JP2021127314A - 口腔用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】口腔内炎症の予防や治療に適した口腔用組成物を提供する。【解決手段】チリコンブ（Durvillaea antarctica）由来のフコイダンを有効成分として含有する口腔内炎症の予防又は治療のための口腔用組成物。当該フコイダンは、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用及び一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用に優れ、口腔内の炎症の予防や治療に適する。【選択図】図８

Description

本発明は、口腔内炎症の予防又は治療のための口腔用組成物に関する。

口腔内炎症性疾患は、口の中の粘膜(唇、舌、頬の内側、歯肉など)に起こる炎症性疾患であり、代表的には唇、舌、頬の内側等に生じる口内炎や歯周組織に生じる歯周炎等が挙げられる。従来より、口腔内炎症性疾患の予防や改善のための口腔用組成物が開発されており、例えば、特許文献１には、アスコルビン酸−２−グリセリドを有効成分とする歯周病予防治療用組成物が開示されている。また、特許文献２には、ハスの抽出物を有効成分とする歯周病予防治療用組成物が開示されている。また、特許文献３には、特定の複合ハイドロタルサイト粒子を含有する口内炎予防治療薬が開示されている。

一方、昆布、ワカメ等の褐藻類が含油する成分であるフコイダンは、様々な生理活性を有することが知られており、医薬品、機能性食品、化粧品等に利用可能とされている。
褐藻類由来のフコイダンは分子量が極めて大きい巨大分子であり（ＭＷ２０万程度）、生体吸収性に乏しいことに加え、強い抗凝血活性を有するため、通常低分子化して用いられる。例えば、特許文献４には、褐藻類由来のフコイダンを分解してマグネシウムを含有する分子量２５０〜５００の分解物を含有する医薬組成物が開示されている。

特開２０１６−１３０２５２号公報 特開２０１４−２４７７１号公報 特開２００９−２３５０５３号公報 特開２００８−１２０７３８号公報

上述のように、従来から口腔内炎症性疾患を対象とした様々な口腔用組成物が報告されているが、フコイダンを有効成分としたものは知られていなかった。また、フコイダンの性質は、原料となる褐藻類の種類のみならず、同じ褐藻類を原料とした場合でも抽出条件等によって異なる場合がある。
かかる状況下、本発明の目的は、口腔内炎症の予防や治療に適したフコイダンを含有する口腔用組成物を提供することである。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、下記の発明が上記目的に合致することを見出し、本発明に至った。

すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
＜１＞ チリコンブ（Durvillaea antarctica）由来のフコイダンを有効成分として含有する口腔内炎症の予防又は治療のための口腔用組成物。
＜２＞ 前記フコイダンの分子量範囲が６０００Ｄａ以上４００００Ｄａ以下である＜１＞に記載の口腔用組成物。
＜３＞ 前記フコイダン１００ｇ当たりの硫酸根含量が９ｇ以上１１ｇ以下である＜１＞または２＜に＞記載の口腔用組成物。
＜４＞ 前記フコイダンが、
下記条件にて測定されたサイズ排除クロマトグラムにおいて、
下記保持時間にピークトップを有するピーク（ｉ）〜（ｉｖ）を有し、
ピーク（ｉ）〜（ｉｖ）の総ピーク面積に対する、ピーク（ｉ）の面積の比が６０％以上６５％以下であるフコイダンである＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の口腔用組成物。
（保持時間）
ピーク（ｉ） ：９．２６〜９．２８分
ピーク（ｉｉ） ：９．７５〜９．７６分
ピーク（ｉｉｉ）：９．９９〜１０．００分
ピーク（ｉｖ） ：１０．２２〜１０．２３分
（測定条件）
測定方法：サイズ排除クロマトグラフィー
カラム：ＯＨｐａｋ ＳＢ-８０６Ｍ ＨＱ（８．０×３００ｍｍ,１３μｍ）
溶離液：超純水
流量：１．０ｍＬ/ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
検出器：蒸発光散乱検出器
試料濃度： ２０．０ｍｇ/ｍＬ
試料注入量：２０μＬ
＜５＞ 前記フコイダンの含有量が１０質量％以上９０質量％以下である＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の口腔用組成物。
＜６＞ 歯周病の予防又は治療のための口腔用組成物である＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の口腔用組成物。
＜７＞ 形態が、タブレット錠である＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の口腔用組成物。
＜８＞ シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害用である＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の口腔用組成物。
＜９＞ 一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制用である＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の口腔用組成物。

また、本発明の他の態様は、以下の通りである。
＜Ａ１＞ チリコンブ由来のフコイダンであって、
下記条件にて測定されたサイズ排除クロマトグラムにおいて、
下記保持時間にピークトップを有するピーク（ｉ）〜（ｉｖ）を有し、
ピーク（ｉ）〜（ｉｖ）の総ピーク面積に対する、ピーク（ｉ）の面積の比が６０％以上６５％以下である、
ことを特徴とするフコイダン。
（保持時間）
ピーク（ｉ） ：９．２６〜９．２８分
ピーク（ｉｉ） ：９．７５〜９．７６分
ピーク（ｉｉｉ）：９．９９〜１０．００分
ピーク（ｉｖ） ：１０．２２〜１０．２３分
（測定条件）
測定方法：サイズ排除クロマトグラフィー
カラム：ＯＨｐａｋ ＳＢ-８０６Ｍ ＨＱ（８．０×３００ｍｍ,１３μｍ）
溶離液：超純水
流量：１．０ｍＬ/ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
検出器：蒸発光散乱検出器
試料濃度： ２０．０ｍｇ/ｍＬ
試料注入量：２０μＬ
＜Ａ２＞ １００ｇ当たりの硫酸根含量が９ｇ以上１１ｇ以下である＜Ａ１＞に記載のフコイダン。
＜Ａ３＞ 分子量範囲が、６０００Ｄａ以上４００００Ｄａ以下である＜Ａ１＞または＜Ａ２＞に記載のフコイダン。
＜Ａ４＞ ＜Ａ１＞から＜Ａ３＞のいずれかに記載のフコイダンを含有するフコイダン組成物。

本発明によれば、口腔内炎症の予防や治療に適したフコイダンを含有する口腔用組成物が提供される。

チリコンブ由来フコイダン（実施例１）のサイズ排除クロマトグラムである。 モズク由来フコイダン（比較例１）のサイズ排除クロマトグラムである。 実施例１の水抽出物のＣＯＸ−１阻害試験の結果である。 実施例１の水抽出物のＣＯＸ−２阻害試験の結果である。 実施例１のエタノール抽出物のＣＯＸ−１阻害試験の結果である。 実施例１のエタノール抽出物のＣＯＸ−２阻害試験の結果である。 実施例１の水抽出物の一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制試験の結果である。 実施例１のチリコンブ由来フコイダンのマウスの口内炎抑制活性の評価結果である。

以下、本発明について例示物等を示して詳細に説明するが、本発明は以下の例示物等に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において任意に変更して実施できる。なお、本明細書において、「〜」とはその前後の数値又は物理量を含む表現として用いるものとする。

＜１．口腔用組成物＞
本発明は、チリコンブ（Durvillaea antarctica）由来のフコイダンを有効成分として含有する口腔内炎症の予防又は治療のための口腔用組成物（以下、「本発明の口腔用組成物」と称す。）に関する。なお、以下、本発明の口腔用組成物が含有するフコイダンを「本発明のフコイダン」と称す場合がある。

本明細書において「口腔内炎症」とは、口腔内に生じる炎症を意味し、具体的には口内炎、口腔粘膜炎、歯肉炎、歯周病等が挙げられる。なお、本明細書において「口腔内炎症の予防」とは、口腔内炎症が生じることを防ぐ、又は口腔内炎症の悪化を防止することを意味し、「口腔内炎症の治療」とは、口腔内炎症の改善及び寛解、並びに口腔内炎症の進展の抑制が含まれる。また、本発明の口腔用組成物は、いずれのステージの口腔内炎症が対象となりうるが、感染初期の炎症や、慢性であっても軽度の口腔内炎症への適用が望ましい。

本発明の口腔用組成物は、任意の口腔内炎症に対する予防や治療作用を有するが、特に歯周病の予防又は治療のために有用である。歯周病は発症初期にみられる歯肉の炎症による腫れや歯肉と歯の隙間（歯周ポケット）からの出血を伴なう歯肉炎と、歯を支える歯槽骨が破壊される歯周炎とに大別されるが、いずれにも予防や治療作用を有する。

本発明の口腔用組成物は、本発明のフコイダンのみから構成されていてもよいし、本発明のフコイダンと任意の成分を組み合わせた組成物であってもよい。任意成分の配合割合は、その目的に応じて適宜選択して決定することができる。
上述の通り、本発明の口腔用組成物は、歯周病の予防又は治療用として有用であるが、歯周病は、歯周病菌により発症するため、歯周病菌の殺菌、増殖抑制作用を有する成分を配合してもよい。この場合、配合する歯周病菌の殺菌、増殖抑制作用を有する成分としては、本発明のフコイダンの作用を著しく阻害することない成分であれば、通常、歯周病菌の殺菌、増殖抑制用として用いられている任意の成分を使用することができる。

実施例に示すように、本発明のフコイダンは、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用に優れる。ＣＯＸ−２は、生体における炎症反応の誘導において重要な役割を果たし、ＮＯは、炎症時に多量に産生された場合には炎症を悪化させる。そのため、本発明のフコイダンを配合した組成物は、ＣＯＸ−２活性を阻害し、ＮＯ産生を抑制することによって、口腔内炎症の予防又は治療をすることが可能である。

以下、本発明のフコイダン及び本発明の口腔用組成物をより詳細に説明する。

一般に、フコイダンは、化学構造がただ一つ決まった分子ではなく、分子量も明確な定義がないため、本明細書においては、「フコイダン」は重量平均分子量が５０００以上であって、主要構成成分としてフコースおよび硫酸基を含む硫酸化多糖と定義する。なお、フコース以外の構成成分としてガラクトース、マンノース、キシロース、グルクロン酸等を含む。

本発明のフコイダンは、チリコンブ（Durvillaea antarctica）由来のフコイダンであって、口腔内炎症の予防又は治療のための薬理作用を有し、ヒトに適用が許容されるものであれば特に限定されない。
本発明において、「チリコンブ由来のフコイダン」とは、実質的に原材料にチリコンブを使用し、チリコンブから単離された精製フコイダンであっても、チリコンブからの抽出物である粗精製物のいずれであってもよい。

また、本発明のフコイダンとして、口腔内炎症の予防又は治療のための薬理作用を有している限り、フコイダン以外にも、アミノ酸、ビタミン、酵素、ミネラル、その他微量元素を含んでいるものも使用できるが、精製フコイダンを使用することもできる。
本発明において「精製フコイダン」とは、フコイダンを含む混合物からフコイダン以外の成分を除去し、分離精製して得られるフコイダンを意味する。分離精製処理は目的とするフルボ酸が得られる限り任意であり、フコイダン及び他の成分を含む溶液をイオン交換樹脂に通すことなどにより行うことができる。

チリコンブからのフコイダンの抽出や精製は、公知の方法で行えばよい。例えば、チリコンブを粉砕後して加水後、加熱して熱水抽出し、得られた抽出物を固液分離（遠心分離、ろ過等）、脱塩等の処理を行うことによって精製されたフコイダンを得ることができる。得られた精製フコイダンは、さらに分子量に応じて分離してもよいし、凍結乾燥、噴霧乾燥等の乾燥処理を行ってもよい。

本発明のフコイダンは、口腔内炎症の予防又は治療のための薬理作用が得られる限り、フコイダンの塩、化学的処理により改変されたフコイダンを包含するものとする。化学的処理としては例えば、硫酸化、ポリ硫酸化、アセチル化、エステル化、およびメチル化等が挙げられる。

また、本発明のフコイダンは、より優れた口腔内炎症の予防又は治療のための薬理作用が得られる点で、分子量範囲が好適には６０００Ｄａ以上４００００Ｄａ以下の範囲であり、より好適には６２００Ｄａ以上３９８００Ｄａ以下の範囲である。なお、本明細書において、フコイダンの分子量範囲は、後述する条件にて測定されたサイズ排除クロマトグラムより算出することができる。

本発明のフコイダン１００ｇ当たりの硫酸根含量が９ｇ以上１１ｇ以下であることが好ましい。硫酸根含量の算出方法、残存率については、実施例にて後述する。

本発明のフコイダンとして、下記条件にて測定されたサイズ排除クロマトグラムにおいて、下記保持時間にピークトップを有するピーク（ｉ）〜（ｉｖ）を有し、ピーク（ｉ）〜（ｉｖ）の総ピーク面積に対する、ピーク（ｉ）の面積の比が、特定の範囲（６０％以上６５％以下）であるフコイダンが好ましい。

（保持時間）
ピーク（ｉ） ：９．２６〜９．２８分
ピーク（ｉｉ） ：９．７５〜９．７６分
ピーク（ｉｉｉ）：９．９９〜１０．００分
ピーク（ｉｖ） ：１０．２２〜１０．２３分

（測定条件）
測定方法：サイズ排除クロマトグラフィー
カラム：ＯＨｐａｋ ＳＢ-８０６Ｍ ＨＱ（８．０×３００ｍｍ,１３μｍ）
溶離液：超純水
流量：１．０ｍＬ/ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
検出器：蒸発光散乱検出器
試料濃度： ２０．０ｍｇ/ｍＬ
試料注入量：２０μＬ

なお、サイズ排除クロマトグラフィーは、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ製高速液体クロマトグラフ、装置名「ＨＰＬＣ １２００ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ」等により測定することができる。

当該フコイダンは後述する実施例の方法で評価することができる。
図１に、上記条件にて測定された本発明のフコイダンのサイズ排除クロマトグラムの一例を示す。図１のフコイダンの詳細については、実施例１にて後述するが、図１のフコイダンは、保持時間９．２６〜９．２８分の間にピークトップを持つピーク（ｉ）、保持時間９．７５〜９．７６分の間にピークトップを持つピーク（ｉｉ）、保持時間９．９９〜１０．００分の間にピークトップを持つピーク（ｉｉｉ）、保持時間１０．２２〜１０．２３分の間にピークトップを持つピーク（ｉｖ）を有する。

一方、図２に、従来の比較例１（モズク由来フコイダン）のサイズ排除クロマトグラムのサイズ排除クロマトグラムの一例を示す。図２の詳細については、比較例１にて後述するが、図２の比較例１（モズク由来フコイダン）のクロマトグラムは、本発明のフコイダンのクロマトグラムと明確に形状が異なることが分かる。

このように本発明のフコイダンは、従来のモズク由来フコイダンとは異なる性質を有したフコイダンである。

サイズ排除クロマトグラムにおける上記「総ピーク面積」とは、測定開始から測定終了までの全てのピーク（ピーク（ｉ）〜（ｉｖ））の面積の和を意味する。測定終了点は、その保持時間以降のピーク強度及びピークの傾きが実質的に０となる点とする。
また、「ピーク（ｉ）の面積」は、ピーク（ｉ）の立ち上がりの点（測定開始後、ピーク強度が実質的に０より大きくなる最初の点）の保持時間から、ピーク（ｉ）のピークトップ検出後、最初にピークの傾きが０となる点（変曲点）の保持時間までの間の面積とする。

上記条件にて測定されたサイズ排除クロマトグラムにおいて、総ピーク面積に対する、ピーク（ｉ）の面積の比（（ピーク（ｉ）の面積／総ピーク面積）×１００）が６０％以上６５％以下であることが好ましく、６２％以上６４％以下であることがより好ましい。

また、本発明のフコイダンとして、口腔内炎症の予防又は治療のための薬理作用を有している限り、各種市販されているものをそのまま又は適宜濃縮、希釈して使用することができる。このような市販品には、精製の都合上、不純物を含有している場合があるが、その場合はさらに分離精製して使用することもできる。
好適な市販品としては、株式会社エフ・シーシー堀内製「ＨＯＲＩＵＣＨＩ Ｈ−Ｆｕｃｏｉｄａｎ」が挙げられる。

本発明の口腔用組成物は、本発明のフコイダンのみから構成されていてもよいし、本発明のフコイダンと任意の成分を組み合わせた組成物であってもよい。任意成分の配合割合は、その目的に応じて適宜選択して決定することができる。
上述の通り、本発明の口腔用組成物は、歯周病の予防又は治療用として有用であるが、歯周病は、歯周病菌により発症するため、歯周病菌の殺菌、増殖抑制作用を有する成分を配合してもよい。この場合、配合する歯周病菌の殺菌、増殖抑制作用を有する成分としては、本発明のフコイダンの作用を著しく阻害することない成分であれば、通常、歯周病菌の殺菌、増殖抑制用として用いられている任意の成分を使用することができる。

本発明の口腔用組成物において、フコイダンの配合量は特に制限はなく、使用目的や剤型を考慮し、有意な口腔内炎症の予防又は治療のための薬理作用が得られる範囲で適宜決定すればよい。例えば、口腔用組成物全量を１００質量％としたときにフコイダンの量として、１０〜９０質量％である。

本発明の口腔用組成物の製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。具体的には、本発明のフコイダンまたはフコイダンを含む組成物を、他の成分と混合する方法などが挙げられる。

本発明の口腔用組成物は、医薬組成物であっても、非医薬組成物であってもよい。なお、本明細書において、「医薬組成物」とは、薬事法に規定される医薬品又は医薬部外品の組成物であり、「非医薬組成物」とは、医薬組成物に分類されないものであり、具体的には、歯磨剤、洗口剤、口臭予防改善剤等のオーラルケア品や、サプリメント、機能性食品、食品添加剤等が挙げられる。

また、本発明の口腔用組成物は、口腔内炎症の予防又は治療のために好適であるが、本発明のフコイダンはさらに抗菌、抗ウイルス、免疫調節機能等の様々な薬理的作用を有する生理活性物質となりうる。上述の通り、本発明のフコイダンは、実施例に示すように、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用に優れる。そのため、本発明のフコイダンは、口腔用のみならず、非口腔用のシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害剤、一酸化窒素産生抑制剤、免疫賦活剤の有効成分としての使用も可能である。

本発明の口腔用組成物の形態は、特に制限はなく従来公知の口腔用組成物で使用される剤型を目的に応じて適宜選択することができる。本発明の口腔用組成物の形態は、具体的には、粉体、顆粒、タブレット錠（トローチ錠、チュアブル錠を含む）、チューイングガム剤、外用液剤、ペースト剤、軟膏剤、シロップ剤、クリーム剤、スプレー剤等が例示される。この中でも、タブレット錠が好ましい形態として例示できる。
また、口腔用組成物として、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分をさらに適宜含有していてもよい。

本発明の口腔用組成物は、その剤型や口腔内の炎症の種類や程度等に応じて適宜使用方法が選択される。典型的には、液状製剤の場合には、口腔内の炎症に対して塗布や散布、噴霧等によって、直接的に接触させる方法が挙げられる。また、固形製剤の場合（典型的には、タブレット錠）の場合には、液状製剤と比較して口腔内での滞留時間が長くすることができる。

本発明の口腔用組成物の使用量としては、特に制限はなく、使用態様や所望される作用効果、口腔内の状態等を考慮し、適宜選択することができる。

本発明の口腔用組成物を使用する頻度、期間としては、特に制限はなく、口腔内の状態に応じて適宜選択することができる。

また、本発明の口腔用組成物は、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。そのため、本発明の口腔用組成物は、歯磨剤等のペット用のオーラルケア品、ペットフード等の動物用のサプリメントや機能性食品へ添加することもできるし、これを配合した動物用の医薬組成物として用いることもできる。

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

１．チリコンブ由来フコイダンの分析
（原料）
原料となるチリコンブ粉末として、株式会社エフ・シーシー堀内製「ＨＯＲＩＵＣＨＩ Ｈ−Ｆｕｃｏｉｄａｎ」を使用した。「ＨＯＲＩＵＣＨＩ Ｈ−Ｆｕｃｏｉｄａｎ」は、チリコンブ（Durvillea antarctica）を粉砕後して加水後、加熱して熱水抽出し、得られた抽出物を固液分離（遠心分離、ろ過等）、脱塩等の処理を行うことによって得られる精製フコイダンである。以下、ＨＯＲＩＵＣＨＩ Ｈ−Ｆｕｃｏｉｄａｎを「実施例１のチリコンブ由来フコイダン」と記載する。

１．物性分析
実施例１のチリコンブ由来フコイダンに対し、以下の物性分析を行った。また、比較として、市販のモズク由来フコイダン（以下、比較例１）についても同様に分析を行った。
なお、以下の物性分析（前処理含む）は、日本健康・栄養食品協会の認定健康食品(ＪＨＦＡ)の規格基準「フコイダン食品」の解説書の方法に準じて行った。

１−１．チリコンブ由来フコイダンの構成糖の測定
低分子分画を除去する前処理を行った試料に対し、ＪＨＦＡ規格基準「フコイダン食品」の解説書の「フコイダンの構成糖定量試験法」にしたがって、実施例１のチリコンブ由来フコイダンの構成糖を評価した。その結果、チリ昆布由来フコイダンはフコース、マンノース、グルコースまたはガラクトースより構成されている糖であることが明らかとなった。

１−２．サイズ排除クロマトグラフィーによる評価
実施例１のチリコンブ由来フコイダン及び比較例１のモズク由来フコイダンについて、サイズ排除クロマトグラフィーによる評価を行った。なお、各試料は、ＪＨＦＡ規格基準「フコイダン食品」の解説書の方法に準じて前処理を実施したものを装置に注入した。

サイズ排除クロマトグラフィーの条件は以下のとおりである；
（測定装置）Ａｇｉｌｅｎｔ製高速液体クロマトグラフ、装置名「ＨＰＬＣ １２００ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ」
（測定条件）
測定方法：サイズ排除クロマトグラフィー
カラム：ＯＨｐａｋ ＳＢ-８０６Ｍ ＨＱ（８．０×３００ｍｍ,１３μｍ）
溶離液：超純水
流量：１．０ｍＬ/ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
検出器：蒸発光散乱検出器
試料濃度： ２０．０ｍｇ/ｍＬ
試料注入量：２０μＬ

図１に実施例１のチリコンブ由来フコイダン、図２に比較例１のモズク由来フコイダンのサイズ排除クロマトグラムをそれぞれ示す。
図１に示されるように実施例１のチリコンブ由来フコイダンは、溶出時間の異なる４つのピークを有していており、図２に示すモズク由来フコイダンとは明らかに異なる形状を示していた。
実施例１のサイズ排除クロマトグラムにおいて、溶出時間の短い方からピーク（ｉ）、ピーク（ｉｉ）、ピーク（ｉｉｉ）、ピーク（ｉｖ）としたときに、各ピークの溶出時間（ピークトップ）とピーク面積を表１に示す。なお、ピーク面積は、Ａｇｉｌｅｎｔ社製ＯｐｅｎＬＡＢ ＣＤＳにてデータ解析ソフトを用いて算出した。
ピーク（ｉ）〜（ｉｖ）の総ピーク面積に対する、ピーク（ｉ）の面積の比を算出したところ、６３％であった。

実施例１及び比較例２のサイズ排除クロマトグラムからそれぞれの分子量範囲を求めた結果を表２に示す。実施例１のチリコンブ由来フコイダンは、モズク由来フコイダンと比較して分子量が小さく、６０００〜４００００Ｄａの範囲であることが認められた。

１−３．硫酸根含有量の定量評価
ＪＨＦＡ規格基準「フコイダン食品」の解説書の「フコイダンの硫酸根試験法」（ロジゾン酸法）にしたがって、実施例１のチリコンブ由来フコイダン及び比較例１のモズク由来フコイダンについて硫酸根の含有量を定量評価した。結果を表３に示す。
なお、硫酸根の含有量は以下の式で表される。

硫酸根の含有量（ｇ/１００ｇ）＝
｛（硫酸根濃度（μｇ/ｍＬ）×４０）/（試料採取量（ｇ）×１００００）｝×１００

以上の物性評価により、実施例１のチリコンブ由来フコイダンは、従来のモズク由来フコイダンと比較して特性が異なり、特有の物性を有することが認められた。

２．機能性評価
実施例１のチリコンブ由来フコイダンについて、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害試験、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制試験を行った。また、マウスを使用した口内炎抑制試験を行った。

２−１．シクロオキシゲナーゼ阻害試験
実施例１のチリコンブ由来フコイダンの水抽出物、エタノール抽出物を使用してシクロオキシゲナーゼ阻害試験を行った。
シクロオキシゲナーゼ（cyclooxygenase: ＣＯＸ）は、生体における炎症反応の誘導において重要な役割を果たす機能分子である。COXには、2種類のアイソザイムであるＣＯＸ−１とＣＯＸ−２が存在する。ＣＯＸ−１は、大部分の正常組織において恒常的に発現している。一方、ＣＯＸ−２は、正常な状態ではほとんど発現していないが、血管損傷や炎症が起こると血管内皮細胞や血管平滑筋細胞等に速やかに誘導される。ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２によってアラキドン酸はプロスタグランジンに変換され、最終生成物ＰＧＦ２αを与える。ＰＧＦ２αの生成量を測定することで、フコイダン製品の水抽出物、エタノール抽出物を添加した際にどの程度COXの働きを抑制し、炎症を抑えることができるか評価した。

水抽出物は、チリコンブ由来フコイダン約１ｇに水を１００ｍＬ加え、振とう抽出（室温、２００ｒｐｍ、２４時間）し、遠心分離（３０００ｒｐｍ,、１０分）して上清を凍結乾燥して得た。エタノール抽出物は、チリコンブ由来フコイダン約１ｇにエタノールを１００ｍＬ加え、振とう抽出（室温、２００ｒｐｍ、２４時間）し、Ｎｏ.２の濾紙で濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮・乾固することで得た。

シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）は、ＣＯＸ活性とペルオキシダーゼ活性を併せ持つ多機能酵素である。ＣＯＸ領域はアラキドン酸をプロスタグランジンＧ２（ＰＧＧ２）へ変換し、ペルオキシダーゼ活性がこれを還元することでプロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）が生成される。ＣＯＸは二つのアイソフォームが知られており、ＣＯＸ−１は恒常的に様々な細胞種で発現している一方、ＣＯＸ−２は急性的な炎症時に合成される。ＣＯＸは炎症メディエーターであるプロスタグランジン（ＰＧ）の生成に関与するため、ＣＯＸ阻害は炎症抑制に重要である。プロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α）を指標にＣＯＸ活性を測定することで抗炎症効果を評価した。試験は、ケイマンケミカル社のColormetric COX(ovine) Inhibitor screening Assay Kit(CatalogNo.760111)を用いて行った。ＣＯＸ−１としてヒツジ精嚢ミクロソーム（ケイマンケミカル社製）、ＣＯＸ−２としてヒツジ胎盤由来ＣＯＸ−２精製品（ケイマンケミカル社製）を使用した。

ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２にそれぞれ基質であるアラキドン酸を添加し、プロスタンジンの生成反応（以下、「ＣＯＸ反応」と記載する。）を行い、上記チリコンブ由来フコイダンの水抽出物、エタノール抽出物をキットの試験方法に従い添加し、プロスタンジンの生成量への影響を評価した。
シクロオキシゲナーゼ反応によって生成したプロスタンジンは酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）を利用して定量した。シクロオキシゲナーゼ活性により生じた酸化テトラメチル-ｐ-フェニレンジアミン（ＴＭＰＤ）の吸光度（５９０ｎｍ）の増加を指標に酵素活性を測定し、チリコンブ由来フコイダンの水抽出物、エタノール抽出物のＣＯＸ−１阻害活性率及びＣＯＸ−２阻害活性率を算出した。また、ブランクは５０％ １，３−ブチレングリコール水溶液とした。

図３に実施例１の水抽出物のＣＯＸ−１阻害試験、図４に実施例１の水抽出物のＣＯＸ−２阻害試験、図５に実施例１のエタノール抽出物のＣＯＸ−１阻害試験、図６に実施例１のエタノール抽出物のＣＯＸ−２阻害試験の結果をそれぞれ示す。

実施例１の水抽出物の添加では、ＣＯＸ−１活性の阻害は認められなかったのに対し（図３）、ＣＯＸ−２活性は、最終濃度１０μｇ/ｍＬおよび１００μｇ/ｍＬの濃度区において阻害されることが確認された（図４）。この効果は特に１００μｇ/ｍＬで顕著であり、ＣＯＸ−２活性は、実施例１の水抽出物によりほぼ１００％阻害されることが確認された。

また、実施例１のエタノール抽出物添加により、ＣＯＸ−１活性に対し、５μｇ/ｍＬ、５０μｇ/ｍＬおよび５００μｇ/ｍＬの濃度依存的な活性抑制が認められた（図５）。また、ＣＯＸ−２活性に対しても最終濃度５０μｇ/ｍＬおよび５００μｇ/ｍＬの濃度区において炎症誘導型ＣＯＸ−２活性が濃度依存的に阻害された（図６）。

以上の通り、実施例１のチリコンブ由来フコイダンの水抽出物、エタノール抽出物のいずれにおいてもＣＯＸ−２活性の阻害効果が認められ、特に、水抽出物(１００μｇ/ｍＬ)においてはほぼ１００％の阻害作用を示した。また、エタノール抽出物では、水抽出物には認められなかったＣＯＸ−１活性の阻害効果も認められた。
この結果から、実施例１のチリコンブ由来フコイダンはＣＯＸ活性阻害（特にはＣＯＸ−２活性阻害）による抗炎症効果を有する可能性が示唆された。

２−２．一酸化窒素産生抑制試験
実施例１のチリコンブ由来フコイダンの水抽出物を使用して一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制試験を行った。マクロファージ）は、異物を捕食消化するスカベンジャーの役割とともにヘルパーＴ細胞に抗原提示してサイトカインなどを分泌させる役割を有する。炎症刺激を受けたマクロファージは一酸化窒素（ＮＯ）を産生するため、ＮＯを指標として抗炎症効果を評価した。

水抽出物は上記「２−１．シクロオキシゲナーゼ阻害試験」と同様の方法で調製した。
マクロファージ（Ｍ１）は、異物を捕食消化するスカベンジャーの役割とともにヘルパーＴ細胞に抗原提示してサイトカインなどを分泌させる役割を有する。それに加え活性化したマクロファージは、スーパーオキシドアニオン（Ｏ_２ ⁻）や一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ;ＮＯ）、プロスタグランジン（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ；ＰＧ）、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ)-α、インターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ；ＩＬ)-１,６,１２等やケモカインなどの非常に多くの化学伝達物質を分泌して，免疫反応や炎症反応の誘導を惹起し様々な生体防御に係わっている。炎症刺激を受けたマクロファージはＮＯを産生するため、ＮＯを指標として抗炎症効果を評価した。また、ケルセチンは抗炎症作用を示すことが報告されており、これはヒスタミンの生成や遊離など炎症反応に関わる酵素の発現を抑制すると考えられている。

図７に示す通り、実施例１の水抽出物（５００μｇ/ｍＬ、１０００μｇ/ｍＬ）の添加により、コントロールと比較してＮＯ産生を抑制する効果が観察された。この結果から、実施例１のチリコンブ由来フコイダンはＮＯ産生抑制による抗炎症効果を有する可能性が示唆された。

２−３．マウスの口内炎抑制活性の評価
実施例１のチリコンブ由来フコイダンの抗炎症作用を、電気メス火傷モデルを用いてin vivoにて検証した。
実験には、６月齢のＣ５７/ＢＬ６マウス４匹（オス）を用い、１つの個体の片側に実験群、反対側に対照群を設定した。マウスの麻酔には適量のソムノペンチルを腹腔内に投与した。図８の通り、実験群にはマウスの片側鼻翼部にフコイダン１００μｇ/ｍＬ生理食塩水溶解液を０．１ｍＬ注入、対照群には同じマウスのもう一方側の鼻翼部に生理食塩水を０．１ｍＬ注入した。注入後直ちに小型焼灼器（Change-a-tip cauteries, Bovie社、米国テネシー州）を両側鼻翼部に無圧で２秒間当てた。２秒間の制御は自作の電子回路（Arduino Uno, Arduino社 イタリア）にリレーを接続し、１５秒おきに２秒間、３ボルト通電する仕組みとした。４８時間後に実験動物をサクリファイスし、１倍の倍率にて写真撮影を行った。

図８に１つの個体の小型焼灼器による火傷処理直後、及び４８時間後の写真を示す。
火傷処理直後（図８左）では、対照群である生理食塩水注入側（生食側）及び実験群であるチリコンブ由来フコイダン溶液注入側（フコイダン側）で同程度の火傷が認められたが、４８時間後（図８右）ではチリコンブ由来フコイダン溶液注入側（フコイダン側）の方が炎症が少なく、創傷治癒が早い傾向が認められた。他の個体についても、実験群では対照群に比較して４８時間後の炎症が少なかった。
以上の結果から、マウスの口内炎において、フコイダン注入による創傷治癒の促進効果が示された。

本発明によれば、天然物由来のフコイダンを有効成分とし、口腔内炎症の予防や治療に適した口腔用組成物が提供されるため、産業上有望である。

Claims (9)

1. チリコンブ（Durvillaea antarctica）由来のフコイダンを有効成分として含有することを特徴とする口腔内炎症の予防又は治療のための口腔用組成物。
2. 前記フコイダンの分子量範囲が６０００Ｄａ以上４００００Ｄａ以下である請求項１に記載の口腔用組成物。
3. 前記フコイダン１００ｇ当たりの硫酸根含量が９ｇ以上１１ｇ以下である請求項１または２に記載の口腔用組成物。
4. 前記フコイダンが、
   下記条件にて測定されたサイズ排除クロマトグラムにおいて、
   下記保持時間にピークトップを有するピーク（ｉ）〜（ｉｖ）を有し、
   ピーク（ｉ）〜（ｉｖ）の総ピーク面積に対する、ピーク（ｉ）の面積の比が６０％以上６５％以下であるフコイダンである請求項１から３のいずれかに記載の口腔用組成物。
   （保持時間）
   ピーク（ｉ） ：９．２６〜９．２８分
   ピーク（ｉｉ） ：９．７５〜９．７６分
   ピーク（ｉｉｉ）：９．９９〜１０．００分
   ピーク（ｉｖ） ：１０．２２〜１０．２３分
   （測定条件）
   測定方法：サイズ排除クロマトグラフィー
   カラム：ＯＨｐａｋ ＳＢ-８０６Ｍ ＨＱ（８．０×３００ｍｍ,１３μｍ）
   溶離液：超純水
   流量：１．０ｍＬ/ｍｉｎ
   カラム温度：３０℃
   検出器：蒸発光散乱検出器
   試料濃度： ２０．０ｍｇ/ｍＬ
   試料注入量：２０μＬ
5. 前記フコイダンの含有量が１０質量％以上９０質量％以下である請求項１から４のいずれかに記載の口腔用組成物。
6. 歯周病の予防又は治療のための口腔用組成物である請求項１から５のいずれかに記載の口腔用組成物。
7. 形態が、タブレット錠である請求項１から６のいずれかに記載の口腔用組成物。
8. シクロオキシゲナーゼ−２活性阻害用である請求項１から７のいずれかに記載の口腔用組成物。
9. 一酸化窒素産生抑制用である請求項１から７のいずれかに記載の口腔用組成物。

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