JP5931146B2 - １型又は４型過敏症のアレルギー症状抑制剤 - Google Patents

Description

本発明は、パラミロンの効能を利用した１型又は４型過敏症のアレルギー症状抑制剤又は１型過敏症のアレルギー症状抑制剤に関する。

アレルギー性疾患の一つであるアトピー性皮膚炎では、環境抗原（ハウスダスト・花粉・カビ等）に対するアレルギー反応の獲得及びそれに対する過剰反応が起こることにより、痒みを伴う皮膚炎症状を呈すると考えられている。
これらのアレルゲンによる感作が成立するためには、抗原提示細胞による抗原の貪食と抗原情報の提示及びTh2型CD4+T細胞による抗原認識が必要である。
Th2型CD4+T細胞が皮膚病変領域に浸潤し、サイトカインを産出して炎症を惹起する場合（４型過敏症）と、更にリンパ節へ移動したTh2型CD4+T細胞がB細胞のIgEに感作された抹消組織における肥満細胞の脱顆粒による炎症反応が起こる場合（１型過敏症）がある。
人・動物のアトピー性皮膚炎には、この４型過敏症と１型過敏症の双方が関与している。

ユーグレナよりパラミロンを単離し、このパラミロンを含有した健康食品やサプリメント等が開発されているとともに、薬剤等様々な用途に利用する技術が開発されている。

その一例として、例えば、特許文献１には、パラミロンを含有する凍結乾燥した薬剤の技術が開示されている。
特許文献１に記載の技術では、培養したユーグレナ細胞からパラミロンを単離し、このパラミロンを含有させた非経口投与又は経口投与の薬剤を製造する。
そして、その薬剤は、生体用マトリックス、特にプラスター、栄養補助剤としての使用、化粧品成分、医薬成分の投与のため使用される。

また、特許文献２には、肌荒れ等の皮膚疾患を改善する成分として、ユーグレナ属原生生動物が産出するβ-1,3-glucanを含有させる技術が開示されている。
特許文献２の技術では、β-1,3-glucanを基剤等に含有させて塗布したり、食品に含有させて経口投与することにより肌荒れ等の皮膚疾患を改善することができるということが開示されている。

特表２００３−５２９５３８号公報 特開２００４−３３９１１３号公報

このように、ユーグレナより単離されたパラミロンは、様々な用途に使用され実績をあげている。
一方、出願人は、このようにユーグレナより単離されたパラミロンを更に有効に活用するために鋭意研究を重ねた。

本発明の目的は、パラミロンの効能を利用した１型又は４型過敏症のアレルギー症状抑制剤を提供することにある。

上記課題は、請求項１に係る発明である１型又は４型過敏症のアレルギー症状抑制剤によれば、ユーグレナ由来の結晶性の単離精製パラミロンを有効成分とする経口投与用の１型又は４型過敏症のアレルギー症状抑制剤からなることにより解決される。
「結晶性パラミロン」とは、培養されたユーグレナより公知の方法で精製されたパラミロンを指し、通常粉末体として提供される。
つまり、本明細書においては、「アモルファス」との物質的区別を図るべく「結晶性」という文言を使用したものである。

また、具体的には、少なくとも、アレルゲンの感作前から前記アレルゲンの感作時まで、継続して経口投与される１型又は４型過敏症のアレルギー症状抑制剤（但し、前記単離精製パラミロンの低粘度化物及び微粒分散化物を除く）である。
更に、具体的には、前記１型又は４型過敏症のアレルギー症状は、アトピー性皮膚炎若しくは花粉症のアレルギー症状である。
上記のような特性を有した、本発明に係る１型又は４型過敏症のアレルギー症状抑制剤は、食品、薬品、飼料から選択される少なくとも一の製品に含有されて提供されることにより、有効な効果であるアレルギー抑制機能を有効に奏する。

「含有」という文言は、「少なくとも一部に成分として含まれる」という意味であり、「全てがパラミロンで構成される」こともその概念に含む。
このように、本発明に係るパラミロンを有効成分とする１型又は４型過敏症のアレルギー症状抑制剤は、あらゆる形態でアレルギー抑制機能を有する物質として提供され得るとともに、広く活用の場を想定することができ有用である。

本発明に係る１型又は４型過敏症のアレルギー症状抑制剤は、結晶性パラミロンの効能を利用したものである。
この結晶性パラミロンを有効成分とする１型又は４型過敏症のアレルギー症状抑制剤を投与することによって、アレルギー症状が有効に抑制される。
このように、本発明に係る１型又は４型過敏症のアレルギー症状抑制剤は、アレルギー性疾患を有効に抑制するために広く活用することができる。

参考例に係るアモルファスパラミロンの製造工程を示す工程図である。 参考例に係るアモルファスパラミロンの回折ピーク位置確認フルスキャン結果を示すスキャンチャートである。 参考例に係るアモルファスパラミロンの回折強度測定用詳細スキャン結果を示すスキャンチャートである。 実験プロトコルである。 皮膚炎スコア結果を示すグラフである。 耳介の状態及び背面皮膚状態を撮像した写真である。 耳介の厚さを示すグラフである。 皮膚の病理組織を撮像した写真である。 血清総IgE濃度を示すグラフである。 血清IL-4濃度を示すグラフである。 血清IFN−γ濃度を示すグラフである。

以下、本発明の一実施形態を図面に基づいて説明する。
なお、以下に説明する構成は本発明を限定するものでなく、本発明の趣旨の範囲内で種々改変することができるものである。
本実施形態は、培養されたユーグレナより公知の方法で精製された結晶性パラミロンに関するものである。

図１はアモルファスパラミロンの製造工程を示す工程図、図２はアモルファスパラミロンの回折ピーク位置確認フルスキャン結果を示すスキャンチャート、図３はアモルファスパラミロンの回折強度測定用詳細スキャン結果を示すスキャンチャート、図４は実験プロトコル、図５は皮膚炎スコア結果を示すグラフ、図６は耳介の状態及び背面皮膚状態を撮像した写真、図７は耳介の厚さを示すグラフ、図８皮膚の病理組織を撮像した写真、図９は血清総IgE濃度を示すグラフ、図１０は血清IL-4濃度を示すグラフ、図１１は血清IFN−γ濃度を示すグラフである。

図１により、参考例に係るアモルファスパラミロンの製造方法について説明する。
なお、本製造方法は、約４０ｇのアモルファスパラミロンを製造するための例であり、アモルファスパラミロンの製造量を増減させるためには、適宜スケールを変更することにより対応する。手順は同様である。

まず、工程１で、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を調整する。
本実施形態においては、水酸化ナトリウム水溶液を２リットル調整する。
次いで、工程２で、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に結晶性パラミロン粉末を５０ｇ添加して溶解させる。
結晶性パラミロン粉末は、１〜２時間スターラで撹拌することにより、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶解させる。
この結晶性パラミロン粉末は、培養したユーグレナより、公知の方法で分離精製されたものである。

次いで、工程３で、１Ｎ塩酸により、パラミロン粉末が溶解した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を中和する。
なお、１Ｎ塩酸を滴下するに従い、滴下部分がゲル化するが、このゲルをスパーテル等で崩しながら、中和が確認されるまで中和反応を継続する。
中和が完了した時点では、水分がゲルに完全に抱き込まれ、全体がゼリー状となる。

次いで、工程４で、水分を分離すべく、遠心分離を行う。
この遠心分離は、水分が分離し、沈殿を回収することができる条件で行えばよい。
本実施形態においては、１００ｍｌ遠沈管で２５００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行う。

次いで、工程５で、上清を捨て、沈殿の洗浄を行う。
この工程では、蒸留水を沈殿に添加して撹拌し、遠心分離を行う。
つまり、上清廃棄→蒸留水添加→撹拌→遠心分離という工程を繰り返し実施することにより沈殿を洗浄し、沈殿したゲルを回収する。
本実施形態においては、４回の上記洗浄工程を繰り返す。

次いで、工程６で、回収したゲルをバットに広げ、冷凍庫で凍結させ、工程７で凍結乾燥機により凍結乾燥させ、アモルファスパラミロンを得る。
このようにして回収したアモルファスパラミロンは、吸湿性が高いため、ある程度手でほぐした後、乾燥剤を入れたデシケータで保存する。
この操作で、約４０ｇのアモルファスパラミロンを作成することができる。

次いで、参考例に係るアモルファスパラミロンについて説明する。
アモルファスパラミロンの結晶度を測定するために、各パラミロンサンプルのＸ線回折を行った。
サンプルとしては、以下のサンプルを準備した。
（１）サンプル
１．サンプルＡ 結晶性パラミロン
２．サンプルＢ アモルファスパラミロン（３０ｇ生産スケール）
３．サンプルＣ アモルファスパラミロン（１５ｇ生産スケール）
４．サンプルＤ アモルファスパラミロン（５ｇ生産スケール）
これらのサンプルは、粉砕機により粉砕された後、Ｘ線回折装置により分析される。
なお、サンプルＡは、結晶性パラミロン粉末であるが、サンプルＢ乃至サンプルＤを粉砕するため、前処理条件を同一とする目的で粉砕処理を実施した。
また、サンプルＡは対照であり、アモルファス化されたパラミロンであるサンプルＢ乃至サンプルＤのサンプルＡに対する相対結晶度を算定した。

（２）前処理
１．粉砕器
Retsh社製ボールミルMM400
粉砕条件：振動数２０回／秒、粉砕時間５分
２．Ｘ線回折装置
スペクトリス社製H’PertPRO
測定条件：管電圧４５KV、管電流４０mA
測定範囲：２θ ５〜７０°（回折ピーク位置確認フルスキャン）
２θ ５〜３０°（強度測定用詳細スキャン）

（３）分析
１．ピーク位置確認
フルスキャンで回折ピーク位置を確認し、回折ピーク強度測定に用いる角度を決定した。
２．回折ピーク強度測定
上記ピーク位置確認で決定した角度で詳細スキャンを実施し、回折ピーク強度を測定した。
その結果を基に、回折ピーク強度比を相対結晶度として算出した。

（４）結果
１．ピーク位置確認
回折ピーク位置確認フルスキャンの結果を図２に示す。
図２に示すとおり、サンプルＡにおいて、２θ＝２０°の付近に顕著なピークを観測することができた。
よって、強度測定用詳細スキャンを行う範囲を２θが５°乃至３０°の範囲と決定した。
２．強度測定結果
強度測定用詳細スキャンの結果を図３に示す。
図３に示すように、サンプルＢ乃至サンプルＤにおける２θ＝２０°の付近の回折ピークが、サンプルＡの回折ピークに比して小さくなっていることが認められ、このことより、サンプルＢ乃至サンプルＤの結晶度がサンプルＡの結晶度に比して小さくなっていることがわかる。
３．結晶度算出
強度測定結果とアモルファスパラミロンのサンプルであるサンプルＢ乃至サンプルＤの相対結晶度の算出結果を表１に示す。

相対結晶度は、強度測定結果に基づき下式にて算出する。
相対結晶度（％）＝（サンプル回折ピーク強度／対照回折ピーク強度）×１００
つまり、対照である結晶性パラミロンの結晶度を１００％とし、アモルファス化したパラミロンの結晶度を算出したものである。
このように、アモルファスパラミロンの相対結晶度は、相対結晶度２０％以下程度であると考えられ、より詳しくは、相対結晶度１６％以下となっていることがわかる。

なお、回折ピーク位置確認フルスキャンの結果である図２には、その他、２θ＝２０°付近のピークの他に、数本のシャープなピークが存在する。
これは、サンプルＢ乃至サンプルＤに共通に現れていることから、同様の構造によるものであると考えられ、このことからも、アモルファス化によって、結晶構造が変化し、結晶性パラミロンとは異なる構造となったことがわかる。

これは、元は３重螺旋であったβ-1,3-glucanの結晶構造が、アモルファス化を行うことによって無くなり、β-1,3-glucanの螺旋構造ではない立体構造のピーク若しくはノーマルな一本鎖のβ-1,3-glucanのピーク等が現れている可能性があると推測される。

次いで、効果の一例を示す。
アトピー性皮膚炎モデルマウスを使用した。
実験方法について説明する。
まず、ＮＣ／Ｎｇａマウス、オス、５週齢を購入し、１週間の馴致飼育の後、図４に示すプロトコルに基づき実験及び評価を行った。
ＮＣ／Ｎｇａマウスとは、皮膚炎を自然発症させることを目的として作成された自然発症皮膚炎モデルマウスである。
ＮＣ／Ｎｇａマウスには、被検物質を所定量混入した粉末飼料及び被検物を混入しない粉末飼料（陰性及び陽性コントロール）を試験期間中、毎日自由に摂取させた（試験期間：５４日）。
被検物質投与後７日目に背部及び腹部を毛刈し、接触皮膚炎感作性物質トリニトロクロルベンゼン（2,4,6-Trinitrochlorbenzene：以下「ＴＮＣＢ」）溶液を感作のために胸・腹部・後肢（フットパット）に１５０μｌ塗布した。
ＴＮＣＢ溶液は、９９．５％エタノール：アセトン＝４：１の割合で混合した溶液に、ＴＮＣＢを５％の濃度で溶解させたものを使用した。
感作後４日目以降１週間おきにＴＮＣＢ溶液を背部及び左右耳介両面に塗布した。
ＴＮＣＢ溶液は、背部に１３０μｌ、耳介一面に対して１０μｌずつ塗布した。
感作後４７日目に安楽死を施し、背部皮膚、左右耳介、血液を採取し、各評価を実施した。

実験群は、
ａ．陰性コントロール（ＴＮＣＢ非感作）：標準飼料投与
ｂ．陽性コントロール：標準飼料投与
ｃ．培養されたユーグレナより公知の方法で精製された結晶性パラミロン０．１％投与（飼料に混合）
ｄ．培養されたユーグレナより公知の方法で精製された結晶性パラミロン１％投与（飼料に混合）
ｅ．アモルファスパラミロン０．１％投与（飼料に混合）
ｆ．アモルファスパラミロン１％投与（飼料に混合）
とした。
各、ｎ＝１０である。

（１）皮膚炎スコア
結果を、図５に示す。
図５は、皮膚炎スコアの結果を示す。
皮膚炎スコアとは、
ａ．発赤・出血
ｂ．浮腫
ｃ．擦傷・表皮剥離・組織欠損
ｄ．乾皮・痂皮
の程度に基づき、０（無兆候）、１（軽微）、２（中程度）、３（重篤）の４段階に評点化し、合計点数をスコアとして示したものである（０〜１２点）。
感作後、０、４、１１、１８、２５、３２、３９、４６、４７日目に評価を実施した。

図５に示すように、陽性コントロール群には、顕著な皮膚炎兆候が認められたことに対し、結晶性パラミロン投与群及びアモルファスパラミロン投与群は、皮膚炎兆候が抑制されていることがわかる。
そして、陽性コントロール群と、結晶性パラミロン投与群及びアモルファスパラミロン投与群との間には、有意差が認められ（有意水準５％）、有効に皮膚炎兆候が抑制されていることが検証された。

（２）耳介肥厚
感作後、０、４、１１、１８、２５、３２、３９、４６、４７日目における耳介の厚さをダイヤルシックネスゲージ（型式Ｇ−６Ｃ、株式会社尾崎製作所）にて測定した。
結果を図６(写真)及び図７に示す。

図６に示すように、陽性コントロール群では、耳介が顕著に肥厚及び変形していたことがわかる。
これは、皮膚炎の症状が進行したためである。
これに対して、結晶性パラミロン投与群及びアモルファスパラミロン投与群においては、当該徴候の抑制が認められた。
このように、結晶性パラミロン投与群及びアモルファスパラミロン投与群では、皮膚炎の進行が抑制されていることがわかる。

また、図７に示すように、感作後４７日目における耳介の厚さにおいては、陽性コントロール群と結晶性パラミロン１％投与群との間、陽性コントロール群とアモルファスパラミロン０．１％投与群及びアモルファスパラミロン１％投与群との間、結晶性パラミロン０．１％投与群及び結晶性パラミロン１％投与群とアモルファスパラミロン０．１％投与群及びアモルファスパラミロン１％投与群との間、に有意差（有意水準５％）が認められた。
このように、結晶性パラミロン自体に皮膚炎抑制効果が認められた。

（３）皮膚の病理組織学的所見
各群の皮膚のパラフィン包埋切片を作成し、ＨＥ染色を施した。
結果を図８（写真）に示す。

図８に示すように、陰性コントロール群では、明らかな病理組織学変化が認められなかったことに対し、陽性コントロール群では、表皮の肥厚、角化亢進、真皮における好酸球、肥満細胞、リンパ球をはじめとする炎症細胞の浸潤が観察された。
結晶性パラミロン投与群及びアモルファスパラミロン投与群では、当該組織学的所見の軽減化が認められた。

（４）血清総IgE濃度
マウスIgE測定キット（コスモバイオ、YSE-7675）を用い、ELISA法にて測定を実施した。
結果を図９に示す。

陽性コントロール群では、血清IgE濃度の顕著な上昇が認められたことに対し、結晶性パラミロン投与群及びアモルファスパラミロン投与群では、血清IgE上昇が抑制されていた。
この結果より、パラミロンは、アトピー性皮膚炎の特に１型過敏症を有効に抑制することが分かった。
つまり、アトピー性皮膚炎の１型過敏症は、リンパ節へ移動したTh2型CD4+T細胞がB細胞のIgEに感作された抹消組織における肥満細胞を脱顆粒することによる炎症反応であるため、パラミロンによりIgEを減少させ、本症状を抑制することができることが分かった。
また、この結果より、パラミロンが、アレルギーの一種である花粉症の抑制に有効であることも分かった。
つまり、パラミロンは血清IgE濃度の上昇を抑制するため、花粉のアレルゲンと結合するIgEを減少させ、アレルギー症状を抑制するために有効であることが分かった。
換言すれば、パラミロンは免疫調節機能を有し、アトピー性皮膚炎の１型過敏症及び人の花粉症の症状改善効果を示すことが分かった。

（５）血清サイトカイン
血清サイトカインである血清IL-4濃度及び血清IFN−γ濃度の測定を実施した。
その結果を図１０及び図１１に示す。

図１０に示すように、陽性コントロール群では、血清IL-4濃度の顕著な上昇が認められたことに対し、結晶性パラミロン投与群及びアモルファスパラミロン投与群では、血清IL-4濃度の上昇が抑制されていた。

なお、図１１に示すように、陽性コントロール群では、血清IFN−γ濃度の顕著な上昇が認められた。
結晶性パラミロン各投与群及びアモルファスパラミロン各投与群では、血清IFN−γ濃度の減少傾向が認められた。
図１１に示すように、血清IFN−γ濃度の減少傾向が認められるため、結晶性パラミロン及びアモルファスパラミロンには、血清IFN−γ濃度上昇を抑制する効果があることが分かった。
この結果より、パラミロンは、アトピー性皮膚炎の４型過敏症を有効に抑制することが分かった。
つまり、アトピー性皮膚炎の４型過敏症は、Th2型CD4+T細胞が皮膚病変領域に浸潤し、サイトカインを産出して炎症を惹起するところ、パラミロンはサイトカインを減少させ、有効にアトピー性皮膚炎の４型過敏症を抑制することが分かった。

このように、結晶性パラミロン自体に各アレルギー性疾患を抑制する効果が認められた。

このように、パラミロンは、アレルギー性疾患を有効に抑制するアレルギー抑制物質として機能することが検証された。
本実施形態においては、経口投与したが、投与方法はこれに限られることはなく、本発明の趣旨を逸脱するものでなければ、どのような投与方法でもよい。

つまり、薬品としての使用にとどまらず、他の材料と混和して健康食品として活用することも可能であるし、飼料等としての用途も想定することができる。
以上のように、パラミロンは、アレルギー抑制物質として、広い用途に供することが期待されるものである。

Claims (4)

1. ユーグレナ由来の結晶性の単離精製パラミロンを有効成分とする経口投与用の１型又は４型過敏症のアレルギー症状抑制剤。
2. 少なくとも、アレルゲンの感作前から前記アレルゲンの感作時まで、継続して経口投与されることを特徴とする請求項１に記載の１型又は４型過敏症のアレルギー症状抑制剤（但し、前記単離精製パラミロンの低粘度化物及び微粒分散化物を除く）。
3. ユーグレナ由来の結晶性の単離精製パラミロンを有効成分とする経口投与用の４型過敏症のアレルギー症状抑制剤。
4. ユーグレナ由来の結晶性の単離精製パラミロンを有効成分とする経口投与用のアトピー性皮膚炎若しくは花粉症の１型過敏症のアレルギー症状抑制剤。