JP5816081B2 - Ｔｐｂ塩の生体分子分離のための使用 - Google Patents

Description

本発明は、少なくとも１つのカチオン基を含む生体分子の分離方法、およびこの使用を含む生体分子の製造方法に関する。

本発明の方法は、例えば、血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体を選択的に遮断するエプチフィバチド（Ｅｐｔｉｆｉｂａｔｉｄｅ）（配列番号５）の製造に使用することができる。これは、血小板に可逆性に結合し、半減期が短い。冠動脈形成、心筋梗塞、およびアンギナ中の患者の治療において静注液として有効性が示されている。

本発明の方法は、オミガナン（Ｏｍｉｇａｎａｎ）の製造にも使用することができる。オミガナン（Ｏｍｉｇａｎａｎ）は、その５塩酸（５ＨＣｌ）塩の形で主に使用されるペプチドＨ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１）の国際共通名称（Ｃｏｍｍｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｎｏｍｉｎａｔｉｏｎ：ＣＩＤ）である。オミガナン（Ｏｍｉｇａｎａｎ）は、カチオン性抗菌ペプチドである。最近の研究から、炎症反応においてある役割を果たすこともできることがわかった。オミガナン（Ｏｍｉｇａｎａｎ）は、インビトロのアッセイにおいて、皮膚にコロニー形成し、炎症性疾患の発生においてある役割を果たす可能性がある微生物に対して迅速な殺菌活性を示した。

特許文献１には、グアニジン基および非置換テトラフェニルホウ酸イオンを含む化合物のペプチド合成における中間体としての使用が開示されている。一例として、アルギニンおよびテトラフェニルボレート（ＴＰＢ）によって生成される化合物の合成、およびペプチドＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＯＨの合成におけるその使用が記載されている。

米国特許第５，２６２，５６７号明細書

今回、驚くべきことに、液体媒体からの生体分子の分離の改善、特に少なくとも１つのカチオン基を含む生体分子のテトラフェニルホウ酸（ＴＰＢ）塩の使用による分離によって、所望の生体分子を高収率および高純度で得ることが可能になることがわかった。

したがって、本発明は、少なくとも１つのカチオン基を含む生体分子を、前記生体分子を含有する液体媒体から分離する方法であって、テトラフェニルホウ酸（ＴＰＢ）塩の使用を含む方法に関する。

本発明では、「カチオン基」という用語は、正電荷を有する生体分子の官能基を指す。本発明におけるカチオン基は、しばしばグアニジン基またはアミノ基から選択される。カチオン基がアミノ基であるとき、第一級、第二級、および好ましくは第三級のプロトン化されたアミノ基から選択される場合が多い。より好ましくは、アミノ基は、第四級（アンモニウム）基、例えばテトラアルキルアンモニウム基である。グアジニン基は、別の好ましいカチオン基である。

本発明では、「ＴＰＢ」という用語はテトラフェニルボレートを表す。ＴＰＢアニオンは、ベンゼン環上で置換されていてもよく、または非置換でもよい。好ましくは、ＴＰＢアニオンは非置換である。

適切な置換ＴＰＢアニオンの例としては、例えばテトラキス［３，５−ビス（トリフルオロメチルフェニル］ボレートが挙げられる。

本発明において、使用されるＴＰＢ塩は、一般に水溶液を生成することができる。ＴＰＢ塩のカチオンは、しばしば無機カチオンである。適切な無機イオンは、例えばナトリウム（Ｎａ＋）およびリチウム（Ｌｉ＋）である。ＬｉＴＰＢおよびＮａＴＰＢが好ましい。最も好ましく使用されるテトラフェニルホウ酸塩はＮａＴＰＢである。

本発明による方法において、テトラフェニルホウ酸塩の使用量は、一般に生体分子に存在するカチオン基１つ当たりテトラフェニルホウ酸塩１から１０当量であり、この量は好ましくは１から２当量、より好ましくは１から１．１当量である。

本発明による方法において、ＴＰＢ塩を、好ましくはアルカリ性剤と一緒に使用する。アルカリ性剤は、特に無機塩基、例えばＮａＨＣＯ_３およびＮａ_２ＣＯ_３から選択することができる。一般に、アルカリ性剤の選択は、精製対象の生体分子のアルカリ性状態に対する感度に依存する。

本発明では、「生体分子−ＴＰＢ塩」という用語は、生体分子テトラフェニルホウ酸（ＴＰＢ）塩を指す。

本発明では、「生体分子を含有する液体媒体」は、特に水性溶媒（「水溶液」）、有機溶媒（「有機溶液」）、またはそれらの混合物から選択される溶媒にとかした生体分子の溶液を表すと理解される。

本発明では、「水性溶媒」という用語は、特に水、および水溶性化合物の水溶液、例えば塩水または他の何らかの鉱物塩水溶液を指す。

「水と混じり合わない化合物」は、特に水溶液と接触させたとき、デカンテーションによって水相を有機相から分離することが可能になる化合物を表すと理解される。

本発明において、生体分子は、一般にペプチド、ペプチド誘導体、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体、および多糖からなる群から選択される。

本発明では、「ペプチド」という用語は、モノマーがアミノ酸であり、アミド結合を介して互いに共有結合しているポリマーを指す。ペプチドは、２個、またはしばしば２個以上のアミノ酸モノマー長である。さらに、本明細書における特定のペプチド配列はすべて、左から右への方向が通常のアミノ末端からカルボキシ末端への方向である式で表わされる。

本発明では、「アミノ酸」という用語は、少なくとも１つのＮＲ_１Ｒ_２基、好ましくはＮＨ_２基と、少なくとも１つのカルボキシル基とを含む任意の化合物を表すよう意図されている。本発明のアミノ酸は、天然または合成とすることができる。グリシンを除いて、天然アミノ酸はキラル炭素原子を含む。別段の記載のない限り、Ｌ型配置の天然アミノ酸を含む化合物が好ましい。アミノ酸残基は、本願全体を通して以下の通り省略して記載されている。アルギニンはＡｒｇまたはＲである。リシンはＬｙｓまたはＫである。プロリンはＰｒｏまたはＰである。トリプトファンはＴｒｐまたはＷである。アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤである。システインはＣｙｓまたはＣである。

本発明では、ペプチドの「カルボキシ末端」という用語は、遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を末端に有するアミノ酸配列の末端である。一方、ペプチドの「アミノ末端」という用語は、遊離アミノ基（−ＮＨ_２）を有するアミノ酸を末端に有するアミノ酸配列の末端を指す。

本明細書では、「ペプチド誘導体」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応するＤ型異性体、または非天然アミノ酸残基もしくはその化学的誘導体で置換されている類似体を包含する。ペプチドの化学的誘導体としては、通常ペプチドの一部分でない化学的部分をさらに少なくとも１つ含む誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。このような誘導体の例は、（ａ）アミノ末端または別の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体であって、ここで、アシル基は、アセチル、ヘキサノイル、オクタノイルなどのアルカノイル基；アロイル基、例えばベンゾイルまたはビオチニルとすることができる、（ｂ）末端カルボキシル基、または別の遊離カルボキシル基もしくはヒドロキシ基のエステル、および（ｃ）アンモニアまたは適切なアミンとの反応で生成される末端カルボキシル基または別の遊離カルボキシル基のアミドである。

本発明のフレームにおいて「オリゴヌクレオチド」という用語は、特に核酸塩基に結合している糖単位を含むヌクレオシドモノマー単位のオリゴマーを表し、前記ヌクレオシドモノマー単位は、インターヌクレオチド結合で結合している。「インターヌクレオチド結合」は、特に、自然界に見られる核酸に典型的に存在するホスホジエステル結合、または合成核酸および核酸類縁体に典型的に存在する他の結合など、２つのヌクレオシド部分間の化学結合を指す。このようなインターヌクレオチド結合は、例えばホスホまたはホスフィット基を含むことができ、この結合としては、ホスホもしくはホスフィット基の１個または複数の酸素原子が、置換基で修飾され、あるいは別の原子、例えば硫黄原子、またはモノアルキルアミノもしくはジアルキルアミノ基の窒素原子で置換されている結合を挙げることができる。典型的なインターヌクレオチド結合は、リン酸またはその誘導体のジエステル、例えばリン酸エステル、チオリン酸エステル、ジチオリン酸エステル、ホスホロアミド酸エステル、およびチオホスホロアミド酸エステルである。本発明において、インターヌクレオチド結合は、一般に適切な保護基で保護されている。β−シアノエチル基は、適切な保護基の一例である。

「ヌクレオシド」という用語は、特に糖に結合している核酸塩基からなる化合物を表すと理解される。糖としては、リボースや２’−デオキシリボースなどのフラノース環、およびシクロヘキセニル、アンヒドロヘキシトール、モルホリノなどの非フラノース環が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ヌクレオシドに含まれる糖の以下に記載される修飾、置換、および位置は、フラノース環を参照して記載されるが、同じ修飾および位置は、他の糖の環の類似の位置にも適用される。糖は、さらに修飾することができる。糖の修飾の非限定的な例として、特に例えばフラノシル糖環の２’位または３’位、特に２’位における、例えば水素；ヒドロキシ；メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシなどのアルコキシ；アジド；アミノ；アルキルアミノ；フルオロ；クロロおよびブロモによる修飾；２’−４’−および３’−４’−結合フラノシル糖環修飾、例えば環４’−ＯのＳ、ＣＨ_２、ＮＲ、ＣＨＦ、またはＣＦ_２による置換を含む、フラノシル糖環における修飾を挙げることができる。

「核酸塩基」という用語は、特に相補的核酸塩基または核酸塩基類似体と対になることができる特に窒素含有ヘテロ環式部分を表すと理解される。典型的な核酸塩基は、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）と、ピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む、天然核酸塩基；ならびに、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロ−ウラシルおよび−シトシン、５−プロピニル−ウラシルおよび−シトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アザ−ウラシル、−シトシンおよび−チミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、および他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンと、フッ素化塩基などの他の合成および天然核酸塩基を含む、修飾核酸塩基である。さらなる修飾核酸塩基としては、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）などの３環式ピリミジン；置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドル−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などのＧ−クランプが挙げられる。他の潜在的に適切な塩基としては、ユニバーサル塩基、疎水性塩基、乱交雑塩基、およびサイズ拡大塩基が挙げられる。

本発明では、「オリゴヌクレオチド誘導体」という用語は、「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）、モルホリノホスホロジアミデート、ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートなどの分子のクラスを指す。本発明による方法を、カチオン性ＰＮＡに適宜適用することができる。

本発明による方法を適用することができる生体分子の別のクラスは、カチオン性セルロースまたはカチオン性デンプンまたはカチオン性シクロデキストリンなどのカチオン性多糖である。カチオン性多糖は、例えば上述の少なくとも１つのカチオン性アミノ基、特に少なくとも１つの第四級（アンモニウム）基で官能化された多糖である。

グアニジン基またはアミノ基を含むペプチドの典型的な例は、アルギニン、ホモアルギニン、およびリシンから選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチドである。アルギニンおよびホモアルギニンから選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチドが好ましい。

グアニジン基またはアミノ基を含むオリゴヌクレオチドの典型的な例は、上記のアデノシン、グアノシン、およびシトシン、ならびにそれらの誘導体から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドである。

本発明による方法は、一般に生体分子を含有する液体媒体にＴＰＢ塩を添加するステップを含む。ＴＰＢ塩は、固体の形で、または好ましくは溶液、例えば水溶液として供給することができる。生体分子を含有する液体媒体にＴＰＢ塩を添加すると、一般に生体分子−ＴＰＢ塩が形成される。

本発明による方法において、生体分子中のカチオン基の数は、少なくとも１つである。本発明による方法に従って分離することができる生体分子の特定の例は、２から２０、しばしば３から１５のカチオン基を含む。

本発明による方法において、液体媒体から選択される生体分子は、一般に固体の生体分子−ＴＰＢ塩の形、またはその後の反応ステップでの使用に適した有機溶液の形で得られる。

固体の生体分子−ＴＰＢ塩が望ましいとき、本発明による方法は、一般に生体分子を含有する液体媒体から固体の生体分子−ＴＰＢ塩を沈殿または結晶化するステップを含む。この場合、液相を水溶液と適宜接触させることができる。このような水溶液は、例えば水、塩水、または他の何らかの鉱物塩水溶液とすることができる。この場合、水溶液のｐＨを制御することが特に有利である。水溶液のｐＨ値は、好ましくは１０以下、より好ましくは９以下、さらにより好ましくは７．５以下に制御される。水溶液のｐＨ値は、好ましくは５以上、より好ましくは、６．０以上、最も好ましくは６．５以上に制御される。水溶液のｐＨ値は、鉱物塩の添加によって制御することができる。使用することができる適切な塩としては、アルカリまたはアルカリ土類塩化物、特に塩化ナトリウム、アルカリまたはアルカリ土類硫酸塩、特に硫酸カリウム、アルカリまたはアルカリ土類炭酸水素塩、特に炭酸水素ナトリウムが挙げられる。塩化ナトリウムを好ましくは塩水溶液の５重量％の量で含む塩水溶液が、特に好ましい。

沈殿または結晶化は、一般に０℃から２０℃、好ましくは０℃から５℃の温度で実施される。

沈殿または結晶化した生体分子−ＴＰＢ塩は、例えば濾過、デカンテーション、遠心、またはスプレー乾燥によって水溶液から分離することができる。

適切な一手法によれば、生体分子−ＴＰＢ塩は、濾過によって回収され、場合によっては洗浄される。生体分子−ＴＰＢ塩は、場合によってはその後の反応ステップ、凍結乾燥、包装、および／または貯蔵などのその後の処理ステップにかける前に乾燥させることが好ましい。

ここで、特定の実施形態に関連して、本発明をさらに説明する。

本発明の第１の特定の実施形態において、液体媒体は水溶液である。

本発明のこの第１の態様において、少なくとも１つのカチオン基を含む生体分子の水溶液は、例えば有機溶媒または溶媒混合物中の前記生体分子を製造するための合成溶液に水溶液を添加することによって得ることができる。

次いで、少なくとも１つのカチオン基を含む生体分子を含有する前記水溶液は、一般に有機洗浄溶媒で洗浄される。有機洗浄溶媒は、好ましくは水と混じり合わない化合物から選択される。適切な有機洗浄溶媒の非限定的な例は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）やクロロホルムなどのハロカーボン、酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）や酢酸イソプロピル（ＡｃＯｉＰｒ）などのエステル、およびジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）などのエーテルから選択される。

任意選択の洗浄ステップによって、有機相と一緒に、反応媒体中で使用される有機反応溶媒、例えばＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、反応物質、および／または出発試薬の除去が可能になる。

本発明の第１の実施形態の第１の態様において、水溶液中に存在する少なくとも１つのカチオン基を含む生体分子は、上述されたように水溶液から固体の生体分子−テトラフェニルホウ酸（ＴＰＢ）塩［生体分子−ＴＰＢ塩］として沈殿または結晶化される。沈殿または結晶化は、例えばＴＰＢ塩を含有する水溶液に前記生体分子を含有する水溶液を注ぎ込むことによって実現することができる。別の例において、生体分子を含有する水溶液に、ＴＰＢ塩を含有する水溶液を添加する。沈殿または結晶化した生体分子−ＴＰＢ塩を、上述されたようにさらに処理することができる。

本発明による方法の第１の実施形態の第２の態様において、水溶液中に存在する少なくとも１つのカチオン基を含む生体分子は、生体分子−ＴＰＢ塩として第１の有機溶液に抽出される。抽出は、一般に水溶液をＴＰＢ塩および適切な有機溶媒または溶媒混合物と接触させることによって行われる。好ましい有機溶媒は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）やクロロホルムなどのハロカーボン、酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）や酢酸イソプロピル（ＡｃＯｉＰｒ）などのエステル、およびジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ＭＴＢＥなどのエーテルの単独、または例えばｎ−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノールなどのアルコールとの組合せから選択される。ジクロロメタンを使用して、良好な結果が得られる。

本発明による方法の第１の実施形態のこの態様において、生体分子を含有する水溶液のｐＨを制御することが特に有利である。この水溶液のｐＨ値は、好ましくは１０以下、より好ましくは９以下、さらにより好ましくは７．５以下に制御される。この水溶液のｐＨ値は、好ましくは５以上、より好ましくは６．０以上、最も好ましくは６．５以上に制御される。この水溶液ｐＨ値は、例えば鉱物塩水溶液を添加することによって制御することができる。上記の塩水溶液中で使用することができる適切な塩としては、アルカリまたはアルカリ土類塩化物、特に塩化ナトリウム、アルカリまたはアルカリ土類硫酸塩、特に硫酸カリウム、アルカリまたはアルカリ土類炭酸水素塩、特に炭酸水素ナトリウムが挙げられる。

本発明による方法の第１の実施形態の第３の態様において、本発明は、少なくとも１つのカチオン基を含む生体分子−ＴＰＢ塩の製造方法であって、
（ａ）少なくとも１つのカチオン基を含む生体分子の水溶液を準備するステップと、
（ｂ）ＴＰＢ塩を水溶液に添加するステップと、
（ｃ）生体分子−ＴＰＢ塩を水溶液から回収するステップと
を含む方法に関する。

本発明による方法の第２の実施形態において、液体媒体は有機溶液である。

この第２の態様において、液体媒体は、場合により水溶液で洗浄した後、テトラフェニルホウ酸塩が添加され、それによって生体分子−ＴＰＢ塩を含有する第１の有機溶液を生じる有機溶液である。少なくとも１つのカチオン基を含む生体分子の有機溶液は、例えば合成ステップが完了した後、有機溶媒または溶媒混合物、特に上述された反応溶媒中の生体分子を製造するための合成溶液を有機希釈溶媒で希釈することによって得ることができる。有機希釈溶媒は、好ましくは水と混じり合わない化合物から選択される。好ましくは、有機希釈溶媒は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）やクロロホルムなどのハロカーボン、酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）や酢酸イソプロピル（ＡｃＯｉＰｒ）などのエステル、およびジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ＭＴＢＥなどのエーテルの単独、または例えばｎ−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノールなどのアルコールとの組合せから選択される。ジクロロメタンを使用して、良好な結果が得られる。

少なくとも１つのカチオン基を含む生体分子の前記有機溶液を、上述されたように場合により水溶液で洗浄し、さらにＴＰＢ塩を含有する水溶液で洗浄することができ、それによって生体分子が生体分子−ＴＰＢ塩として溶解したままである第１の有機溶液が生じる。様々な洗浄ステップによって、第１の有機溶液中の不純物および他の望ましくない化合物含有量の低減が可能になる。

本発明による方法の第２の実施形態の第１の有利な態様において、生体分子−ＴＰＢ塩を単離することなく、得られた第１の有機溶液をその後の反応ステップにかける。

本発明による方法の第２の実施形態の第２の有利な態様は、少なくとも１つのカチオン基を含む生体分子−ＴＰＢ塩の製造方法であって、
（ａ）少なくとも１つのカチオン基を含む生体分子の有機溶液を準備するステップと、
（ｂ）ＴＰＢ塩を有機溶液に添加するステップと、
（ｃ）生体分子−ＴＰＢ塩を第１の有機溶液から回収するステップと
を含む方法に関する。

本発明による方法の第３の実施形態において、例えば上記の第１および第２の実施形態に記載されたように得ることができる生体分子−ＴＰＢ塩を含有する第１の有機溶液を、別の有機溶媒または溶媒混合物で処理して、生体分子−ＴＰＢ塩を含有する第２の有機溶液を得ることができる。別の有機溶媒または溶媒混合物は、生体分子−ＴＰＢ塩を含有する第１の有機溶液に直接添加してもよく、または前記第１の有機溶液を場合によってはさらに処理した後に添加してもよい。この好ましい後者の場合、例えば、生体分子−ＴＰＢ塩を含有する第１の有機溶液を、別の有機溶媒または溶媒混合物を添加する前に特に真空下で蒸発させることによって濃縮してもよい。別の有機溶媒は、好ましくはメタノールまたはメトキシエタノールなどのアルコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などのアミド型溶媒、ジクロロメタン（ＤＣＭ）やクロロホルムなどのハロカーボン、酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）や酢酸イソプロピル（ＡｃＯｉＰｒ）などのエステル、およびジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ＭＴＢＥなどのエーテル；ピリジン、アセトニトリル、またはそれらの混合物から選択される少なくとも１つの成分を含むことが好ましい。より好ましくは、別の有機溶媒は、メタノール、メトキシエタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）から選択される。メタノールまたはメトキシエタノールを用いることで、良好な結果が得られる。

本発明による方法の第３の実施形態の第１の有利な態様において、生体分子−ＴＰＢ塩を単離することなく、得られた第２の有機溶液をその後の反応ステップにかける。

本発明による方法の第３の実施形態の第２の有利な態様において、生体分子−ＴＰＢ塩は、上述されたように、沈殿または結晶化によって第２の有機溶液から固体の生体分子−ＴＰＢ塩として分離される。沈殿または結晶化は、生体分子−ＴＰＢ塩を含有する第２の有機溶液を水溶液に添加することによって行うことができる。あるいは、水溶液を前記第２の有機溶液に添加することによって、沈殿または結晶化を行うこともできる。沈殿または結晶化した生体分子−ＴＰＢ塩を、上述されたようにさらに処理することができる。

本発明による方法の第３の実施形態の第３の有利な態様において、生体分子−ＴＰＢ塩を含有する第２の有機溶液を、さらに濃縮ステップにかける。濃縮ステップは、真空下で蒸発させることによって実施される場合が多い。

本発明による方法の第４の実施形態において、例えば上記の第１または第２の実施形態において記載されるように得ることができる生体分子−ＴＰＢ塩を含有する第１の有機溶液を、例えば本明細書に前述されたように濃縮ステップにかけて、生体分子−ＴＰＢ塩を含有する濃縮された有機溶液を生じる。

生体分子−ＴＰＢ塩は、第３および第４の実施形態において記載されたように得ることができる濃縮された有機溶液から、上述されたように、例えば沈殿または結晶化によって分離することができる。沈殿または結晶化は、生体分子−ＴＰＢ塩を含有する濃縮された有機溶液を水溶液に注ぎ込むことによって行うことができる。あるいは、水溶液を前記濃縮された有機溶液に添加することによって、沈殿または結晶化を行うこともできる。沈殿または結晶化した生体分子−ＴＰＢ塩を、上述されたようにさらに処理することができる。

得られた生体分子−ＴＰＢ塩を含有する濃縮された有機溶液は、その後の反応ステップに直接使用することができる。場合によっては、前記濃縮された有機溶液を本明細書に前述された別の有機溶媒で希釈し、次いでその後の反応ステップにかけることができる。

本発明による方法の様々な実施形態は、好ましくは少なくとも１つのカチオン基を含むペプチドまたはその誘導体、さらに具体的にはグアニジン基またはアミノ基を含むペプチドまたはペプチド誘導体からなる群から選択される生体分子に適用することができる。グアニジン基またはアミノ基を含むペプチドまたはペプチド誘導体の典型的な例は、アルギニン（Ａｒｇ）、ホモアルギニン（ｈｏｍｏ Ａｒｇ）、およびリシン（Ｌｙｓ）から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチドである。

したがって、本発明は、別の特定の態様において、カチオン基を含む１個または複数のアミノ酸単位を含むペプチドまたはその誘導体の製造方法であって、
（ａ）有機溶液中で、第１のアミノ酸または第１のペプチドを第２のアミノ酸または第２のペプチドとカップリングさせて、カチオン基を含むペプチドを生じるステップであって、第１および／または第２のアミノ酸またはペプチドはカチオン基を含むステップと、
（ｂ）カップリングステップの終了後に、ＴＰＢ塩を添加するステップと、
（ｃ）本明細書に前述されたように、カチオン基を含むペプチドまたはその誘導体を水溶液または有機溶液から分離するステップと
を含む方法に関する。

本発明による方法は、ペプチド中のカチオン基の数が、２から２０、好ましくは３から１５である場合特に有利である。

本発明の方法は、カップリングステップで、アミノ酸ＡｒｇまたはＨａｒを含むペプチドが関与するとき特に有益である。驚くべきことに、ステップ（ｂ）および（ｃ）においてテトラフェニルホウ酸塩の場合、ＡｒｇまたはＨａｒの側鎖に対して保護基の使用を省略できることがわかった。本発明によるペプチド製造方法は、オミガナン（Ｏｍｉｇａｎａｎ）（配列番号１）またはエプチフィバチド（Ｅｐｔｉｆｉｂａｔｉｄｅ）（配列番号５）の製造に適用できることが有利である。

本発明のペプチド製造方法のステップ（ａ）において、関与するアミノ酸またはペプチド中間体中の１個または複数のアミノ基に、保護基を一般に使用することができる。

例示として、本発明のペプチド製造方法において、以下の保護基を使用することができる。ホルミル、トリフルオロアセチル、フタロイル、４−トルエンスルホニル、ベンゼンスルホニル、２−ニトロフェニルスルフェニルなどのアシル型保護基；置換または非置換のベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニリル）プロプ−２−イル−オキシカルボニル、２−（３，５−ジメチルオキシフェニル）プロプ−２−イル−オキシカルボニル、トリフェニルホスホノエチルオキシカルボニルなどの芳香族ウレタン型保護基；脂肪族ウレタン型保護基、特にｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２−メチルスルホニルエチルオキシカルボニル、および２，２，３−トリクロロエチルオキシカルボニル；
シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニルなどのシクロアルキルウレタン型保護基；チオウレタン型保護基、特にフェニルチオカルボニル；特にトリフェニルメチル（トリチル）などのアルキル型保護基；ならびに例えばｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシリルなどのベンジルトリアルキルシラン基；ならびに例えばメチルエステル、エチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステルなどのアルコキシ基、ベンジルエステルおよびｐ−ニトロベンジルエステル。

本発明のペプチド製造方法において、第１のアミノ酸またはペプチドは、一般に活性化カルボキシル基を有する。本発明の方法において、様々な活性化基、例えばＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、ピバロイルクロリド（ＰｉｖＣｌ）、ｉ−ブチルクロロホルメート（ＩＢＣＦ）に由来する基を使用してもよい。これらの活性化基に加えて、添加剤を有利に使用することがある。好ましい添加剤は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｓｕｃ−ＯＨ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、または３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）である。

本発明によるペプチド製造方法の別の特定の態様は、カップリングステップが完了した後、有機溶媒中の前記ペプチドを製造するための合成溶液に水溶液を添加することによって、少なくとも１つのカチオン基を含むペプチドまたはその誘導体の水溶液または有機溶液が得られる方法に関する。

一般に、ペプチドカップリングステップ後の合成溶液は、塩基を含有してもしなくてもよい。その結果、その後のステップは、塩基が存在するか否かに依存することがある。

合成溶液中に塩基が存在しない本発明によるペプチド製造方法の第１の実施形態において、合成溶液を酸の水溶液、例えば塩酸で希釈することが好ましい。好ましくは、次いで、溶液を有機溶媒またはその混合物で洗浄する。有機溶媒は、好ましくは水と混じり合わない化合物から選択される。このような適切な有機溶媒の非限定的な例は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）やクロロホルムなどのハロカーボン、酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）や酢酸イソプロピル（ＡｃＯｉＰｒ）などのエステル、およびジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ＭＴＢＥなどのエーテルから選択される。いくつかの異なる溶媒を使用してもよい。ジクロロメタン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、ジイソプロピルエーテル、およびＭＴＢＥの単独または組合せの使用が、特に有利である。洗浄ステップによって、有機相と一緒に、反応媒体中で使用される有機溶媒（例えば、ＤＭＦ、ＤＭＡ、ＮＭＰ）、反応物質（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）、および／または出発アミノ酸もしくはペプチドの除去が可能になる。

本発明のこの実施形態において、少なくとも１つのカチオン基を含むペプチドまたはその誘導体は水溶液中に存在し、水溶液へのＴＰＢ塩の添加およびペプチドまたはその誘導体のテトラフェニルホウ酸（ＴＰＢ）塩の回収は、上述されたように、特に本発明による方法の第１の実施形態に記載されたように、本発明による方法に従って実施することができる。

合成溶液中に塩基が存在する本発明によるペプチド製造方法の第２の実施形態において、合成溶液を上述された希釈溶媒で希釈することが好ましい。第２のステップにおいて、有機溶媒を含む有機溶液（有機相）を酸の水溶液に洗浄できることは有利である。この洗浄ステップは、特に出発化合物がＡｒｇ、ならびにＴＰＢとの塩を形成することができる特定の塩基性添加剤（例えば、ＴＥＡ、ＤＩＰＥＡ）および反応物質（例えば、ＥＤＵ）を含有するとき、出発化合物の水相を介した除去を可能にする。

本発明のこの実施形態において、少なくとも１つのカチオン基を含むペプチドまたはその誘導体は有機溶液中に存在し、有機溶液へのＴＰＢ塩の添加およびペプチドまたはその誘導体のテトラフェニルホウ酸（ＴＰＢ）塩の回収は、上記の様々な実施形態に記載されたように、本発明の方法に従って実現することができる。

オミガナン（Ｏｍｉｇａｎａｎ）（配列番号１）の合成の枠組みにおいて特に適切である特定の一実施形態において、本発明によるペプチド合成方法は、Ａｒｇ含有ペプチドのテトラフェニルホウ酸塩を形成するステップを含む。典型的には、前記Ａｒｇ含有ペプチドのテトラフェニルホウ酸塩は、通常本発明による方法に従ってカップリングステップによって得られるＡｒｇ含有ペプチドを含有するカップリングステップ反応媒体を、テトラフェニルホウ酸アニオンの供給源と接触させることによって形成される。テトラフェニルホウ酸塩は、テトラフェニルホウ酸アニオンの供給源として適切である。

したがって、好ましくは少なくとも１つのカップリングステップの完了後に添加されるテトラフェニルホウ酸塩（ＴＰＢ）の存在下で、少なくとも１ステップを行うことが好ましい。

テトラフェニルホウ酸（ＴＰＢ）塩のカチオンは、無機または有機とすることができる。有機イオンの例は、テトラエチルアンモニウム、ジイソプロピルエチルアンモニウム、Ｎ−エチルピペリジニウム、Ｎ−メチルモルホリニウム、Ｎ−エチルモルホリニウムである。適切な無機イオンは、例えばナトリウム（Ｎａ^＋）またはリチウム（Ｌｉ^＋）である。最も好ましくは、水溶液を生成することができるテトラフェニルホウ酸塩が使用される。ＬｉＴＰＢおよびＮａＴＰＢが好ましい。最も好ましく使用されるテトラフェニルホウ酸塩はＮａＴＰＢである。

ＴＰＢアニオンは、そのベンゼン環上で置換されていてもよく、または置換なしに使用することができる。好ましくは、ＴＰＢアニオンは置換されていない。適切な置換ＴＰＢアニオンの例としては、例えばテトラキス（３，５−ビストリフルオロメチルフェニル）ボレートが挙げられる。

テトラフェニルホウ酸塩の使用量は、広い制限内で異なり得る。好ましくは、Ａｒｇ含有ペプチド中の１Ａｒｇ単位当たり１から１０当量、好ましくは１から１．５当量のテトラフェニルホウ酸塩が使用される。

テトラフェニルホウ酸塩は、好ましくは本発明の方法において少なくとも１つのカップリングステップの完了後のワークアップ時に、溶媒または溶媒の混合物の存在下で使用される。適切な溶媒は、特にメタノール、メトキシエタノール、ジクロロメタン、ｎ−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、およびｔｅｒｔ−ブタノールである。メトキシエタノールを使用して、良好な結果が得られた。

この実施形態において、前記Ａｒｇ含有ペプチドのテトラフェニルホウ酸塩を、単離することなく少なくとも１つのその後の合成ステップにかけることができることは有利である。しばしば、前記Ａｒｇ含有ペプチドのテトラフェニルホウ酸塩を少なくとも脱保護ステップと、続いてカップリングステップにかける。

本発明はまた、少なくとも１つのカチオン基を含む固体の生体分子−ＴＰＢ塩にも関する。特に本明細書に記載されるペプチド、さらに具体的にはＡｒｇまたはＨａｒ含有ペプチドは、本発明による固体の生体分子−ＴＰＢ塩中の好ましい生体分子であり、とりわけ本発明の方法に従って得てもよい。

驚くべきことに、固体の生体分子−ＴＰＢ塩は、貯蔵されたとき実質的に安定であることがわかった。

「実質的に安定」は、貯蔵前後の生体分子−ＴＰＢ塩の生体分子含有量を比較した場合に、貯蔵後に見出される生体分子−ＴＰＢ塩含有量が、貯蔵前の生体分子含有量の少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％であるという事実を特に表すものとして理解される。

したがって、本発明はまた、本発明による固体の生体分子−ＴＰＢ塩を貯蔵する方法にも関する。

固体の生体分子−ＴＰＢ塩は、一般に２５℃以下、より好ましくは２２℃以下、さらにより好ましくは２０℃以下の温度で貯蔵される。固体の生体分子−ＴＰＢ塩は、一般に−９０℃以上、しばしば−８０℃以上の温度で貯蔵される。好ましくは、−２０℃以上、より好ましくは０℃以上の温度で貯蔵される。

本発明による固体の生体分子−ＴＰＢ塩の使用によって、比較的低いエネルギー消費で長期貯蔵が可能になることが明らかになった。

本発明による固体の生体分子−ＴＰＢ塩は、しばしば２４時間を超える、例えば１週間を超える期間貯蔵される。安定性を、１年以上にも及ぶ期間観察してもよい。しばしば、貯蔵期間は６か月を超えない。

本発明はまた、生体分子合成における中間体の供給源としての固体の生体分子−ＴＰＢ塩の使用にも関する。本発明による使用は、好ましくはカップリング、脱保護、または精製ステップにおいて使用することができるペプチド断片に適用される。

本発明は、少なくとも１つのカチオン基を含む生体分子の塩の製造方法であって、（ａ）生体分子のＴＰＢ塩の溶液を準備するステップと、（ｂ）前記溶液と対イオン塩を、テトラフェニルホウ酸アニオンが対イオンに対して交換されるように接触させるステップであって、そのカチオンは、テトラフェニルボレートと、溶液において生体分子のＴＰＢ塩より溶解度が低い塩を形成するステップと、（ｃ）生体分子の対イオン塩を溶液から場合によっては回収するステップとを含む方法にも関する。

一実施形態において、イオン交換は、溶液に対イオン塩を添加することによって実現することができ、そのカチオンは、テトラフェニルホウ酸イオンと塩を形成する。一般に、カチオンおよび溶媒は、溶液を対イオン塩と接触させると、カチオンＴＰＢ塩が溶液から沈殿するように選択される。適切な対イオン塩は、一般に、カリウム塩、例えば塩化カリウムおよび酢酸カリウム、好ましくは第四級アンモニウム塩、例えば酢酸テトラアルキルアンモニウムおよび塩化アンモニウムから選択される。塩化ベンジルトリメチルアンモニウムなどの塩化テトラアルキルアンモニウムは、良好な結果を生じる。本発明のこの特定の実施形態において、生体分子−ＴＰＢ塩を、一般に有機溶媒に溶解する。有機溶媒は、好ましくはメタノールまたはエタノールなどのアルコールから選択される。メタノールが最も好ましいアルコールである。第四級アンモニウムカチオン、例えばベンジルトリメチルアンモニウムカチオンから選択されるカチオンとアルコールの組合せが、特に好ましい。

この実施形態において使用される対イオン塩／ＴＰＢアニオンのモル比は、一般に約１、好ましくは１から１．１である。

別の実施形態において、イオン交換は、イオン交換樹脂を使用することによって実施される。この実施形態において、交換は、好ましくは交換樹脂が入っているカラムに生体分子−ＴＰＢ塩溶液を通すことによって行われる。交換樹脂の適切な例は、上述された固定化アミノカチオン基、特に第四級（アンモニウム）基を所望の対イオン、特にアセテートまたはクロリドと共に含む。適切なイオン交換樹脂の具体例は、Ｒｏｈｍ ａｎｄ ＨａａｓからＩＲＡ ９５８という名称で市販されている。交換樹脂は、好ましくはメタノール、エタノールなどのアルコールから選択される有機溶媒で場合によっては洗浄することができる。メタノールが最も好ましいアルコールである。

以下の実施例は、本発明を例示するよう意図されているが、その範囲を限定するものではない。

記載される比は体積比を指す。他に何も記載されていない場合、化合物の純度は９８重量％より高く、記載される比は体積比を指す。ｉｓｏ−ブタノールが使用された場合には、ｓｅｃ−ブタノールも同様に使用することができる。

これらの実施例において、および本明細書全体を通して、使用される略語は以下の通り定義される。Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニルであり、ｎ−ＢｕＯＨはｎ−ブタノールであり、ＤＣＭはジクロロメタンであり、ＤＩＰＥＡはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドであり、ＤＭＡはＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドであり、Ｆｍｏｃはフルオレニルメチルオキシカルボニルであり、ＨＢＴＵはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウム−ヘキサフルオロルホスフェート）であり、ＨＯＢｔは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールであり、ＨＯＯＢＴは３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジンであり、ＥＤＣはＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドであり、ＤＣＣはジシクロヘキシルカルボジイミドであり、ｉ−ＢｕＯＨはｉｓｏ−ブタノールであり、ＩＰＥはジイソプロピルエーテルであり、ＭｅＣＮはアセトニトリルであり、ＭｅＯＨはメタノールであり、ＮＭＭはＮ−メチルモルホリンであり、ＮＭＰは１−メチル−２−ピロリドンであり、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、ｐＮＡはｐ−ニトロアニリンアミドであり、Ｔｏｓはトシルであり、ＭＴＢＥはメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルである。

実施例１：ＨＣｌ．Ｈ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ_２の合成
１．０２当量のＺ−Ａｒｇ−ＯＨ．ＨＣｌ（Ｍｗ＝３４４．８）をＤＭＡとＣＨ_２Ｃｌ_２（６／４）の混合物に室温で添加した。その後、１．０３当量のＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｍｗ＝１３５．１２）および１．００当量のＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ_２（Ｍｗ＝２４５．３；純度：９９％）を添加した。溶液を０±５℃に冷却した後、１．０３当量のＥＤＣ．ＨＣｌ（Ｍｗ＝１９１．７）を添加した。

０±５℃でさらに３０分間、次いで室温で少なくとも２時間撹拌を続けた。ＨＰＬＣで反応の完了を確認した後、反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２／ｉｓｏ−ＢｕＯＨ（６／４）の混合物で希釈し、０．５当量のＨＣｌ溶液で抽出した。酸性の水相をＣＨ_２Ｃｌ_２／ｉｓｏ−ＢｕＯＨ（６／４）の混合物で２回抽出した。有機相を合わせて、まず１．０５当量のテトラフェニルホウ酸ナトリウム（ＴＰＢＮａ）（Ｍｗ＝３４２ｇ）を含有する５％（重量）のＮａ_２ＣＯ_３水溶液で洗浄し、次いで５％（重量）のＮａＣｌ水溶液で４回洗浄した。

有機相を真空中で濃縮した後、濃縮物に、メトキシエタノールを数回に小分けして添加して、微量のｉｓｏ−ブタノールを除去した。次いで、さらに蒸発させた。次いで、濃縮物を最後にメトキシエタノールで希釈し、５％（重量）の冷（０から５℃）ＮａＣｌ水溶液にゆっくりと添加した。ペプチドが沈殿し、それを低温で少なくとも３０分間維持し、次いで濾過した。

固体を冷（０±５℃）脱塩水で３回洗浄した。その後、固体をＭｅＯＨに再溶解し、わずかに濁った溶液が得られるまで撹拌した。溶液を部分濃縮し、次いで冷却した５％（重量）のＮａＣｌ水溶液に、メタノール性溶液をゆっくりと添加した。濾別する前に、沈殿物を低温で少なくとも３０分間維持した。最後に、固体を冷脱塩水（０℃±５℃）で３回洗浄し、真空乾燥した（４５℃）。灰色がかった白色固体が最終的に得られた。内容物のＮＭＲ測定に基づく収率は、８９％であった。

ＨＣｌ．Ｈ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ_２の合成
１．００当量のＴＰＢ．Ｚ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ_２（Ｍｗ＝５３５．６；純度＝６２．０％）のメタノール溶液を、メタノールで洗浄した樹脂ＩＲＡ ９５８（Ｍｗ＝１０００；３．００当量）が入っているカラムに数回通した。ＨＰＬＣで交換を確認した後、樹脂を濾過し、メタノールで３回洗浄した。有機相を合わせて、真空中で部分濃縮した。濃縮された溶液を水で希釈した。

Ｐｄ触媒（Ｍｗ＝１０６．４；２重量％）を添加し、次いで懸濁液を３５±５℃で少なくとも５時間水素化した。触媒を濾別し、メタノール／水の混合物で２回洗浄した。濾液を真空中で蒸発させ、残渣をＤＭＡに懸濁し、微量の水をなくすために真空中で部分蒸発させた。含水率を確認した後、最終溶液をＨＣｌ（０．１Ｎ）で滴定し、その後精製することなく使用した。

収率（滴定に基づく）：９０％。

実施例２：２ＨＣｌ．Ｈ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ_２（配列番号２）の合成
Ｚ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ_２．２ＴＰＢ（配列番号２）の合成
１．００当量のＺ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＨ（Ｍｗ＝４９４．５；純度＝８５．０％）および１．１０当量のＨＯＯＢｔ（Ｍｗ＝１６３．１３）を、ＣＨ_２Ｃｌ_２で予め希釈しておいた１．１５当量のＨＣｌ．Ｈ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ_２（Ｍｗ＝４３７．５；純度＝２０．０％）のＤＭＡ溶液に添加した。溶液を−５±５℃に冷却した後、１．００当量のＨＣｌ／ジオキサン（４Ｎ）をゆっくりと注ぎ入れ、次いで１．１０当量のＥＤＣ（Ｍｗ＝１９１．７）を添加した。反応混合物を−５±５℃で少なくとも３時間撹拌し、次いで５±５℃で少なくとも８時間撹拌した。ＨＰＬＣで反応の完了を確認した後、反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２／ｓｅｃ−ブタノール（６／４）の混合物で希釈し、まずＨＣｌ（０．５当量）を含有する５％（重量）のＮａＣｌ水溶液、次いで２．２当量のＮａＴＰＢ（Ｍｗ＝３４２）を含有する５％（重量）のＮａ_２ＣＯ_３水溶液１９００ｍｌ、最後に５％（重量）のＮａＣｌ水溶液で５回洗浄した。有機層を濃縮した後、残渣をメタノールに溶解し、次いで残留しているＣＨ_２Ｃｌ_２の大部分をなくすために真空中で濃縮した。この最終溶液をＮＭＲで滴定し、その後精製することなく使用した。

収率（滴定含量に基づく）＝８３％。

２ＨＣｌ．Ｈ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ_２（配列番号２）の合成
１．００当量の２ＴＰＢ．Ｚ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ_２（Ｍｗ＝８７８．１１）のメタノール溶液を、６．００当量のメタノールで洗浄した樹脂ＩＲＡ ９５８（Ｍｗ＝１０００）が入っているカラムに数回通した。ＨＰＬＣで交換を確認した後、樹脂を濾過し、メタノールで３回洗浄した。有機相を合わせて、真空中で部分濃縮した。濃縮された溶液を水で希釈し、Ｐｄ触媒を添加した。次いで、懸濁液を３５±５℃で少なくとも３時間水素化した。触媒を濾別し、メタノールで２回洗浄した。濾液を真空中で蒸発させ、残渣をＤＭＡに溶解し、残留している水をなくすためにさらに濃縮した。含水率を確認した後、沈殿物をＤＭＡに溶解し、溶液の重量を適合させるために真空中で部分蒸発させた。最終溶液を０．１Ｎ ＨＣｌで滴定し、その後精製することなく使用した。

収率（滴定に基づく）：９５％。

実施例３：２ＨＣｌ．Ｈ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ_２（配列番号３）の合成
Ｚ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ_２．２ＴＰＢ（配列番号３）の合成
１．００当量のＺ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ（Ｍｗ＝６２１．７；純度＝９４．０％）を、ＣＨ_２Ｃｌ_２で予め希釈した１．０５当量の２ＨＣｌ．ＨＴｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ_２（Ｍｗ＝８１６．９；純度＝１５．０％）のＤＭＡ溶液に添加した。次いで、１．２０当量のＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（Ｍｗ＝１２９．２）および１．０５当量の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）（ＨＢＴＵ）（Ｍｗ＝３７９．２４）を添加した。反応混合物を室温で少なくとも１時間撹拌した。ＨＰＬＣで反応の完了を確認した後、反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２／ｉｓｏ−ブタノール（８／２）の混合物で希釈し、まず５％（重量）のＮａＣｌ水溶液およびＨＣｌ（１．５当量）、次いで５％（重量）のＮａ_２ＣＯ_３水溶液および２．２当量のＮａＴＰＢ（Ｍｗ＝３４２ｇ／ｍｏｌ）、最後に５％（重量）のＮａＣｌ水溶液で３回洗浄した。有機層を濃縮した後、残留油をメトキシエタノールに数回溶解し、次いで残留しているｉｓｏ−ブタノールの大部分をなくすために真空中で濃縮した。ＧＣ制御した後、濃縮物を、５％（重量）の冷（０±５℃）ＮａＣｌ水溶液にゆっくりと注ぎ込むことによって沈殿させた。少なくとも１時間撹拌した後、懸濁液を濾過し、冷水で２回洗浄した。沈殿物を真空中、４５℃で乾燥した。白色固体が、最終的に得られた。

収率（ＮＭＲ含有量に基づく）＝９８％。

２ＨＣｌ．Ｈ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ_２（配列番号３）の合成
１．００当量の２ＴＰＢ．Ｚ−ＴｒｐＴｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ_２（配列番号３）（Ｍｗ＝１３４７．５；純度＝６４．０％）のメタノール溶液を、メタノールで洗浄した樹脂ＩＲＡ ９５８（またはＡｍｂｅｒｊｅｔ Ｃｌ １０００；６．００当量）が入っているカラムに数回通した。ＨＰＬＣで交換を確認した後、樹脂を濾過し、３回洗浄した。有機相を合わせて、真空中で部分濃縮し、次いで水で希釈した。最後に、２％（重量）のＰｄ触媒を添加し、懸濁液を４０℃で少なくとも３時間水素化した。触媒を濾別し、メタノール／水の混合物で３回洗浄した。濾液を合わせて、真空中で蒸発させ、残渣をＤＭＡに懸濁し、残留している水をなくすためにさらに濃縮した。含水率を確認した後、溶液をＨＣｌ（０．１Ｎ）、ＡｇＮＯ_３（０．１Ｎ）、またはＮＭＲで滴定し、その後精製することなく使用した。

収率（滴定に基づく）＝８２％。

実施例４：Ｚ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ_２．３ＴＰＢ（配列番号４）の合成
１．００当量のＺ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ（Ｍｗ＝５９１．６５；純度＝９６．０％）、１．００当量のＨＣｌ／ジオキサン（４Ｎ）、および１．０５当量のＨＯＢｔ（Ｍｗ＝１３５．１２；純度＝９８．０％）を、ＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈したＤＭＡに溶かした１．００当量の２ＨＣｌ．Ｈ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ_２（配列番号３）（Ｍｗ＝１２１３．４；純度＝８５．０％）に添加した。溶液を１０±５℃に冷却した後、１．０２当量のＥＤＣ（Ｍｗ＝１９１．７）を添加した。反応混合物を１０±５℃で３０分間撹拌し、次いで室温で少なくとも４時間撹拌した。ＨＰＬＣで反応の完了を確認した後、反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２／ｉｓｏ−ブタノール（８／３）の混合物で希釈し、まずＨＣｌ（０．５当量）を含む５％（重量）のＮａＣｌ水溶液、次いで３当量のＮａＴＰＢ（Ｍｗ＝３４２）を含有する５％（重量）のＮａ_２ＣＯ_３水溶液、最後に５％（重量）のＮａＣｌ水溶液で２回洗浄した。有機層を濃縮した後、残留油をメトキシエタノールに数回溶解し、次いでｉｓｏ−ブタノールの大部分をなくすために真空中で濃縮した。ＧＣ制御した後、濃縮物を、５％（重量）の冷ＮａＣｌ水溶液にゆっくり注ぎ込むことによって沈殿させた。少なくとも１時間撹拌した後、懸濁液を濾過し、冷水で２回洗浄した。沈殿物を４０±５℃で乾燥した。灰色がかった白色固体が、最終的に得られた。

収率（ＮＭＲ含有量に基づく）＝８７％。

１．００当量の３ＴＰＢ．Ｚ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＴｒｐＴｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ_２（Ｍｗ＝１７８７．１；純度＝５７．０％）のメタノール溶液を、メタノールで洗浄した樹脂ＩＲＡ ９５８（Ｍｗ＝１０００、９．００当量）が入っているカラムに数回通した。ＨＰＬＣで交換を確認した後、樹脂を濾過し、メタノールで３回洗浄した。有機相を合わせて、真空中で部分濃縮した。次いで、濃縮された溶液を水で希釈し、Ｐｄ触媒を添加した。次いで、懸濁液を３５±５℃で少なくとも６時間水素化した。触媒を濾別し、メタノール／水の混合物で３回洗浄した。濾液を合わせて、真空中で蒸発させ、残渣をＤＭＡに懸濁し、残留している水をなくすためにさらに濃縮した。含水率を確認した後、溶液をＨＣｌ（０．１Ｎ）またはＮＭＲで滴定し、その後精製することなく使用した。

収率（ＮＭＲ含有量測定に基づく）：９３％。

実施例５：Ｚ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．２ＨＣｌの合成
Ｚ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．２ＨＣｌの合成
７．７ｇのＺ−（Ｄ）ＡｒｇＯＨ（２５ｍｍｏｌ）および１３．８ｇの２ＨＣｌ．Ｈ−Ｇｌｙ−ＡｒｇｐＮＡを、室温で約１００ｍｌのＤＭＡに完全に溶解するまで分散した。次いで、混合物を０℃に冷却し、ＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン）を添加して、過剰のＨＣｌを中和し、続いて３．６ｇのＨＯＢｔ（２６．１３ｍｍｏｌ）および５．７ｇのＤＣＣ（２７．５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を、２５±５℃に状態調節する前に、０℃で少なくとも１時間撹拌させておいた。反応が完了したとみなされたとき（続いてＨＰＬＣを行い）、粗生成物を真空中で濃縮し、次いで濃縮物を水で希釈して、ＤＣＵを沈殿させ、次いで濾過によって除去し、水で洗浄した。水溶液をＤＣＭで数回洗浄して、ＤＭＡ（ジメチルアセトアミド）およびＨＯＢｔを除去した。ＮａＨＣＯ_３水溶液の添加を制御することによって、ｐＨを６．５〜７．５に調整しながら、２当量のＴＰＢＮａおよび５００ｍｌのＤＣＭを水溶液に注ぎ込んだ。１時間混合した後、水相を廃棄し、有機相をＮａＣｌ水溶液で数回、最後に水で洗浄した。溶媒を真空下で除去し、ＭｅＯＨで置換した。

Ｚ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．２ＴＰＢの単離
次いで、Ｚ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．２ＴＰＢのメタノール性溶液を、５％のＮａＣｌ水溶液に０±５℃で注ぎ込んで、Ｚ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．２ＴＰＢを沈殿させた。濾過し、水で洗浄し、真空下で乾燥した後、Ｚ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．２ＴＰＢが白色固体として得られた。

Ｚ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡの二塩酸塩（ｂｉｓｃｈｌｏｒｈｙｄｒａｔｅ ｓａｌｔ）の単離
ＴＰＢ塩をメタノールに溶解し、溶液を、メタノールで洗浄した樹脂ＩＲＡ ９５８が入っているカラムに数回通した。ＨＰＬＣで交換を確認した後、樹脂をメタノールで数回洗浄した。濃縮された濾液を合わせて、真空下で濃縮し、得られた固体をＨＰＬＣで精製し、最後に凍結乾燥して、Ｚ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡをその二塩酸塩として得た。

実施例６：Ａｃ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．２ＨＣｌの合成
精製Ａｃ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．２ＴＰＢの単離
水／アセトニトリル（３１ｌ）中Ａｃ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｐ−ｐＮＡ．２ＴＦＡ溶液のｐＨは、ＮａＨＣＯ_３水溶液を添加することによって７±０．５に調整した。アセトニトリル部分を真空中で蒸発させた（必要なら水を添加することによって、溶液の体積を維持した）。１ｋｇのＴＰＢＮａおよび１．１ｋｇのＮａＨＣＯ_３を水（約２０ｌ）に溶解した。次いで、濃縮されたペプチド溶液を、ＴＰＢＮａ／ＮａＨＣＯ_３水溶液に徐々に注ぎ込んだ。Ａｃ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．２ＴＰＢが沈殿した。濾過し、水（４０ｌ）で洗浄し、真空下で乾燥した（４５℃）後、１．６ｋｇのＡｃ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．２ＴＰＢが得られた。

精製Ａｃ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．２ＨＣｌの単離
ＴＰＢ塩をメタノール（２０ｌ）に溶解し、メタノールで洗浄した樹脂ＩＲＡ ９５８（樹脂７．６ｋｇ）が入っているカラムに数回通した。ＨＰＬＣで交換を確認した後、樹脂をメタノール（各回１１ｌ）で数回洗浄した。濃縮された濾液を合わせて、冷却した（−５℃±５℃）アセトニトリル（４４ｌ）中で沈殿させた。アセトニトリル（１２ｌ）で洗浄し、真空下で乾燥した後、沈殿物が、灰色がかった白色固体０．８ｋｇをもたらした。必要なら、Ａｃ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．２ＨＣｌを２回沈殿させることができる。

実施例７：Ｍｐｒ（^＊）−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（^＊）−ＮＨ_２（配列番号５）の合成
（＊）は、メルカプトプロピオン酸とシステインアミドの間のジスルフィド架橋を示す。
４６．６ｇのＭｐｒ（Ｔｒｔ）−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＮＨ_２（配列番号５）（Ｍｗ＝１３７４．８ｇ／ｍｏｌ、２０ｍｍｏｌ＝１．００当量）のメタノール溶液５５０ｍｌを、１３０ｇの洗浄した樹脂ＩＲＡ ９５８（Ｍｗ＝１０００ｇ／ｍｏｌ；６．７２当量）で処理した。ＨＰＬＣで交換を確認した後、樹脂を濾過し、３４０ｍｌのメタノールで数回洗浄した。有機相を合わせて、１５００ｍｌのメタノール、５４００ｍｌのジクロロメタン、最後に１８０ｍｌの水を添加することによって希釈した。希釈した溶液に、２４ｇのヨウ素を添加した。ＨＰＬＣで環化を確認した後、７００ｍｌのＮａ_２Ｓ_２Ｏ_３（３．６重量％）を水溶液中に添加することによって、残留しているヨウ素をクエンチする。次いで、反応混合物を、１９０ｍｌの樹脂アセテート（Ｍｗ＝７２０ｇ／ｍｏｌ；５７当量）で中和した。濾過し、樹脂を２１０ｍｌのメタノールおよび１８００ｍｌの水で洗浄した後、有機層を水層から分離した。１００００ｍｌのジクロロメタンを添加することによって、ペプチド（配列番号５）を、中和した水層から２１ｇのＮａＴＰＢ（Ｍｗ＝３４２．２ｇ／ｍｏｌ；３当量）で抽出した。有機層の分離および蒸発の後に、残渣をメタノール（９００ｍｌ）に溶解し、次いで残留しているジクロロメタンの大部分をなくすために真空中で濃縮した。メタノール溶液を２４００ｇの洗浄した樹脂ＩＲＡ ９５８（Ｍｗ＝１０００ｇ／ｍｏｌ；１２．１当量）に懸濁した。ＨＰＬＣで交換を確認し、樹脂を洗浄した後、有機相を合わせたところに、２４０ｍｌの酢酸を添加することによって希釈した。この溶液を分取ＨＰＬＣでさらに精製した。

実施例８：Ｍｐｒ（Ｔｒｔ）−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＮＨ_２ＴＰＢ塩（配列番号５）の貯蔵
本発明による方法に従って沈殿により、固体のＭｐｒ（Ｔｒｔ）−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＮＨ_２ＴＰＢ塩（配列番号５）を得た。生成物を、２０〜２５℃の温度で１年を超えて貯蔵した。固体のＴＰＢ塩は、貯蔵後も実質的に安定なままであった。

Claims (15)

1. 少なくとも１つのカチオン基を含む生体分子を、前記生体分子を含む液体媒体から分離する方法であって、テトラフェニルホウ酸（ＴＰＢ）塩の使用を含み、前記ＴＰＢ塩は、アルカリ性剤と一緒に使用されて、生体分子ＴＰＢ塩の形成がもたらされ、前記ＴＰＢ分子は、ベンゼン環上で非置換である方法。
2. 前記使用されるＴＰＢ塩の量は、前記生体分子に存在するカチオン基当たり１から１０当のＴＰＢ塩である、請求項１に記載の方法。
3. テトラフェニルホウ酸塩を前記液体媒体に添加するステップを含み、前記液体媒体は、前記生体分子の水溶液であり、前記生体分子のＴＰＢ塩を、沈殿または結晶化によって前記水溶液から分離させる、請求項１または２に記載の方法。
4. テトラフェニルホウ酸塩を前記液体媒体に添加するステップを含み、前記液体媒体は、前記生体分子の水溶液であり、前記生体分子のＴＰＢ塩を、有機溶媒への抽出によって前記水溶液から分離し、前記抽出は、第１の有機溶液を生じさせる、請求項１または２に記載の方法。
5. アルコール、アミド型溶媒、ハロカーボン、エステル、エーテルから選択される別の有機溶媒を準備するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記ＴＰＢ塩を添加する前に、前記水溶液が、水と実質的に混じり合わず、ハロカーボン、エステル、およびエーテルから選択される有機洗浄溶媒で洗浄される、請求項４または５に記載の方法。
7. 前記生体分子の水溶液のｐＨが、５から１０である、請求項３から６のいずれかに記載の方法。
8. テトラフェニルホウ酸塩を前記液体媒体に添加するステップを含み、前記液体媒体が、有機溶液であり、前記テトラフェニルホウ酸塩が前記有機溶液に添加され、それによって、生体分子−ＴＰＢ塩を含有する第１の有機溶液を生じる、請求項１または２に記載の方法。
9. アルコール、アミド型溶媒、ハロカーボン、エステル、エーテルから選択される別の有機溶媒を準備するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記生体分子が、前記有機溶液から固体の生体分子−ＴＰＢ塩として沈殿または結晶化される、請求項５から９のいずれかに記載の方法。
11. 前記有機溶液を、前記生体分子のＴＰＢ塩を単離することなくさらなる合成ステップにかけるステップを含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記テトラフェニルホウ酸塩がＮａＴＰＢであり、前記アルカリ性剤が、ＮａＨＣＯ_３およびＮａ_２ＣＯ_３から選択される無機塩基である、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
13. 請求項１から１２のいずれか一項に記載の分離方法を含む、生体分子の製造方法。
14. 前記生体分子が、アルギニン、ホモアルギニン、およびリシンから選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチドである、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
15. （ａ）有機溶液中で、第１のアミノ酸または第１のペプチドを第２のアミノ酸または第２のペプチドとカップリングさせて、カチオン基を含むペプチドを生じさせるステップであって、前記第１および／または第２のアミノ酸またはペプチドがカチオン基を含む、ステップと、
    （ｂ）カップリングステップの完了後に、ＴＰＢ分子がベンゼン環上で非置換であるＴＰＢ塩およびアルカリ性剤を添加するステップと、
    （ｃ）カチオン基を含むペプチドまたは誘導体を、生体分子ＴＰＢ塩の形態で有機溶液から分離するステップと
    を含む、カチオン基を含む１個または複数のアミノ酸単位を含むペプチドまたはその誘導体の製造のための方法。