JP5926682B2

JP5926682B2 - 水溶性生体関連物質の分離方法

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Publication number: JP5926682B2
Application number: JP2012533041A
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Inventors: 大西　敦; 敦大西; 亮太濱嵜
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Current assignee: Daicel Corp
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Filing date: 2011-09-09
Publication date: 2016-05-25
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Description

本発明は水溶性生体関連物質の分離方法に関する。

生理活性を有する生体関連物質、例えば糖類や核酸化合物類、アミノ酸類やタンパクやビタミン類および酸性化合物といった物質は生体内で有効な効果を示すことから、そのほとんどは水溶性であり、そのためこれら物質の分析のほとんどは、逆相条件のクロマトグラフィー法が適用されることが多い。
一方、近年こういった生体関連の水溶性生理活性物質のクロマトグラフィー分離、分析を数%〜40%の水を移動相に含有する水系順相クロマトグラフィー下で検討しようとする報告が相次いでいる（例えば、非特許文献１参照）。この水系順相クロマトグラフィーはHILIC（Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography）とも呼ばれ、これまで逆相クロマトグラフィーでは保持が弱く分離困難であった化合物の分離、高濃度の塩やイオンペア試薬を使用しないで揮発性有機溶剤と水のみを移動相に用いることからLC-MSへ適用しやすい分析モードとして考えられている。

これらHILIC分離カラムの多くは、シリカ及びアミン修飾、アミド修飾型の分離剤が多くの場合使用されているが、これ以外にもポリアミン、ポリアクリル酸、ポリビニル、シクロデキストリン、両イオン性カラムなどが挙げられるが、様々な官能基、構造、物性を有する多種多様な生体由来化合物の分離分析においては、より良く分離が可能なHILIC用分離剤が求められている（例えば、非特許文献２参照）。

例えば、単糖、多糖、及び糖アルコール等の糖類の分離方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等のクロマトグラフィー技術が知られている。このような糖類の分離に用いられる分離剤としては、例えば、シリカゲルにポリアクリルアミドを化学結合してなる分離剤や、シリカゲルにポリアルキレンポリアミンを化学結合してなる分離剤が知られている（例えば、特許文献１及び２参照。）。また、糖類の分離方法としては、例えば水で膨潤したセルロースをカラム管に充填して、水とアルコールとの混合液を溶離液としてオリゴ糖をカラムクロマトグラフィーで分離する方法が知られている（例えば、特許文献３参照。）。一方で、セルロース等の多糖の誘導体を用いる分離剤として、例えば、セルロースやアミロースのジメチルフェニルカルバメート誘導体等の多糖誘導体がシリカゲルに化学結合してなる光学異性体分離用の分離剤が知られている（例えば、特許文献４参照。）。

特許第２５０４００５号公報特許第２５５８００７号公報特許第３８８５９１２号公報特許第２７５１００４号公報

Journal of Chromatography A,1994, vol.676, pp.191-202 Journal of Separation Science, 2006, vol.29, pp.1784-1821

本発明は、水溶性生体関連物質を分離する新規な方法を提供する。

本発明者らは、シリカゲルに多糖が化学結合してなる分離剤が、水溶性生体関連物質の化合物ごとへの分離に優れていることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち本発明は、担体と担体の表面に化学結合によって結合する多糖とからなる分離剤を用いてクロマトグラフィーによって二種以上の水溶性生体関連物質の混合液から水溶性生体関連物質を分離する方法を提供する。

また本発明は、担体と担体の表面に化学結合によって結合する多糖とからなる、水溶性生体関連物質分離用の分離剤を提供する。

また本発明は、前記水溶性生体関連物質が、糖類、核酸化合物類、アミノ酸、水溶性ビタミン、生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体並びにオリゴペプチドから選ばれる１種以上である前記の方法及び分離剤を提供する。

また本発明は、前記多糖がセルロース又はアミロースである前記の方法及び分離剤を提供する。

本発明は、担体と担体の表面に化学結合によって結合する多糖とからなる分離剤という、これまで水溶性生体関連物質の化合物ごとへの分離能を有することが知られていない分離剤を用いることから、水溶性生体関連物質の新たな分離方法を提供することができる。

実施例の分離剤１を用いたＨＰＬＣによる糖類の分離のＲＩ検出器によるクロマトグラムを示す図である。実施例の分離剤１を用いたＨＰＬＣによる糖類の分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。実施例の分離剤２を用いたＨＰＬＣによる糖類の分離のＲＩ検出器によるクロマトグラムを示す図である。実施例の分離剤２を用いたＨＰＬＣによる糖類の分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。実施例の分離剤１を用いたＨＰＬＣによる核酸塩基の分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。実施例の分離剤２を用いたＨＰＬＣによる核酸塩基の分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。実施例の分離剤１を用いたＨＰＬＣによるヌクレオシドの分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。実施例の分離剤２を用いたＨＰＬＣによるヌクレオシドの分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。実施例の分離剤１を用いたＨＰＬＣによる水溶性ビタミンの分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。実施例の分離剤２を用いたＨＰＬＣによる水溶性ビタミンの分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。実施例の分離剤１を用いたＨＰＬＣによるアミノ酸の分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。実施例の分離剤２を用いたＨＰＬＣによるアミノ酸の分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。実施例の分離剤１を用いたＨＰＬＣによる生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体の分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。実施例の分離剤２を用いたＨＰＬＣによる生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体の分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。実施例の分離剤２を用いたＨＰＬＣによる核酸塩基とヌクレオシドの混合物の分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。市販されているＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣによる核酸塩基の分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。市販されているＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣによるヌクレオシドの分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。市販されているＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣによる水溶性ビタミンの分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。市販されているＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣによるアミノ酸の分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。市販されているＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣによる生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体の分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。実施例の分離剤１を用いたＨＰＬＣによるジペプチドとトリペプチドの混合物の分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。実施例の分離剤２を用いたＨＰＬＣによるジペプチドとトリペプチドの混合物の分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。市販されているＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣによるジペプチドとトリペプチドの混合物の分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを示す図である。

発明の実施の形態

本発明では、担体と担体の表面に化学結合によって結合する多糖とからなる水溶性生体関連物質分類用の分離剤が用いられる。本発明の水溶性生体関連物質の分離方法では、前記の本発明の分離剤を用いてクロマトグラフィーによって二種以上の水溶性生体関連物質の混合液から各水溶性生体関連物質を分離する。

前記担体には、クロマトグラフィー用の分離剤の担体として通常用いられる担体を用いることができる。前記担体は、多孔質の担体であることが好ましい。このような多孔質担体としては、多孔質無機担体や多孔質有機担体が挙げられる。多孔質無機担体としては、例えば、シリカゲル、けいそう土、多孔質ガラス、ヒドロキシアパタイト、アルミナ、酸化チタン、及びマグネシアが挙げられる。多孔質有機担体としては、例えば、ポリアクリルアミド及びポリアクリレートが挙げられる。

また前記担体は、カラムクロマトグラフィーに通常用いられる形態で用いることができる。このような形態としては、例えば、カラム管に充填される粒子、カラム管に収容される多孔質の円柱体、及び膜分離に用いられる多孔質膜が挙げられる。前記担体は、汎用性や分離剤の調製の容易さの観点から、シリカゲルであることが好ましい。シリカゲルの粒径は、得られるピーク理論段数と圧力損失との兼ね合いとの観点から、１〜１，０００μｍであることが好ましく、２〜１００μｍであることがより好ましい。シリカゲルの平均孔径は、比表面積と高分子量化合物の孔中への浸透との兼ね合いとの観点から、１ｎｍ〜１００μｍであることが好ましく、２ｎｍ〜５００ｎｍであることがより好ましい。

前記多糖には、還元末端を有する多糖を用いることができる。このような多糖は、合成多糖や天然多糖の中から選ぶことができる。前記多糖は、結合様式の規則性の高い多糖が分析対象物の形の認識の観点から好ましい。このような多糖としては、例えば、α−１，４−グルカン（アミロース）、β−１，４−グルカン（セルロース）、α−１，６−グルカン（デキストラン）、β−１，６−グルカン（プスツラン）、α−１，３−グルカン、β−１，３−グルカン（例えば、カードラン、シゾフィラン）、α−１，２−グルカン、β−１，２−グルカン、β−１，４−キトサン、β−１，４−Ｎ−アセチルキトサン（キチン）、β−１，４−ガラクタン、α−１，６−ガラクタン、β−１，２−フラクタン（イヌリン）、β−２，６−フラクタン（レバン）、β−１，４−キシラン、β−１，３−キシラン、β−１，４−マンナン、α−１，６−マンナン、プルラン、アガロース、アルギン酸、及びアミロース含量の高い澱粉、が挙げられる。

前記多糖は、高純度の多糖を容易に得ることができる観点から、セルロース、アミロース、β−１，４−キトサン、キチン、β−１，４−マンナン、β−１，４−キシラン、イヌリン、又はカードランであることが好ましく、セルロース又はアミロースであることがより好ましい。

前記多糖の数平均重合度は、単量体の繰り返し重合による規則正しい高次構造の構築の観点から、１１以上であることが好ましい。多糖の数平均重合度は、特に上限はないが、５００以下であることが、取り扱いの容易さの観点から好ましい。

本発明において、多糖は化学結合によって担体の表面に結合する。多糖は担体の表面に共有結合やイオン結合等の化学結合によって直接結合してもよいし、担体の表面に固定されているスペーサ分子を介して結合してもよい。このようなスペーサ分子は、担体の種類に応じて適宜に選ぶことができる。

例えばシリカゲルに対する前記スペーサ分子としては、シリカゲルの表面のシラノール基と結合する第一の官能基と、多糖の還元末端と化学結合する第二の官能基とを有する化合物を用いることができる。第一の官能基としては、例えばシラン基やシラノキシ基が挙げられる。第二の官能基としては、例えば、ビニル基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アルデヒド基、イソシアネート基、チオシアナート基、イソチオシアナート基、チオール基、シラノール基、エポキシ基、エーテル基、エステル基、アミド基、及びハロゲン原子が挙げられる。

前記スペーサ分子は、第一の官能基にアミノ基を含む化合物が好ましく、第１級アミン化合物であることがより好ましい。このようなスペーサ分子には、例えば、市販のシランカップリング剤や、このシランカップリング剤にアミノ基を導入した化合物を用いることができる。

前記分離剤は、例えばスペーサ分子による担体の表面処理と、表面処理された担体と多糖との化学結合とによって得ることができる。

スペーサ分子による担体の表面処理は、例えば担体がシリカゲルである場合では、シリカゲルの表面に、アミノ基を有するシランカップリング剤、例えば３−アミノプロピルトリエトキシシラン、を公知の方法で化学結合させることによって行うことができる。

表面処理された担体と多糖との化学結合は、例えば、還元末端を持つ多糖をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）や、塩化リチウム−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ／ＬｉＣｌ）等の溶媒に溶解し、さらに還元剤を加え、５０〜８０℃で１２時間反応させ、前記の表面処理シリカゲルの表面に存在するアミノ基と多糖の還元末端とを共有結合させる還元アミノ化法により行うことができる。

前記還元剤には、公知の還元剤の中から適当な化合物を選ぶことができ、例えばＮａＢＨ₄（水素化ホウ素ナトリウム）、ＮａＢＨ₃ＣＮ（水素化シアノホウ素ナトリウム）、ボランピリジンコンプレックス、ボランジメチルアミンコンプレックス、ボラントリメチルアミン等のボラン化合物が挙げられる。還元アミノ化法では、反応系に酢酸をさらに加え、ｐＨ６〜８の中性付近の条件で行ってもよい。

分離剤の生成における多糖の使用量は、特に制限されないが、通常は担体の使用量に対して５〜５０質量％程度であることが好ましい。また残存シラノール基の影響を抑制する観点から、分離剤にはエンドキャッピング処理が施されていることが好ましい。エンドキャッピング処理は、公知の方法により行うことができ、このような処理によって、分離剤の分離能をさらに安定させ、又は向上させることができる。

本発明で分離される前記水溶性生体関連物質には、なお、本発明で言う「水溶性」の物質は、水を溶媒としてその水に溶解するものをいい、極性分子結晶のうち分子量の比較的小さいもの、あるいは多数の水素結合を有するものや、水溶液中でプロトンを供与あるいは受容するものが含まれる。そして、本発明でいう「水溶性」とは、水への溶解度が０．００１％（１０ｐｐｍ）以上のものをいう。水溶性生体関連物質の分子量は、概ね３０〜１００００であるものを含む。本発明で言う「水溶性生体関連物質」は生体を構成する物質、生体の代謝に用いられる物質、生理活性を有する物質などのうち、水溶性のものが含まれる。
このような水溶性生体関連物質として、具体的には、核酸塩基やヌクレオシドを含む核酸化合物類、水溶性ビタミン、アミノ酸、生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体、オリゴペプチドが挙げられる。
これらの分離対象となる水溶性生体関連物質は、下記で列挙する同じカテゴリーに属するもののみを分離対象とすることもできるし、異なるカテゴリーに属するものが含まれる混合物も分離対象とすることができる。

本発明で分離される前記核酸化合物類としては、チミン、ウラシル、アデニン、シトシン、グアニンを含む核酸塩基や、５−メチルウリジン、ウリジン、アデノシン、シチジン、グアノシンを含むリボヌクレオシド並びに、チミジン、デオキシウリジン、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンを含むデオキシリボヌクレオシドのようなヌクレオシドが挙げられる。

本発明で分離される前記水溶性ビタミンとしては、ビタミンＣ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ナイアシンやニコチンアミドを含むビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２などが挙げられる。

本発明で分離される前記アミノ酸としては、α−アミノ酸であることが好ましく、タンパク質を構成する、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンが挙げられる。

本発明で分離される前記生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体としては、好ましくは炭素数１〜５００、より好ましくは炭素数１〜３００で、カルボキシル基を有するものが挙げられる。本発明でいう「生理活性」とは、生体の特定の生理的調節機能に対して作用する性質である。
上記の酸性化合物及びその誘導体としては、例えば、ピリジンカルボン酸と、その含窒素六員環の任意の水素が水酸基で置換された誘導体、カルボキシル基が炭素数１〜３のアルコールでエステル化された誘導体、さらには含窒素六員環の任意の水素が水酸基で置換され、カルボキシル基がエステル化されたものなどが挙げられる。より具体的には、ニコチン酸、ニコチン酸メチル、６−ヒドロキシニコチン酸及び５−ヒドロキシニコチン酸が挙げられる。
また、ギ(蟻)酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸(ブチル酸)、イソ酪酸、吉草酸(バレリアン酸)、イソ吉草酸、カプロン酸、エナント酸(ヘプチル酸)、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸(セタン酸)、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ツベルクロステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサヘキサエン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸のような脂肪酸、及び不飽和脂肪酸の場合は、トランス、シス異性体も分離対象の具体例として挙げられる。

本発明で分離される前記オリゴペプチドとしては、アミノ酸残基が５以下のものが好ましく、より好ましくはトリペプチドやジペプチドが挙げられる。ペプチドを構成するアミノ酸残基としては、前記α−アミノ酸が挙げられる。

本発明で分離される前記糖類には、グルコース、キシロース、及びフルクトース等の単糖、マルトース、ラクトース、及びスクロース等の二糖、及び、グリセロール等の糖アルコールが挙げられる。

前記分離剤は、粒子状、円柱状、又は膜状の分離剤を用いるクロマトグラフィーにおいて、分離剤として用いることができる。このようなクロマトグラフィーとしては、例えば、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、擬似移動床クロマトグラフィー、及び、超臨界流体クロマトグラフィーが挙げられる。これらのクロマトグラフィーは、前記の分離剤を用いる以外は、通常の方法で行うことができる。

これらのクロマトグラフィーにおいて、移動相には、水や各種有機溶剤等の液体、超臨界流体、及び亜臨界流体等の公知の流体を移動相として用いることができる。例えば超臨界流体クロマトグラフィーでは、移動相として、超臨界二酸化炭素からなる超臨界流体、亜臨界流体二酸化炭素からなる亜臨界流体、又は、超臨界流体二酸化炭素と添加剤との混合流体を用いることができる。前記添加剤としては、例えば炭素数１〜８のアルコール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン、クロロホルム、メチレンクロリド、酢酸エステル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、及び水が挙げられる。添加剤は一種でも二種以上でもよい。

前記分離剤を用いるクロマトグラフィーは、水溶性生体関連物質の分離に適した条件で行う以外は、通常のクロマトグラフィーと同様の操作により、試料中の水溶性生体関連物質の分析や、混合物からの特定の糖類の分取に用いることができる。水溶性生体関連物質の分離条件には、例えば公知の水溶性生体関連物質の分離条件そのもの、又はこのような公知の条件からさらに導き出された条件を採用することができる。

１８０℃、２時間における真空乾燥によって予め活性化しておいたシリカゲル（富士シリシア化学（株）製、平均孔径５０ｎｍ、粒径５μｍ）１０ｇに脱水ベンゼン１２ｍＬ、脱水ピリジン１ｍＬを添加し、３−アミノプロピルトリエトキシシラン０．７ｍＬを加えて９０℃で１２時間反応させた。この表面処理シリカゲルを、メタノール、アセトン、ヘキサンで洗浄した後、６０℃で２時間真空乾燥し、表面にアミノプロピル基が結合した表面処理シリカゲルを得た。

得られた表面処理シリカゲルに、アミロース１．０ｇ（平均重合度：１６０）を脱水ＤＭＳＯ８ｍＬに溶解した溶液を加え、得られたスラリーに、ＮａＢＨ₃ＣＮ１５０ｍｇを脱水ＤＭＳＯ５ｍＬに溶解した溶液に酢酸３０ｍｇを添加した溶液を加え、窒素下５０℃で１２時間反応させて表面処理シリカゲルのアミノ基とアミロースの還元末端とを化学結合させ、アミロース結合シリカゲルを得た。

得られたアミロース結合シリカゲルを、ガラスフィルターＧ４を用いて濾過し、残渣をＤＭＳＯ、テトラヒドロフラン、メタノール、アセトン、ヘキサンで洗浄し、アミロース結合シリカゲルから未結合のアミロース等を除き、６０℃で２時間真空乾燥し、アミロースがシリカゲルの表面に化学結合によって結合してなる分離剤１を得た。分離剤１の元素分析値はＣ：４．２９％、Ｈ：０．９０％、Ｎ：０．２２％であった。

また、前記表面処理シリカゲルに、セルロース１．０ｇ（Ｍｅｒｃｋ社製、平均重合度：２００）を脱水ＤＭＡ／ＬｉＣｌ２１ｍＬに溶解した溶液を加え、得られたスラリーに、ＮａＢＨ₃ＣＮ１５０ｍｇを脱水ＤＭＡ／ＬｉＣｌ５ｍＬに溶解した溶液に酢酸３０ｍｇを添加した溶液を加え、窒素下５０℃で３６時間反応させて表面処理シリカゲルのアミノ基とセルロースの還元末端とを化学結合させ、セルロース結合シリカゲルを得た。

得られたセルロース結合シリカゲルを、ガラスフィルターＧ４を用いて濾過し、残渣をＤＭＡ／ＬｉＣｌ、テトラヒドロフラン、メタノール、アセトン、ヘキサンで洗浄し、セルロース結合シリカゲルから未結合のセルロース等を除き、６０℃で２時間真空乾燥し、セルロースがシリカゲルの表面に化学結合によって結合してなる分離剤２を得た。分離剤２の元素分析値はＣ：２．１２％、Ｈ：０．５６％、Ｎ：０．１５％であった。

分離剤１及び２をそれぞれ内径０．４６ｃｍ、長さ２５ｃｍのステンレススチール製空カラムにスラリー充填法にて充填し、充填された分離剤１を収容するカラム１と、充填された分離剤２を収容するカラム２とをそれぞれ得た。なお、分離剤のカラムへの充填には、（株）京都クロマト製のＰＳ１０、ＰＳ−２０オートパッキングシステムを用いた。

これらのカラム１及び２を使用して、グルコース、キシロース、フルクトース、グリセロール、マルトース、ラクトース、及びスクロースの計７種の糖類に対する分離剤１及び２の分離能をＨＰＬＣによって評価した。試料溶液には、７種の糖類を総量で約４，０００ｐｐｍにて移動相に溶解した溶液を用いた。移動相には水とアセトニトリルとの混合液（水／アセトニトリル＝２５／７５（体積比））を用いた。移動相の流量は０．５ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度は２５℃であり、試料溶液の打ち込み量は２０μＬであり、検出器にはＲＩ検出器及びＵＶ検出器を用いた。ＵＶ検出器における検出波長は１９０ｎｍとした。分離剤１による糖の分離のＲＩ検出器によるクロマトグラムを図１に、分離剤１による糖の分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを図２に、分離剤２による糖の分離のＲＩ検出器によるクロマトグラムを図３に、分離剤２による糖の分離のＵＶ検出器によるクロマトグラムを図４に、それぞれ示す。

＜核酸塩基の分離＞
前記カラム１及び２を使用して、チミン、ウラシル、アデニン、シトシンの計４種の核酸塩基に対する分離剤１及び２の分離能をＨＰＬＣによって評価した。試料溶液は、４種の核酸塩基が各々５０ｐｐｍとなるような濃度とした。移動相には１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルとの混合液（１０ｍＭＡｃＯＮＨ₄ａｑ／ＣＨ₃ＣＮ＝１０／９０(体積比)）を用いた。移動相流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎ.、カラム温度は２５℃、試料溶液の打ち込み量は１μＬ、検出器にはＵＶ検出器（２５４ｎｍ）を用いた。分離剤１による核酸塩基のクロマトグラムを図５に、分離剤２による核酸塩基のクロマトグラムを図６に示す。溶出順序は分離剤１及び２ともに同様である。

(核酸塩基の分離：比較例)
市販されているＯＤＳカラム（商品名：Ｌ column；化学物質評価研究機構）を使用して、チミン、ウラシル、アデニン、シトシンの計４種の核酸塩基に対するＯＤＳカラムの分離能をＨＰＬＣによって評価した。試料溶液は、４種の核酸塩基が各々２５０ｐｐｍとなるような濃度とした。移動相には１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルとの混合液（１０ｍＭＡｃＯＮＨ₄ａｑ／ＣＨ₃ＣＮ＝９０／１０（体積比））を用いた。移動相流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎ.、カラム温度は２５℃、試料溶液の打ち込み量は１μＬ、検出器にはＵＶ検出器（２５４ｎｍ）を用いた。ＯＤＳカラムによる核酸塩基のクロマトグラムを図１６に示す。ＯＤＳカラムでは核酸塩基化合物を保持できない。

＜ヌクレオシドの分離＞
前記カラム１及び２を使用して、チミジン、ウリジン、アデノシン、シチジン、グアノシンのヌクレオシドに対する分離剤１及び２の分離能をＨＰＬＣによって評価した。試料溶液は、５種のヌクレオシドが各々２００ｐｐｍとなるような濃度とした。移動相には１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルとの混合液（１０ｍＭＡｃＯＮＨ₄ａｑ／ＣＨ₃ＣＮ＝１０／９０（体積比））を用いた。移動相流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎ.、カラム温度は２５℃、試料溶液の打ち込み量は１μＬ、検出器にはUV検出器（２５４ｎｍ）を用いた。分離剤１によるヌクレオシドのクロマトグラムを図７に、分離剤２によるヌクレオシドのクロマトグラムを図８に示す。溶出順序は分離剤１及び２ともに同様である。

(ヌクレオシドの分離：比較例)
市販されているODSカラム（商品名：Ｌ column；化学物質評価研究機構）を使用して、チミジン、ウリジン、アデノシン、シチジン、グアノシンのヌクレオシドに対するＯＤＳカラムの分離能をＨＰＬＣによって評価した。試料溶液は、５種のヌクレオシドが各々２００ｐｐｍとなるような濃度とした。移動相には１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルとの混合液（１０ｍＭＡｃＯＮＨ₄ａｑ／ＣＨ₃ＣＮ＝１０／９０（体積比)）を用いた。移動相流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎ.、カラム温度は２５℃、試料溶液の打ち込み量は１μＬ、検出器にはＵＶ検出器（２５４ｎｍ）を用いた。ＯＤＳカラムによるヌクレオシドのクロマトグラムを図１７に示す。ＯＤＳカラムではヌクレオシドを保持できない。

＜水溶性ビタミンの分離例＞
前記カラム１及び２を使用して、ニコチンアミド、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣの水溶性ビタミンに対する分離剤１及び２の分離能をＨＰＬＣによって評価した。試料溶液は、５種の水溶性ビタミンが各々１６０ｐｐｍとなるような濃度とした。移動相には１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルとの混合液（Ａ液：１０ｍＭＡｃＯＮＨ₄ａｑ、Ｂ液：ＣＨ₃ＣＮ、Ｂ液：０−１０分（９０→５０％）、１０．０１−３０分（５０％））を用いた。移動相流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎ.、カラム温度は２５℃、試料溶液の打ち込み量は５μＬ、検出器にはＵＶ検出器（２５４ｎｍ）を用いた。分離剤１による水溶性ビタミンのクロマトグラムを図９に、分離剤２による水溶性ビタミンのクロマトグラムを図１０に示す。溶出順序は分離剤１及び２ともに同様である。

(水溶性ビタミンの分離：比較例)
市販されているＯＤＳカラム（商品名：Ｌ column；化学物質評価研究機構）を使用して、ニコチンアミド、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣの水溶性ビタミンに対するＯＤＳカラムの分離能をＨＰＬＣによって評価した。試料溶液は、５種の水溶性ビタミンが各々１６０ｐｐｍとなるような濃度とした。移動相には１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルとの混合液（１０ｍＭＡｃＯＮＨ₄ａｑ／ＣＨ₃ＣＮ＝９０／１０（体積比））を用いた。移動相流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎ.、カラム温度は２５℃、試料溶液の打ち込み量は３μＬ、検出器にはUV検出器（２５４ｎｍ）を用いた。ＯＤＳカラムによるヌクレオシドのクロマトグラムを図１８に示す。ＯＤＳカラムでは水溶性ビタミンを保持できない。

＜アミノ酸の分離＞
カラム１及び２を使用して、トリプトファン、ロイシン、プロリン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリンのアミノ酸に対する分離剤１及び２の分離能をＨＰＬＣによって評価した。試料溶液は、トリプトファンが８ｐｐｍ,それ以外の６種のアミノ酸が８００ｐｐｍとなるような濃度とした。移動相には２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．２）とアセトニトリルとの混合液（２０ｍＭＨ₃ＰＯ₄（ｐＨ＝６．２）ｂｕｆｆｅｒ／ＣＨ₃ＣＮ＝２５／７５（体積比））を用いた。移動相流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎ.、カラム温度は４０℃、試料溶液の打ち込み量は５μＬ、検出器にはＵＶ検出器（２００ｎｍ）を用いた。分離剤１によるアミノ酸のクロマトグラムを図１１に、分離剤２によるアミノ酸のクロマトグラムを図１２に示す。溶出順序は分離剤１及び２ともに同様である。

(アミノ酸の分離：比較例)
市販されているODSカラム（商品名：Ｌ column；化学物質評価研究機構）を使用して、トリプトファン、ロイシン、プロリン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリンのアミノ酸に対するＯＤＳカラムの分離能をＨＰＬＣによって評価した。試料溶液は、チロシンが８ｐｐｍ,それ以外の6種のアミノ酸が８００ｐｐｍとなるような濃度とした。移動相には２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．２）とアセトニトリルとの混合液（２０ｍＭＨ₃ＰＯ₄（ｐＨ＝６．２）ｂｕｆｆｅｒ／ＣＨ₃ＣＮ＝２５／７５（体積比））を用いた。移動相流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎ.、カラム温度は４０℃、試料溶液の打ち込み量は５μＬ、検出器にはＵＶ検出器（２００ｎｍ）を用いた。ＯＤＳカラムによるアミノ酸のクロマトグラムを図１９に示す。溶出順序は分離剤１及び２ともに同様である。ＯＤＳカラムによるアミノ酸のクロマトグラムを図１９に示す。ＯＤＳカラムではアミノ酸を保持できない。

＜生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体の分離＞
カラム１及び２を使用して、ニコチン酸メチル、ニコチン酸、６−ヒドロキシニコチン酸、５−ヒドロキシニコチン酸に対する分離剤１及び２の分離能をＨＰＬＣによって評価した。試料溶液は、ニコチン酸メチルが１００ｐｐｍ、それ以外の生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体が２５０ｐｐｍとなるような濃度とした。移動相には１０ｍＭ酢酸アンモニウムとアセトニトリルとの混合液（１０ｍＭＡｃＯＮＨ₄／ＣＨ₃ＣＮ＝１０／９０（体積比））を用いた。移動相流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎ.、カラム温度は４０℃、試料溶液の打ち込み量は５μＬ、検出器にはＵＶ検出器（２２０ｎｍ）を用いた。分離剤１による生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体のクロマトグラムを図１３に、分離剤２による生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体のクロマトグラムを図１４に示す。溶出順序は分離剤１及び２ともに同様である。

(生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体の分離：比較例)
市販されているＯＤＳカラム（商品名：Ｌ column；化学物質評価研究機構）を使用してニコチン酸メチル、ニコチン酸、６−ヒドロキシニコチン酸、５−ヒドロキシニコチン酸に対するＯＤＳカラムの分離能をＨＰＬＣによって評価した。試料溶液は、ニコチン酸メチルが１００ｐｐｍ、それ以外の生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体が２５０ｐｐｍとなるような濃度とした。移動相には１０ｍＭ酢酸アンモニウムとアセトニトリルとの混合液（１０ｍＭＡｃＯＮＨ₄／ＣＨ₃ＣＮ＝９０／１０（体積比））を用いた。移動相流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎ.、カラム温度は２５℃、試料溶液の打ち込み量は５μＬ、検出器にはＵＶ検出器（２２０ｎｍ）を用いた。ＯＤＳカラムによるアミノ酸のクロマトグラムを図２０に示す。ＯＤＳカラムでは生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体を保持できない。

＜核酸塩基とヌクレオシド混合物の分離＞
カラム２を使用して、チミン、ウラシル、アデニン、シトシンの４種の核酸塩基およびチミジン、ウリジン、アデノシン、シチジン、グアノシンの５種のヌクレオシド、合計９化合物に対する分離剤２の分離能をＨＰＬＣによって評価した。試料溶液は、４種の核酸塩基が各々１００ｐｐｍ、５種のヌクレオシドが１２０ｐｐｍとなるような濃度とした。移動相には１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルとの混合液（Ａ液：１０ｍＭＡｃＯＮＨ₄ａｑ、Ｂ液：ＣＨ₃ＣＮ、Ｂ液：０−２０分（９５→７０％）、２０．０１−３０分（７０％））を用いた。移動相流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎ.、カラム温度は２５℃、試料溶液の打ち込み量は１μＬ、検出器にはＵＶ検出器（２５４ｎｍ）を用いた。分離剤２による核酸塩基とヌクレオシド混合物のクロマトグラムを図１５に示す。

＜ジペプチド及びトリペプチドの分離＞
カラム１及び２を使用して、Ｈ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｈ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−ＯＨ、Ｈ−Ｇｌｕ−Ｇlu-ＯＨのジペプチドおよびトリペプチドに対する分離剤１及び２の分離能をＨＰＬＣによって評価した。試料溶液は、Ｈ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＯＨが７０ｐｐｍ, それ以外の３種試料が２９０ｐｐｍとなるような濃度とした。移動相には２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．２）とアセトニトリルとの混合液（２０ｍＭＨ₃ＰＯ₄（ｐＨ＝６．２）ｂｕｆｆｅｒ／ＣＨ₃ＣＮ＝４０／６０（体積比））を用いた。移動相流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎ.、カラム温度は４０℃、試料溶液の打ち込み量は３μＬ、検出器にはＵＶ検出器（２００ｎｍ）を用いた。分離剤１によるジペプチドおよびトリペプチドのクロマトグラムを図２１に、分離剤２によるジペプチドおよびトリペプチドのクロマトグラムを図２２に示す。溶出順序は分離剤１及び２ともに同様である。

(ジペプチド及びトリペプチドの分離：比較例)
市販されているＯＤＳカラム（商品名：Ｌ column；化学物質評価研究機構）を使用して、Ｈ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｈ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−ＯＨ、Ｈ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＯＨのジペプチドおよびトリペプチドに対するＯＤＳカラムの分離能をＨＰＬＣによって評価した。試料溶液は、Ｈ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＯＨが７０ｐｐｍ, それ以外の３種試料が２９０ｐｐｍとなるような濃度とした。移動相には２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．２）とアセトニトリルとの混合液（２０ｍＭＨ₃ＰＯ₄（ｐＨ＝６．２）ｂｕｆｆｅｒ／ＣＨ₃ＣＮ＝９０／１０（体積比））を用いた。移動相流量は１．０ｍＬ／ｍin.、カラム温度は４０℃、試料溶液の打ち込み量は３μＬ、検出器にはＵＶ検出器（２００ｎｍ）を用いた。ＯＤＳカラムによるジペプチドおよびトリペプチドのクロマトグラムを図２３に示す。ＯＤＳカラムではジペプチドおよびトリペプチドの分離には適さない。

図１〜図１５、図２１及び２２から明らかなように、分離剤１及び２のいずれにおいても、糖類、核酸化合物、アミノ酸、水溶性ビタミン、酸性化合物及びその誘導体並びにオリゴペプチドに対して十分な分離が得られている。また分離剤１及び２における上記分離対象物の溶出順序は同じである。分離剤１は分離剤２に比べて全体の溶出時間がより短く、分離剤２は分離剤１に比べて各ピーク間の距離がより長い。よって、例えば分離剤１は上記分離対象物の分析への適用が期待され、分離剤２は上記分離対象物の分取への適用が期待される。

食品・化粧料・医農薬などの分野では、生体内で有効な効果を示すために親水性もしくは極性化合物が多く、ＯＤＳカラムでは保持しない化合物に対して、効率的な分離技術の高度化がさらに期待されている。よって本発明はこのような分野における糖類、核酸化合物、アミノ酸、水溶性ビタミン、生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体、オリゴペプチドの生産性向上やその分析の高速化をもたらすことが期待され、これら分野におけるさらなる発展に寄与することが期待される。

１グリセロール
２キシロース
３フルクトース
４グルコース
５スクロース
６マルトース
７ラクトース
８チミン
９ウラシル
１０アデニン
１１シトシン
１２チミジン
１３ウリジン
１４アデノシン
１５シチジン
１６グアノシン
１７ニコチンアミド
１８ビタミンＢ６
１９ビタミンＢ１
２０ビタミンＢ１２
２１ビタミンＣ
２２トリプトファン
２３ロイシン
２４プロリン
２５アラニン
２６グルタミン酸
２７アスパラギン酸
２８セリン
２９ニコチン酸メチル
３０ニコチン酸
３１６−ヒドロキシニコチン酸
３２５−ヒドロキシニコチン酸
３３Ｈ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＯＨ
３４Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ
３５Ｈ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−ＯＨ
３６Ｈ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＯＨ

Claims

担体と担体の表面に化学結合によって結合する多糖とからなる分離剤を用いてクロマトグラフィーによって二種以上の水溶性生体関連物質の混合液から水溶性生体関連物質を分離する方法であって、
前記水溶性生体関連物質が、糖類、アミノ酸、水溶性ビタミン、生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体、オリゴペプチド、核酸塩基、並びにヌクレオシドから選択される１種以上である、方法。
前記多糖がセルロース又はアミロースであることを特徴とする請求項１に記載の方法。