JP5914465B2

JP5914465B2 - 止血剤組成物

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Publication number: JP5914465B2
Application number: JP2013510679A
Authority: JP
Inventors: フォン・ドンゲン，エリザベト
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2010-05-20
Filing date: 2011-04-07
Publication date: 2016-05-11
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Description

本発明は、止血剤として医薬用途のための架橋したゼラチン組成物に向けられている。本発明は、さらに、前記組成物の製造に向けられている。これらの組成物は、血管閉塞型器具(vascular plug type device)、創傷縫合具、切り傷を治療するのに使用するための包帯、浸出性傷等を含む種々の医学的用途の止血剤として有用である。

止血剤は外科的処置に使用する即時外傷管理から広範囲の用途がある。これらの物質は、傷口の開いた傷、脾臓や腎臓傷害のような種々のタイプの傷からの出血をコントロールする助けとなる。

天然誘導源から製造された生分解性止血剤は数十年間利用できてきた。これらの例は、アップジョンにより製造されたＧｅｌｆｏａｍ^Ｒであって、米国特許第２，４６５，３５７号明細書に開示されたもの；Ａｃｅｃｏｎにより製造されたＡｖｉｔｅｎｅ^Ｒであって、米国特許第３，７４２，９５５号明細書に開示されたもの、およびジョンソンアンドジョンソンにより製造されたＳｕｒｇｉｃｅｌｌ^Ｒであって、米国特許第３，３６４，２００号明細書に開示されたものである。これらの生分解性止血剤は、主に、コラーゲン、ゼラチンおよびセルロースを使用して製剤化される。これらの材料のうちコラーゲンから製造されたものが、血小板に影響を与えず、生理学的止血に類似した方法で、出血を止める凝血カスケードを活性化することが知られている唯一の種類である。

血小板は、止血の開始段階で重要な役割を演じる。したがって、損傷に続いて血小板は露出した内皮下結合組織に接着し：次いで、追加の血小板は接着した血小板層に結合し、さらなる出血に対するバリヤーとして作用する栓を形成する。接着した血小板も凝固促進因子を放出し、血液凝固を促進する。

コラーゲンは結合組織の主要な成分であり、血小板が、接着および凝集によりコラーゲン繊維と相互作用することは周知である。言い換えれば、コラーゲンは止血開始に重要である。

さらに、コラーゲン誘導止血剤における改良は、その作用の速度を上げてきた。こうして、米国特許第４，２１５，２００号明細書は、コラーゲン繊維に化学的改質を施し、静電荷を増し、生理学的ｐＨにおいて高い陽電荷にすることを記載する。しかし、これらの処理は望ましくない化学残留物のリスクをもたらす。

さらに、動物源コラーゲンの止血剤における使用は、例えば、抗原反応やアレルギー反応のような潜在的免疫原性に関する懸念のような安全性の問題をもたらす。現在使用されている動物源コラーゲンやゼラチン混合物を完全に特性化し、精製し、又は再生成することができないことは、製薬や医学業界に進行中の関心事である。さらに、抽出および精製過程からもたらされる細菌汚染やエンドトキシン荷重に関する安全性問題が存在する。組み換え技術により製造したコラーゲン様ペプチドやゼラチン類はこれらの安全性問題の解決法である。組み換えコラーゲン様ペプチドの使用は、国際特許出願ＷＯ２００４０７８１２０号公報に開示されているが、この公報は、組み換えコラーゲン繊維から製造される物質は市販されている止血スポンジの微小構造に似ていることのみを教示する。国際特許出願ＷＯ２００００９０１８号公報は、止血剤中の組み換えコラーゲンＩＩＩの使用を教示する。しかし、記載されている組み換えコラーゲンは、プロリル−４−ヒドロキシラーゼの存在下で組み換え製造するために事実上微小繊維でもある。ホモ−またはヘテロ−三量体構造は天然コラーゲンによく似ている。しかし、ホモ−またはヘテロ−三量体コラーゲン様蛋白質は、該蛋白質が微小器官（特に、好適Ｐｉｃｈｉａ宿主系）により分泌される最も効率的な組み換え生成系と両立しない。これらの分泌ベースの系は、例えば、分泌された蛋白質の収量が顕著に高い等の多くの利点がある。別の利点は、分泌された組み換え蛋白質を精製するための下流処理が、当該処理が組み換え生成物を得るための宿主細胞の崩壊を必要としないので、そんなに複雑でないことである。したがって、化学的修正の必要性がなく効率的であり、しかも現在公知のコラーゲン誘導薬剤よりも生成するのにより容易な組み換えコラーゲン様蛋白質やゼラチン蛋白質に基づく止血剤に対する必要性がある。

米国特許第２，４６５，３５７号明細書米国特許第３，７４２，９５５号明細書米国特許第３，３６４，２００号明細書米国特許第４，２１５，２００号明細書ＷＯ２００４０７８１２０号公報国際特許出願ＷＯ２００００９０１８号公報

一般的定義
「含む “comprising” 」という用語は、記載した部分、工程または成分の存在を特定すると解釈すべきであるが、一以上の追加の部分、工程または成分を排除しない。

不定冠詞 “a” や “an” により要素への言及は、一つの若しくは一つのみの要素であることを明らかに要求する文脈でない限り、二以上の要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞 “a” や “an” は、通常、「少なくとも一つ」を意味する。

「蛋白質」、「ポリペプチド」または「ペプチド」という用語は、交換可能に使用され、アミノ酸類の鎖からなる分子に言及し、作用、サイズ、三次元構造や起源の特定のものへの言及ではない。

本明細書中で使用する「ゼラチン」という用語は、起源が、伝統的な方法による抽出または組み換えまたは生合成のいずれかのゼラチン、あるいはゼラチンの少なくとも一構造および／または機能的特性を有するいずれかの分子に言及する。ゼラチンは、現在、動物（例えば、ウシ、ブタ、げっ歯類、ニワトリ、ウマ、ウオ等）源、例えば、骨および組織から誘導されるコラーゲンからの抽出により得られる。この用語は、ゼラチン製品に含まれる二種以上の組成物ならびにゼラチン物質に貢献する個々のポリペプチドの双方を包含する。したがって、本発明に関連して使用される組み換えゼラチンという用語は、ゼラチンポリペプチドを含む組み換えゼラチン物質ならびに個々のゼラチンポリペプチドの双方を包含する。ゼラチンを誘導できるポリペプチドは、コラーゲン、プロコラーゲンならびにコラーゲンの少なくとも一構造および／または機能的特性を有するその他のポリペプチドのようなポリペプチドである。このようなポリペプチドはシングルコラーゲン鎖、またはコラーゲンホモ三量体もしくはヘテロ三量体、あるいはいずれかのフラグメント、誘導体、オリゴマー、ポリマー、あるいはそのサブユニットを含有でき、少なくとも一つのコラーゲン様ドメイン（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ領域）を含有する。この用語は、特に、天然で見出されていない人工配列、例えば、改変コラーゲン配列、例えば、天然コラーゲン配列から、削除、追加、置換、またはその他の変更により改変した配列である。このような配列は、適切な改変コラーゲンポリヌクレオチド構造等から得ることができる。

明細書中で記載する「架橋剤」という用語は、架橋結合剤（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）を含む組成物に言及する。本明細書で使用する「架橋結合剤」は、有機分子における分子内および分子間共有架橋を導入することができる反応性化学化合物に言及する。

図１は、血液試料の血小板数における種々の架橋済みゼラチンの影響を示す。図２は、架橋済みゼラチンと接触後の血液試料のβ−トロンボグロブリンの量を示す。図３は、種々の架橋済みゼラチンの存在下におけるトロンビン−抗トロンビンコンプレックスの形成を示す。図４は、種々の架橋済みゼラチンの存在下の血液凝固時間を示す。図５は、種々の架橋済みゼラチンの存在下の血液凝固を妨げるのに必要なヘパリンの最小量を示す。

より十分に本発明を記載する。しかし、本発明は多くの異なる形態に具現化でき、本明細書で記載する特定の実施態様に限定されると解釈すべきでない。
本発明は、止血剤として使用するために少なくとも７の等電点を示す架橋ゼラチンを含む組成物を提供する。

好ましくは、架橋されるべきゼラチンの等電点は、架橋前、少なくとも７、より好ましくは少なくとも８、特に少なくとも９、より特に少なくとも１０、そして特別に少なくとも１１である。

好ましくは、架橋後の架橋ゼラチンの等電点は、少なくとも８、より好ましくは少なくとも９、特に少なくとも１０、そして、より特に少なくとも１１である。
ゼラチンおよび架橋ゼラチンの等電点は、ゼラチンのアミノ酸組成に基づいて算出する。

架橋されているゼラチンは、好ましくは、組み換えゼラチンである。ＥＰ０９２６５４３号、ＥＰ１０１４１７６号およびＷＯ０１／３４６４６号各公報、ならびに、具体的には、ＥＰ０９２６５４３号およびＥＰ１０１４１７６号各公報の実施例は好適な組み換えゼラチンおよびメチロトローフィック酵母（特に、Ｐｉｃｈａｐａｓｔｏｒｉｓ）を使用するその製造方法を記載する（これらの特許公報を参照として全体を本明細書中に含める）。

組み換えゼラチンの利点は、一定の特性を引き出すためにアミノ酸配列を上手く処理できることである。これらの特性の例は、（ｉ）組み換えゼラチンの等張点および電荷密度（例えば、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｄ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）またはリシン（Ｌｙｓ）のような荷電アミノ酸を導入または除去できる）、（ｉｉ）グリコシル化パターン（例えば、一定位置のトレオニンおよび／またはセリンアミノ酸の欠如がグリコシル化の欠如をもたらす）、（ｉｉｉ）組み換えゼラチンのサイズ、（ｉｖ）架橋性アミノ酸の量（例えば、リシンの量）、（ｖ）生分解性をメタロプロテイナーゼの開裂サイト有無により修正できる。

好適な実施態様では、架橋されているゼラチンは、少なくとも１．０そしてより好ましくは少なくとも１．１である、アルギニンおよびリシン残基の総数とグルタミンおよびアスパラギンアミノ酸残基の総数との間の比を含む。より好適な実施態様では、本発明は止血用組成物を提供し、ここで、架橋されたゼラチン、好ましくは、組み換えゼラチンは、架橋前に少なくとも０．４０ミリモル／ｇリシン残基、より好ましくは、少なくとも０．６０ミリモル／ｇ、そして特に少なくとも０．８０ミリモル／ｇを含む。

明らかに、一層架橋可能な基が入手できるとき、架橋量は、原則として、架橋可能な基がより少なく存在する場合に比較してより多い。また、架橋基の量は、架橋ゼラチンの生分解性を決定する。組み換えゼラチンを使用するとき、架橋性基の量を制御でき、したがって、架橋ゼラチンの生分解性を上手く処理できる。

架橋の最適度は止血剤の意図する使用および意図する塗布方法に依存する。架橋の最小量は塗布後溶解しない止血剤をもたらし得る。
別の好適実施態様では、組成物中の組み換えゼラチンは、１０ｇ未満のブルーム強度を示す非ゲル化性組み換えゼラチンである。

ヒドロキシプロリンおよびヒドロキシリシン残基の存在しない組み換えゼラチンも好ましい。これらのようなヒドロキシル化残基は、分子内および分子間水素橋の形成ができ、ホモまたはヘテロ三量コラーゲン構造をもたらし、これらは、酵母、特にＰｉｃｈａｐａｓｔｏｒｉｓによる細胞外分泌による好適な方法と両立できない。細胞外分泌と両立できる組み換えゼラチンの例は、ＥＰ０９２６５４３、ＥＰ１０１４１７６およびＷＯ０１／３４６４６号公報に開示されている。

別の好適な実施態様では、細胞結合性を増強するためおよび／または可及的に少ない免疫原性のため官能化組み換えゼラチンを架橋し本発明の止血用組成物を形成できる、例えば、ＥＰ１６０８６８１号およびＥＰ１３６８０５５号公報に開示されており、これらの特許文献全体を参照として本明細書に含める。

別の好適な実施態様では、本発明の組成物に使用する組み換えゼラチンの分子量は、少なくとも２４ｋＤａ、より好ましくは、少なくとも３５ｋＤａ、そして最も好ましくは少なくとも５０ｋＤａである。

別の好適な実施態様では、組み換えゼラチンはＲＧＤモチーフに富んだゼラチンである。本発明の文脈で「ＲＧＤに富んだゼラチン」という用語は、ゼラチン様ポリペプチドが、分子当たりアミノ酸の総数の百分率として算出して、ＲＧＤモチーフの一定のレベルおよびＲＧＤモチーフのより均等な分布を示すことを意味する。本発明の文脈では、ＲＧＤに富んだゼラチンは、国際特許出願ＷＯ２００４／０８５４７３号およびＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載されている（これらの公報を参照として本明細書中に全体として含める）。好ましくは、組み換えゼラチンは、組み換えゼラチン構造当たり少なくとも１のＲＧＤモチーフ、より好ましくは、少なくとも３のそして特に少なくとも５のＲＧＤモチーフを含む。

１種以上の異なるゼラチンは架橋していても良い。好ましくは、単一のゼラチンが架橋される。
本発明の架橋止血組成物の重要な特徴は、当該組成物は生分解性であり、それを除去するのに侵襲性外科的方法を要しない。

推測するに、天然ゼラチンの分解をもたらすのと同じメカニズムにより組み換えゼラチンが分解するがどうか自明でない。天然ゼラチンおよびコラーゲンが、プロテアーゼ、具体的にマトリックス−メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）により人体中で分解されることは知られている。マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ’ｓ）は亜鉛依存性エンドペプチダーゼである。ＭＭＰ’ｓはメトジンシン科（ｍｅｔｚｉｎｃｉｎｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）として知られているプロテアーゼの上科に属する。集合的に、これらのプロテアーゼは総ての種類の細胞外マトリックス蛋白質を分解できるが、しかし、多くの生物活性分も処理できる。ＭＭＰ’ｓの重要なグループはコラゲナーゼである。これらのＭＭＰ’ｓは、３重らせん線維コラーゲンを識別３／４および１／４フラグメントに分解できる。これらのコラーゲンは骨や軟骨の主要成分であり、ＭＭＰ’ｓはコラーゲンを分解できる唯一の公知のほ乳類酵素である。伝統的に、コラゲナーゼは、ＭＭＰ−１（間質コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−８（好中球コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ３）およびＭＭＰ−１８（コラゲナーゼ４）である。ＭＭＰ’ｓの別の重要なグループは、ゼラチナーゼにより形成される。これらのＭＭＰ’ｓの主要基質は、タイプＩＶコラーゲンおよびゼラチンであり、これらの酵素は触媒ドメイン中に挿入された追加のドメインの存在により区別される。このゼラチン結合領域は、亜鉛結合モチーフ直前に位置し、触媒ドメインの構造を崩壊させない別の折りたたみ単位を形成する。このサブグループの２メンバーはＭＭＰ−２（７２ｋＤａゼラチナーゼ、ゼラチナーゼ−Ａ）およびＭＭＰ−９（９２ｋＤａゼラチナーゼ、ゼラチナーゼ−Ｂ）である。しかし、国際特許出願ＷＯ／２００８１０３０４５号公報は、ＭＭＰの公知の開裂部位を含まない組み換えゼラチンがヒトマトリックスメタロプロテナーゼ１（ＭＭＰ１）による酵素的分解性であったことを開示する（参照として明細書中に含める）。予測されるより明らかに多くの種類の組み換えゼラチンが分解されうる。したがって、架橋組み換えゼラチンは、止血剤組成物に望ましい漸次生分解性要求を発揮し得る。

本発明の止血剤組成物の製造は、表面電荷において中性作用示すか、または架橋したゼラチンにおいて陽電荷をもたらすをいずれかの架橋剤を使用する当業界で公知のいずれかの方法により達成できる。

好ましくは、架橋剤は、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドおよび１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドのようなカルボジイミド類であるが、これらに限定されない。好適な実施態様では、本発明の止血剤組成物の製造方法は、水溶性カルボジイミドを使用する、ゼラチンを架橋することにより達成される。さらにより好適な実施態様では、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣもしくはＥＤＡＣ）を使用してゼラチンを架橋する。架橋反応条件は使用する架橋剤に依存し、当該条件は当業者に周知である。

本発明の好適な組成物は、等電点が少なくとも７の架橋済み組み換えゼラチンを９２〜９９．０重量％含む。
本発明の組成物は当業者に公知であるいずれかの方法により製造できる。

本発明の組成物は、好適には、下記：
（ａ）ゼラチン、好ましくは、組み換えゼラチンを水中に、少なくとも０．１、０．５、１，３、６、１２、２４〜３５重量容量％溶解させること；
（ｂ）得られた溶液を凍結乾燥させること；
（ｃ）少なくとも０．１、０．２５、０．５、１、１．５、２、２．５〜１０重量％の濃度のカルボジイミド架橋剤、好ましくはＥＤＣを含む極性溶媒、好ましくは、エタノール中で、凍結乾燥させた物質を、少なくとも１０分で最高２４時間までの間で架橋させること；
を含む方法により製造される。

本発明の組成物は、好適には、下記：
（ａ）ゼラチン、好ましくは、組み換えゼラチンを水中に、少なくとも０．１、０．５、１，３、６、１２、２４〜３５重量容量％溶解させること、
（ｂ）得られた溶液（ａ）のｐＨを、３〜６、より好ましくは、４〜５そしてさらにより好ましくは４．５に調整すること、
（ｃ）少なくとも０．６、１．２、３．６、７．２、１２．５のモル比で少なくとも１０分で最高２４時間、ＥＤＣ／リシン残基中のＥＤＣを加えることにより、得られた溶液を架橋させること；
（ｄ）架橋済みゼラチンヒドロゲルを超トラックスし（ｕｌｔｒａｕｘｉｎｇ）、水で濯ぐこと；
（ｅ）得られた架橋済みゼラチンヒドロゲル粒子を凍結乾燥し、粉末を得ること；
を含む方法により好適に製造できる。

本発明の別の局面は、少なくとも７の等電点を示す架橋済みゼラチンを含む組成物の止血剤として使用するための医薬の製造における使用を提供する。ゼラチンおよび架橋済みゼラチンの組成物および総ての態様の好適なものは上述した通りである。

本発明の止血剤は、表面、特に大きな表面からの出血の阻止に特に適用できる。例えば、当該止血剤は、（ａ）切除もしくは切断骨、（ｂ）切断器官、例えば、外科的にもしくは外傷的に切断された脾臓、肝臓もしくは腎臓、（ｃ）微小血管が優先する中枢神経系、（ｄ）補綴手術、（ｅ）壊死組織の外科的切除によりもたらされる滲血表面、（ｆ）美容整形外科および（ｇ）一以上の小さな源（例：顔面切）からの滲血や出血に有用である。

止血剤は、種々の形態、例えば、表面に対して直接的粉末として；鉛筆型の止血薬として；ゲル、スポンジもしくは繊維形態として；または医薬器具、創傷用包帯もしくはその他の医薬用具の表面上の被覆として施用され得る。使用する止血剤の量は、出血表面や血液の流れの重篤度の程度で変動する。充分な止血剤を施用して所望の阻止を行う。総ての適用は、その自身最適な架橋度を示し得る。

本発明を下記の非制限的実施例で例証するが、特記しない限り総ての部および百分率は重量を基準とする。

本発明の実施例を添付の図面で例証する。
図１は、血液試料の血小板数における種々の架橋済みゼラチンの影響を示し；
図２は、架橋済みゼラチンと接触後の血液試料のβ−トロンボグロブリンの量を示し；
図３は、種々の架橋済みゼラチンの存在下におけるトロンビン−抗トロンビンコンプレックスの形成を示し；
図４は、種々の架橋済みゼラチンの存在下の血液凝固時間を示し；
図５は、種々の架橋済みゼラチンの存在下の血液凝固を妨げるのに必要なヘパリンの最小量を示す。

異なる架橋方法を使用する止血剤の製造
国際特許出願ＷＯ２００８１０３０４１号に記載されている通りにして製造した組み替えゼラチンＣＢＥ３を使用した。架橋手順は下記の通りである：すなわち、ＣＢＥ３溶液（１％）をＥＤＣ架橋のためｐＨ４でまたはヘキサメチレンジイソシアナート（ＨＭＤＩＣ）もしくは脱ヒドロ化熱処理架橋（ＤＨＴ）のためｐＨ１０で緩衝化させ、次いで、凍結乾燥させた。凍結乾燥させたＣＢＥ３溶液を、無水エタノール中に溶解させたＥＤＣ（０．２５％）またはＨＭＤＩＣ（０．００７５％）と２４時間反応させることにより架橋した。反応の最後にエタノールを室温で減圧乾燥により除去した。ＤＨＴ架橋は、凍結乾燥させたＣＢＥ３を１夜８０℃で熱処理をし、次いで、８時間１６０℃で減圧条件下熱処理することにより行った。

動的チャンドラーループ法を使用する止血活性の評価
種々の架橋済みゼラチンの止血作用を「動的チャンドラーループ法」（ＣｈａｎｄｌｅｒＡＢ等、１９５８、ＬａｂＩｎｖｅｓｔ，７：ｐ１１０−１１４）を使用して試験した。この試験は、血液凝固モデルとして回転ミキサー中の管内部の止血材料を使用する。このモデルは、ヒト止血系の異なるカスケード反応（凝固、細胞変化、血小板および補体活性化）を開始するため人工表面の能力を研究する働きをする。

標準範囲の活性化部分トロンボプラスチン時間を有する３人の健常ボランティア（年齢：２０〜５０歳）から血液を採取した。これらの実験に使用した血液の品質は決定的重要性を有する。したがって、血液提供者の次の除外基準を厳格に行った：２週間前から喫煙したり服薬特に、アセチルサリチル酸、経口避妊薬、非ステロイド性抗炎症薬等のような止血に影響を与える薬剤を服薬したボランティアはいなかった。血液は、血流停止なく、非常に注意して「バタフライ」（約、１．４ｍｍ）を用いて滅菌し、予め抗凝血化処理した容器中に直接静脈穿刺により採取した。使用した抗凝血剤は５ＩＵ／ｍｌＨｅｐａｒｉｎ−Ｎａｔｒｉｕｍ−２５０００−ｒａｔｉｏｐｈａｒｍ（ＲａｔｉｏｐｈａｒｍＧｍｂＨ，Ｕｌｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）だった。総ての実験は、同じロット番号の抗凝固剤を使用した。各実験は、３人の提供者の各々から１２．５ｍｌの血液を使用して３回行った。実験を３７℃で行った。血液に加えた止血剤試料の表面積は５０ｃｍ^２だった。コントロールは架橋済みゼラチン無しの血液である。

下記のようにして血液凝固試験を行った：

結果
図１
ＥＤＣ架橋済み組み換えゼラチンは血小板の減少をもたらす。血液と人工表面との接触は、血小板機能の連続した損失を伴う血小板の活性化と変性をもたらす。血小板量の大きな減少は、高いトロンボゲン形成能に関連する。顕著な減少は、ＥＤＣを用いて架橋した組み換えゼラチンで観察された。その他の架橋方法では減少は観察されなかった。
図２
動的チャンドラーループ実験は、ＥＤＣ架橋済み組み換えゼラチンが血小板の活性化をもたらすことを示す。表面への接着性による血小板の活性は、４段階の事象をもたらす：すなわち、偽足の形成を伴う形態変化、接着、凝固および血小板因子のα−顆粒（血小板因子４、β−トロンボグロブリン、等）外への放出である。血漿中のβ−トロンボグロブリンの濃度は血小板活性化度に一致する。
図３
動的チャンドラーループ実験は、ＥＤＣ架橋済み組み換えゼラチンがトロンビン−抗トロンビンコンプレックスの形成をもたらすことを示す。トロンビン−抗トロンビンコンプレックス（ＴＡＴ）は、トロンビン形成の感受性高いマーカーであり、したがって、凝固活性検出の卓越したマーカーでもある。ＴＡＴコンプレックスは、生成したトロンビンと抗トロンビンＩＩＩとの結合後に形成される。極度に高いＴＡＴ濃度は、特に、高ヘパリン濃度（５ＩＵ／ｍｌ）を用いる実験におけるゼラチンの強力な凝血促進能に反映する。
凝固速度
図４
凝固メーター（Ｂｉｏｍａｔｉｃ２０００，Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を使用して凝固速度を測定した。当該凝固メーターは、試料にする特定の光波長の試料の吸光度を測定し、吸光度が経過時間と共にどのように変化するかによる光学的に凝固の過程をモニターする。上述したようにして４人の健常なボランティアから血液を採取した。これらの試料にヘパリンを加えなかった。表面積５０ｃｍ^２の架橋済みゼラチン止血剤を血液に加えた。最も早い凝固時間をＥＤＣ架橋済み組み換えゼラチンで検出し、それは強力な凝固促進能を示す。

実施例５
動的チャンドラーループ実験に記載されている通りにして提供者から血液を採取した。Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｎａｔｒｉｕｍ−２５０００−ｒａｔｉｏｐｈａｒｍ（ＲａｔｉｏｐｈａｒｍＧｍｂＨ，Ｕｌｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、１、３または５ＩＵ／ｍｌ濃度で、１２．５ｍｌ血液に加えた。血液を５０ｃｍ^２止血剤試料と共にチャンドラーループシステム中で１時間にわたって３７℃で回転させ、その後、肉眼で目視できる血栓形成を防止するためにヘパリンの最小濃度を決定した。肉眼的に目視できる血液凝固の形成を防止するために必要なヘパリンの濃度は、止血剤の性能を示す。１ＩＵ／ｍｌヘパリン濃度は、アミン−アミン架橋したゼラチンに必要であるが、ＥＤＣ架橋済み組み換えゼラチンは、このヘパリン濃度で血液凝固を依然として引き起こす。ヘパリン濃度を３ＵＬ／ｍｌまで増加させても、ＥＤＣ架橋済み組み換えゼラチンを用いると依然として血液凝固を阻止しなかった。ＥＤＣ架橋済み組み換えゼラチンを加えた血液中の血栓形成を防止するのに、５ＵＬ／ｍｌヘパリンの添加が必要だった。

Claims

止血剤として使用するための、少なくとも７の等電点を有する架橋済みゼラチンを含む組成物であって、ゼラチンが、少なくとも一つのＲＧＤモチーフを含み、ゼラチンを１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を使用して架橋する、当該組成物。
架橋しようとするゼラチンの等電点が架橋前に少なくとも７である、請求項１に記載の止血剤として使用するための組成物。
架橋しようとするゼラチンの等電点が架橋前に少なくとも９である、請求項１または２に記載の止血剤として使用するための組成物。
架橋後の架橋済みゼラチンの等電点が少なくとも９である、請求項１〜３のいずれかに記載の止血剤として使用するための組成物。
前記組み換えゼラチンは、ヒドロキシプロリン残基およびヒドロキシリジン残基を含まない、請求項４に記載の止血剤として使用するための組成物。
前記組み換えゼラチンが、架橋前、少なくとも０．４０ミリモル／ｇリシン残基を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の止血剤として使用するための組成物。
前記組み換えゼラチンが、少なくとも１．０であるアルギニンおよびリシンの総数とグルタミンおよびアスパラギンアミノ酸残基の総数との間の比を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の止血剤として使用するための組成物。
前記組み換えゼラチンの分子量が少なくと５０ｋＤａである、請求項１〜７のいずれかに記載の止血剤として使用するための組成物。
請求項１〜８のいずれかに記載の組成物の製造方法であって、
（ａ）水中に少なくとも０．１〜３５重量容量％のゼラチンを溶解させること；
（ｂ）得られた溶液を凍結乾燥させること；
（ｃ）得られた凍結乾燥物を、少なくとも０．１〜１０重量％濃度の１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を含む極性溶媒中で架橋すること、ここで、架橋は少なくとも１０分〜２４時間まで行うこと
を含む上記組成物の製造方法。