＦ−ＰＥＧ２０００−ビオチンの結合は、組換えＢＤＮＦによって競合的に置換される。この結合データは、非線形回帰分析によって分析したところ、ＢＤＮＦ結合のＫＩ、３．５±１．３ｐｍｏｌ／ウェルおよびＮＳＢパラメータが得られた。（Ｃ）ｔｒｋＢ ＥＣＤへのＢＤＮＦ−ＰＥＧ２０００−ビオチンの結合は、融合タンパク質によって競合的に置換される。この結合データは、非線形回帰分析によって分析したところ、融合タンパク質結合のＫＩは２．２±１．２ｐｍｏｌ／ウェルで、天然ＢＤＮＦのＫＩと有意差があるとはいえない。これらのデータは、ｔｒｋＢ受容体に対する融合タンパク質の親和性が天然ＢＤＮＦの親和性と等しいことを示している。
図２５は、（Ａ）ヒト神経ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における低酸素症−再酸素負荷神経保護測定法の設計を示した図である。細胞をレチノイン酸に７日間曝露して、ｔｒｋＢ、ＢＤＮＦ受容体の遺伝子発現の上方制御を引き起こす。（Ｂ）３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）によるミトコンドリア呼吸の測定に基づいた神経保護測定法。最大の神経保護は、ＢＤＮＦ４ｎＭによって確立され、融合タンパク質４ｎＭは、ヒト神経細胞において、同程度の神経保護レベルを生じる。ＭＴＴレベルは、細胞の約５０％のみがレチノイン酸に応答してｔｒｋＢを誘導するので、低酸素症ではない細胞のレベルにはもどらない。
図２６は、（Ａ）ヒトＢＢＢのｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系として使用した、ヒト脳から単離された毛細血管の光学顕微鏡写真である。（Ｂ）ヒトＢＢＢ上のＨＩＲに対する［３Ｈ］−融合タンパク質の結合の放射線−受容体測定法。結合は非標識融合タンパク質によって自己阻害される。非線形回帰分析によって飽和データをスキャッチャードプロットに当てはめると、結合パラメータ、ＫＤ＝０．５５±０．０７ｎＭ、Ｂｍａｘ＝１．３５±０．１０ｐｍｏｌ／ｍｇｐが得られる。
図２７は、成体アカゲザルにおける融合タンパク質の薬物動態および脳への取り込み。（Ａ）麻酔した成体アカゲザルに［３Ｈ］−融合タンパク質または［１２５Ｉ］マウスＨＩＲＭＡｂのいずれかのタンパク質を１回静脈注射した後、［３Ｈ］−融合タンパク質または［１２５Ｉ］マウスＨＩＲＭＡｂの血清濃度を時間に対してプロットする。（Ｂ）麻酔した成体アカゲザルに［３Ｈ］融合タンパク質を、または麻酔した成体ラットの［３Ｈ］−ＢＤＮＦを１回静脈注射した後、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）によって沈殿可能な血清放射活性を時間に対してプロットする。（Ｃ）麻酔した成体アカゲザルに、［３Ｈ］融合タンパク質または［３Ｈ］マウスＩｇＧ２ａのいずれかを１回静脈注射してから１８０分後の脳分布の毛細血管欠乏分析。（Ｄ）融合タンパク質３７３μｇを静脈注射してから１８０分後の融合タンパク質の霊長類脳における濃度を、霊長類脳の内在性ＢＤＮＦ濃度と比較して示した図である。
発明の詳細な説明
Ｉ．導入
ＩＩ．定義
ＩＩＩ．血液脳関門
Ａ．輸送系
Ｂ．血液脳関門受容体媒介輸送系に結合する構造
ＩＶ．血液脳関門を通過して輸送するための薬剤
Ａ．ニューロトロフィン
Ｂ．脳由来神経栄養因子
Ｖ．組成物
ＶＩ．核酸、ベクター、細胞および製造
Ａ．核酸
Ｂ．ベクター
Ｃ．細胞
Ｄ．製造
ＶＩＩ．方法
ＶＩＩＩ．キット
略語
ＡＬＳ 筋萎縮性側索硬化症
ＢＢＢ 脳血液関門
ＢＤＮＦ 脳由来神経栄養因子
ＢＲＢ 脳網膜関門
ＣＤＲ 相補性決定領域
ＣＥＤ 対流増強送達
ＣＨ１ ＩｇＧ定常領域の第１部
ＣＨ２ ＩｇＧ定常領域の第２部
ＣＨ３ ＩｇＧ定常領域の第３部
ＣＨＯ チャイニーズハムスター卵巣細胞
ＣＨＯＰ ＣＨＯ細胞宿主タンパク質
ＣＬＢＡ 競合リガンド結合測定法
ＣＭＶ サイトメガロウイルス
ＣＮＳ 中枢神経系
ＤＨＦＲ ジヒドロ葉酸レダクターゼ
ＥＣＤ 細胞外ドメイン
ＦＲ フレームワーク領域
ＦＷＤ フォワード
ＨＩＲ ヒトインシュリン受容体
ＨＩＲＭＡｂ ヒトインシュリン受容体に対するモノクローナル抗体
ＨＩＶ ヒト免疫不全ウイルス
ＩＣ 脳内
ＩＣＣ 免疫細胞化学
ＩＣＶ 側脳室内
ＩＤ 注射用量
ＩＥＦ 等電点電気泳動
ＩＧＦ インシュリン様成長因子
ＩｇＧ イムノグロブリンＧ
ＬＤＬ 低密度リポタンパク質
ＭＡｂ モノクローナル抗体
ＭＲＴ 平均滞留時間
ＭＴＨ 分子版トロイの木馬
ＭＴＸ メトトレキセート
ＭＷ 分子量
ＮＳＢ 非特異的結合
ＮＴ−３ ニューロトロフィン−３
ＮＴ−４／５ ニューロトロフィン−４／５
ＯＤＮ オリゴデオキシヌクレオチド
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＰＲＯ プロモーター
ＲＥＶ リバース
ＲＭＴ 受容体媒介輸送
ＳＤＭ 部位特異的変異誘発
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミドゲル電気泳動
ＳＦＭ 無血清培地
ＳＮＰ 一塩基多形
ＴＣＡ トリクロロ酢酸
ＴＦＦ タンジェンシャルフロー濾過
ＴＦＩ 一過性前脳虚血
ＴｆＲ トランスフェリン受容体
ＴｒｋＢ ＢＤＮＦ受容体
ＴＶ タンデムベクター
ｖＢＤＮＦ ＢＤＮＦ変種
ＶＤ 分布量
ＶＨ 重鎖の可変領域
ＶＬ 軽鎖の可変領域
Ｉ．導入
血液脳関門は、多くの末梢投与薬を中枢神経系に輸送するのを制限する因子である。本発明は、ＢＢＢを通過してＣＮＳに薬剤を輸送するのに重要な３つの要素、１）薬剤がＢＢＢと十分に接触してＢＢＢを横断するために、十分な時間末梢循環中にあることが可能な薬剤の薬物動態プロファイル、２）ＢＢＢを通過させるための薬剤の修飾、および３）一旦ＢＢＢを通過した薬剤の活性の保持に取り組む。本発明の様々な態様は、ＢＢＢを通過して輸送されるために、および／または構造に結合していながら、脳においてその活性のいくらか、もしくは全てを保持するために、薬剤の血清半減期の延長をもたらす構造に共有結合した薬剤（例えば、治療薬）の融合構造（例えば、融合タンパク質）を提供することによって、これらの要素に取り組む。
したがって、一態様では、本発明は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる構造に共有結合した薬剤を利用する組成物および方法を提供する。この組成物および方法は、薬剤、例えば、神経治療薬などの治療薬を末梢血から、ＢＢＢを通過してＣＮＳに輸送するのに有用である。本発明に有用な神経治療薬には、ニューロトロフィン、例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＢＢＢを通過できる構造は、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系でＢＢＢに結合し、ＢＢＢを通過することができる。いくつかの実施形態では、ＢＢＢを通過できる構造は、抗体、例えば、キメラＭＡｂなどのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）ある。
いくつかの実施形態では、本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）で活性のあるペプチドに共有結合した、ＢＢＢを通過できる構造を含む融合タンパク質であって、血液脳関門を通過できる構造および中枢神経系で活性のあるペプチドがそれぞれ、別々の実体としてのそれらの活性（または、それぞれの受容体に対する結合親和性）と比較して、それらの活性（または、それぞれの受容滞日する結合親和性）の一部（例えば、１０〜１００％）を保持している融合タンパク質を提供する。
別の態様では、本発明は、イムノグロブリンに共有結合した陽イオン治療用ペプチドを含有する組成物であって、この組成物中の陽イオン治療用ペプチドが、陽イオン治療用ペプチド単独の血清半減期よりも平均して少なくとも約５倍長い血清半減期を有する組成物を提供する。
本発明はまた、ペプチドおよびタンパク質をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、イムノグロブリンの軽鎖をコードする遺伝子およびペプチドに共有結合したイムノグロブリンの重鎖から形成された融合タンパク質をコードする遺伝子を含有する単一の核酸配列を提供する。いくつかの実施形態では、この融合タンパク質のペプチドは、治療用ペプチド、例えば、ニューロトロフィンなどの神経治療用ペプチドである。本発明はまた、本発明の核酸を含有するベクターおよびこのベクターを含有する細胞を提供する。イムノグロブリン融合タンパク質の製造方法であって、前記融合タンパク質が、治療薬と融合したイムノグロブリン重鎖を含有し、イムノグロブリン軽鎖遺伝子および治療薬に融合したイムノグロブリン重鎖の遺伝子の両方がＤＮＡの１片に永久的に組み込まれている１本のタンデムベクターを真核細胞に永久的に組み込むことを含む方法をさらに提供する。
本発明はさらに、治療用組成物、例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる構造に共有結合した薬剤および薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、血液脳関門を通過できるイムノグロブリンに共有結合したＢＤＮＦを含み、神経障害を治療するのに有効な量でＢＢＢを通過することができる、神経障害を治療するための組成物を提供する。
本発明はまた、１種または複数の本発明の組成物の有効量を、所望により障害のその他の治療と併用して、個体に末梢投与することを含む、個体における神経障害を治療する方法を提供する。
ＩＩ．定義
本明細書で使用したように、「薬剤」には、生物における生理学的または生化学的効果を含む効果を生じるのに有用ないかなる物質も含まれる。「治療薬」とは、治療効果、すなわち、障害の改善、予防、および／または完全な、もしくは部分的な治癒を導く効果を生じさせる、または生じさせるようにする物質である。「治療効果」はまた、本明細書で使用したように、障害に罹患していない個体における平均的または正常な状態よりも良好な状態を作り出すこと、すなわち、正常または平均的な状態と比較して、認知、記憶、気分またはＣＮＳの機能の少なくとも一部に起因すると考えられるその他の特性の改善などの平均以上の効果を含む。「神経治療薬」は、ＣＮＳにおいて治療効果をもたらす薬剤である。「治療用ペプチド」には、ペプチドからなる治療薬が含まれる。「陽イオン治療用ペプチド」には、等電点が約７．４を上回る、いくつかの実施形態では、約８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、または約１２．５を上回る治療用ペプチドが包含される。陽イオン治療用ペプチドの下位区分は陽イオン神経治療用ペプチドである。
本明細書で使用したように、「中枢神経系（ＣＮＳ）において活性のあるペプチド」には、ＣＮＳに投与された場合に効果を有するペプチドが含まれる。この効果は、治療効果または非治療効果、例えば、診断効果または研究に有用な効果であってよい。この効果が治療効果である場合、そのペプチドはまた、治療用ペプチドである。ＣＮＳにおいて活性のあるペプチドでもある治療用ペプチドは、本明細書で使用したような用語「神経治療用ペプチド」に包含される。
本明細書で使用したような「治療」または「治療すること」には、治療的有益および／または予防的有益を実現することが含まれる。治療的有益とは、根底にある治療すべき障害または症状の根絶または改善を意味する。例えば、神経障害を有する個体において、治療的有益には、障害の進行の部分的もしくは完全な停止、または障害の部分的もしくは完全な回復が含まれる。また、治療的有益は、患者がまだ症状に冒されている可能性があるという事実に関わりなく、患者において改善が認められるように、根底にある症状に関連した生理学的もしくは心理学的徴候の１種または複数の根絶または改善によって実現する。治療の予防的有益には、症状の予防、症状の進行の遅延（例えば、神経障害の進行の緩徐化）、または症状発症の可能性の減少が含まれる。本明細書で使用したように、「治療すること」または「治療」には、予防が含まれる。
本明細書で使用したように、「有効量」という用語は、有益な、もしくは所望する結果、例えば、有益な、もしくは所望する臨床結果、または増強された認知、記憶、気分もしくはその他の所望するＣＮＳの結果を実施するために十分な量であることができる。有効量はまた、予防効果をもたらす量、例えば、病理学的または望ましくない症状の出現を遅延、低下または除去する量である。ＣＮＳのこのような症状には、認知症、本明細書で記載したような神経変性疾患、最適以下の記憶または認知、気分障害、一般的なＣＮＳ加齢またはその他の望ましくない症状が含まれる。有効量は、１回または複数回の投与で投与することができる。治療に関して、本発明の組成物の「有効量」は、障害、例えば、神経障害の進行を緩和、改善、安定化、逆行または遅延させるのに十分な量である。「有効量」は、単独で使用した、または疾患もしくは障害を治療するために使用される１種または複数の薬剤と併用した本発明の組成物のいずれかのものであってよい。本発明の意味における治療薬の「有効量」は、患者の担当医または獣医によって決定される。このような量は、当業者によって容易に確認され、本発明に従って投与された場合に治療効果を生じる。治療有効量に影響を及ぼす要素には、使用した治療薬の比活性、障害の種類（例えば、急性対慢性神経障害）、障害開始から経過した時間ならびに治療する個体の年齢、身体的状態、その他の疾患状態の存在および栄養状態が含まれる。さらに、患者に投与してよいその他の薬物も、投与する治療薬の治療有効量の決定に影響を及ぼす。
本明細書で使用したような「対象」または「個体」は、動物、例えば、哺乳類である。いくつかの実施形態では、「対象」または「個体」はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は神経障害を罹患している。
いくつかの実施形態では、薬剤は「末梢投与される」または「末梢から投与される」。本明細書で使用したように、これらの用語は、ＣＮＳに直接投与しない、すなわち、血液脳関門の脳ではない側に薬剤を接触させる、薬剤、例えば、治療薬の個体への任意の投与形態を意味する。本明細書で使用したように、「末梢投与」には、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、吸入、頬膜貫通、鼻腔内、直腸および経口投与が含まれる。
本明細書では、「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」とは、それ自体組成物を投与されている個体に有害な抗体の産生を引き起こさない任意の担体のことである。このような担体は、当業者には周知である。薬学的に許容される担体／賦形剤の十分な検討は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ、ＡＲ編、第２０版、２０００：Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ ＰＡ、ＵＳＡに見いだすことができる。薬学的に許容される担体の例には、塩、例えば、無機酸塩、例えば、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など、および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などが含まれる。例えば、本発明の組成物は、液状で提供することができ、ｐＨを変化させた（５〜８）水性溶液をベースにした生理食塩水中で、ポリソルベート−８０などの界面活性剤０．０１〜１％、またはマンニトール、ソルビトールもしくはトレハロースなどの炭水化物添加物を含めるか、または含めないで、製剤化することができる。通常使用する緩衝液には、ヒスチジン、酢酸塩、リン酸塩またはクエン酸塩が含まれる。
「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」とは、挿入のために使用した方法、例えば、直接的取り込み、形質導入、ｆ−交配または組換え宿主細胞を創出するための当業界で公知のその他の方法にかかわらず、外来ポリヌクレオチドを含む細胞のことである。外来ポリペプチドは、非組み込みベクター、例えば、プラスミドとして維持することができ、あるいは、宿主ゲノム中に組み込むことができる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書ではアミノ酸残基のポリマーを意味するために同義に使用される。すなわち、ポリペプチドを指す説明は、ペプチドの説明およびタンパク質の説明に同様に適用され、逆の場合も同じである。この用語は、天然に生じるアミノ酸ポリマーならびに１個または複数のアミノ酸残基が天然には生じないアミノ酸、例えば、アミノ酸類似体であるアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で使用したように、この用語は、完全長タンパク質（すなわち、抗原）を含む任意の長さのアミノ酸鎖であって、アミノ酸残基がペプチド共有結合によって結合しているアミノ酸鎖を包含する。
「アミノ酸」という用語は、天然に生じる、および天然には生じないアミノ酸、ならびに天然に生じるアミノ酸と類似の方法で機能を果たすアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を意味する。天然にコードされたアミノ酸には、２０個の共通のアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン）およびピロリシンおよびセレノシステインがある。アミノ酸類似体は、天然に生じるアミノ酸と同様の基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムのことである。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然に生じるアミノ酸と同様の基本的化学構造を保持している。
アミノ酸とは、一般的に知られている３文字表記またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨された１文字表記によって本明細書では表すことができる。ヌクレオチドは、同様に、通常受け入れられている１文字コードによって表すことができる。
「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチドおよび１本鎖または２本鎖の形態のそれらのポリマーを意味する。特に限定しなければ、この用語は、参照とする核酸と類似の結合特性を有し、天然に生じるヌクレオチドと類似の方法で代謝される天然のヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。特に他に限定しなければ、この用語はまた、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アンチセンス技術で使用したＤＮＡの類似体（ホスホロチオエート、ホスホロアミデートなど）を含むオリゴヌクレオチド類似体を意味する。特に指示しなければ、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたそれらの変種（限定はしないが、縮重コドン置換）および相補配列ならびに明確に指示された配列を非明示的に包含する。具体的に、縮重コドン置換は、１個または複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって実現することができる（Ｂａｔｚｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８（１９８５）；およびＣａｓｓｏｌ他、（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１〜９８（１９９４））。
「単離された」および「精製された」という用語は、天然の環境から実質的または本質的に取り出された、あるいは濃縮された物質を意味する。例えば、単離された核酸は、通常それに隣接した核酸または試料中のその他の核酸もしくは成分（タンパク質、脂質など）から分離された核酸であってよい。別の例では、ポリペプチドが天然の環境から実質的に取り出された、または濃縮された場合、そのポリペプチドは精製されている。核酸およびペプチドの精製および単離の方法は、当業界では周知である。
ＩＩＩ．血液脳関門
一態様では、本発明は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる構造に共有結合した薬剤を利用する組成物および方法を提供する。この組成物および方法は、薬剤、例えば、神経治療薬などの治療薬を末梢血から、血液脳関門を通過してＣＮＳに輸送するのに有用である。本明細書で使用したように、「血液脳関門」とは、脳毛細血管内皮原形質膜内で緊密な結合によって形成される末梢循環と脳および脊髄との間の関門のことであり、分子量６０Ｄａの尿素と同じくらい小さい分子であっても、脳内への分子の輸送を制限する極めて厳重な関門を形成する。脳内の血液脳関門、脊髄内の血液脊髄関門、網膜内の血液網膜関門は、中枢神経系（ＣＮＳ）内の近接した毛細血管関門であり、集合的に血液脳関門またはＢＢＢと称される。
ＢＢＢは、新たな神経治療薬、診断薬ならびに脳およびＣＮＳのための研究手段の開発において制約となる段階である。高分子治療薬、例えば、組換えタンパク質、アンチセンス剤、遺伝子薬、モノクローナル抗体、またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）をベースにした薬剤の本質的に１００％が、薬理学的に有意な量ではＢＢＢを通過しない。低分子薬はＢＢＢを通過できると一般的に考えられているが、実際には、ＢＢＢを通過して輸送されないので、低分子全体の２％未満しか脳内で活性を有さない。薬理学的に有意な量でＢＢＢを通過するためには、分子は液体に可溶性で、分子量が４００ダルトン（Ｄａ）未満でなければならず、低分子の大部分がこれらの２つの分子的特性を備えていない。したがって、ほとんどの有望な治療的、診断的または研究用分子は、薬理学的に活性のある量でＢＢＢを通過しない。ＢＢＢを迂回するために、側脳室内（ＩＣＶ）注入、脳内（ＩＣ）投与および対流増強送達（ＣＥＤ）などの侵襲的経頭蓋送達戦略を使用する。脳への経頭蓋薬剤送達は、高価で、侵襲的で、ほとんど効果がない。ＩＣＶ経路では、ＢＤＮＦは脳の脳室上皮にのみ輸送され、脳の実質内へは輸送されず、ＩＣＶ経路によって投与される薬剤ではこれが一般的である。ニューロトロフィン、例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）のＩＣ投与は、脳内の薬剤拡散の効率が低いため、薬剤を局所的に注射部位に輸送するのみである。ニューロトロフィンのＣＥＤは、脳の白質路から優先的な流体の流れを生じ、脱髄および星細胞腫の原因となる。
本発明は、ＢＢＢを迂回し、薬剤、例えば、神経保護因子を末梢血からＢＢＢを通過させるために、これらの侵襲性の高い、一般的に満足のいかない方法の代替法を提案する。末梢血からＣＮＳに所望する物質を輸送するための機構の提供は、ＢＢＢに存在する内在性輸送経を使用することを基にしている。
Ａ．輸送系
いくつかの実施形態では、本発明は、ＢＢＢを通過して輸送することが望ましい薬剤、例えば、神経治療薬を結合させた、ＢＢＢ受容体媒介輸送系に結合する構造を含む組成物を提供する。本発明の組成物および方法は、選択された内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系によって輸送でき、所望する薬剤に結合させることもできる任意の適切な構造を利用することができる。いくつかの実施形態では、この構造は、抗体である。いくつかの実施形態では、この抗体はモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、例えば、キメラＭＡｂである。
内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系。ＢＢＢは、いくつかの高分子の血液から脳への輸送を可能にする特異的な受容体を有することが示されており、これらの輸送体は、本発明の組成物の輸送体として適している。本発明に有用な内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系には、インシュリン、トランスフェリン、インシュリン様成長因子１および２（ＩＧＦ１およびＩＧＦ２）、レプチンおよびリポタンパク質を輸送する輸送系が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明は、内在性インシュリンＢＢＢ受容体媒介輸送系、例えば、ヒト内在性インシュリンＢＢＢ受容体媒介輸送系によってＢＢＢを通過できる構造を利用する。
Ｂ．ＢＢＢ受容体媒介輸送系に結合する構造
ＣＮＳに対する薬剤を送達するための非侵襲的な１取り組みは、ＢＢＢ上の受容体と結合する構造、例えば、分子に関心のある薬剤を結合させることである。次に、この構造は、ＢＢＢを通過して薬剤を輸送するための媒介物として役立つ。このような構造は、本明細書では「分子版トロイの木馬（ＭＴＨ）」と称する。一般的に、必ずしも必要ではないけれども、ＭＴＨは、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系でＢＢＢを横断する内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系に結合することができる外来ペプチドまたはペプチド様部分（例えば、ＭＡｂ）である。ある実施形態では、ＭＴＨは、輸送系の受容体、例えば、インシュリン受容体に対する抗体であることができる。いくつかの実施形態では、この抗体はモノクローナル抗体（ＭＡｂ）である。いくつかの実施形態では、このＭＡｂはキメラＭＡｂである。したがって、Ａｂは通常脳から排除されるという事実があるにもかかわらず、それらがＢＢＢ上の受容体に特異性を有するならば、分子を脳実質に送達するための効果的な媒体であることができる。
したがって、抗体、とりわけＭＡｂは、本発明の実施形態に特に有用である。ある種の受容体特異的ＭＡｂは、内在性リガンドを模倣して、ＭＴＨとして機能し、特異的受容体系での輸送を介して原形質膜関門を横断することができる。ある種の実施形態では、ＭＴＨはヒトＢＢＢ上のヒトインシュリン受容体（ＨＩＲ）に対するＭＡｂである。ＨＩＲ ＭＡｂは、ヒトＢＢＢ ＨＩＲ上の細胞外表面エピトープに結合し、この結合によって、ＭＡｂは、ヒトＢＢＢインシュリン受容体によって媒介される輸送反応を介してＢＢＢを横断することができる。
「抗体」という用語は、本明細書で使用したように、天然に生じたもの、人工的に誘導されたもの、または組換えのいずれにしても、特異的な免疫反応活性を有する任意の分子を関連して含む。一般的に、必ずしも必要ではないけれども、抗体は２種類の分子を含むタンパク質であり、それぞれの分子が２種類の異なるポリペプチドを有し、短い方が抗体の軽鎖として機能し、長い方のポリペプチドが抗体の重鎖として機能する。通常、本明細書で使用したように、抗体は、重鎖または軽鎖の少なくとも１個の可変領域を含む。さらに、抗体は可変領域の組み合わせを含むことができる。この組み合わせは、１個の軽鎖または１個の重鎖の複数の可変領域を含むことができる。抗体はまた、１個または複数の重鎖の可変領域と組み合わさった１個または複数の軽鎖の可変領域を含むことができる。抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体液性応答の発生によって得られるイムノグロブリン分子であることができ、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を含む。さらに、本発明は、本明細書で記載した抗体の抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖ断片、１個または複数のＣＤＲを含む断片、１本鎖抗体（例えば、１本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ））、ジスルフィド安定化（ｄｓＦｖ）Ｆｖ断片、異種結合抗体（例えば、二特異的抗体）、ｐＦｖ断片、重鎖単量体もしくは二量体、軽鎖単量体もしくは二量体、および１個の重鎖および１個の軽鎖からなる二量体を含む。このような抗体断片は、化学的方法によって、例えば、プロテアーゼ、例えば、ペプシンもしくはパパインによる完全な抗体の切断、または組換えＤＮＡの特性技術によって、例えば、切断型重鎖および／または軽鎖遺伝子で形質転換した宿主細胞を使用して、作製することができる。このような断片を製する合成方法も企図される。重鎖および軽鎖単量体は、完全な抗体を還元剤、例えば、ジチオスレイトールもしくはベータ−メルカプトエタノールで処理することによって、または所望する重鎖もしくは軽鎖またはその両方をコードするＤＮＡで形質転換された宿主細胞を使用することによって、同様に作製することができる。免疫学的に特定の抗原と反応する抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、あるいはファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択などの組換え方法によって作製することができる。
「キメラ」抗体には、異なる哺乳類の組み合わせから得られた抗体が含まれる。哺乳類は、例えば、ウサギ、マウス、ラット、ヤギまたはヒトであってよい。異なる哺乳類の組み合わせには、ヒトおよびマウスを原料とする断片の組み合わせが含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）、一般的にヒトモノクローナル抗体である。このような抗体は、抗原曝露に応答して特異的ヒト抗体を産生するように「操作」されたトランスジェニックマウスから得られる。これらの技術では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の因子を、内在性重鎖および軽鎖遺伝子座を標的とした破壊を含有する胚性幹細胞系由来のマウス種に導入する。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスは、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを作製するために使用することができる。
ヒトにおいて使用するために、ヒトに投与された場合に著しい免疫原性を有さないのに十分なヒト配列を含有するキメラＭＡｂ、例えば、約８０％ヒトおよび約２０％マウス、または約８５％ヒトおよび約１５％マウス、または約９０％ヒトおよび約１０％マウス、または約９５％ヒトおよび５％マウス、または約９５％超ヒトおよび約５％未満マウスが好ましい。本発明で使用するために十分なヒト配列を備えたヒトＢＢＢインシュリン受容体に対するキメラ抗体は、例えば、本明細書に全体を参考として援用したＣｏｌｏｍａ他（２０００）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１７：２６６〜２７４に記載されている。ＨＩＲ ＭＡｂのより高度にヒト化された形態も操作することができ、ヒト化ＨＩＲＭＡｂは、マウスＨＩＲＭＡｂと同程度の活性を有し、本発明の実施形態で使用することができる。本明細書に全体を参考として援用した２００２年１１月２７日出願の米国特許出願公開第２００４１０１９０４号を参照のこと。
本発明で使用する抗体は、グリコシル化されていても、されていなくてもよい。抗体をグリコシル化する場合、抗体の機能に著しい影響を及ぼさないグリコシル化のパターンを使用することができる。グリコシル化は、抗体が生成される細胞に典型的な様式で行うことができ、細胞の種類に応じて変化させることができる。例えば、マウス骨髄腫細胞によって産生されたモノクローナル抗体のグリコシル化パターンは、形質移入されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生されたモノクローナル抗体のグリコシル化パターンとは異なっていてよい。いくつかの実施形態では、抗体は、形質移入されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生されたパターンでグリコシル化される。
したがって、いくつかの実施形態では、所望するレベルのヒト配列を備えた遺伝子的に操作されたＨＩＲ ＭＡｂを、ＢＢＢを通過する輸送が所望される薬剤、例えば、神経治療薬、例えば、ヒトＢＤＮＦなどのニューロトロフィンと融合して、二機能分子である組換え融合タンパク質を作製する。この組換え治療用神経保護因子／ＨＩＲＭＡｂは、（ｉ）ＢＢＢ ＨＩＲ上の輸送によって、ヒトＢＢＢを通過し、（ｉｉ）末梢投与後、脳の内側に一旦入ったら神経治療効果を引き起こすために因子の標的、例えば、ニューロンＢＤＮＦ受容体、ｔｒｋＢを活性化することができる。
ＩＶ．ＢＢＢを通過して輸送するための薬剤
ＢＢＢを通過して輸送することが所望される薬剤は、ＣＮＳに導入するための任意の適切な物質であってよい。一般的に、この薬剤は、ＢＢＢを通過して輸送することが所望され、天然の形態では、有意な量でＢＢＢを通過しない物質である。この薬剤は、例えば、治療薬、診断薬、または研究薬であってよい。診断薬には、ペプチド放射線医薬品、例えば、脳癌を画像診断するための上皮成長因子（ＥＧＦ）（Ｋｕｒｉｈａｒａ ａｎｄ Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ（１９９９）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５４：６１５９〜６１６３）、およびアルツハイマーなど脳アミロイドを画像診断するためのアミロイドペプチド（Ｌｅｅ他（２００２）Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂｏｌ．２２：２２３〜２３１）が含まれる。いくつかの実施形態では、この薬剤は、治療薬、例えば神経治療薬である。ニューロトロフィンの他に、潜在的に有用な治療用タンパク質剤には、リソソーム蓄積症のための組換え酵素（例えば、本明細書に全体を参考として援用した２００５年２月１７日出願の米国特許出願公開第２００５０１４２１４１号）、内在性ペプチドを模倣しているか、または脳障害のために内在性ペプチド、ポリペプチド、例えば、自閉症のためにセクレチンの作用を遮断するモノクローナル抗体（Ｒａｔｌｉｆｆ−Ｓｃｈａｕｂ他（２００５）Ａｕｔｉｓｍ９：２５６〜２６５）、薬物またはアルコール中毒のためのオピオイドペプチド（Ｃｏｗｅｎ他（２００４）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８９：２７３〜２８５）、あるいは食欲制御のための神経ペプチド（Ｊｅｔｈｗａ他（２００５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８９：Ｅ３０１〜３０５）が含まれる。いくつかの実施形態では、この薬剤は、本明細書では「ニューロトロフィン」とも呼ばれる神経栄養因子である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ニューロトロフィンを利用する組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態では、単一のニューロトロフィンを使用できる。その他では、ニューロトロフィンの組み合わせを使用する。いくつかの実施形態では、本発明は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を利用する。
Ａ．ニューロトロフィン
多くの神経栄養因子は、脳において神経を保護するが、血液脳関門を通過できない。これらの因子は、本発明の組成物および方法で使用するために適しており、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−４／５、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２およびその他のＦＧＦ、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン、ペルセフィン、インターロイキン類、顆粒球コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ、ネトリン、カルジオトロフィン−１、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミッドカイン、プレイオトロフィン、骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、セマフォリンおよび幹細胞因子（ＳＣＦ）が含まれる。ＢＢＢを通過する融合タンパク質の前駆体として使用されるニューロトロフィンを利用した本発明のいくつかの実施形態で特に有用なのは、ＢＤＮＦと同様に自然に二量体構造を形成するものである。ＢＤＮＦまたはＮＴ−３などのある種のニューロトロフィンは、異種二量体構造を形成することができ、いくつかの実施形態では、本発明は、抗体、例えば、ＨＩＲＭＡｂの１本目の鎖（例えば、軽鎖または重鎖）に融合した１個のニューロトロフィン単量体および抗体の２本目の鎖（例えば、軽鎖または重鎖）に融合した別のニューロトロフィン単量体から構成された融合タンパク質を提供する。一般的に、分子版トロイの木馬に融合させることができる組換えタンパク質の分子量範囲は、１０００ダルトンから５０００００ダルトンである。
Ｂ．脳由来神経栄養因子
本発明の実施形態で特に有用な１ニューロトロフィンは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である。ＢＤＮＦは、多くの急性および慢性脳疾患において神経保護薬として使用できる強力な神経治療薬である。しかし、ＢＢＢを通過してＢＤＮＦを輸送できないことは、脳および脊髄のための神経治療薬としてこの分子を開発することの妨げとなってきた。
ＢＤＮＦは、急性および慢性脳疾患の治療に有用な神経治療薬である。実験的脳卒中では、ＢＤＮＦを脳内投与すると、神経保護作用がある。全脳虚血では、例えばその後心停止が起こる可能性があり、ＢＤＮＦを脳内に直接投与すると神経保護作用がある。プリオン病、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの慢性神経変性疾患の実験モデルでは、ＢＤＮＦを直接脳内に注射すると神経保護作用がある。
実験的に脳疾患においてＢＤＮＦの薬理学的効果を示す研究では、脳内薬剤送達方法に従ってニューロトロフィンを直接脳に投与することが必要である。この脳内薬剤送達は、ＢＤＮＦが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて血液脳関門（ＢＢＢ）を形成する脳の毛細血管壁を通過しないので必要である。ＢＢＢを通過してＢＤＮＦを輸送することができないので、ＢＢＢを実験的に破壊しなければ、末梢投与後ニューロトロフィンを脳または脊髄を含むＣＮＳに移行させることは不可能である。臨床試験では、ＢＤＮＦの皮下投与が慢性神経変性症状の治療に効果がないのは、ＢＢＢを通過してＢＤＮＦを輸送することができないためであることが示された。末梢投与した後、ＣＮＳ治療薬としてＢＤＮＦを利用できないことは予測通りで、神経治療薬、特にＢＤＮＦなどの高分子薬の開発では、ＢＢＢが担う制限的役割の結果である。ＢＤＮＦは、ＢＢＢを通過せず、ＢＢＢを通過してニューロトロフィンを輸送することができないため、末梢投与した後、分子が脳で薬理学的な活性を生じることができない。ＢＢＢを通過してＢＤＮＦを輸送することができないことは、ＣＮＳで薬理学的に活性を生じるためには、頭蓋骨を通過して、脳内に直接ニューロトロフィンを注入しなければならないことを意味する。しかし、ＢＤＮＦをＨＩＲ ＭＡｂなどのトロイの木馬に融合させると、このニューロトロフィンは、非侵襲的な末梢投与経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、または経口投与によっても、血液から脳に移行させることができる。この新種の分子がＢＢＢを通過する特性のおかげで、頭蓋骨または脊柱管の貫通を必要とする侵襲性の送達方法によってＢＤＮＦを直接ＣＮＳに投与することは必要ない。ＢＤＮＦ変種およびＨＩＲ ＭＡｂを再調製した融合タンパク質は、血液から脳にＢＤＮＦを移行することができ、ヒト疾患の神経治療薬としてＢＤＮＦの開発を可能にする。
本明細書で使用したように、「ＢＤＮＦ」という用語には、薬学的に許容される塩およびプロドラッグ、ならびに塩のプロドラッグ、天然に生じるＢＤＮＦの多形、水和物、溶媒和物、生物学的に活性のある断片、生物学的に活性のある変種および立体異性体、ならびに天然に生じるＢＤＮＦのアゴニスト、模倣物およびアンタゴニスト変種およびそれらのポリペプチド融合物が含まれる。ＢＤＮＦの天然の配列に１個または複数の欠失、置換または挿入を含む変種、特にアミノ末端、カルボキシ末端またはその両方に１個または複数のアミノ酸の欠失を含む天然のＢＤＮＦの切断型変種は、「ＢＤＮＦ」という用語によって包含される。いくつかの実施形態では、本発明は、天然ＢＤＮＦのカルボキシ切断型変種、例えば、ＢＤＮＦのカルボキシ末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１０個を上回るアミノ酸が欠如した変種を使用する。ＢＤＮＦ変種には、融合タンパク質変種が高い親和性で脳神経保護受容体にまだ結合する限り、アミノ酸１１９個の完全なＢＤＮＦ、カルボキシル末端が切断されたアミノ酸１１７または１１８個の変種、アミノ末端が切断された変種、またはアミノ酸組成の約２０、３０もしくは４０％までが変化している変種が含まれる。Ａｂ、例えば、ＨＩＲＭＡｂなどのＭＡｂを使用する場合、融合タンパク質が内在性受容体、例えば、ＨＩＲに高親和性で結合して、ヒトＢＢＢを通過する輸送を促進する限り、Ａｂ、例えば、ＨＩＲＭＡｂの軽鎖もしくは重鎖のいずれかのフレームワーク領域（ＦＲ）または相補性決定領域（ＣＤＲ）内のアミノ酸が置換された他の融合タンパク質変種を作製することができる。他の融合タンパク質変種は、組成物またはＨＩＲＭＡｂから融合タンパク質を分離するリンカーペプチドの長さを変化させることによって作製することができる。
いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦの完全長アミノ酸１１９個配列（配列番号３９）が利用される。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦのカルボキシの１個のアミノ酸が切断された変種（配列番号３９のアミノ酸１〜１１８）が利用される。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦのカルボキシの２個のアミノ酸が切断された変種（配列番号３９のアミノ酸１〜１１７）が利用される。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦのカルボキシの３個のアミノ酸が切断された変種（配列番号３９のアミノ酸１〜１１６）が利用される。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦのカルボキシの４個のアミノ酸が切断された変種（配列番号３９のアミノ酸１〜１１５）が利用される。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦのカルボキシの５個のアミノ酸が切断された変種（配列番号３９のアミノ酸１〜１１４）が利用される。
ヒトＢＤＮＦの配列を配列番号３９に示す。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３９の配列と約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一であるＢＤＮＦ、またはそれらの切断型変種、例えば、１個または２個のアミノ酸が切断されたカルボキシル末端を有するアミノ酸１１７個もしくは１１８個の変種、あるいは切断されたアミノ末端を有する変種を利用する。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２の配列と少なくとも約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一な配列を備えた、アミノ酸２個が切断されたカルボキシ切断型のアミノ酸１１７個のヒトＢＤＮＦ変種を利用する。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２を含む配列を備えた、アミノ酸が２個切断されたカルボキシル切断型のアミノ酸１１７個のヒトＢＤＮＦを利用する。
したがって、本発明に有用なＢＤＮＦには、本明細書で開示したアミノ酸配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または９５％超または９９％超、例えば、１００％の配列同一性を有するペプチドが含まれる。
パーセント配列同一性は、従来の方法によって測定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏ．４８：６０３（１９８６）、およびＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９９２）を参照のこと。簡単に説明すると、ギャップ開始ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ１およびＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（前述）の「ＢＬＯＳＵＭ６２」スコアリングマトリクスを使用して、アラインメントスコアを最適化するために、２個のアミノ酸配列を整列される。次に、パーセント同一性は、（［同一マッチの総数］／［長い配列の長さおよび２個の配列を整列されるために長い配列に導入されたギャップの数］）（１００）として算出する。
当業者であれば、２個のアミノ酸配列を整列されるために利用できる多くの確立されたアルゴリズムがあることは理解している。Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎの「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書で開示したアミノ酸配列および別のペプチドのアミノ酸配列によって共有される同一性のレベルを調べるために適切なタンパク質アラインメント法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）およびＰｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）によって記載されている。簡単に説明すると、ＦＡＳＴＡは最初に、保存的アミノ酸置換、挿入または欠失を考慮せずに、検索配列（例えば、配列番号２４または配列番号３９）および最高密度の一致（ｋｔｕｐ値が１の場合）または対の一致（ｋｔｕｐ＝２の場合）のいずれかを有する試験配列によって共有される領域を同定することによって配列類似性を特徴付ける。次に、１０個の最高密度の一致領域を、アミノ酸置換マトリクスを使用して全対のアミノ酸の類似性を比較することによって再評価し、領域の末端を「整える」ことによって最高スコアに関与する残基のみを含むようにする。「カットオフ」値（配列の長さおよびｋｔｕｐ値をベースにした予め決定した式によって計算）を上回るスコアを有するいくつかの領域がある場合、ギャップを有する近似アラインメントを形成するためにこれらの領域を結合させることができるかどうかを決定するために、整えた最初の領域を調べる。最後に、２個のアミノ酸配列のスコアが最高の領域を、アミノ酸の挿入および欠失が可能なＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ−Ｓｅｌｌｅｒｓアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４（１９７０）、Ｓｅｌｌｅｒｓ、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２６：７８７（１９７４））の変法を使用して整列させる。ＦＡＳＴＡ分析のパラメータの例は、ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開放ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝１および置換マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。これらのパラメータは、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）の付録２に説明されているように、スコアリングマトリクスファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を変更することによってＦＡＳＴＡプログラムに導入することができる。
本発明はまた、本明細書で開示したアミノ酸配列と比較して、保存的アミノ酸変化を有するペプチドを含む。多くのこのような変化は具体的に記載されてきた。より一般的には、例えば、配列番号３３の１個または複数のアミノ酸置換を含有する変種、またはその切断型変種、例えば、配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２を得ることができる。これらの変種では、例えば、アルキルアミノ酸は、ＢＤＮＦペプチドアミノ酸配列のアルキルアミノ酸と置換され、芳香族アミノ酸は、ＢＤＮＦペプチドアミノ酸配列の芳香族アミノ酸と置換され、硫黄含有アミノ酸は、ＢＤＮＦペプチドアミノ酸配列の硫黄含有アミノ酸と置換され、ヒドロキシ含有アミノ酸は、ＢＤＮＦペプチドアミノ酸配列のヒドロキシ含有アミノ酸と置換され、酸性アミノ酸は、ＢＤＮＦペプチドアミノ酸配列の酸性アミノ酸と置換され、塩基性アミノ酸はＢＤＮＦペプチドアミノ酸配列の塩基性アミノ酸と置換され、または二塩基性モノカルボキシリックアミノ酸は、ＢＤＮＦペプチドアミノ酸配列の二塩基性モノカルボキシリックアミノ酸と置換される。共通アミノ酸の中でも、例えば、「保存的アミノ酸置換」は、以下の群、（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン、（３）セリンおよびトレオニン、（４）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（５）グルタミンおよびアスパラギン、および（６）リシン、アルギニンおよびヒスチジンのそれぞれの中のアミノ酸間の置換によって例示される。ＢＬＯＳＵＭ２表は、タンパク質配列部分の約２０００個の局所マルチプルアラインメントから得られたアミノ酸置換マトリクスであり、５００個を上回る関連タンパク質群の保存性の高い領域を表している（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９９２））。したがって、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度は、本発明のアミノ酸配列に導入することができる保存的アミノ酸置換を限定するために使用することができる。化学特性だけに基づいてアミノ酸置換を設計することは可能であるが（前述の通り）、「保存的アミノ酸置換」という用語は、−１を上回るＢＬＯＳＵＭ６２値によって表される置換を意味することが好ましい。例えば、アミノ酸置換は、その置換がＢＬＯＳＵＭ６２値０、１、２または３を特徴とするならば、保存的である。このシステムに従って、好ましい保存的アミノ酸置換の特徴は、ＢＬＯＳＵＭ６２値が少なくとも１（例えば、１、２または３）であり、より好ましい保存的アミノ酸置換の特徴は、ＢＬＯＳＵＭ６２値が少なくとも２（例えば、２または３）である。
アミノ酸配列は、他の残基、例えば、追加的Ｎ−またはＣ−末端アミノ酸を含んでいてよく、配列が本発明の組成物および方法において機能を果たすために十分な生物学的タンパク質活性を保持する限り、まだ本質的に本明細書で開示した配列の１つで記載した通りであることも理解されたい。
Ｖ．組成物
本発明の組成物は、陽イオン化合物の血清半減期の延長、ＢＢＢを通過する薬剤の輸送、および／またはＢＢＢを通過して一旦輸送された薬剤の活性の保持の１種または複数において有用である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる構造に共有結合した神経治療薬を含有する組成物であって、末梢投与後、脳内の神経治療薬の濃度を平均して少なくとも約１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０または５０ｎｇ／グラム脳上昇させることができる組成物を提供する。本発明はまた、ヒトＢＢＢインシュリン受容体に対するキメラＭＡｂに共有結合した薬剤を含有する組成物を提供する。本発明はさらに、中枢神経系（ＣＮＳ）で活性のあるペプチドに共有結合した、ＢＢＢを通過することができる構造を含有する融合タンパク質であって、血液脳関門を通過できる構造および中枢神経系で活性のあるペプチドはそれぞれ、別々の実体としての活性と比較して、平均してそれらの活性の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％を保持している融合タンパク質を提供する。ある種の実施形態では、本発明はさらに、陽イオン物質の血清半減期を延長する組成物を提供する。本発明はまた、本発明の１個または複数の組成物および薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる構造に共有結合した神経治療薬を含有する組成物であって、末梢投与後、脳内の神経治療薬の濃度を平均して少なくとも約１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０または５０ｎｇ／グラム脳上昇させることができる組成物を提供する。
薬剤の「上昇」とは、単独で投与された（すなわち、ＢＢＢを通過することができる構造に共有結合していない）薬剤の濃度と比較した薬剤の脳内での濃度の増加である。薬剤単独の少量のみが通常ＢＢＢを通過する薬剤の場合、「上昇」は、一定の脳レベルと比較して、薬剤の増加であってよい。「平均」とは、好ましくは異なる個体における少なくとも３、４、５または５個を上回る測定の平均のことである。上昇を測定する個体は、哺乳類、例えば、ラット、または、好ましくは、霊長類、例えば、サルである。神経治療薬（ＢＤＮＦ）のレベルの上昇の測定の一例を実施例７に示す。
いくつかの実施形態では、ＢＢＢを通過することができる構造は、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系、例えば、インシュリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、ＬＤＬ受容体またはＩＧＦ受容体を利用する系を利用する。いくつかの実施形態では、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系は、インシュリンＢＢＢ受容体媒介輸送系である。いくつかの実施形態では、ＢＢＢを通過することができる構造は、抗体、例えば、キメラＭＡｂなどのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）である。この抗体は、ヒトへの投与に適した十分なヒト配列を備えたキメラ抗体であってよい。抗体は、グリコシル化または非グリコシル化されていてよく、いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、ＣＨＯ細胞においてその合成によって形成されたグリコシル化パターンで、グリコシル化されている。この構造が抗体である実施形態では、抗体と神経治療薬との間の共有結合は、抗体−薬剤融合物が血液脳関門を通過するのを可能にして、神経治療薬がＣＮＳ内においてその活性の治療上有用な部分を保持している限り、抗体の任意の適切な部分と神経治療薬との間の結合であってよい。ある実施形態では、共有結合は、抗体の１本または複数の軽鎖と神経治療薬との間である。ペプチド神経治療薬（例えば、ＢＤＮＦなどのニューロトロフィン）の場合、ペプチドは、そのカルボキシまたはアミノ末端によって抗体の軽鎖（ＬＣ）または重鎖（ＨＣ）のカルボキシまたはアミノ末端に共有結合させることができる。任意の適切な結合、例えば、軽鎖のカルボキシ末端からペプチドのアミノ末端、重鎖のカルボキシ末端からペプチドのアミノ末端、軽鎖のアミノ末端からペプチドのアミノ末端、重鎖のアミノ末端からペプチドのアミノ末端、軽鎖のカルボキシ末端からペプチドのカルボキシ末端、重鎖のカルボキシ末端からペプチドのカルボキシ末端、軽鎖のアミノ末端からペプチドのカルボキシ末端、または重鎖のアミノ末端からペプチドのカルボキシ末端を使用することができる。いくつかの実施形態では、この結合は、ＨＣのカルボキシ末端からペプチドのアミノ末端である。末端アミノ酸の間の結合は必要ではなく、本発明の必要性に合致する任意の結合を使用でき、ペプチドの非末端アミノ酸の間のこのような結合は、当業者によって容易に実施されることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、本発明は、天然型または切断変種のいずれかのＢＤＮＦを利用する。すばらしいことに、ＢＤＮＦのこれらの型の融合タンパク質は完全な輸送および活性を保持していることが発見された。ニューロトロフィンは細胞内でｉｎ ｖｉｖｏにおいてプレプロ型として翻訳され、プレプロ−ＢＤＮＦは次に、ＢＤＮＦのアミノ末端からプレプロペプチドが切断されてから成熟ＢＤＮＦに変換されるので、これは驚くべきことである。ＢＤＮＦのプレプロ型およびプレプロペプチドのその後の切断の可能性を保存するために、プレプロＢＤＮＦを標的ＭＡｂのＨＣまたはＬＣのいずれかのアミノ末端に融合させることが必要と思われる。ＭＡｂの抗原結合部位を含むＭＡｂ分子の重鎖または軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端近くに配置されているので、これによって、標的抗原にＭＡｂが結合するのを阻害することができた。したがって、抗体鎖のアミノ末端へのプレプロニューロトロフィンの融合は、抗体活性を弱めるだけでなく、翻訳後の抗体の折りたたみを損なうことも予測される。本発明は、ニューロトロフィン、例えば、ＢＤＮＦ変種（ｖＢＤＮＦ）の成熟型をＨＩＲ ＭＡｂの重鎖のカルボキシル末端に融合させることができるという予期せぬ発見を示している。この新たな遺伝子操作融合タンパク質の産生によって、ＨＩＲおよびｔｒｋＢ受容体の両方に高い親和性で結合する二機能性分子が創出される。
いくつかの実施形態では、同じ神経治療薬の複数の分子がＢＢＢを通過する構造に結合している。例えば、１個のニューロトロフィンが抗体に結合している本発明の組成物では、ニューロトロフィンの１個の分子が各重鎖に結合しており、ホモ二量体形成に理想的な構造が自然に生成される。これは、ＢＤＮＦを含有する組成物の場合である。ＢＤＮＦなどのニューロトロフィンは、生物学的活性があり、コグネイト受容体、例えば、ｔｒｋＢに高い親和性で結合するホモ二量体構造を強制的に形成することが必要である。図１８に例示したように、２個のＢＤＮＦ分子の間で天然に生じるホモ二量体構造は、ニューロトロフィンがＩｇＧ分子のＣＨ３領域のカルボキシル末端に融合された場合に形成される。理論に結びつけはしないが、ＩｇＧに結合した場合、ＢＤＮＦの活性の本質的に１００％が予期せず見いだされたことは、これによって説明することができると考えられる（例えば、図２４参照）。
いくつかの実施形態では、神経治療薬の複数の種類を、血液脳関門を通過できる構造に結合させることができる。いくつかの実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１０個を上回る様々な神経治療薬を、血液脳関門を通過できる構造に結合させることができる。ある実施形態では、２種の異なるニューロトロフィンを、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系に対する抗体に結合させる。ニューロトロフィンの組み合わせを使用することができる。本発明のいくつかの実施形態で特に有用なのは、ＢＢＢを通過する融合タンパク質の前駆体として使用されるニューロトロフィンで、ＢＤＮＦと同様に自然に二量体構造を形成するものである。ＢＤＮＦまたはＮＴ−３などのある種のニューロトロフィンは、異種二量体構造を形成することができ、いくつかの実施形態では、本発明は抗体、例えば、ＨＩＲＭＡｂの１本目の鎖（例えば、重鎖）に融合した１個のニューロトロフィン単量体および抗体の２本目の鎖に融合した別のニューロトロフィン単量体から構成された融合タンパク質を提供する。一般的に、分子版トロイの木馬に融合させることができる組換えタンパク質の分子量範囲は、１０００ダルトンから５０００００ダルトンである。
いくつかの実施形態では、ＢＢＢを通過できる構造の複数の種類、例えば、分子版トロイの木馬を使用できる。様々な構造は、単一の神経治療薬、例えば、ＢＤＮＦなどの単一のニューロトロフィン、または複数の神経治療薬、例えば、複数のニューロトロフィン、またはそれらの任意の組み合わせに共有結合させることができる。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、各ＭＴＨに同一のニューロトロフィンを結合させるか、または様々なニューロトロフィンを結合させるか、またはニューロトロフィンの組み合わせを結合させる。したがって、神経保護組換えタンパク質は、インシュリン受容体、トランスフェリン受容体、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、または低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体に対するモノクローナル抗体あるいはインシュリン、トランスフェリン、ＩＧＦまたはＬＤＬを含む内在性リガンドを含む、血液脳関門を通過して受容体媒介輸送される複数の分子版トロイの木馬に融合させることができる。吸収性媒介輸送によって血液脳関門を横断するリガンドはまた、陽イオンタンパク質、または膜レクチンに結合する炭水化物を備えたタンパク質を含む分子版トロイの木馬として使用できる。分子版トロイの木馬の分子量範囲は、１０００ダルトンから５０００００ダルトンである。
ＢＢＢを通過できる構造と神経治療薬との間の共有結合は、直接的（例えば、１ペプチドの末端アミノ酸と、それが結合したその他のペプチドの末端アミノ酸との間のペプチド結合）であるか、またはリンカーを介して間接的であってよい。リンカーを使用する場合、任意の適切なリンカー、例えば、ペプチドリンカーであってよい。ペプチドリンカーを使用する場合、アミノ酸長は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０を上回ってよい。いくつかの実施形態では、３個のアミノ酸リンカーを使用する。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列ｓｅｒ−ｓｅｒ−ｍｅｔである。共有結合は切断可能であってよいが、いくつかの実施形態では、切断はその系の活性には必要ではなく、実際に、本発明のこれらの実施形態の利点は、融合タンパク質は、切断されなくても、ＢＢＢを一旦通過すると、輸送と活性の両方について部分的に、または完全に活性を有することである。
いくつかの実施形態では、非共有結合を使用できる。ＭＴＨ、例えば、ＭＡｂの高分子治療用神経保護因子への非共有的結合の一例は、アビジン／ストレプトビオチン結合である。このような取り組みはさらに、本明細書に全体を参考として援用した、２００５年４月２１日出願の米国特許出願第１０／８５８７２９号、表題「薬剤送達用汎用ベクターとしての抗成長因子受容体アビジン融合タンパク質」に記載されている。
神経治療薬は、任意の適切な神経治療薬、例えば、ニューロトロフィンであってよい。いくつかの実施形態では、神経治療薬は、ニューロトロフィン、例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−４／５、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２およびその他のＦＧＦ、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン、ペルセフィン、インターロイキン類、顆粒球コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ、ネトリン、カルジオトロフィン−１、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミッドカイン、プレイオトロフィン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、セマフォリンまたは幹細胞因子（ＳＣＦ）である。いくつかの実施形態では、ニューロトロフィンはＢＤＮＦである。ＢＤＮＦは、天然ＢＤＮＦまたはＢＤＮＦ変種であってよい。いくつかの実施形態では、２アミノ酸カルボキシル切断型ＢＤＮＦを利用する。ＢＤＮＦは、ヒトＢＤＮＦであってよい。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦは、配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２の配列と少なくとも約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一である配列を含有する。
いくつかの実施形態では、本発明はＢＢＢを通過できる構造に共有結合した神経治療薬を含有する組成物であって、末梢投与後、脳内の神経治療薬の濃度を平均して少なくとも約１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０または５０ｎｇ／グラム上昇させることができ、神経治療薬がニューロトロフィンであり、ＢＢＢを通過できる構造が内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系に対するＭＡｂである組成物を提供する。抗体は、グリコシル化または非グリコシル化されていてよく、いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、ＣＨＯ細胞においてその合成によって形成されたグリコシル化パターンで、グリコシル化されている。ある種の実施形態では、ニューロトロフィンは、ＢＤＮＦ、例えば、２アミノ酸カルボキシ切断型ＢＤＮＦである。ＭＡｂは、インシュリンＢＢＢ受容体媒介輸送系に対する抗体、例えば、キメラＭＡｂであってよい。この抗体は、ヒトへの投与に適した十分なヒト配列を備えたキメラ抗体であってよい。いくつかの実施形態では、インシュリン受容体は、ヒトインシュリン受容体であり、ＢＤＮＦはヒトＢＤＮＦである。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦは、配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２の配列と約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一である配列を含有する。ＢＤＮＦは、そのアミノ末端で重鎖のカルボキシ末端に、所望により、末端間にリンカー、例えば、アミノ酸３個のリンカーｓｅｒ−ｓｅｒ−ｍｅｔをはさんで共有結合することができる。いくつかの実施形態では、ＭＡｂの重鎖は、配列番号２４のアミノ酸２０〜４６２と約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一である配列を含有する。いくつかの実施形態では、ＭＡｂの軽鎖は、配列番号３６のアミノ酸２１〜２３４と約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一である配列を含有する。
いくつかの実施形態では、本発明は、融合ＭＡｂを含有する組成物であって、この融合ＭＡｂが２アミノ酸カルボキシ切断型ヒトＢＤＮＦに結合したヒトインシュリンＢＢＢ受容体媒介輸送系に対する抗体である組成物を提供する。ＢＤＮＦは、そのアミノ末端を介して、抗体の重鎖のカルボキシ末端にｓｅｒ−ｓｅｒ−ｍｅｔリンカーによって結合している。この抗体は、ヒトへの投与に適した十分なヒト配列を備えたキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、本発明は、重鎖−ＢＤＮＦ融合物を備えた融合ＭＡｂを含有する組成物であって、前記融合ＭＡｂ軽鎖が、配列番号３６のアミノ酸配列２１〜２３４に少なくとも約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％または約９９％同一であるか、または実質的に１００％同一であり、前記重鎖−ＢＤＮＦ融合物が、配列番号２４のアミノ酸２０〜５８２に少なくとも約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％または約９９％同一であるか、または実質的に１００％同一である組成物を提供する。
本発明はまた、ヒトＢＢＢインシュリン受容体に対するキメラＭＡｂに共有結合した薬剤を含有する組成物を提供する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質を形成するために、ＭＡｂの重鎖を薬剤に共有結合させる。薬剤は、本明細書で記載した任意の薬剤であってよく、すなわち、ＢＢＢを通過して輸送するための任意の薬剤が望ましい。いくつかの実施形態では、この薬剤は、治療薬、例えば、本明細書で記載した神経治療薬、例えばＢＤＮＦなどのニューロトロフィンである。ある実施形態では、ＢＤＮＦは、２アミノ酸カルボキシル末端切断型ＢＤＮＦである。
驚くべきことに、本発明の多機能融合タンパク質、例えば、２機能性融合タンパク質は、別々の部分、例えば、ＢＢＢを通過できる部分およびＣＮＳで活性のある部分の活性を高い割合で保持していることが発見された。したがって、本発明はさらに、中枢神経系（ＣＮＳ）で活性のあるペプチドと共有結合した、ＢＢＢを通過することができる構造を含有する融合タンパク質であって、前記血液脳関門を通過できる構造および中枢神経系で活性のある前記ペプチドがそれぞれ、別々の実体としての活性と比較して、平均してそれらの活性の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％を保持している融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）で活性のあるペプチドと共有結合した、ＢＢＢを通過することができる構造を含有する融合タンパク質であって、前記血液脳関門を通過できる構造および中枢神経系で活性のある前記ペプチドがそれぞれ、別々の実体としての活性と比較して、平均してそれらの活性の少なくとも約５０％を保持している融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）で活性のあるペプチドと共有結合した、ＢＢＢを通過することができる構造を含有する融合タンパク質であって、前記血液脳関門を通過できる構造および中枢神経系で活性のある前記ペプチドがそれぞれ、別々の実体としての活性と比較して、平均してそれらの活性の少なくとも約６０％を保持している融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）で活性のあるペプチドと共有結合した、ＢＢＢを通過することができる構造を含有する融合タンパク質であって、前記血液脳関門を通過できる構造および中枢神経系で活性のある前記ペプチドがそれぞれ、別々の実体としての活性と比較して、平均してそれらの活性の少なくとも約７０％を保持している融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）で活性のあるペプチドと共有結合した、ＢＢＢを通過することができる構造を含有する融合タンパク質であって、前記血液脳関門を通過できる構造および中枢神経系で活性のある前記ペプチドがそれぞれ、別々の実体としての活性と比較して、平均してそれらの活性の少なくとも約８０％を保持している融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）で活性のあるペプチドと共有結合した、ＢＢＢを通過することができる構造を含有する融合タンパク質であって、前記血液脳関門を通過できる構造および中枢神経系で活性のある前記ペプチドがそれぞれ、別々の実体としての活性と比較して、平均してそれらの活性の少なくとも約９０％を保持している融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、血液脳関門を通過できる構造は、別々の実体としての活性と比較して、その活性の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％を保持しており、中枢神経系において活性のあるペプチドは、別々の実体としての活性と比較して、その活性の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％を保持している。
本明細書で使用したように、「活性」には、生理学的活性（例えば、ＢＢＢを通過する能力および／または治療活性）が含まれ、構造のそれぞれの受容体に対する結合親和性も含まれる。
ＢＢＢを通過できる構造のＢＢＢを通過する輸送は、標準的方法によって、単独の構造および本発明の融合構造の一部としての構造と比較することができる。例えば、モデル動物、例えば、霊長類などの哺乳類による融合構造、例えば、融合タンパク質の薬物動態および脳への取り込みを使用することができる。このような技術は、薬物動態および成体アカゲザルによる本発明の融合タンパク質の脳への取り込みを示した実施例７に例示されている。同様に、薬剤単独の機能と本発明の融合構造の一部としての薬剤の機能とを比較するために、薬剤の機能、例えば、治療薬の治療機能または予防機能の標準的モデルも使用することができる。例えば、ニューロトロフィン単独および融合タンパク質に結合させた同じニューロトロフィンの活性をモデル系（ヒト神経細胞における低酸素症−再酸素化）において示した実施例５を参照のこと。実施例５および実施例７の両方では、本発明の融合タンパク質は、個々の成分、すなわち、ＢＢＢを通過できる構造（ヒトインシュリン受容体に対するＭＡｂ）および治療薬（ＢＤＮＦ）の輸送能力および治療機能の約１００％保持していた。
あるいは、受容体に対する結合親和性を、活性のマーカーとして使用することができる。受容体に対する結合親和性を、構造単独の場合と、融合タンパク質の一部の場合の構造の場合とを比較する。結合親和性測定法の適切な種類は、競合リガンド結合測定法（ＣＬＢＡ）である。例えば、ニューロトロフィンに融合した内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系に対するＭＡｂを含有する融合タンパク質では、ＣＬＢＡは、融合タンパク質の一部として、または別々の実体として、ＭＡｂのその受容体に対する親和性およびニューロトロフィンのその受容体に対する親和性の両方を測定するために使用することができ、親和性の割合を算出する。いくつかの実施形態におけるように、ＣＮＳで活性のあるペプチドのイオン性、例えば、陽イオン性が強く、程度の強い非特異的結合を引き起こす場合、非特異的結合を排除するために適切な測定法を採用すべきである。例えば、実施例４を参照のこと。「平均」測定値は、少なくとも３つの別々の測定値の平均である。
前記の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、血液脳関門を通過することができる構造は、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送体、例えば、インシュリン輸送体、トランスフェリン輸送体、レプチン輸送体、ＬＤＬ輸送体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択された輸送体上でＢＢＢを通過する。いくつかの実施形態では、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送体は、インシュリン輸送体またはトランスフェリン輸送体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送体は、インシュリン輸送体、例えば、ヒトインシュリン輸送体である。ＢＢＢを通過できる構造は、抗体、例えば、キメラＭＡｂなどのＭＡｂである。抗体は、本明細書で記載したように、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送体に対する抗体である。ＣＮＳで活性のあるペプチドは、神経治療薬、例えば、ニューロトロフィンであってよい。いくつかの実施形態では、ニューロトロフィンは、脳由来神経栄養因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−４／５、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２およびその他のＦＧＦ、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン、ペルセフィン、インターロイキン類、顆粒球コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ、ネトリン、カルジオトロフィン−１、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミッドカイン、プレイオトロフィン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、セマフォリンまたは幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ニューロトロフィンは、切断型ＢＤＮＦなどのＢＤＮＦ、例えば、カルボキシ切断型ＢＤＮＦである。カルボキシル切断型ＢＤＮＦは、いくつかの実施形態では２個のカルボキシル末端アミノ酸を欠如している。ＢＢＢを通過できる構造および神経治療薬は、いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーによって共有結合している。
ある種の実施形態では、本発明は、陽イオン物質の血清半減期を延長する組成物を提供する。現在の多くの治療薬、特に陽イオン治療用ペプチド（例えば、ＢＤＮＦ）の１つの限界は、循環系から速やかに排泄されることである。陽イオン物質、例えば、陽イオンペプチドの正電荷は、細胞膜の負電荷と迅速に相互作用し、細胞内、特に肝臓および脾臓への吸収性媒介エンドサイトーシスの引き金となる。これは、神経治療薬だけでなく（迅速な排泄がＢＢＢとの接触のみを制限し、そうしてＢＢＢを通過する能力を制限することを意味する）、その他の薬剤、例えば、ｔａｔペプチドなどの陽イオン性の移入ペプチド、または核酸に結合する陽イオンタンパク質（例えば、プロタミン、ポリリシン、ポリアルギニン）またはビオチン化薬剤に結合するアビジンなどの陽イオンタンパク質にとっても事実である。驚くべきことに、イムノグロブリンに共有結合した陽イオン治療用ペプチドを含む本発明の融合組成物は、融合イムノグロブリンの共有部分とはなっていない同様のペプチドと比較して血清半減期を非常に増強させることが示されている。強い陽イオン性のタンパク質、例えば、ＢＤＮＦのイムノグロブリン、例えば、ＨＩＲＭＡｂへの融合は、２つの重要で、予期できない効果、１）陽イオンタンパク質の血清半減期を非常に増強する効果、２）結合したイムノグロブリンの血液クリアランスを加速しないことを有する効果を有することが示されたので、これは重要な発見である。予備研究によって、ＢＤＮＦの陽イオン性によって、陽イオン治療用ペプチド、例えば、陽イオンＢＤＮＦのモノクローナル抗体への非共有結合が、抗体の血液クリアランスを非常に加速し、肝臓での取り込みの非常に促進することが示されている。図２７Ａおよび実施例７の実験は、陽イオン治療用ペプチド、例えば、ＢＤＮＦはＩｇＧ融合タンパク質として再度操作されると、血漿での薬物動態がＩｇＧ部分によって支配され、ＢＤＮＦの血液レベルが長期間高く維持され、実際に、融合タンパク質中のＢＤＮＦの血清半減期がＢＤＮＦ単独の場合の少なくとも約１００倍となることを示している。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、イムノグロブリンに共有結合した陽イオン治療用ペプチドを含む組成物であって、この組成物中の陽イオン治療用ペプチドの血清半減期が、陽イオン治療用ペプチド単独の血清半減期の、平均して少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００であるか、または約１００倍を上回る組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、イムノグロブリンに共有結合した陽イオン治療用ペプチドを含む組成物であって、この組成物中の陽イオン治療用ペプチドの血清中の平均滞留時間（ＭＲＴ）が、陽イオン治療用ペプチド単独の血清半減期よりも平均して少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍であるか、または約１００倍を上回る組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、イムノグロブリンに共有結合した陽イオン治療用ペプチドを含む組成物であって、この組成物中の陽イオン治療用ペプチドの全身クリアランス速度が、陽イオン治療用ペプチド単独の全身クリアランス速度よりも平均して少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍であるか、または約１００倍を上回る組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、イムノグロブリンに共有結合した陽イオン治療用ペプチドを含む組成物であって、この組成物中の陽イオン治療用ペプチドの末梢投与後の平均血液レベルが、陽イオン治療用ペプチド単独を末梢投与後の平均血液レベルの、平均して少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍であるか、または約１００倍を上回る組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、この陽イオン治療用ペプチドは、神経治療薬を含む。陽イオンペプチドである神経治療薬の例は、インターフェロン、インターロイキン、サイトカイン、または等電点（ｐＩ）が８を上回る成長因子である。いくつかの実施形態では、この神経治療薬は、ニューロトロフィンである。陽イオンペプチドニューロトロフィンには、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５、ＮＧＦおよびＦＧＦ−２が含まれる。いくつかの実施形態では、このニューロトロフィンはＢＤＮＦである。
いくつかの実施形態では、イムノグロブリンは、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系に対する抗体である。いくつかの実施形態では、この内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系は、インシュリンＢＢＢ輸送系、ＢＢＢトランスフェリン受容体、ＢＢＢレプチン受容体、ＢＢＢ ＩＧＦ受容体、またはＢＢＢリポタンパク質受容体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗体は、内在性インシュリンＢＢＢ受容体媒介輸送系に対する抗体である。抗体は、本明細書で記載したような任意の適切な抗体であってよい。
医薬組成物。本発明はまた、本発明の１個または複数の組成物および薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物を提供する。薬学的に許容される担体／賦形剤の十分な検討は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ、ＡＲ編、第２０版、２０００：Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ ＰＡ、ＵＳＡに見いだすことができる。本発明の医薬組成物には、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内注射、経口、直腸、頬膜貫通、肺、経皮、鼻腔内および末梢投与に適したその他の経路を含む任意の末梢経路によって投与するために適した組成物が含まれる。
本発明の組成物は、注射、例えば、静脈内、皮下、筋肉内または腹腔内投与のための医薬組成物として特に適している。本発明の水性組成物には、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散させることができる本発明の組成物の有効量が含まれる。「薬学的に、または薬理学的に許容できる」という用語は、適切であれば、動物、例えば、ヒトに投与された場合に有害な、アレルギー性またはその他の望ましくない反応を生じない分子体および組成物のことである。本明細書で使用したように、「薬学的に許容される担体」には、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張薬および吸収遅延剤などのいずれかまたは全てが含まれる。薬学的に活性のある物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当業界では周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分に不適合である場合を除いて、治療組成物中におけるその使用は企図される。補助的な活性成分も組成物に組み入れることができる。
注射可能な組成物のための薬学的に許容される担体の例には、例えば、無機酸塩、例えば、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など、および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などが含まれる。例えば、本発明の組成物は、液体の形態で提供することができ、ｐＨを変化させた（５〜８）生理的食塩水をベースにした水性溶液中で、ポリソルベート−８０などの界面活性剤０．０１〜１％、またはマンニトール、ソルビトールもしくはトレハロースなどの炭水化物添加物を含めるか、または含めないで、製剤化することができる。通常使用する緩衝液には、ヒスチジン、酢酸塩、リン酸塩またはクエン酸塩が含まれる。通常の保存および使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防御するために保存剤を含有することができる。微生物作用の防御は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。
ヒト投与の場合、調製物は、ＦＤＡおよびその他の管理機関の基準によって必要とされる無菌性、発熱原性、一般的安全性および純度基準を満たす。活性化合物は一般的に、非経口投与用に製剤化され、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、病巣内または腹腔内経路によって注射するために製剤化される。活性成分または要素を含有する水性組成物の調製は、本発明の開示に照らし合わせれば当業者にはわかるであろう。一般的に、このような組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかの注入物質として調製することができ、注射前に液体を添加することによって溶液または懸濁液を調製して使用するために適した固形にも調製することができ、調製物は乳化することもできる。
滅菌注射溶液は、上記に列挙した様々なその他の成分を含む適切な溶媒に活性化合物を必要な量で取り入れ、必要であれば、その後濾過滅菌することによって調製する。一般的に、分散物は、様々な滅菌活性成分を、基礎分散培地および上記に列挙したものの必要なその他の成分を含有する滅菌媒体に取り入れることによって調製する。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製方法には、既に濾過滅菌したそれらの溶液から活性成分および任意の他の所望する成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥技術が含まれる。
製剤化されてから、溶液は、投与製剤に適合した方法で、治療上有効であるような量で投与される。製剤は、様々な剤形で、例えば、前述の注射溶液の形式で容易に投与されるが、薬剤放出カプセルなども使用することができる。
「単位用量」という用語は、対象に使用するために適した単位を物理的に分離された単位を意味し、各単位は、投与、すなわち、適切な経路および治療計画に関連して、前述した所望する応答を生じるために計算された医薬組成物の予め決定された量を含有する。投与する量は、治療の数および単位用量の両方に従って、治療する対象、対象の状態および所望する防御に左右される。いずれにしても、投与に関与する人が、個々の対象のために適切な用量を決定する。
活性のある治療薬は、用量当たり約０．０００１から１．０ミリグラム、または約０．００１から０．１ミリグラム、または約１．０から１００ミリグラムまたは約０．０１から１．０グラムなども含むように混合物中に処方することができる。複数用量も投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質の約２．５から約２５ｍｇ、例えば、ＢＤＮＦおよびＨＩＲＭＡｂの融合タンパク質の約２．５から約２５ｍｇの投与量をヒトに対して投与するための単位用量として使用する。
非経口投与、例えば、静脈内または筋肉内注射のために製剤化した化合物に加えて、限定はしないが、皮内投与（米国特許第５９９７５０１号、第５８４８９９１号および第５５２７２８８号を参照）、肺投与（米国特許第６３６１７６０号、第６０６００６９号および第６０４１７７５号参照）、頬投与（米国特許第６３７５９７５号および第６２８４２６２号参照）、経皮投与（米国特許第６３４８２１０号および第６３２２８０８号参照）および経粘膜投与（米国特許第５６５６２８４号参照）を含む本発明のその他の代替投与法も使用できる。このような投与法は全て、当業界では周知である。鼻用溶液またはスプレー、エアロゾルまたは吸入剤などの本発明の鼻腔内投与も使用することができる。鼻用溶液は通常、滴剤またはスプレーで鼻腔に投与するように設計された水性溶液である。鼻用溶液は、鼻分泌物と多くの観点で類似するように調製される。したがって、水性鼻用溶液は通常等張で、ｐＨ５．５から６．５に維持されるように少し緩衝化されている。さらに、眼科用調製物で使用されるものと類似の抗菌保存液および適切な薬剤安定化剤は、必要であれば製剤に含めることができる。様々な市販の鼻用調製物が知られており、例えば、抗生物質が含まれ、抗ヒスタミン薬が喘息予防のために使用されている。
その他の投与様式に適切な他の製剤には、座薬および膣座薬が含まれる。直腸座薬および座薬も使用できる。座薬は様々な重量および形状の固形剤形をしており、通常、直腸または尿道に挿入するために投薬される。挿入後、座剤は軟化し、腔内液体に溶融または溶解する。座薬では、従来の結合剤および担体には一般的に、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれ、このような座薬は、任意の適切な範囲、例えば、０．５％から１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成することができる。
経口用製剤には、例えば、医薬品等級のマンニトール、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤が含まれる。これらの組成物は、液体、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放製剤または粉末の形態をとる。ある種の限定された実施形態では、経口用医薬組成物は、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体を含むか、または硬ゼラチンカプセルもしくは軟ゼラチンカプセルに封入してよく、または錠剤に圧縮してよく、または食事療法用の食品に直接組み入れてよい。経口治療用投与では、活性化合物は賦形剤と共に組み入れてよく、消化可能な錠剤、頬側錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの形態で使用してよい。このような組成物および調製物は、活性化合物を少なくとも０．１％含有することができる。組成物および調製物の割合はもちろん変化させてよく、単位の重量の約２と約７５％の間、または約２５〜６０％の間であると都合よくなり得る。このような治療上有用な組成物における活性化合物の量は、適切な投薬量が得られるようにする。
錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどはまた、以下のもの、結合剤、例えば、トラガカントゴム、アカシアゴム、コーンスターチまたはゼラチン、賦形剤、例えば、リン酸２カルシウム、崩壊剤、例えば、コーンスターチ、馬鈴薯澱粉、アルギン酸など、光沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、および甘味剤、例えば、スクロース、乳糖またはサッカリンを含有することができ、矯味矯臭剤、例えば、ペパーミント、ウィンターグリーン油、またはチェリーフレーバを添加することができる。投与単位形態がカプセルの場合、前記の種類の物質に加えて、液体担体を含有することができる。様々なその他の物質は、コーティング剤として、またはその他の場合は、投与単位の物理的形態を変更するために存在させることができる。例えば、錠剤、丸剤またはカプセルは、シェラック、糖またはその両方でコーティングしてよい。エリキシルのシロップは、甘味剤として活性化合物スクロース、保存剤としてメチレンおよびプロピルパラベン、顔料および矯味矯臭剤、例えば、チェリーまたはオレンジフレーバを含有してよい。いくつかの実施形態では、経口用医薬組成物は、活性化合物を胃の環境から防御するために、腸溶コーティングしてよく、腸溶コーティング法および製剤は、当業界では周知である。
ＶＩ．核酸、ベクター、細胞および製造法
本発明はまた、核酸、ベクター、細胞および製造法を提供する。
Ａ．核酸
いくつかの実施形態では、本発明は本発明のタンパク質またはペプチドをコードする核酸を提供する。ある種の実施形態では、本発明はイムノグロブリンの軽鎖をコードする第１の配列およびイムノグロブリンの重鎖をコードする第２の配列を含有する単一の核酸配列であって、前記第１の配列はまた、軽鎖に共有結合したペプチドの融合タンパク質として発現されるペプチドをコードするか、または前記第２の配列はまた、重鎖に共有結合したペプチドの融合タンパク質として発現されるペプチドをコードする核酸配列を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、核酸配列を提供し、いくつかの実施形態では、本発明は、特定のヌクレオチド配列と少なくとも約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一な核酸配列を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３３のヌクレオチド５８〜１３８６と少なくとも約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一である第１の配列および配列番号３３のヌクレオチド１３９６〜１７４６と少なくとも約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一である第２の配列を含有する核酸を提供する。
２種類の核酸の配列比較では、一般的に、１種の配列は、試験配列と比較される参照配列として用いられる。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、その後位置を指定し、必要であれば、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。初期設定のプログラムパラメータを使用することができ、あるいは他のパラメータを指定することもできる。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータをベースにして、参照配列に対して試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
本明細書で使用したように、「比較ウインドウ」には、２０から６００、通常約５０から約２００、より通常には約１００から約１５０からなる群から選択された隣接した位置の数の任意の１つの区域に対する参照を含み、２種の配列を最適に整列させた後、１配列を隣接した位置の同数の参照配列と比較することができる。比較する配列の整列方法は、当業界では周知である。比較する配列の最適なアラインメントは、限定はしないが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃ、の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ手法によって、または手動アラインメントおよび視覚的検証によって（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５追補）を参照）実施することができる。
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターで公的に利用できる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アルゴリズムの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、初期設定としてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、一般的に「低複雑」フィルターを無効にして実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２種の配列の類似性の統計学的分析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによってもたらされる類似性の１測定値は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、２種のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致が偶然生じる確率の指標となる。例えば、参照核酸に対して試験核酸を比較して、最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、この核酸は、参照配列と類似であると考えられる。
本発明は本発明のペプチドのいずれかをコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、イムノグロブリンの軽鎖をコードする遺伝子および融合タンパク質をコードする遺伝子を含有する単一の核酸配列であって、この融合タンパク質がペプチドに共有結合したイムノグロブリンの重鎖を含む拡散配列を提供する。いくつかの実施形態では、このペプチドは治療用ペプチドである。いくつかの実施形態では、このペプチドは神経治療用ペプチド、例えば、ＢＤＮＦなどのニューロトロフィンである。いくつかの実施形態では、このＢＤＮＦは、２アミノ酸カルボキシル切断型ＢＤＮＦである。いくつかの実施形態では、イムノグロブリンはＭＡｂである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧはＭＡｂ、例えばキメラＭＡｂである。抗体は、輸送系、例えば、内在性ＢＢＢ受容体媒介輸送系、例えば、内在性ＢＢＢ受容体インシュリン輸送系に対する抗体であってよい。いくつかの実施形態では、内在性ＢＢＢ受容体媒介インシュリン輸送系は、ヒト内在性ＢＢＢ受容体媒介インシュリン輸送系であり、イムノグロブリン重鎖が共有結合しているペプチドはヒトＢＤＮＦである。任意の適切なペプチド、神経治療用ペプチド、ニューロトロフィン、ＢＤＮＦ、抗体、モノクローナル抗体またはキメラ抗体は、本明細書で記載したように、融合タンパク質として一緒にされて、核酸によってコードされ、単一の核酸配列でコードされていてよい。当業界で周知のように、遺伝子コードの縮重のため、適切なコドンの任意の組み合わせを、所望する融合タンパク質のコードに使用することができる。さらに、組換え技術に有用なその他の因子、例えば、プロモーター、終止シグナルなどを核酸配列に含めることができる。このような因子は当業界では周知である。さらに、記載した、および本明細書で特許請求した核酸配列は全て、配列の相補体を含む。
融合タンパク質の成分として、ＢＤＮＦ、例えば、ＢＤＮＦ変種をコードするいくつかの実施形態では、ＢＤＮＦは、配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２の配列と約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一である配列を含有する。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦはアミノ末端でイムノグロブリン、例えば、ＭＡｂの重鎖のカルボキシ末端に結合する。ＭＡｂの重鎖は、配列番号２４のアミノ酸２０〜４６２と約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一である配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、イムノグロブリン、例えば、ＭＡｂの軽鎖は、配列番号３６のアミノ酸２１〜２３４と約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一である配列を含む。この核酸はさらにＭＡｂの重鎖とＢＤＮＦとの間のペプチドリンカーをコードする核酸配列を含有することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｓ−Ｓ−Ｍである。この核酸はさらに、シグナルペプチドをコードする核酸配列であって、このシグナルペプチドが重鎖に結合している核酸配列を含有する。当業界で公知であるか、またはその後開発された任意の適切なシグナルペプチドを使用することができる。いくつかの実施形態では、重鎖に結合したシグナルペプチドは、配列番号２４のアミノ酸１〜１９と約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、この核酸は、別のシグナルペプチドをコードする核酸配列であって、この別のシグナルペプチドが軽鎖に結合している核酸配列を含有する。軽鎖に結合したシグナルペプチドは、配列番号３６のアミノ酸１〜２０と約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一である配列を含むことができる。この核酸は、選択可能なマーカーをコードする核酸配列を含有できる。いくつかの実施形態では、この選択可能なマーカーはＤＨＦＲである。ＤＨＦＲの配列は、配列番号３８のアミノ酸１〜１８７と約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一であることができる。
ある種の実施形態では、本発明は、イムノグロブリン成分をコードする第２の配列と同一のオープンリーディングフレーム内に、神経治療用ペプチド、例えば、ＢＤＮＦなどのニューロトロフィンをコードする第１の配列を含む核酸を提供する。イムノグロブリン成分は、例えば、配列番号３３のヌクレオチド５８〜１３８６と少なくとも約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一である軽鎖または重鎖、および配列番号３３のヌクレオチド１３９６〜１７４６と少なくとも約、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一である第２の配列であることができる。いくつかの実施形態では、この核酸はまた、配列番号３５のヌクレオチド６１〜７０２と少なくとも約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一である第３の配列を含有する。いくつかの実施形態では、この核酸はさらに、第１のシグナルペプチドをコードする第４の配列および第２のシグナルペプチドをコードする第５の配列を含有する。いくつかの実施形態では、第４の配列は、配列番号３３のヌクレオチド１〜５７と少なくとも約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一であり、第５の配列は配列番号３５のヌクレオチド１〜６０と少なくとも約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一である。いくつかの実施形態では、この核酸はさらに、選択可能なマーカー、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする配列を含有している。いくつかの実施形態では、ＤＨＦＲをコードする配列は、配列番号３７のヌクレオチド１〜５６１と少なくとも約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一である。
Ｂ．ベクター
本発明はまた、ベクターを提供する。このベクターは、本明細書で記載した核酸配列のいずれかを含有することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、ペプチド、例えば、ニューロトロフィンなどの治療用ペプチドに融合した抗体重鎖をコードする核酸、および抗体の軽鎖をコードする核酸を含有する、いずれもが核酸の１片、例えば、ＤＮＡの１片に組み込まれている１本のタンデム発現ベクターを提供する。この１本のタンデムベクターは、１種または複数の選択および／または増幅遺伝子も含むことができる。本発明の例示的ベクターの作製方法は、実施例に挙げてある。しかし、当業界で知られているような任意の適切な技術をベクターの構築に使用することができる。
１本のタンデムベクターを使用すると、従来の技術よりもいくつかの利点がある。イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）遺伝子の真核細胞系への形質移入には一般的に、ＩｇＧを構成する重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）をコードする別々のプラスミドを細胞系に同時形質移入することが必要である。ＩｇＧ融合タンパク質の場合、組換え治療用タンパク質をコードする遺伝子は、ＨＣまたはＬＣ遺伝子のいずれかに融合させることができる。しかし、この同時形質移入の取り組みでは、ＨＣおよびＬＣ融合遺伝子の両方またはＨＣ融合物およびＬＣ遺伝子を同等に高く取り込んだ細胞系を選択することが困難である。本発明のある種の実施形態で使用する融合タンパク質の製造の取り組みは、ＤＮＡの１本鎖上に、ＨＣ融合タンパク質遺伝子、ＬＣ遺伝子、選択遺伝子、例えば、ネオ、および増幅遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含む必要な遺伝子全てを含有する１本のプラスミドＤＮＡで永久的に形質移入された細胞系を作製することである。図１２の融合タンパク質タンデムベクターの図に示したように、ＨＣ融合遺伝子、ＬＣ遺伝子、ネオ遺伝子およびＤＨＦＲ遺伝子は全て、別々ではあるがタンデムなプロモーターおよび別々ではあるがタンデムな転写終止配列の制御下にある。したがって、治療用タンパク質の融合遺伝子およびＨＣまたはＬＣ ＩｇＧ遺伝子を含む遺伝子は全て、宿主ゲノムに等しく組み入れられる。
Ｃ．細胞
本発明はさらに、本発明の１種または複数のベクターを組み込んだ細胞を提供する。この細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。いくつかの実施形態では、この細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞はマウス骨髄腫細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。ベクターを細胞に組み込む例示的方法を実施例に挙げる。しかし、当業界で知られているように、任意の適切な技術を、ベクターの細胞への組み込みに使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明はイムノグロブリン融合タンパク質を発現できる細胞であって、永久的に１本のタンデム発現ベクターを導入した細胞であり、イムノグロブリン軽鎖遺伝子および治療薬に融合させたイムノグロブリン重鎖の遺伝子の両方が、核酸、例えば、ＤＮＡの１片に組み込まれている細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本発明はイムノグロブリン融合タンパク質を発現できる細胞であって、永久的に１本のタンデム発現ベクターを導入した細胞であり、イムノグロブリン重鎖遺伝子および治療薬に融合させたイムノグロブリン軽鎖の遺伝子の両方が、核酸、例えば、ＤＮＡの１片に組み込まれている細胞を提供する。タンデムベクターの導入は、例えば、染色体核酸への永久的組み込みによって、または、例えば、エピソーム遺伝子因子の導入によることができる。
Ｄ．製造方法
さらに、本発明は製造方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明はイムノグロブリン融合タンパク質の製造方法であって、真核細胞に１本のタンデム発現ベクターを永久的に導入することによって、前記融合タンパク質が、治療薬と融合したイムノグロブリン重鎖を含有しており、イムノグロブリン軽鎖遺伝子および治療薬に融合したイムノグロブリン重鎖の遺伝子の両方が核酸、例えば、ＤＮＡの１片に永久的に組み込まれている製造方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明はイムノグロブリン融合タンパク質の製造方法であって、真核細胞に１本のタンデム発現ベクターを永久的に導入することによって、前記融合タンパク質が、治療薬と融合したイムノグロブリン軽鎖を含有しており、イムノグロブリン重鎖遺伝子および治療薬に融合したイムノグロブリン軽鎖の遺伝子の両方が核酸、例えば、ＤＮＡの１片に永久的に組み込まれている製造方法を提供する。いくつかの実施形態では、ベクターの導入は、宿主細胞ゲノムに永久的に統合することによって実現される。いくつかの実施形態では、ベクターの導入は、エピソームの遺伝的因子を含有するベクターを宿主細胞に導入することによって実現される。エピソームの遺伝的因子は当業界では周知である。いくつかの実施形態では、この治療薬は神経治療薬である。いくつかの実施形態では、この核酸の一片はさらに、１個または複数の選択可能なマーカーの遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、この核酸の一片はさらに、１個または複数の増幅遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、イムノグロブリンはＩｇＧ，例えば、キメラＭＡｂなどのＭＡｂである。この方法にはさらに、イムノグロブリン融合タンパク質を発現し、および／またはイムノグロブリン融合タンパク質を精製することを含んでよい。発現および精製を含む例示的製造方法を実施例に挙げる。
しかし、当業界で知られているような任意の適切な技術を製造、所望によりタンパク質の発現および精製に使用することができる。これらには、タンパク質合成の非組換え技術、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄによって最初に開発され、Ｓｔｅｗａｒｔ他の「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９８４）に記載された、手動または自動の固相合成が含まれる。化学合成では、Ｃ末端から開始して予め決定された配列にアミノ酸を結合させる。基本的な固相合成法には、Ｃ末端を保護したαアミノ酸を適切な不溶性樹脂支持体に結合させることが必要である。合成用のアミノ酸は、前の残基（または樹脂支持体）と適切なペプチド結合を確実に形成するために、αアミノ基を保護する必要がある。カルボキシル末端における縮合反応を完了した後、次の残基の添加を可能にするためにαアミノ保護基を除去する。α保護基のいくつかの種類は記載されており、Ｓｔｅｗａｒｔ他の「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９８４）を参照し、酸に不安定な場合は、ウレタンをベースにした３級ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）が歴史的に好まれている。塩基に不安定な９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）を含むその他の保護基および関連する化学的戦略を使用することができる。また、反応性アミノ酸側鎖官能基は、合成が完了するまで保護する必要がある。複雑に列挙された官能基保護基は、戦略およびその用途の限界と共に、Ｂｏｄａｎｓｋｙの「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９７６）およびＳｔｅｗａｒｔ他の「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９８４）に概説されている。
固相合成は、記載したＣ末端α保護アミノ酸残基の結合によって開始される。結合には、１−ヒドロキシベンゾ−チアゾール（ＨＯＢＴ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＩＰＣ）またはエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下または非存在下で、薬剤、例えば、ジシクロへキシカルボジイミド（ＤＣＣ）を活性化する必要がある。Ｃ末端残基を結合させた後、酸に不安定な３級ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基の場合、αアミノ保護基をジクロロメタン中でトリフルオロ酢酸（２５％以上）によって除去する。ジクロロ−メタン中においてトリエチルアミン（１０％）による中和段階によって、遊離アミン（塩に対して）を回収する。Ｃ末端残基を樹脂に添加した後、脱保護、中和および結合の周期を、中間の洗浄段階と共に、保護ペプチド鎖を伸長するために繰り返す。保護アミノ酸それぞれを過剰に（３から５倍）、等モル量の結合試薬と共に適切な溶媒中に導入する。最後に、完全にブロックしたペプチドを樹脂支持体上に組み立てた後、樹脂からペプチドを切断し、側鎖保護基を除去するために試薬を適用する。無水フッ化水素（ＨＦ）は、酸に不安定な３級ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基を切断する。特に側鎖官能基の副反応を回避するために、ジメチルスルフィドおよびアニソールなどのいくつかの求核捕捉剤を含める。
ＶＩＩ．方法
本発明はまた、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明はＣＮＳで活性のある薬剤を有効量でＢＢＢを通過して輸送する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は治療法、診断法または研究法を提供する。診断法には、ＢＢＢを通過して輸送することができるペプチド放射性医薬品、例えば、ペプチドリガンドの融合物または脳内の内在性受容体のペプチド様ＭＡｂの開発、その後の融合タンパク質の放射標識、その後の全身投与およびペプチド放射性医薬品の脳内における局在の外部画像診断が含まれる。
ニューロトロフィン薬剤の開発は、ＣＮＳで活性のある薬剤の送達の開発、例えば、ＣＮＳ薬開発が、ＢＢＢを通過する送達、例えば、ＣＮＳ薬剤送達を並列して計画することなく行われる場合に直面する問題を例示している。１９９０年代の「脳の１０年」の間の分子神経科学の進歩は、ＢＤＮＦ、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−４／５、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２およびその他のＦＧＦ、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン、ペルセフィン、インターロイキン類、顆粒球コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ、ネトリン、カルジオトロフィン−１、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミッドカイン、プレイオトロフィン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、セマフォリンまたは幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む３０種を上回る様々な神経栄養因子のクローニング、発現および精製をもたらした。これらの天然の物質は、脳における強力な回復性の薬剤であり、タンパク質を脳に直接注射すると神経保護をもたらす。さらに、ＢＤＮＦを脳に直接注射すると、新たな脳細胞形成および神経発生の刺激因子となる可能性がある。
ニューロトロフィンはＢＢＢを通過しないので、ＢＤＮＦなどのニューロトロフィンは、治療効果を実現するために脳に直接注射しなければならない。したがって、神経栄養因子を末梢（静脈内、皮下）投与した後、これらの分子が脳障害に有益な効果を有することは期待できない。１９９０年代に、慢性神経変性障害、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療のために、神経栄養因子の開発が試みられた。臨床方法では、神経変性疾患を治療するためにはニューロトロフィンはＢＢＢを通過しなくてはならなくても、神経栄養因子を皮下投与によって投与した。臨床試験は進められ、ＡＬＳのためのニューロトロフィン第ＩＩＩ相臨床試験は全て失敗した。その後、側脳室内（ＩＣＶ）注入または対流増強送達（ＣＥＤ）によってニューロトロフィンを投与することが試みられたが、これらの侵襲的送達様式は効果がないか、毒性があった。ニューロトロフィン分子、それ自体が神経治療薬として不十分であるならば、ごく最近の理論では、ニューロトロフィン低分子模倣物、ニューロトロフィン遺伝子治療、またはニューロトロフィン幹細胞治療の開発を提唱している。
しかし、神経治療薬がＢＢＢを通過できないならば、末梢投与経路のための薬剤として神経治療薬を開発することができる。神経治療薬、例えば、ＢＤＮＦなどのニューロトロフィンをＭＴＨ、例えば、キメラＨＩＲＭＡｂに結合させると、動物、例えば、ヒトなどの哺乳類において、急性の脳および脊髄の症状、例えば、局所脳虚血、全脳虚血および脊髄損傷の治療のため、ならびにプリオン病、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、ＡＬＳ、多発硬化症、横断性脊髄炎、運動ニューロン疾患、ピック病、結節性硬化症、リソソーム蓄積症、カナバン病、レット症候群、脊髄小脳失調症、フリードライヒ失調症、視神経萎縮および網膜変性症を含む神経変性疾患の慢性的治療のために、ＣＮＳに神経治療薬を非侵襲的に送達するための新たな取り組みを提案する。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＮＳで活性のある薬剤を有効量で末梢循環からＢＢＢを通過して輸送する方法であって、この薬剤がＢＢＢを通過する構造に共有結合しており、薬剤単独では有効量でＢＢＢを通過しない方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、神経治療薬を治療有効量で末梢循環からＢＢＢを通過して輸送する方法であって、この神経治療薬がＢＢＢを通過する構造に共有結合しており、神経治療薬単独では治療有効量でＢＢＢを通過しない方法を提供する。
本発明はまた、いくつかの実施形態では、治療有効量の治療薬、例えば、ＢＢＢを通過できる構造に共有結合した神経治療薬を末梢投与することによってＣＮＳの障害を治療する方法であって、この薬剤単独では末梢投与された場合有効量でＢＢＢを通過できない方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＮＳ障害は、急性障害であり、いくつかの場合では、薬剤を１回投与することのみが必要であってよい。いくつかの実施形態では、ＣＮＳ障害は、慢性障害であり、いくつかの場合では、薬剤を複数回投与することが必要であってよい。
いくつかの実施形態では、有効量、例えば、治療有効量とは、脳内の濃度が、少なくとも約０．００１、０．０１、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００または１００ｎｇ／グラム脳を上回るようにする。いくつかの実施形態では、例えば、ＢＤＮＦなどのニューロトロフィンの治療有効量は、脳のレベルが約０．１から１０００、または約１〜１００、または約５〜５０ｎｇ／ｇ脳を実現するようにする。いくつかの実施形態では、この神経治療薬は、ニューロトロフィンである。いくつかの実施形態では、ニューロトロフィンは、ＢＤＮＦ、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−４／５、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２およびその他のＦＧＦ、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン、ペルセフィン、インターロイキン類、顆粒球コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ、ネトリン、カルジオトロフィン−１、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミッドカイン、プレイオトロフィン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、セマフォリンまたは幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、このニューロトロフィンは、切断型ＢＤＮＦなどのＢＤＮＦ、例えば、本明細書で記載したカルボキシル切断型ＢＤＮＦである。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＮＳの障害の治療を必要とする個体にニューロトロフィンの有効量を末梢投与することによってＣＮＳの障害を治療する方法であって、前記ニューロトロフィンが、前記末梢投与後、脳内のニューロトロフィン濃度の平均的上昇が少なくとも約０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００または１００ｎｇ／グラム脳を上回るようにＢＢＢを通過することができ、１回投与してから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０日間を過ぎてもニューロトロフィンのレベルが上昇したまま維持される方法を提供する。いくつかの実施形態では、１回投与してから約２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０日間を過ぎてもニューロトロフィンのレベルは約１ｎｇ／ｇ脳、または約２ｎｇ／ｇ脳、または約５ｎｇ／ｇ脳を上回ったまま維持される。いくつかの実施形態では、ニューロトロフィンは、切断型変種を含むＢＤＮＦである。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＮＳの障害の治療を必要とする個体に本発明の組成物の有効量を末梢投与することによって、ＣＮＳの障害を治療する方法を提供する。本明細書で使用した「末梢投与」という用語には、ＣＮＳに直接投与しない、すなわち、物理的貫通またはＢＢＢの破壊が関与しない任意の投与方法が含まれる。「末梢投与」には、限定はしないが、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、頬膜貫通、経皮、直腸、経肺胞（吸入）または経口投与が含まれる。本明細書で記載したように、本発明の任意の適切な組成物を使用することができる。いくつかの実施形態では、この組成物は、キメラＨＩＲ−ＭＡｂに共有結合したニューロトロフィンである。いくつかの実施形態では、このニューロトロフィンはＢＤＮＦである。いくつかの実施形態では、このＢＤＮＦは、本明細書で記載した変種、例えば、カルボキシル末端切断変種である。
本明細書で使用したように、「ＣＮＳの障害」または「ＣＮＳ障害」には、脳および／または脊髄に影響を及ぼし、不十分な機能をもたらす任意の症状が包含される。いくつかの実施形態では、この障害は急性障害である。ＣＮＳの急性障害には、局所脳虚血、全脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、急性感染、てんかん重積、片頭痛、急性精神病、自殺願望うつ病および急性の不安／恐怖症が含まれる。いくつかの実施形態では、この障害は慢性障害である。ＣＮＳの慢性障害には、慢性神経変性、網膜変性症、うつ病、慢性感情障害、リソソーム蓄積症、脳の慢性感染、脳癌、脳卒中リハビリテーション、先天的代謝異常、自閉症、精神遅滞が含まれる。慢性神経変性には、プリオン病、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、多発硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、横断性脊髄炎、運動ニューロン疾患、ピック病、結節性硬化症、リソソーム蓄積症、カナバン病、レット症候群、脊髄小脳失調症、フリードライヒ失調症、視神経萎縮および網膜変性症などの神経変性疾患ならびにＣＮＳの加齢が含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明は網膜の治療法、あるいは失明の治療または予防法を提供する。網膜は、脳のように、血液網膜関門（ＢＲＢ）によって血液から保護されている。インシュリン受容体は、ＢＢＢおよびＢＲＢの両方の上で発現し、ＨＩＲＭＡｂは、ＲＭＴを介してＢＲＢを通過して網膜まで治療薬を輸送することが示された。ＢＤＮＦは、網膜変性において神経保護的であるが、ＢＤＮＦはＢＲＢを通過しないので、眼球に直接ニューロトロフィンを注射する必要がある。いくつかの実施形態では、ＨＩＲＭＡｂはＢＲＢを通過してＢＤＮＦを輸送し、したがって、ニューロトロフィンは血液区画から網膜神経細胞に曝露されるので、本発明の融合タンパク質は、静脈注射または皮下注射と同程度の非侵襲的な投与経路で、網膜変性および失明を治療するために使用される。
いくつかの実施形態では、本発明はうつ病の治療法を提供する。うつ病患者の小集団は、ＢＤＮＦが脳で欠乏している可能性があり、一塩基多形（ＳＮＰ）と感情障害との関連が報告されている。ＢＤＮＦを脳に直接注射すると、齧歯類モデルでは持続性のある抗うつ効果がある。ニューロトロフィンはＢＢＢを通過しないので、ＢＤＮＦは、脳に直接注射しなければならない。いくつかの実施形態では、本発明は本発明の融合タンパク質を慢性的に投与することによって、したがって、ＢＤＮＦの脳レベルを上昇させ、うつ病および脳ＢＤＮＦの産生が減少した患者で治療効果をもたらして、うつ病を治療する方法を提供する。
製剤化および投与。任意の適切な製剤、投与経路および本発明の組成物の用量を使用することができる。製剤、用量、投与経路は、通常の実験を行うだけで当業者によって決定される。本発明の組成物、例えば、融合タンパク質は通常、約０．０１〜１０００ｍｇ、または約０．０５〜５００ｍｇ、または約０．１〜１００ｍｇ、または約１〜１００ｍｇ、または約０．５〜５０ｍｇ、または約５ｍｇ〜５０ｍｇ、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０、２５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇの単回投与で、例えば、静脈投与で投与される。一般的に、急性脳疾患、例えば、脳卒中、心停止、脊髄損傷または頭部外傷の治療のためには高用量を使用することができるが、一方、慢性症状、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ＭＳ、ＡＬＳ、横断性脊髄炎、運動ニューロン疾患、ピック病、結節性硬化症、リソソーム蓄積症、カナバン病、レット症候群、脊髄小脳失調症、フリードライヒ失調症、視神経萎縮および網膜変性症ならびに加齢の治療のためには、低用量の慢性的投与を使用することができる。経口投与には、当業界で知られているように、吸収効率およびタンパク質の可能性のある代謝に応じて、静脈内または皮下投与よりも高用量が必要となることがあり、通常の実験をベースにして前述の事項から調節することができる。
静脈または皮下投与では、本発明の製剤は、液体の形態で提供することができ、ｐＨを変化させた（５〜８）生理食塩水をベースにした水性溶液で、ポリソルベート−８０などの界面活性剤０．０１〜１％、またはマンニトール、ソルビトールもしくはトレハロースなどの炭水化物添加物を含めるか、または含めないで、製剤化することができる。通常使用する緩衝液には、ヒスチジン、酢酸塩、リン酸塩またはクエン酸塩が含まれる。
ヒトへの投薬量は、適切な動物のデータから計算することができる。例えば、ＢＤＮＦ−ＭＡＢ結合体のヒト用量は、前臨床薬物動態研究をベースにしており、これらの測定値は２種、ラットおよびアカゲザルで実施された。３匹のラット脳虚血モデルでの予備実験によって、ＢＤＮＦ−ＭＡｂ結合体の有効用量の範囲は、ＢＤＮＦ−ＭＡｂ結合体の形態でＢＤＮＦが５〜５０μｇ／ラットから２０〜２００μｇ／ｋｇであることが示された。融合タンパク質分子のＢＤＮＦ成分は１６％で、ＨＩＲＭＡｂ成分は８４％であるので、融合タンパク質の用量は同等のＢＤＮＦ用量よりも６倍高い。ラットにおける薬物動態研究では、これらの用量では、結合体形態のＢＤＮＦの濃度が血漿中では５０〜５００ｎｇ／ｍＬ、脳内では５〜５０ｎｇ／ｇになることが示されている。成体アカゲザルのＨＩＲＭＡｂによる薬物動態研究では、最初の１時間の平均血漿濃度は０．１％注射用量（ＩＤ）／ｍＬで、脳濃度は０．０２％ＩＤ／ｇであることが示されている。融合タンパク質の脳濃度は、約０．０１％ＩＤ／ｇである（図２７）。種間のスケーリング効果およびアカゲザルと比較してヒトの体重および脳の大きさは１０倍を上回るため、ヒトで計画された血漿濃度は０．０１％ＩＤ／ｍＬであり、脳濃度は０．００１％ＩＤ／ｇである。ヒトの脳は１２００グラムなので、注射した用量の１％超がヒト脳に送達し、これは小分子と同程度の脳取り込みレベルである。ヒトにおける融合タンパク質の注射用量が２．５〜２５ｍｇと仮定すると、６０分後に予測される血漿濃度は２５０〜２５００ｎｇ／ｍｌ融合タンパク質、６０分後に予測される脳濃度は２５〜２５０ｎｇ／ｇ融合タンパク質であり、これはＢＤＮＦ４〜４０ｎｇ／グラム脳に相当する。ヒトにおける融合タンパク質用量５ｍｇおよび２５ｍｇは、全脳虚血および局所的脳虚血のどちらでも神経保護的なＢＤＮＦの脳濃度を生じる。このＢＤＮＦは、融合タンパク質を１６％含むので、ヒトに投与されたＢＤＮＦの有効な用量は、融合タンパク質の用量２．５ｍｇでは０．４ｍｇ、２５ｍｇでは４．０ｍｇである。
融合タンパク質はまた、慢性ＣＮＳ障害、例えば、神経変性疾患、脳卒中または脳／脊髄損傷リハビリテーション、あるいはうつ病の治療のために慢性的に使用するように製剤化することができる。慢性的治療には、本発明の組成物、例えば、融合タンパク質を静脈内、筋肉内、または皮下から、急性治療で使用したものと同様の製剤で、毎日、毎週、隔週投与することが必要になることがあり得る。あるいは、この組成物、例えば、融合タンパク質は、生分解可能なポリマーの一部として製剤化され、月１回の計画で投与することができる。
併用治療。本発明の組成物、例えば、融合タンパク質は、併用治療の一部として投与することができる。併用治療には、治療するＣＮＳ障害のための別の治療と組み合わせて本発明の組成物を投与することが必要である。本発明の組成物を別のＣＮＳ障害法または組成物と併用するならば、本発明の組成物と別の方法または組成物の任意の組み合わせを使用してよい。したがって、例えば、本発明の組成物の使用は、別のＣＮＳ障害治療薬と併用するならば、その２種類は、同時に、連続的に、重複した期間中に、類似の、同一の、または異なる頻度などで投与してよい。いくつかの場合、１種または複数のその他のＣＮＳ障害治療薬と組み合わせて本発明の組成物を含有する組成物を使用する。
本発明の方法で使用できるその他のＣＮＳ障害治療薬には、限定はしないが、脳卒中用の血栓溶解療法、アルツハイマー病用のアミロイド特異的療法、パーキンソン用のドーパミン回復療法、遺伝子障害、癌、もしくは感染用のＲＮＡ干渉療法、およびてんかん用の抗けいれん治療が含まれる。これらの薬剤の投薬量、投与経路、投与計などは、当業界で周知である。
いくつかの実施形態では、組成物、例えば、融合タンパク質は、別の医薬品と共に、同一の製剤内または別々の組成物として、患者に同時投与される。例えば、融合タンパク質は、ＢＤＮＦ以外の組換えタンパク質を、ヒト血液脳関門を通過して輸送するようにも設計された別の融合タンパク質と共に製剤化することができた。融合タンパク質は、その他の高分子または小分子と組み合わせて製剤化することができる。
ＶＩＩ．キット
本発明の組成物、例えば、融合タンパク質は、容器または適切な包装内に製剤、例えば、融合タンパク質を含むキットとして提供することができる。組成物は、乾燥粉末形態、固形（すなわち、凍結乾燥）、溶液、または懸濁液で提供することができる。組成物がタンパク質の場合、このタンパク質に、乳化剤、塩、保存剤、その他のタンパク質、核酸、プロテアーゼ阻害剤、抗生物質、香料、多糖類、接着剤、ポリマー、ミクロフィブリル、油などを添加することができる。輸送、保存および／または消費者が使用するために組成物を包装する。輸送、保存および使用のための治療用組成物のこのような包装は、当業界で周知である。包装された組成物には、組成物を分配および保存するための成分をさらに含めることができ、例えば、製剤、例えば、融合タンパク質を患者に投与する前に溶解するための滅菌水または適切な緩衝液からなる別々に包装された希釈剤も含めることができる。本発明のキットには、使用指示書、臨床研究の結果、治療の所望される予後および予測経過、予防措置および副作用の情報などの文書を含めることもできる。このキットは、所望によりさらに、その他の成分、例えば、手袋、はさみ、テープ、使用済みバイアルおよびその他の廃棄物を処分するための器具、マスク、殺菌剤、抗生物質などを含有することができる。
実施例１
ＩｇＧ−神経治療薬融合物の完全な遺伝子を含有する１本のタンデムベクターの構築
融合タンパク質の重鎖（ＨＣ）をコードする真核発現ベクターの遺伝子操作を図１に概略する。最終的な融合タンパク質ＨＣ発現ベクターは、ｐＨＩＲＭＡｂ−ＢＤＮＦ、またはクローン４１６と示される。このベクターは、ＨＩＲＭＡｂのＨＣに融合したＢＤＮＦ変種から構成される融合タンパク質を産生するように設計された。ＢＤＮＦまたはＢＤＮＦの変種（ｖＢＤＮＦ）のいずれかをＨＩＲＭＡｂに融合させることができる。ｖＢＤＮＦは、ある種のアミノ酸が置換していることによって天然のヒトＢＤＮＦとは異なっており、例えば、ｖＢＤＮＦではＢＤＮＦのカルボキシル末端の２アミノ酸が存在しない。クローン４１６プラスミドは、ＨＩＲＭＡｂのキメラ型のＨＣを産生するクローン４００およびは図２に記載した通りに作製された成熟ヒトｖＢＤＮＦをコードするｃＤＮＡから得られた。クローン４００は、ヒトＩｇＧ１定常領域をコードする染色体断片から得られ、イントロンおよびエキソン配列の両方から構成されるキメラヒトＩｇＧ１をコードする。クローン４００におけるキメラＨＩＲＭＡｂのＨＣ遺伝子を、部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）によるＣＨ３領域の３’末端に位置する終止コドンの操作を容易にするために、ｐＣＲＩＩプラスミドのＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。ＣＨ３領域の末端に位置する終止コドンの操作は、ＳｓｐＩ部位を創出する部位特異的変異誘発によって実施した。ＳｓｐＩ部位は、クローン４１５を作製するために、クローン４００への平滑末端連結によるｖＢＤＮＦｃＤＮＡの挿入を可能にする（図３）。ＳＤＭは、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＳＤＭキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ）を使用して実施した。センスおよび相補的変異誘発プライマーは、ＣＨ３終止コドン（ａａＴＧＡｇ）がＳｓｐＩ部位（ａａＴＡＴｔ）に変異するように設計した。さらに、プライマーは、終止コドン５’−および３’−周囲領域の１５個のヌクレオチドを含有しており、ＳＤＭ−ＳｓｐＩフォワード（ＦＷＤ）およびリバース（ＲＥＶ）と称されるこれらのプライマーの配列を表１に挙げる。
Figure 0005941607
ＩｇＧプロモーター領域のＤＮＡ配列分析によって、この領域に付加されたＳｓｐＩ部位の存在が明らかになった。したがって、まず、クローン４０４をＸｈｏＩおよびＮｈｅＩで消化することによってＨＣプロモーター領域（ＰＲＯ−ＶＨ）を遊離することが必要で、クローン４０４は、ＸｈｏＩ−ＮｈｅＩリンカーで再クローニングされ、クローン４０５が作製された（−Ｐｒｏ−ＶＨ）。ＸｈｏＩ−ＮｈｅＩリンカーを作製するために使用されるフォワードおよびリバースＯＤＮの配列を表１に挙げる。このプラスミドクローン４０５（−Ｐｒｏ−ＶＨ）は、ＳＤＭによって導入された１個のＳｓｐＩ部位を有する。ヒトｃＢＤＮＦｃＤＮＡをＳｓｐＩでサブクローニングして、クローン４１４と称される中間体プラスミド（示さず）を作製した。次に、完全な融合タンパク質ＨＣ発現カセットを、以前に除去したＰＲＯ−ＶＨ断片をサブクローニングすることによって再構築し、クローン４１５を作製した。次に、融合タンパク質ＨＣ遺伝子を真核発現ベクター、クローン４００にＢａｍＨＩ部位でサブクローニングして、クローン４１６を作製した。
ｖＢＤＮＦｃＤＮＡは、ＰＣＲによって、２つの同等の取り組みのいずれかによって作製された。１つの取り組みでは、発現配列ｔａｇ（ＥＳＴ）として単離され、ヒトＢＤＮＦをコードする原核発現プラスミド、ｐＨＴＢＳ０１をＢａｍＨＩおよびＢｐＩＩで消化して、ゲル精製して、Ｔ４リガーゼおよび５’末端リンカーで再連結し、クローン４１２を生じた（図２）。５’末端リンカーを生じるために使用されるフォワードおよびリバースＯＤＮの配列を表２に挙げる。
Figure 0005941607
Figure 0005941607
次に、クローン４１２をＸｈｏＩおよびＢｓｉＷＩで消化して、ゲル精製して、Ｔ４リガーゼおよび３’末端リンカーで再連結し、クローン４１３を作製した（図２）。３’末端リンカーを作製するために使用されるフォワードおよびリバースＯＤＮの配列を表２に挙げる。再構築された終止コドンを有するｖＢＤＮＦをコードするｖＢＤＮＦｃＤＮＡをＮｒｕＩによってクローン４１３から遊離し、ゲル精製して、このアガロースゲルの臭化エチジウム染色を図３Ａに示す。このゲルは、ｖＢＤＮＦｃＤＮＡの予測された大きさ、０．４ｋｂおよびベクター主鎖、３．５ｋｂを示す。あるいは、ＢＤＮＦｃＤＮＡは、ニューロトロフィンを産生するヒトＵ８７神経膠腫細胞から単離されたポリＡ＋ＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡからＰＣＲによって作製した。Ｕ８７由来ｃＤＮＡからＰＣＲによってｖＢＤＮＦを作製するために使用するプライマーを表２に挙げる。このＰＣＲは、ｖＢＤＮＦｃＤＮＡの予測値０．４ｋｂを生じた（図３Ｂ）。次に、この０．４ｋｂｖＢＤＮＦ断片をＮｒｕＩで消化し、図１に記載したようにクローン４１５にサブクローニングし、完全融合タンパク質ＨＣ発現カセットを作製し、ＢａｍＨＩによって遊離させ、元の真核発現プラスミドにサブクローニングして、クローン４１６、融合タンパク質ＨＣ用の最終発現プラスミドを作製した（図１）。クローン４１６をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩによって２重に消化して分析し、ｖＢＤＮＦを欠如した元のクローン４００の場合と比較した。アガロースゲル分離生成物を図３Ｃに示し、列１および３は、それぞれクローン４１６およびクローン４００から生じた断片を示す。いずれのプラスミドも、６ｋｂのベクター主鎖（列１および列３の３本のバンドの一番上）および２．５ｋｂのプロモーター領域（列１および列３の３本のバンドの一番下）を生じる。しかし、中央のバンドの大きさは、クローン４００と比較してクローン４１６では０．４ｋｂ大きい（列１および３の中央のバンド）。陰性クローンを図３Ｃの列２に示す。
ＨＩＲＭＡｂ ＨＣのＣＨ３領域の再構築されたカルボキシル末端、３−アミノ酸リンカー（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ）、ｖＢＤＮＦ配列、その後の終止コドンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図４に示す。クローン４１６の融合タンパク質ＨＣ遺伝子を含む完全な２７１１ヌクレオチド（ｎｔ）を図５に示す。ＡＴＧ開始コドンおよびＴＧＡ終止コドン終止コドンに下線を引いてある。ヒトＩｇＧ１定常領域のイントロンおよびエキソン配列をそれぞれ、図５にイタリックおよび太字で示す。クローン４１６ベクターのｖＢＤＮＦｎｔ配列は、図５で下線を引いてある。これらのデータは、イントロン配列がヒトＩｇＧ１定量領域のＣＨ１とヒンジ領域との間、ヒンジ領域とＣＨ２との間、およびＣＨ２とＣＨ３領域との間に見いだされることを示している。融合タンパク質ＨＣ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）は、１９個のアミノ酸のシグナルペプチドが切断された後、５６３個のアミノ酸のタンパク質をコードしており、融合タンパク質ＨＣのアミノ酸配列を図６に示す。シグナルペプチドに下線を引いてある。鎖内および鎖間ジスルフィド結合を形成する定常領域内のシステイン残基（Ｃ）は太字で示してあり、ＩｇＧのＣＨ３領域とｖＢＤＮＦの間のセリンーセリンーメチオニン（ＳＳＭ）リンカーには下線が引いてあり、ＣＨ２内アスパラギン残基にある１個のＮ結合グリコシル化部位は、下線を引いた太字で示してある（図６）。融合タンパク質ＨＣタンパク質の個々のドメインのアミノ酸配列を図７に示す。融合タンパク質のｖＢＤＮＦドメインは、１１７個のアミノ酸から構成される。
クローン４１６プラスミドＤＮＡを、キメラＨＩＲＭＡｂの軽鎖（ＬＣ）をコードする発現ブラスミドを既に形質移入してあるマウス骨髄腫細胞にエレクトロポレートした。ｖＢＤＮＦはＨＣにのみ融合するので、キメラＨＩＲＭＡｂのＬＣは変更されない。形質移入された細胞系を選択後、９６ウェルプレートの培地を、２種類の抗ヒトＩｇＧ抗体（１種類の抗体はヒトＩｇＧ１の重鎖に特異的で、他方の抗体はヒトカッパ軽鎖に特異的である）からなるＥＬＩＳＡでスクリーニングした。完全な融合タンパク質をコードする骨髄腫クローンを単離し、１０Ｌバイオリアクターで繁殖させた。しかし、融合タンパク質の産生レベルは低かった。この産生の低さは、（ｉ）重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子および抗生物質耐性遺伝子をコードする３種類の別個の発現プラスミドで骨髄腫細胞系を形質移入したこと、および（ｉｉ）大きなイントロン配列を有する重鎖および軽鎖遺伝子のゲノム断片を使用したことを含むいくつかの要因が原因であった。したがって、融合タンパク質発現プラスミドを、以下の要点を踏まえて再度遺伝子操作した。
（１）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、融合タンパク質ＨＣおよびＬＣ遺伝子のゲノム断片を２種類の遺伝子の「イントロンを含まない」ｃＤＮＡ型に変換した。
（２）融合タンパク質ＨＣおよびＬＣ遺伝子のｃＤＮＡ型を、２種類の遺伝子が別々に配置され、タンデム発現が別個のプロモーターで作動する１本の「タンデムベクター」に配置した。
（３）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの非骨髄腫細胞の形質移入を可能にするために、融合タンパク質ＨＣおよびＬＣ遺伝子の発現を進めるプロモーターを、ヒトＩｇＧプロモーターからサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに変えた。
（４）融合タンパク質をコードするタンデムベクターは、発現ベクターの挿入領域にゲノムの増幅を含有するＣＨＯ細胞系のメソトレキセート（ＭＴＸ）選択を可能にするために、別個のＳＶ４０プロモーター下にジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子をコードする遺伝子を含有する。
融合タンパク質タンデムベクターを作製するために、まず、融合タンパク質ＨＣおよびＬＣ遺伝子のｃＤＮＡ型を別々にコードする中間体プラスミドを作製する必要があった。図８に示したように、ＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ−（ｐＡ）転写末端配列を有し、ｐＣＤと称する真核発現プラスミドをＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、Ｔ４リガーゼおよびＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ−ＳｃａＩ−ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩリンカーで再連結した。このリンカーを作製するために使用されるフォワードおよびリバースＯＤＮの配列を表３に挙げる。
Figure 0005941607
ｐＣＤ−リンカー（図８）と称する得られたプラスミドをＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化して、Ｔ４リガーゼおよびＰＣＲによって融合タンパク質ＨＣｃＤＮＡで再度閉環した。ＰＣＲ反応のために、融合タンパク質ＨＣのゲノム構築物（クローン４１６）およびＬＣ遺伝子で２重に形質移入された前記の骨髄腫細胞系を消化して、骨髄腫由来ポリＡ＋ＲＮＡを生成した（図８のＡ部）。オリゴデオキシチミジン（ＯＤＴ）プライマーを使用して、骨髄腫ポリＡ＋ＲＮＡ０．５μｇから逆転写酵素で骨髄腫ｃＤＮＡを生成し、次いで、最終的にＲＮアーゼで消化した。このｃＤＮＡから、融合タンパク質ＨＣ遺伝子のｃＤＮＡ型を生成するために、表３に示したフォワードおよびリバースプライマーおよび忠実度の高いＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲを使用した。同様に、融合タンパク質ＬＣｃＤＮＡは、骨髄腫由来のｃＤＮＡからＰＣＲによって生成し、融合タンパク質ＬＣｃＤＮＡの増幅に使用したフォワードおよびリバースＰＣＲプライマーの配列を表３に挙げる。ＰＣＲの後で、このｃＤＮＡを０．８％アガロースゲルに添加したところ、増幅すると全て、単一の産物、１．８ｋｂ融合タンパク質ＨＣｃＤＮＡ（図３Ｄ、列１）および０．７ｋｂ融合タンパク質ＬＣｃＤＮＡ（図３Ｄ、列２）が生じた。融合タンパク質ＨＣＰＣＲ産物を、ＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＣＤ−リンカーにサブクローニングして、融合タンパク質ＨＣｃＤＮＡをコードするイントロンを含まない真核発現プラスミドであるクローン４２２ａ（図８）を作製した。クローン４２２ａを、ＮｈｅＩを用いて制限エンドヌクレアーゼによって分析した。ｐＣＤベクターの新たなマルチクローニング領域に部位を有するこの酵素で消化すると、融合タンパク質重鎖可変領域（ＶＨ）ｃＤＮＡに対応する予測０．４ｋｂ断片が生じた（図３Ｅ、列１〜４）。クローン４２２ａによってコードされる融合タンパク質ＨＣｃＤＮＡのヌクレオチド配列を図９Ａに示すが、これはクローン４１６（図５）に存在するイントロン配列が加工された骨髄腫ＲＮＡのＰＣＲによって除去されたことを示している。融合タンパク質ＨＣｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を図９Ｂに示し、このアミノ酸配列は、クローン４１６のゲノム断片によって生じたものと同一である（図６）。
融合タンパク質ＬＣＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩで消化し、ＣＤ−リンカーにサブクローニングして、融合タンパク質ＬＣｃＤＮＡをコードするイントロンを含まない真核発現プラスミドであるクローン４２３ａ（図１０）を作製した。クローン４２３ａをＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩを用いた制限エンドヌクレアーゼによって分析した。ｐＣＤベクターの新たなマルチクローニング領域に部位を有するこれらの酵素で消化すると、融合タンパク質ＬＣｃＤＮＡに対応する予測０．７ｋｂ断片を生じた（図３Ｆ、列１〜５）。クローン４２３ａによってコードされる融合タンパク質ＬＣｃＤＮＡのヌクレオチド配列を図１１Ａに示すが、これはイントロン配列が加工された骨髄腫ＲＮＡのＰＣＲによって除去されたことを示している。融合タンパク質ＬＣｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を図１１Ｂに示す。
クローン４２２ａおよび４２３ａは、図１２に概略したように、融合タンパク質タンデムベクターの前駆体である。ステップ２では、融合タンパク質ＨＣ発現カセットの３’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入するために、クローン４２２ａにＳＤＭを行った。フォワードおよびリバースＳＤＭプライマーの配列を表４に挙げる。
Figure 0005941607
ステップ２では、変異したクローン４２２ａをＥｃｏＲＩで消化し、平滑末端にして、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ−ＸｃａＩリンカーに再連結して、クローン４２２ａ−Ｉを作製した（図１２）。このＥｃｏＲＩリンカーを作製するために使用するＯＤＮの配列を表４に挙げる。クローン４２２ａ−ＩをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、融合タンパク質ＬＣ発現カセットの存在下で、Ｔ４リガーゼによって閉環して、クローン４２２ａ−ＩＩを作製した（図１２）。この融合タンパク質ＬＣ発現カセットは、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでクローンｐＢＳ−ＬＣ−１を消化することによって生成した。クローンｐＢＳ−ＬＣ−１は、ＥｃｏＲＶ消化ｐＢＳ（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）、Ｔ４リガーゼおよびクローン４２３ａをＳｓｐＩで消化することによって生成した融合タンパク質ＬＣ発現カセットから作製した（図１２）。同時に、ＳＶ４０プロモーターおよびＣ型肝炎ウイルスポリＡ領域を含有するマウスＤＨＦＲ発現カセットを、ｐＦＲ４００プラスミド（ｐＤＨＦＲと称する）から、このプラスミドをＳｍａＩおよびＳａｌＩで消化することによって作製した（図１２）。最終的な融合タンパク質タンデムベクターは、ＤＨＦＲ発現カセットをＸｃａＩ消化クローン４２２ａ−ＩＩにサブクローニングし、その後Ｔ４リガーゼで閉環することによって作製した（図１２）。この融合タンパク質タンデムベクターを制限エンドヌクレアーゼによって分析し、１１ｋｂプラスミドをＰｖｕＩによって直線化した（図３Ｇ、列１）。１．８ｋｂ融合タンパク質ＬＣおよび１．５ｋｂＤＨＦＲ発現カセット、および融合タンパク質ＨＣ発現カセットを含む８ｋｂベクター主鎖は、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することによって遊離した（図３Ｇ、列２）。タンデムベクターは、両方向からＤＮＡの配列決定を行い、融合タンパク質ＨＣ、融合タンパク質ＬＣ、およびＤＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列をそれぞれ図１４、１５および１６に示す。融合タンパク質ＨＣおよびＬＣの計算されたＭＷは、それぞれ６２２２０および２５７６０Ｄａで、融合タンパク質ＨＣの任意の炭水化物含量は計算に入れていない。
実施例２
融合タンパク質タンデムベクターによるＣＨＯ細胞のエレクトロポレーションおよびバイオリアクターでの培養。融合タンパク質タンデムベクター（図１２）をＰｖｕＩで直線化して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にエレクトロポレーションし、その後Ｇ４１８（３７５μｇ／ｍｌ）で３週間選択した。９６ウェルプレートにおいて、ヒトＩｇＧ１ ＨＣおよびヒトカッパＬＣの両方に対する２種類の１次抗体を使用するヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡによって、陽性クローンを検出した。導入遺伝子のコピー数が多い細胞系を、ＭＴＸを６００ｎＭまで段階的に増加させることによって選択した。ＭＴＸ選択細胞系をＴ１７５フラスコ中で増殖させ、次にＣＨＯ細胞無血清培地（ＳＦＭ）の１０Ｌ量を有する２０Ｌバイオリアクターに移した。図１７に示したように、ＣＨＯ細胞をバイオリアクター中において１０００万生細胞／ｍＬを超える高密度で潅流様式によって約５０日間維持した。融合タンパク質のこれらの細胞による分泌は、ヒトＩｇＧまたはヒトＢＤＮＦのいずれかに対する抗体を使用したＥＬＩＳＡによって検出した。図１８に示したように、融合タンパク質は、ＨＩＲＭＡｂ重鎖のカルボキシル末端に対してｖＢＤＮＦが１：１で融合したものであり、融合タンパク質重鎖が形成される。図１８に示したように、重鎖は軽鎖と結合する。したがって、融合タンパク質は、（ｉ）ヒトＩｇＧ１ ＨＣ、（ｉｉ）ヒトカッパＬＣ、または（ｉｉｉ）ヒトＢＤＮＦの３種類の抗体と同等によく反応するはずである。図１９に示したように、抗ヒトＩｇＧ抗体または抗ヒトＢＤＮＦ抗体のいずれかをＥＬＩＳＡで使用することによって、ＣＨＯ細胞培地における融合タンパク質の測定値は比例している。これらのＥＬＩＳＡの結果は、免疫細胞化学（ＩＣＣ）によって確かめられており、ＴＶ−１２０で形質移入したＣＨＯ細胞がヒトＩｇＧまたはヒトＢＤＮＦに対する抗体と免疫応答し、ＢＤＮＦ免疫シグナルは組換えＢＤＮＦによる抗ＢＤＮＦ抗体の吸収によって除去されることが示された。
実施例３
バイオリアクターによって生成した融合タンパク質の精製および特徴付け。潅流様式でバイオリアクターから得られた調整培地を１μｍフィルターに通過させて、培地を滅菌条件下で２００ＬＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓ容器に収集し、バイオリアクターに隣接したガラス製扉の冷蔵庫内で４℃に維持した。次に、細胞残渣を除去するために、調整培地２００Ｌのバッチを１μｍおよび０．４μｍの予備フィルターに通過させた。次いで、この培地をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）で濃縮した。ＴＦＦシステムは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２モデルで、分子量のカットオフ値が３０ｋＤａで、総表面積が２．５ｃｍ２である０．５ｍ２濾過カセットから構成される。膜間に１５ＰＳＩの勾配が生じ、２時間以内に２００Ｌから２Ｌに体積が減少する。濃縮した培地を、ＰｒｏｓｅｐＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）組換えプロテインＡアフィニティーカラム１００ｍＬで溶出する前に、０．２２μフィルターに通過させた。試料添加後、カラムを緩衝液Ａ（ＮａＣｌ ０．０２５Ｍ、Ｔｒｉｓ ０．０２５Ｍ、ｐＨ＝７．４、ＥＤＴＡ ３ｍＭ）で洗浄した。ＣＨＯ細胞宿主タンパク質（ＣＨＯＰ）の溶出は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ検出器でＡ２８０でモニターした。融合タンパク質は、クエン酸０．１Ｍ（ｐＨ３）で溶出し、すぐにｐＨ７まで中和するためにＴｒｉｓ塩基を含有した試験管に入れた。中和した酸溶出収集物を、電気伝導率が＜７ｍＳになるまで、２回蒸留水で希釈し、この物質をＴｒｉｓ、０．０２Ｍ、ｐＨ＝７．５で平衡化したセファロースＳＰ陽イオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）５０ｍＬに添加した。Ｔｒｉｓ緩衝液で洗浄後、残存するＣＨＯＰを、ＮａＣｌ、０から１ＭのＮａＣｌ直線勾配で融合タンパク質から分離した。融合タンパク質ピークを収集し、緩衝液を交換し、分子量カットオフ値３０ｋＤａのＭｉｌｌｉｐｏｒｅダイアフィルトレーションで濃縮した。最終濃度の抗体溶液を滅菌濾過（０．２２μｍ）し、４℃で保存した。融合タンパク質は、図２０に示したように、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で均一になるまで精製した。融合タンパク質重鎖の大きさは、５４ｋＤａであるＨＩＲＭＡｂ重鎖の大きさと比較して６８ｋＤａであった。融合タンパク質とＨＩＲＭＡｂ重鎖の大きさの違いは、融合タンパク質の各重鎖に融合した付加ｖＢＤＮＦ単量体（１４ｋＤａ）を反映している。この融合タンパク質は、ウェスタンブロッティング上で抗ヒトＩｇＧ抗体と抗ヒトＢＤＮＦ抗体の両方と、予測した免疫反応バンドの分子量の大きさで反応する（図２１）。等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、組換えＢＤＮＦの導電点（ｐＩ）がＰＩ＞１０で強い陽イオンであることを示している（図２２）。融合タンパク質で観察されたｐＩは８．５で、ＨＩＲＭＡｂのｐＩと近似している（図２２）。融合タンパク質で観察されたｐＩ、８．５は、融合タンパク質ＨＣが９．０４で、ＬＣが５．２７である算出されたｐＩと矛盾しなかった（ｈｔｔｐ：ｓｃａｎｓｉｔｅ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）。
実施例４
融合タンパク質は、２機能性であり、ヒトインシュリン受容体およびヒトｔｒｋＢ受容体の両方に高い親和性で結合する。融合タンパク質のＨＩＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への親和性は、レクチンアフィニティー精製ＨＩＲ ＥＣＤを使用した競合的リガンド結合測定法（ＣＬＢＡ）で測定した。ＨＩＲ ＥＣＤを永久的に形質移入したＣＨＯ細胞を無血清培地（ＳＦＭ）中で増殖させ、ＨＩＲ ＥＣＤをコムギ胚芽凝集素アフィニティーカラムで精製した。ＨＩＲ ＥＣＤをＮｕｎｃ−Ｍａｘｉｓｏｒｂ９６ウェル皿に播種し、マウスＨＩＲＭＡｂのＨＩＲ ＥＣＤに対する結合は、結合測定法のリガンドとして［１２５Ｉ］マウスＨＩＲＭＡｂを添加した後、放射活性測定法によって検出した（図２３Ａ）。［１２５Ｉ］マウスＨＩＲＭＡｂのＨＩＲ ＥＣＤへの結合は、図２３Ｂに示したように、非標識融合タンパク質またはＨＩＲＭＡｂを添加することによって置換された。ＣＬＢＡは、ＨＩＲＭＡｂまたは融合タンパク質と同程度の結合を示す。高親和性および低親和性結合部位モデルを使用したスキャッチャード分析および非線形回帰分析を実施して、融合タンパク質のＨＩＲへの結合の親和定数を決定した。融合タンパク質およびＨＩＲＭＡｂは両方とも、高い親和結合定数、Ｋｉ＝０．６３±０．０７ｎＭでＨＩＲに等しく十分に結合する（図２３Ｂ）。
ｔｒｋＢ ＣＬＢＡは、融合タンパク質の組換えヒトｔｒｋＢ ＥＣＤへの親和性を測定するために設計された。ｔｒｋＢ ＣＬＢＡの設計は、測定中の非特異的結合の程度を高める原因となり、測定の感度を低くしてしまうＢＤＮＦの陽イオン特性のために困難であった。ＢＤＮＦの非特異的結合は、タンパク質に２０００Ｄａポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合することによって排除することができた。２機能ＰＥＧ分子、ビオチン−ＰＥＧ２０００−ヒドラジド（Ｈｚ）は、商業的に入手し、図２４Ａに概略したように、ＢＤＮＦに結合させて、ＢＤＮＦ−ＰＥＧ２０００−ビオチンを作製した。この分子は、ＣＬＢＡの「トレーサー」として使用した。ｔｒｋＢ ＥＣＤは、ＥＬＩＳＡプレートに吸収され、ＢＤＮＦ−ＰＥＧ２０００−ビオチンのｔｒｋＢに対する結合は、アビジンおよびビオチンペルオキシダーゼによって比色測定によって検出した（図２４Ａ）。予備研究によって、ＥＬＩＳＡシグナル（Ａ４９０）はウェルに添加したｔｒｋＢの量に正比例した。さらに、この測定法のブランクは非常に低く、ｔｒｋＢをプレートに入れない場合のＡ４９０は＜０．０４であった。ＢＤＮＦ−ＰＥＧ２０００−ビオチンのｔｒｋＢ ＥＣＤへの結合は、組換えＢＤＮＦ（図２４Ｂ）または融合タンパク質（図２４Ｃ）によって競合的に置換された。非線形回帰分析を使用した結合データのスキャッチャード分析は、図２４Ｂおよび２４Ｃにそれぞれ示したように、ＢＤＮＦまたは融合タンパク質のｔｒｋＢへの結合のＫｉの算出を可能にした。融合タンパク質のｔｒｋＢへの親和性は、組換えＢＤＮＦの親和性と統計学的な差はなかった（図１９、Ｂ、Ｃ）。この測定法の非特異的結合（ＮＳＢ）は、ＢＤＮＦまたは融合タンパク質と同程度であった。ＮＳＢはおそらく、ニューロトロフィンのｔｒｋＢ細胞外ドメインへの非直線的な協同的結合を表している。図２４に示したｔｒｋＢ ＣＬＢＡの結果は、融合タンパク質のｔｒｋＢ受容体に対する親和性が、ｖＢＤＮＦのＨＩＲＭＡｂ重鎖のカルボキシル末端に融合した後も変化しないことを示している。
ＢＤＮＦなどのニューロトロフィンは、生物学的活性があり、コグネイト受容体、例えば、ｔｒｋＢに高い親和性で結合するホモ二量体構造を強制的に形成することが必要である。図１８に例示したように、２個のＢＤＮＦ分子の間に天然に生じるホモ二量体構造は、ニューロトロフィンがＩｇＧ分子のＣＨ３領域のカルボキシル末端に融合した場合に形成された。ＨＩＲＭＡｂ重鎖に融合したにもかかわらず（図１８）、ＢＤＮＦのｔｒｋＢに対する親和性の高い結合が維持されるという驚くべき所見（図２４）は、ＢＤＮＦは通常ｔｒｋＢに二量体として結合するという事実と一致する。
実施例５
低酸素症に罹ったヒト神経細胞は、組換えＢＤＮＦと同等の活性を備えた融合タンパク質によって神経保護される。ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経細胞をレチノイン酸１０μＭに７日間曝露して、ｔｒｋＢ、ＢＤＮＦ受容体の遺伝子発現を誘導した。次に、この細胞を、酸素センサーを備えた密封した容器内で１６時間酸素遮断した。その後、興奮毒性の神経損傷を４時間再度酸素添加することによって誘導した（図２５Ａ）。この４時間の再酸素添加の間に、細胞は何も処理しないか、等モル濃度のヒト組換えＢＤＮＦまたは融合タンパク質に曝露した。図２５Ｂに示したように、この融合タンパク質は、興奮毒性虚血再酸素添加に曝露したヒト神経細胞における神経保護の誘導に関して、天然のヒトＢＤＮＦと効力が等しかった。
実施例６
融合タンパク質の、単離されたヒト脳毛細血管内のヒト血液脳関門インシュリン受容体に対する高い結合親和性。単離されたヒト脳毛細血管は、ヒトＢＢＢのｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系として使用されている（図２６Ａ）。この融合タンパク質は、３Ｈ−Ｎ−スクシニミジルプロピオネートで放射標識され、ヒトＢＢＢのＨＩＲに結合する融合タンパク質の放射性受容体測定法（ＲＲＡ）を確立するためにヒト脳に添加された。［３Ｈ］−融合タンパク質は、非標識融合タンパク質によって結合が自己阻害されるので、ＢＢＢに特異的に結合している（図２６Ｂ）。マウスＨＩＲＭＡｂ（ｍＨＩＲＭＡｂ）はまた、ヒトＢＢＢに対する［３Ｈ］−融合タンパク質の結合を阻害するので、この融合タンパク質は、ヒトＢＢＢのインシュリン受容体に結合される。図２６Ｂの結合データを非線形回折分析でスキャッチャードプロットに当てはめると、結合定数：ＫＤ＝０．５５±０．０７ｎＭ、Ｂｍａｘ＝１．３５×０．１０ｐｍｏｌ／ｍｇｐ、およびＮＳＢ＝０．３９±０．０２ｐｍｏｌ／ｍｇｐが得られ、ＫＤは解離定数であり、Ｂｍａｘは最大結合であり、ＮＳＢは不飽和結合である。ＫＤは＜１ｎＭで、融合タンパク質がヒトＢＢＢ上のＨＩＲに非常に高い親和性で結合することを示している。
実施例７
成体アカゲザルによる融合タンパク質の薬物動態および脳への取り込み。融合タンパク質を、比活性が２．０μＣｉ／μｇになるまで［３Ｈ］−Ｎ−スクシニミジルプロピオネートでトリチウム標識した。５歳のメスアカゲザル、体重５．２ｋｇに、７４６μＣｉ（３７３μｇ）の用量を１回静脈注射することによって投与し、１８０分間かけて複数の時点で血清を採取した。麻酔し、一晩絶食させた霊長類の血清グルコースは、実験期間１８０分の間ずっと一定で、平均７２±２ｍｇ％で、このことは、ＨＩＲＭＡｂをベースにした融合タンパク質の投与が内在性インシュリン受容体の妨害を引き起こさず、糖血症の制御に影響を及ぼさないことを示している。
麻酔したアカゲザルから取り出した血清の総放射活性（図２７Ａ）、およびトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）によって沈殿可能な放射活性（図２７Ｂ）を分析した。薬剤を注射してから１８０分後、動物を安楽死させ、脳の放射活性は、アカゲザルにおける［１２５Ｉ］標識マウスＨＩＲＭＡｂの脳への取り込みに関する予備実験と同様の毛細血管欠乏法（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）（図２７Ｃ）で分析した。［３Ｈ］融合タンパク質の比活性をベースにして、図２７Ｄに示したように、脳放射活性を脳グラム（ｇ）当たりｎｇに変換し、このレベルを成体霊長類脳で報告されたＢＤＮＦ内在濃度と比較した。
血漿薬物動態分析（図２７Ａ）は、遺伝子操作されたＨＩＲＭＡｂおよびＢＤＮＦの融合タンパク質は、元のマウスＨＩＲＭＡｂと同じ速度で血液から除去されることを示している。これは、ＢＤＮＦ、陽イオン性の高いタンパク質のＨＩＲＭＡｂへの融合は、ＨＩＲＭＡｂの血液クリアランスを加速しないことを示しているので、重要な発見である。予備研究によって、陽イオン性ＢＤＮＦをモノクローナル抗体に結合すると、ＢＤＮＦの陽イオン性によって、抗体の血液クリアランスを大いに加速し、肝臓での取り込みを大いに促進することが示されている。図２７Ａの実験は、陽イオン性ＢＤＮＦをＩｇＧ融合タンパク質として再度操作すると、血漿での薬物動態がＩｇＧ部分によって支配され、ＢＤＮＦの血液レベルが長期間高く維持されることを示している。
図２７Ｂのデータは、ＢＤＮＦがＩｇＧ融合タンパク質として再調製されると、血中のニューロトロフィンの代謝安定性が天然ＢＤＮＦと比較して大いに増強されることを示している。その陽イオン性のため、天然ＢＤＮＦは迅速に血液から除去され、ＴＣＡ可溶性放射活性代謝物に迅速に分解された（図２７Ｂ）。しかし、標識融合タンパク質のＴＣＡ不溶性型は、霊長類において、静脈注射後３時間高く維持される（図２７Ｂ）。図２７Ａ、Ｂのデータは、融合タンパク質としてニューロトロフィン医薬品を再遺伝子操作することの利点を示している。天然のニューロトロフィンは、血液から迅速に除去され、迅速に分解された。しかし、ＩｇＧ−ニューロトロフィン融合タンパク質を作製した場合、ニューロトロフィンの血漿薬物動態プロファイルおよび代謝安定性プロファイルは、ＩｇＧ分子と類似している。
天然ＢＤＮＦはＢＢＢを通過して輸送されない。同様に、静脈注射して１８０分後のＩｇＧの脳の量分布（ＶＤ）は血漿量、１８μＬ／ｇと等しかったので、［３Ｈ］−マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ制御抗体は、成体アカゲザルにおいてＢＢＢを通過して輸送されなかった（図２７Ｃ、白い棒）。反対に、［３Ｈ］融合タンパク質の脳ＶＤは、１４０μｌ／ｇ脳を上回った（図２７Ｃ、黒い棒）。毛細血管欠乏分析は、脳の脈管構造を脈管後上清（ｐｏｓｔ−ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）から分離し、脳脈管構造による薬剤の単純な隔離とは対照的に、ＢＢＢを通過した脳内への薬剤の輸送の検出を可能にする。［３Ｈ］融合タンパク質の脈管後上清の脳ＶＤは、脳ホモジェネートのＶＤと等しく（図２７Ｃ）、融合タンパク質がＢＢＢを通過し、脳実質に輸送されることを示している。
融合タンパク質の脳ＶＤは、［３Ｈ］−融合タンパク質の比活性をベースにして、脳１グラム当たりの融合タンパク質ｎｇに変換し、図２７Ｄに示したように２４±１ｎｇ／ｇで、これによって脳内の融合タンパク質の総重量の計算が可能になった。この値は、成体霊長類のＢＤＮＦの内在性脳濃度よりも＞１０倍高い（４５）。したがって、アカゲザル５．２ｋｇに対して３７３μｇの用量の投与は、融合タンパク質７２μｇ／ｋｇの標準化用量と等しく、ＢＤＮＦの脳濃度の著しい上昇をもたらす。静脈内投与後のこのような脳ＢＤＮＦの上昇は、天然ＢＤＮＦはＢＢＢを通過しないので天然ＢＤＮＦでは起こり得ない。しかし、ＢＤＮＦを融合タンパク質の形態に再度遺伝子操作すると、脳内のニューロトロフィンの薬理学的活性レベルが実現する（図２７Ｄ）。
このデータは、（１）融合タンパク質の血漿平均滞留時間（ＭＲＴ）、３１２分は、天然ＢＤＮＦのＭＲＴの３．０分よりも１００倍長く、（２）融合タンパク質の全身クリアランス、０．９４ｍＬ／分／ｋｇは、３７ｍＬ／分／ｋｇであるＢＤＮＦの全身クリアランスよりも３９倍遅かったことを示している。言い換えると、組換えタンパク質の平均血液濃度は、組換えタンパク質をＩｇＧ融合タンパク質として再調製した場合、１００倍超に達した。したがって、ＢＤＮＦの分子版トロイの木馬への融合は２つの利点を有する。（１）ＢＤＮＦ単独ではＢＢＢを通過できないが、分子版トロイの木馬は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過してＢＤＮＦを運搬し、（２）ＢＤＮＦ自体は血液中で約３分しか持続しないが、分子版トロイの木馬はニューロトロフィンの血液からの迅速な消失を防御した。これらの特性はいずれも、血流中に投与した後、脳内のＢＤＮＦの薬理学的効果を増強するのに役立つ。例えば、表５参照のこと。
Figure 0005941607
実施例８
ＢＮＤＦおよびＢＢＢ分子版トロイの木馬の結合による局所的脳虚血の神経保護。急性脳卒中を治療する神経保護薬を開発するために、数多くの試みが開発されてきた。神経保護薬は、特定の小分子の場合、毒性が強いか、または、薬剤がＢＢＢを通過できないために効力がないので、今までのところ成功していない。ＢＤＮＦは、齧歯類の実験的脳卒中および局所的脳虚血と同時に脳に直接注射すると、神経保護的である。高分子はＢＢＢを通過しないので、ＢＤＮＦは、頭蓋骨を貫通して脳に直接注射しなければならない。ＢＢＢは、局所脳虚血後早い時間に元通りになり、ＢＤＮＦはＢＢＢを通過しないので、ＢＤＮＦのみを静脈内投与しても、虚血した脳において神経保護効果は表れない。ＢＢＢを通過してＢＤＮＦを輸送するために、ニューロトロフィンをラットトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対するマウスＭＡｂに結合させた。このペプチド様ＭＡｂはＢＢＢを通過してＢＤＮＦを運搬し、結合したＢＤＮＦ−ＭＡｂ結合体は、このＢＤＮＦはＢＢＢを通過し、脳から血液に入ることができるので、実験的脳卒中に遅延的に静脈内投与した後でも神経保護効果が高い。一旦、脳の内側、ＢＢＢの向こう側に入ると、ＢＤＮＦはそのコグネイト受容体、ｔｒｋＢを活性化し、その後虚血したニューロンにおいて神経保護効果を誘発し、一連のアポトーシス死を停止させる。ＢＤＮＦ−ＭＡｂ結合体の神経保護効果は、用量応答効果、時間応答効果を示し、７日目の神経保護効果は、ＢＤＮＦ−ＭＡｂ結合体を１回静脈内投与して１日目の神経保護効果と同一であるので、長期間持続する。例えば、本明細書に全体を参考として援用した、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ（２００１）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８８９：４９〜５６、およびＺｈａｎｇ ａｎｄ Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ（２００１）Ｓｔｒｏｋｅ ３２：１３７８〜１３７４を参照のこと。ＢＤＮＦはＨＩＲに対するＭＡｂに融合され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで両方のヒトＢＢＢに迅速に結合し、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて霊長類ＢＢＢを通過して迅速に輸送されるので、この融合タンパク質は、ヒト脳卒中においても神経保護的である。
実施例９

ＢＮＤＦおよびＢＢＢ分子版トロイの木馬の結合体の全脳虚血における神経保護効果。脳にＢＤＮＦを直接注射するとまた、心停止後に生じ得るような一過性前脳虚血（ＴＦＩ）において神経保護的である。しかし、ＢＤＮＦはＢＢＢを通過せず、ＴＦＩ後の早い時間ではＢＢＢは完全であるので、神経保護が可能である場合でも、静脈内ＢＤＮＦはＴＦＩに神経保護的ではない。反対に、ＢＤＮＦをラットトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対するマウスＭＡｂに結合させると、ＢＢＢを通過してＢＤＮＦを脳内まで運ぶ分子版トロイの木馬として作用し、静脈内ＢＤＮＦはＴＦＩにおいて神経保護的であった。成体ラットを脳電図（ＥＥＧ）が約１０分間平坦線を生じるＴＦＩに罹患させた。動物を蘇生し、その後、４種類の異なる治療薬、（ａ）緩衝液、（ｂ）未結合ＢＤＮＦ、（ｃ）ＢＤＮＦが結合していない受容体特異的ＭＡｂ、および（ｄ）ＢＤＮＦ−ＭＡｂ結合体のうち１種類を静脈内投与した。生理食塩水、未結合ＢＤＮＦまたはＭＡｂ単独で治療した動物の場合、海馬のＣＡ１部分の錐体ニューロンは神経保護されなかった。しかし、ＢＤＮＦ−ＭＡｂ結合体の場合、遅延型静脈内投与後、ＣＡ１錐体ニューロン密度は完全に正常化される。本明細書に全体を参考として援用したＷｕ ａｎｄ Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ（１９９）、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９６：２５４〜２５９を参照のこと。これは、ＢＤＮＦをＢＢＢ分子版トロイの木馬に結合させるならば、ＢＤＮＦを遅延して静脈内投与した後、全脳虚血で強力な神経保護効果があることを示している。ＢＤＮＦの組換え融合タンパク質および受容体特異的ＭＡｂは、脳障害を永久的に防御するために心停止後投与することができた。
実施例１０
ニューロトロフィンが脳細胞を通過できるならば、ＢＤＮＦは脳および脊髄損傷において神経保護的である。ＢＤＮＦはＢＢＢを通過しないので、頭蓋骨を貫通してニューロトロフィンを直接注射するならば、ＢＤＮＦは脳損傷に神経保護的である。ＢＤＮＦはまた、神経毒による興奮毒性損傷に罹患した脳において神経保護的であり、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１に感染した脳において神経保護的である。ＢＤＮＦは急性脊髄損傷においても神経保護的であるが、前脳のＢＢＢと同じように、ＢＤＮＦは血液脊髄関門を通過しないので、ＢＤＮＦは脊椎管に直接注入することによって投与しなければならない。これらの場合全てにおいて、ＢＤＮＦはＢＢＢを通過せず、ＢＢＢは損傷後早い時間では脳損傷内において完全であるので、神経保護効果がまだある場合でも、ＢＤＮＦの静脈投与は神経保護的ではない。反対に、ＢＤＮＦ融合タンパク質は、ＢＤＮＦをＢＢＢ分子版トロイの木馬に融合させ、末梢投与後に血液から脳および脊髄に浸透できるので、静脈投与後のこれらの症状において神経保護的である。
実施例１１
ニューロトロフィンが脳細胞を通過できるならば、ＢＤＮＦは慢性神経変性症状において神経保護的である。ニューロトロフィンがＢＢＢを通過できないならば、ＢＤＮＦなどのニューロトロフィンは末梢投与経路のための薬剤として開発することができる。ＢＤＮＦのキメラＨＩＲＭＡｂへの融合は、プリオン病、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、ＡＬＳ、横断性脊髄炎、運動ニューロン疾患、ピック病、結節性硬化症、リソソーム蓄積症、カナバン病、レット症候群、脊髄小脳失調症、フリードライヒ失調症、視神経萎縮および網膜変性症を含む神経変性疾患ならびに脳加齢の慢性的治療のためにヒトの脳にＢＤＮＦの非侵襲的に輸送する新たな取り組みを提案する。
実施例１２
網膜変性および失明における治療薬としてのＢＤＮＦ。網膜は、脳のように、血液網膜関門（ＢＲＢ）によって血液から保護されている。インシュリン受容体は、ＢＢＢおよびＢＲＢの両方の上で発現し、ＨＩＲＭＡｂは、ＲＭＴを介してＢＲＢを通過して網膜まで治療薬を輸送することが示された（Ｚｈａｎｇ他、（２００３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７：１１〜１８）。ＢＤＮＦはＢＲＢを通過しないので、ＢＤＮＦは、網膜変性において神経保護的であるが、眼球に直接ニューロトロフィンを注射する必要がある。ＨＩＲＭＡｂはＢＲＢを通過してＢＤＮＦを輸送し、したがって、ニューロトロフィンは血液区画から網膜神経細胞に曝露されるので、融合タンパク質は、静脈注射または皮下注射と同程度の非侵襲的な投与経路で、網膜変性および失明を治療するために使用することができた。
実施例１３
うつ病の治療薬としてのＢＤＮＦ。うつ病患者の小集団は、ＢＤＮＦが脳で欠乏している可能性があり、一塩基多形（ＳＮＰ）と感情障害との関連が報告されている。ＢＤＮＦを脳に直接注射すると、齧歯類モデルでは持続性のある抗うつ効果がある。ニューロトロフィンはＢＢＢを通過しないので、ＢＤＮＦは、脳に直接注射しなければならない。融合タンパク質を慢性的に投与することによって、ＢＤＮＦの脳レベルを上昇させる手段を提供し、うつ病患者および脳ＢＤＮＦの産生が減少した患者において治療効果があり得る。
実施例１４
ＩｇＧ融合タンパク質の製造方法。イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）遺伝子の真核細胞系への形質移入には一般的に、ＩｇＧを構成する重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）をコードする別々のプラスミドを細胞系に同時形質移入することが必要である。ＩｇＧ融合タンパク質の場合、組換え治療用タンパク質をコードする遺伝子は、ＨＣまたはＬＣ遺伝子のいずれかに融合させることができる。しかし、この同時形質移入の取り組みでは、ＨＣおよびＬＣ両方の融合遺伝子またはＨＣ融合物およびＬＣ遺伝子を平等に高く取り込む細胞系を選択することが困難である。融合タンパク質の製造の好ましい取り組みは、ＤＮＡの１本鎖上に、ＨＣ融合タンパク質遺伝子、ＬＣ遺伝子、選択遺伝子、例えば、ネオ、および増幅遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含む必要な遺伝子全てを含有する１本のプラスミドＤＮＡを永久的に形質移入された細胞系を作製することである。図１２の融合タンパク質タンデムベクターの図に示したように、ＨＣ融合遺伝子、ＬＣ遺伝子、ネオ遺伝子およびＤＨＦＲ遺伝子は全て、別々の、しかしタンデムなプロモーターおよび別々の、しかしタンデムな転写終止配列の制御下にある。したがって、治療用タンパク質およびＨＣまたはＬＣ ＩｇＧ遺伝子のいずれかの融合遺伝子を含む遺伝子は全て、宿主細胞ゲノムに平等に組み入れられる。
本発明の好ましい実施形態は本明細書に示して説明しているが、このような実施形態を例示のためのみに提供していることは当業者には明らかであろう。本発明を逸脱することのない多くの変種、変更および置換が当業者によって考えられるだろう。本明細書で説明した本発明の実施形態の様々な変更が、本発明の実施において使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を限定し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造およびそれらの同等物はそれらによって網羅されるものである。
キメラＨＩＲＭＡｂの重鎖（ＶＨ）の可変領域、４領域（ＣＨ、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）からなるヒトＩｇＧ１の定常領域をコードするゲノム断片およびＢＤＮＦ変種（ｖＢＤＮＦ）のｃＤＮＡからなる融合遺伝子をコードする真核発現ベクターの遺伝子操作を示した図である。遺伝子の転写は、ヒトＩｇＧ１プロモーター（ＰＲＯ）によって行われる。このベクターは、融合タンパク質の重鎖（ＨＣ）を生成する。 修飾された５’−および３’−リンカーを備えたｖＢＤＮＦｃＤＮＡをコードする細菌発現プラスミドの遺伝子操作を示した図である。 融合タンパク質を生成するタンデムベクター構築における中間体である様々な構造物の大きさを示した臭化エチジウム染色アガロースゲルを示した図である。（Ａ）列１〜２：ＮｒｕＩで消化した図２のプラスミドで、０．４ｋｂのｖＢＤＮＦおよび３．５ｋｂのベクター主鎖を示している。列３：１．４〜０．１ｋｂの範囲の大きさのＭＷ標準物。列４：２３〜０．６ｋｂの範囲の大きさのＭＷ標準物。（Ｂ）列１：０．４ｋｂのｖＢＤＮＦｃＤＮＡは、ポリＡ＋ヒトＵ８７神経膠腫細胞から単離されたＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを使用した、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成される。ＰＣＲプライマー配列を表２に示す。列２および３：パネルＡに示したのと同じ大きさのＭＷ標準物。（Ｃ）列１：ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化した後のクローン４１６。列２：陰性クローン。列３：ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化した後のクローン４００。列４および５：パネルＡで示したのと同じ大きさのＭＷ標準物。（Ｄ）融合タンパク質ＨＣ（列１）およびＬＣ（列２）をコードするＤＮＡの特性のＰＣＲ断片。列３〜４：パネルＡで示したのと同じ大きさのＭＷ標準物。（Ｅ）列１〜４：ＮｈｅＩで消化した後のクローン４２２ａの４種の、異なるが一致しているコピーで、０．４ｋｂの融合タンパク質ＨＣ可変領域（ＶＨ）ｃＤＮＡの遊離が示されている。列５〜６：パネルＡで示したのと同じ大きさのＭＷ標準物。（Ｆ）列１〜４：ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化した後のクローン４２３ａの５種の、異なるが一致しているコピーで、０．７ｋｂの完全なＬＣｃＤＮＡの遊離が示されている。列５〜６：パネルＡで示したのと同じ大きさのＭＷ標準物。（Ｇ）ＰｖｕＩ（列１）およびＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ（列２）によるタンデムベクター（図１２）の制限エンドヌクレアーゼ地図。ＰｖｕＩ（切断１回）によって、約１１ｋｂの予測直線状ＤＮＡバンドが生成した。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる消化によって、融合タンパク質軽鎖（すなわち、１．８ｋｂ）およびＤＨＦＲ（すなわち、１．５ｋｂ）発現カセットの両方が遊離する。約８ｋｂのバンドは、融合タンパク質重鎖発現カセットを含む主鎖ベクターを表す。列３〜４：順番は逆であるが、パネルＡで示したのと同じ大きさのＭＷ標準物。 融合タンパク質ＨＣのカルボキシル末端とｖＢＤＮＦのアミノ末端との間の融合部位のヌクレオチド（配列番号２１）およびアミノ酸（配列番号２２）を示した図である。ＨＩＲＭＡｂ ＨＣとｖＢＤＮＦとの間の３−アミノ酸リンカーならびにｖＢＤＮＦのカルボキシル末端の新たな終止コドンを示す。 プラスミド４１６にクローニングされた融合タンパク質ＨＣ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２３）を示した図である。イタリック体：ヒトＩｇＧ１定常領域イントロン。太字：ヒトＩｇＧ１エキソン配列。下線部：ｖＢＤＮＦ。 融合タンパク質ＨＣのアミノ酸配列（配列番号２４）を示した図である。ＣＨ３領域とｖＢＤＮＦとの間の３−アミノ酸リンカーのように、アミノ酸１９個のシグナルペプチドに下線を引いてある。ＣＨ２内のＮ−結合グリコシル化コンセンサス配列に下線を引いてある。 融合タンパク質ＨＣの様々なドメインのアミノ酸配列（配列番号２５）を示した図である。 融合タンパク質ＨＣをコードする、イントロンのない真核発現ベクター、クローン４２２ａの生成を示した図である。融合タンパク質ＨＣ ｃＤＮＡは、クローン４１６を形質移入した骨髄腫細胞から単離されたＲＮＡの逆転写酵素によって生じたｃＤＮＡをＰＣＲすることによって生成した。 （Ａ）クローン４２２ａに挿入された融合タンパク質ＨＣ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２６）を示した図である。 （Ｂ）（配列番号２７および２８）図Ａに示したヌクレオチド配列から推定される融合タンパク質ＨＣのアミノ酸配列を示した図である。シグナルペプチドの配列には下線が引いてある。 （Ｂ）（配列番号２７および２８）図Ａに示したヌクレオチド配列から推定される融合タンパク質ＨＣのアミノ酸配列を示した図である。シグナルペプチドの配列には下線が引いてある。 融合タンパク質ＬＣをコードする、イントロンのない真核発現ベクター、クローン４２３ａの生成を示した図である。融合タンパク質ＬＣ ｃＤＮＡは、キメラＨＩＲＭＡｂ ＬＣのＶＬを含むヒトカッパＬＣ遺伝子のイントロン／エキソン配列をコードする染色体断片由来のＬＣ遺伝子を生成する発現ベクターを形質移入された骨髄腫細胞から単離されたＲＮＡの逆転写酵素によって生成したｃＤＮＡをＰＣＲすることによって生成した。 （Ａ）クローン４２３ａに挿入された融合タンパク質ＬＣ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２９）を示した図である。 （Ｂ）（配列番号３０および３１）図Ａに示したヌクレオチド配列から推定される融合タンパク質ＬＣのアミノ酸配列を示した図である。シグナルペプチドの配列には下線が引いてある。 融合タンパク質のＨＣおよびＬＣ遺伝子をコードするタンデムベクターの構造物を示した図である。ＴＶは、ｃＤＮＡ発現ベクター、ＨＣについてはクローン４２２ａおよびＬＣについては４２３ａ、ならびにマウスＤＨＦＲの発現カセットをコードする細菌発現プラスミドから操作された。 融合タンパク質ＨＣ遺伝子およびＬＣ遺伝子ならびにタンデムベクターに組み込まれたＤＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３２）を示した図である。 融合タンパク質ＨＣ遺伝子およびＬＣ遺伝子ならびにタンデムベクターに組み込まれたＤＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３２）を示した図である。 融合タンパク質ＨＣ遺伝子およびＬＣ遺伝子ならびにタンデムベクターに組み込まれたＤＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３２）を示した図である。 タンデムベクターヌクレオチド配列分析に基づいて融合タンパク質ＨＣの推定アミノ酸配列を示した図である（配列番号３３および３４）。シグナルペプチド配列には下線が引いてある。 タンデムベクターヌクレオチド配列分析に基づいて融合タンパク質ＨＣの推定アミノ酸配列を示した図である（配列番号３３および３４）。シグナルペプチド配列には下線が引いてある。 タンデムベクターヌクレオチド配列分析に基づいて融合タンパク質ＬＣの推定アミノ酸配列を示した図である（配列番号３５および３６）。シグナルペプチド配列には下線が引いてある。 タンデムベクターヌクレオチド配列分析に基づいてＤＨＦＲの推定アミノ酸配列を示した図である（配列番号３７および３８）。 バイオリアクターで５０日間一定に維持したＣＨＯ細胞の生細胞および全細胞密度を示した図で、ＣＨＯ細胞は、融合タンパク質をコードするタンデムベクターを永久的に形質移入された。 融合タンパク質、（ａ）血液からＢＢＢを通過する輸送を可能にするヒトＢＢＢヒトインシュリン受容体（ＨＩＲ）に結合し、（ｂ）神経保護を導くニューロン上のｔｒｋＢに結合する２機能性分子の構造を示した図である。 ２次抗体がヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（ｘ軸）またはヒトＢＤＮＦ（ｙ軸）のいずれかに特異的である、２種類の異なる「サンドイッチ」免疫測定法の相関を示した図である。どちらの測定法でも１次抗体はヒトカッパ軽鎖に特異的である。ＣＨＯ細胞調整培地中の融合タンパク質の測定レベルは、抗Ｆｃを使用しても、抗ＢＤＮＦ抗体を使用しても同一である。 キメラＨＩＲＭＡｂおよび融合タンパク質の還元（左）および非還元（右）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示した図である。還元条件下では、軽鎖の大きさ、３０ｋＤａは、キメラＨＩＲＭＡｂおよび融合タンパク質と同一であり、融合タンパク質の重鎖の大きさは、ＢＤＮＦが存在するため、キメラＨＩＲＭＡｂ重鎖より約１５ｋＤａ大きい。非還元条件下では、キメラＨＩＲＭＡｂおよび融合タンパク質はそれぞれ、分子量１８０および２００ｋＤａの単一な異種四量体種として移動する。 （左図）抗ヒトＩｇＧ１次抗体のウェスタンブロットを示した図である。融合タンパク質およびＨＩＲＭＡｂの重鎖の大きさはそれぞれ、６４ｋＤａおよび５０ｋＤａであり、融合タンパク質またはキメラＨＩＲＭＡｂの軽鎖の大きさは２５ｋＤａである。（右図）融合タンパク質またはＢＤＮＦには反応するが、キメラＨＩＲＭＡｂには反応しない抗ヒトＢＤＮＦ抗体によるウェスタンブロットを示した図である。ＭＷ標準物（ＳＴＤＳ）は、右側に示してある。 等電点（ｐＩ）標準物（列１）、キメラＨＩＲＭＡｂ（列２および４）、ＢＤＮＦ（列３）および融合タンパク質（列５）の等電点電気泳動（ＩＥＦ）を示した図である。ＢＤＮＦは、ｐＩ＞１０で強い陽イオンである一方、融合タンパク質のｐＩはキメラＨＩＲＭＡｂのｐＩに近似しており、約８．５で、融合タンパク質の理論的ｐＩに近い。 （Ａ）ヒトインシュリン受容体（ＨＩＲ）競合リガンド結合測定法（ＣＬＢＡ）の概略を示した図である。ＨＩＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に［１２５Ｉ］標識マウスＨＩＲＭＡｂを結合させ、図Ｂに示したように、この結合をキメラＨＩＲＭＡｂまたは融合タンパク質のいずれかと競合的に置換させる。（Ｂ）キメラＩＨＲＭＡｂまたは融合タンパク質のいずれかによる、ＨＩＲ ＥＣＤに対する［１２５Ｉ］標識マウスＨＩＲＭＡｂの結合の置換を示した図である。ＨＩＲ ＥＣＤに対するキメラＨＩＲＭＡｂの親和性は高く、ＨＩＲ ＥＣＤに対する融合タンパク質の親和性は、キメラＨＩＲＭＡｂの親和性と有意差があるとはいえない。これらの結果は、キメラＨＩＲＭＡｂ重鎖のカルボキシル末端にｖＢＤＮＦを融合しても、ＨＩＲに対する融合タンパク質の結合を損なわないことを示している。 （Ａ）ｔｒｋＢ競合リガンド結合測定（ＣＬＢＡ）の設計。ＰＥＧリンカーの利点は、それによる修飾でＥＬＩＳＡウェルに対する陽イオンＢＤＮＦの非特異的結合（ＮＳＢ）が排除され、それによってシグナル／ノイズ比の高い測定が得られることである。ｔｒｋＢ ＥＣＤへのＢＤＮＦ−ＰＥＧ２０００−ビオチンの結合は、アビジンおよびビオチンペルオキシダーゼを使用したペルオキシダーゼ系によって検出された。（Ｂ）ｔｒｋＢ ＥＣＤへのＢＤＮＦ−ＰＥＧ２０００−ビオチンの結合は、組換えＢＤＮＦによって競合的に置換される。この結合データは、非線形回帰分析によって分析したところ、ＢＤＮＦ結合のＫＩ、３．５±１．３ｐｍｏｌ／ウェルおよびＮＳＢパラメータが得られた。（Ｃ）ｔｒｋＢ ＥＣＤへのＢＤＮＦ−ＰＥＧ２０００−ビオチンの結合は、融合タンパク質によって競合的に置換される。この結合データは、非線形回帰分析によって分析したところ、融合タンパク質結合のＫＩは２．２±１．２ｐｍｏｌ／ウェルで、天然ＢＤＮＦのＫＩと有意差があるとはいえない。これらのデータは、ｔｒｋＢ受容体に対する融合タンパク質の親和性が天然ＢＤＮＦの親和性と等しいことを示している。 （Ａ）ヒト神経ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における低酸素症−再酸素負荷神経保護測定法の設計を示した図である。細胞をレチノイン酸に７日間曝露して、ｔｒｋＢ、ＢＤＮＦ受容体の遺伝子発現の上方制御を引き起こす。（Ｂ）３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）によるミトコンドリア呼吸の測定に基づいた神経保護測定法。最大の神経保護は、ＢＤＮＦ４ｎＭによって確立され、融合タンパク質４ｎＭは、ヒト神経細胞において、同程度の神経保護レベルを生じる。ＭＴＴレベルは、細胞の約５０％のみがレチノイン酸に応答してｔｒｋＢを誘導するので、低酸素症ではない細胞のレベルにはもどらない。 （Ａ）ヒトＢＢＢのｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系として使用した、ヒト脳から単離された毛細血管の光学顕微鏡写真である。（Ｂ）ヒトＢＢＢ上のＨＩＲに対する［３Ｈ］−融合タンパク質の結合の放射線−受容体測定法。結合は非標識融合タンパク質によって自己阻害される。非線形回帰分析によって飽和データをスキャッチャードプロットに当てはめると、結合パラメータ、ＫＤ＝０．５５±０．０７ｎＭ、Ｂｍａｘ＝１．３５±０．１０ｐｍｏｌ／ｍｇｐが得られる。 成体アカゲザルにおける融合タンパク質の薬物動態および脳への取り込み。（Ａ）麻酔した成体アカゲザルに［３Ｈ］−融合タンパク質または［１２５Ｉ］マウスＨＩＲＭＡｂのいずれかのタンパク質を１回静脈注射した後、［３Ｈ］−融合タンパク質または［１２５Ｉ］マウスＨＩＲＭＡｂの血清濃度を時間に対してプロットする。（Ｂ）麻酔した成体アカゲザルに［３Ｈ］融合タンパク質を、または麻酔した成体ラットの［３Ｈ］−ＢＤＮＦを１回静脈注射した後、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）によって沈殿可能な血清放射活性を時間に対してプロットする。（Ｃ）麻酔した成体アカゲザルに、［３Ｈ］融合タンパク質または［３Ｈ］マウスＩｇＧ２ａのいずれかを１回静脈注射してから１８０分後の脳分布の毛細血管欠乏分析。（Ｄ）融合タンパク質３７３μｇを静脈注射してから１８０分後の融合タンパク質の霊長類脳における濃度を、霊長類脳の内在性ＢＤＮＦ濃度と比較して示した図である。

Claims (58)

  1. そのアミノ末端で、内在性血液脳関門（ＢＢＢ）インシュリン受容体を介してＢＢＢを通過し得るヒトインシュリン受容体に対するモノクローナル抗体（ＨＩＲＭＡｂ）の重鎖カルボキシル末端と共有結合している物質を含む組成物であって、該物質が、配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）であり、該組成物が末梢投与後、脳内の該物質の濃度を平均して少なくとも５ｎｇ／グラム上昇させ、該物質が受容体と結合して神経保護作用を誘導し、該抗体および該物質がそれぞれ、別々の実体としての活性と比較して、それらの活性の少なくとも３０％を保持している、組成物。
  2. 該物質の分子量が４００ダルトンを超える、請求項１記載の組成物。
  3. 該物質が単独では、末梢投与後の治療有効量でＢＢＢを通過しない、請求項１記載の組成物。
  4. 該ＨＩＲＭＡｂがキメラＨＩＲＭＡｂである、請求項１記載の組成物。
  5. 該ＢＤＮＦがヒトＢＤＮＦである、請求項１記載の組成物。
  6. 該ＨＩＲＭＡｂの重鎖が、配列番号２４のアミノ酸２０〜４６２と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項１記載の組成物。
  7. 該ＨＩＲＭＡｂの重鎖と該ＢＤＮＦとの間にリンカーをさらに含む、請求項６記載の組成物。
  8. 該リンカーがＳ−Ｓ−Ｍである、請求項７記載の組成物。
  9. 該軽鎖が、配列番号３６のアミノ酸２１〜２３４と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項８記載の組成物。
  10. 該ＨＩＲＭＡｂがグリコシル化されている、請求項９記載の組成物。
  11. 該物質が配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２を含む、請求項１記載の組成物。
  12. 該ＢＤＮＦが２アミノ酸カルボキシル切断型変種である、請求項１記載の組成物。
  13. 該ＢＤＮＦが、配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１記載の組成物。
  14. 請求項１記載の組成物および血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する第２の抗体と共有結合している第２の物質を含む第２の組成物を含む組成物。
  15. 該第１および第２の物質が異なっており、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する該第１および第２の抗体が同一の抗体である、請求項１４記載の組成物。
  16. 該第２の物質が第２の抗体の重鎖と共有結合している、請求項１５記載の組成物。
  17. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  18. そのアミノ末端で、内在性血液脳関門（ＢＢＢ）インシュリン受容体を介してＢＢＢを通過し得るヒトインシュリン受容体に対するモノクローナル抗体（ＨＩＲＭＡｂ）の重鎖カルボキシル末端と共有結合している物質を含む組成物であって、該物質が、配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２の配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＢＤＮＦであり、該ＨＩＲＭＡｂが重鎖および軽鎖を含み、該物質が受容体と結合して神経保護作用を誘導する、組成物。
  19. 該ＢＤＮＦが、配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１８記載の組成物。
  20. 該ＢＤＮＦが、配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２を含む、請求項１９記載の組成物。
  21. 該ＢＤＮＦが、２アミノ酸カルボキシル末端切断型ＢＤＮＦである、請求項１９記載の組成物。
  22. 該ＨＩＲＭＡｂの重鎖およびＢＤＮＦが、融合タンパク質を形成し、該融合タンパク質の配列が、配列番号２４のアミノ酸２０〜４６２と少なくとも８０％同一である第１の配列および配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２と少なくとも８０％同一である第２の配列を含む、請求項１８記載の組成物。
  23. 該ＨＩＲＭＡｂがグリコシル化されている、請求項２２記載の組成物。
  24. 該ＨＩＲＭＡｂの軽鎖が、配列番号３６のアミノ酸２１〜２３４と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項２２記載の組成物。
  25. 該第１の配列のカルボキシル末端と該第２の配列のアミノ末端との間にペプチドリンカーをさらに含む、請求項２４記載の組成物。
  26. 該リンカーがＳ−Ｓ−Ｍを含む、請求項２５記載の組成物。
  27. 該ＨＩＲＭＡｂがグリコシル化されている、請求項２６記載の組成物。
  28. 該抗体および該物質がそれぞれ、平均してそれらの活性の少なくとも４０％を保持している、請求項１８記載の組成物。
  29. そのアミノ末端で、内在性血液脳関門（ＢＢＢ）インシュリン受容体を介してＢＢＢを通過し得るヒトインシュリン受容体に対するモノクローナル抗体（ＨＩＲＭＡｂ）の重鎖カルボキシル末端と共有結合しているＢＤＮＦを含む、神経障害を治療するための組成物であって、該ＢＤＮＦがＴｒｋＢ受容体と結合して神経保護作用を誘導するのに有効であり、該共有結合しているＢＤＮＦが神経障害を治療するのに有効な量で内在性ヒトインシュリン受容体を介してＢＢＢを通過する、組成物。
  30. 該抗体および該物質がそれぞれ、平均してそれらの活性の少なくとも４０％を保持している、請求項２９記載の組成物。
  31. そのアミノ末端でイムノグロブリンの重鎖カルボキシル末端と共有結合している物質を含む組成物であって、該組成物中の該物質が、該物質単独の血清半減期よりも平均して少なくとも５倍長い血清半減期を有し、該物質が、配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＢＤＮＦであり、該物質が受容体と結合して神経保護作用を誘導し、該イムノグロブリンが内在性血液脳関門（ＢＢＢ）インシュリン受容体を介してＢＢＢを通過し得るヒトインシュリン受容体に対するモノクローナル抗体（ＨＩＲＭＡｂ）である、組成物。
  32. 該抗体および該物質がそれぞれ、平均してそれらの活性の少なくとも４０％を保持している、請求項３１記載の組成物。
  33. 該物質が、受容体と結合してヒトにおいて神経保護作用を誘導する、請求項１または３１記載の組成物。
  34. そのアミノ末端で、内在性血液脳関門（ＢＢＢ）インシュリン受容体を介してＢＢＢを通過し得るヒトインシュリン受容体に対するモノクローナル抗体（ＨＩＲＭＡｂ）の重鎖カルボキシル末端と共有結合している物質を含む、神経障害を治療するための組成物であって、該物質が、配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＢＤＮＦであり、該物質が受容体と結合して神経保護作用を誘導し、該共有結合している物質が神経障害を治療するのに有効な量でＢＢＢを通過し、該物質および該ＨＩＲＭＡｂがそれぞれ、別々の実体としての活性と比較して、平均してそれらの活性の少なくとも３０％を保持している、組成物。
  35. 該ＨＩＲＭＡｂが重鎖および軽鎖を含む、請求項３４記載の組成物。
  36. 該組成物中のＢＤＮＦが、ＢＤＮＦ単独の血清半減期よりも平均して少なくとも５倍長い血清半減期を有する、請求項３５記載の組成物。
  37. 配列番号２４のアミノ酸４６６〜５８２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である物質のアミノ末端とその重鎖カルボキシル末端で共有結合している内在性血液脳関門（ＢＢＢ）インシュリン受容体を介してＢＢＢを通過し得るヒトインシュリン受容体に対するモノクローナル抗体（ＨＩＲＭＡｂ）を含む融合タンパク質であって、該抗体および該物質がそれぞれ、別々の実体としての活性と比較して、平均してそれらの活性の少なくとも３０％を保持しており、該物質が受容体と結合して神経保護作用を誘導する、融合タンパク質。
  38. 該ＨＩＲＭＡｂがキメラＨＩＲＭＡｂである、請求項３７記載の融合タンパク質。
  39. 該ＢＤＮＦが切断型ＢＤＮＦである、請求項３７記載の融合タンパク質。
  40. 該切断型ＢＤＮＦがカルボキシル切断型ＢＤＮＦである、請求項３９記載の融合タンパク質。
  41. 該カルボキシル切断型ＢＤＮＦが、２個のカルボキシル末端アミノ酸を欠如している、請求項４０記載の融合タンパク質。
  42. 該抗体および該物質が、ペプチドリンカーによって共有結合している、請求項３７記載の融合タンパク質。
  43. 該ＨＩＲＭＡｂが重鎖および軽鎖を含む、請求項３７記載の融合タンパク質。
  44. 該融合タンパク質中のＢＤＮＦが、該ＢＤＮＦ単独の血清半減期よりも平均して少なくとも５倍長い血清半減期を有する、請求項３７記載の融合タンパク質。
  45. 該物質が、受容体と結合してヒトにおいて神経保護作用を誘導する、請求項３７記載の融合タンパク質。
  46. ＢＤＮＦを末梢循環からＢＢＢを通過させて輸送するための医薬の製造のための請求項１記載の組成物の使用。
  47. 個体におけるＣＮＳ障害の治療のための医薬の製造のための請求項１記載の組成物の使用。
  48. 経口、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、直腸、頬膜貫通（ｔｒａｎｓｂｕｃｃａｌ）、鼻腔内、経皮および吸入投与からなる群から選択される投与が適用される、請求項４７記載の使用。
  49. 該投与が、静脈内、筋肉内または皮下投与である、請求項４８記載の使用。
  50. 該ＣＮＳ障害が急性ＣＮＳ障害である、請求項４７記載の使用。
  51. 該急性ＣＮＳ障害が、脊髄損傷、脳損傷局所脳虚血および全脳虚血からなる群から選択される、請求項５０記載の使用。
  52. 該組成物が１回投与される、請求項５０記載の使用。
  53. 該組成物が１週間に約１回以下の頻度で投与される、請求項５０記載の使用。
  54. 該ＣＮＳ障害が慢性障害である、請求項４７記載の使用。
  55. 該慢性障害が、慢性神経変性疾患、網膜虚血およびうつ病からなる群から選択される、請求項５４記載の使用。
  56. 前記慢性神経変性疾患が、プリオン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、多発硬化症、横断性脊髄炎、運動ニューロン疾患、ピック病、結節性硬化症、リソソーム蓄積症、カナバン病、レット症候群、脊髄小脳失調症、フリードライヒ失調症、視神経萎縮および網膜変性症からなる群から選択される、請求項５５記載の使用。
  57. 該個体がヒトである、請求項４７記載の使用。
  58. 該組成物が、１から１００ｍｇの用量で投与される、請求項５７記載の使用。
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