CN102124022A - Tpb盐用于分离生物分子的用途 - Google Patents

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Abstract

用于将含有至少一种阳离子基团的生物分子从含有所述生物分子的一种液体介质中分离出的方法，该方法包括使用一种四苯基硼酸盐(TPB)的盐。

Description

TPB盐用于分离生物分子的用途
本发明涉及一种用于分离含有至少一种阳离子基团的生物分子的方法并且涉及用于制造一种生物分子的方法涉及其用途。
本发明的方法例如可以用来制造依替巴肽(SEQ ID NO：5)，它选择性地阻滞了血小板糖蛋白IIb/IIIa受体。它可逆地结合到血小板上并且具有短的半衰期。已经证明了它在冠状血管成形术、心肌梗塞和心绞痛过程中在治疗病人中作为一种静脉内溶液的疗效。
本发明的方法还可以用来制造奥米加南。奥米加南是对于H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1)肽的通用国际名称(CID)，它主要以其五盐酸盐(5HCl)的盐形式来使用。奥米加南是一种阳离子的抗微生物的肽。最近的研究还显示了它在炎症应答中起作用。在体外测定中，奥米加南显示出对微生物的迅速的杀菌的活性，这些微生物聚居到皮肤上并且可能在炎性疾病的发病机理中起作用。
美国专利号5,262,567披露了使用包括一个胍基团以及一种未取代的四苯基硼酸盐离子的一种化合物作为肽的合成中的中间体。作为一个例子，披露了通过精氨酸以及四苯基硼酸盐(TPB)形成的这种化合物的合成以及其在肽Boc-Leu-Arg-OH的合成中的用途。
现在已经出人意料地发现了，将一种生物分子(特别是含有至少一种阳离子基团的生物分子通过使用一种四苯基硼酸盐(TPB)盐)从一种液体介质出的改进的分离，这种分离使之能够以高产量和高纯度获得所希望的生物分子。
本发明因此涉及用于将含有至少一种阳离子基团的生物分子从含有所述生物分子的一种液体介质中分离出的一种方法，该方法包括使用一种四苯基硼酸盐(TPB)的盐。
为了本发明的目的，术语“阳离子基团”是指该生物分子的一个带正电荷的官能团。在本发明中该阳离子的基团经常是选自一种胍基团或一种氨基基团。当该阳离子基团是一种氨基基团时，它经常是选择质子化的伯、仲以及优选地叔氨基基团。更优选地，该氨基基团是一种季的(铵)基团，例如一种四烷基铵基团。胍(guadinine)基团是另一个优选的阳离子基团。
为了本发明的目的，术语“TPB”表示四苯基硼酸盐。这种TPB阴离子可以是在苯环上被取代的或者它可以是未取代的。优选地，TPB阴离子是未取代的。
合适的取代的TPB阴离子的例子包括例如四[3，5-双(三氟甲苯基]硼酸盐。
在本发明中，所使用的TPB盐总体上能够形成一种水性溶液。在该TPB盐中的阳离子经常是一种无机的阳离子。例如合适的无机离子是钠(Na+)和锂(Li+)。优选LiTPB和NaTPB。最优选使用的四苯基硼酸盐的盐是NaTPB。
在根据本发明的方法中，四苯基硼酸盐的量总体上是从1至10当量的四苯基硼酸盐的盐/在该生物分子中存在的阳离子的基团，优选地该量值是从1至2当量，更优选是从1至1.1当量。
在根据本发明的方法中，该TPB盐优选地与一种碱剂一起使用。这种碱剂可以具体是选自无机的碱类，例如NaHCO3和Na2CO3。总的来讲，碱剂的选择取决于待纯化的生物分子对碱性条件的敏感性。
为了本发明的目的，术语“生物分子-TPB盐”是指生物分子四苯基硼酸盐(TPB)的盐。
为了本发明的目的，“含有该生物分子的一种液体介质”应理解为具体表示该生物分子在一种溶剂中的一种溶液，该溶剂选自一种水性溶剂(“水性溶液”)、一种有机溶剂(“有机溶液”)或它们的混合物。
为了本发明的目的，术语“水性溶剂”具体是指水以及水溶性化合物在水中的溶液，例如盐水或任何其他水性矿物盐溶液。
“与水不混溶的化合物”应理解为具体是表示一种化合物，当与一种水性溶液相接触时它允许将一种水相从一种有机相中通过倾析分离出。
在本发明中，该生物分子总体上是选自下组，该组的构成为一种肽、一种肽衍生物、一种寡核苷酸、一种寡核苷酸衍生物以及一种多糖。
为了本发明的目的，术语“肽”指一个聚合物其中单体是通过酰胺键共价连接在一起的氨基酸。肽具有两个或通常更多的氨基酸单体长度。另外，在此所有具体的肽序列通过化学式表示，它从左至右的方向是氨基端到羧基端的常规的方向。
为了本发明的目的，术语“氨基酸”旨在表示任何含有至少一个NR1R2基团，优选地是NH2基团，和至少一个羧基基团的化合物。本发明的氨基酸可以是天然存在的或合成的。天然的氨基酸，除了甘氨酸外，含有一个手性碳原子。除非另外特别地说明，含有具有L-构型的天然氨基酸的化合物是优选的。在本申请从始至终，氨基酸残基简写如下：精氨酸是Arg或R；赖氨酸是Lys或K；脯氨酸是Pro或P；色氨酸是Trp或W，天冬氨酸是Asp或D；半胱氨酸是Cys或C。
为了本发明的目的，术语肽的“羧基-端”是用游离的羧基基团(-COOH)结束的氨基酸序列的末端。另一方面，术语“氨基端-端“指用具有游离的氨基基团(-NH2)的氨基酸结束的氨基酸序列的每个末端。
如在此所使用的，术语“肽衍生物“包括一种类似物，其中一个或多个氨基酸残基被对应的D-异构体或被一个非天然的氨基酸残基或其化学衍生物代替。一种肽的化学衍生物包括但不限于含有另外的至少一个化学部分(该化学部分通常不是一种肽的一部分)的一种衍生物。此类衍生物的例子是：(a)该氨基端或另一种游离氨基基团的N-酰基衍生物，其中该酰基基团可以是一种链烷酰基基团，例如乙酰基、己酰基、辛酰基以及一种芳酰基基团，例如苯甲酰基或生物素基；(b)该末端羧基基团或另一种游离羧基或羟基基团的酯以及(c)通过与氨或与一种合适的胺反应产生的该末端羧基基团或另一种游离羧基基团的酰胺。
在本发明的框架中，术语“寡核苷酸“具体表示含有连接到核碱基上的糖单元的一种核苷单体单元的低聚物，所述核苷单体单元通过核苷酸间的键相连接。一个“核苷酸间的键”具体是指在两个核苷部分之间的一种化学连接，例如典型地在天然的核酸中存在的磷酸二酯连接，或在合成的核酸以及核酸类似物中典型存在的其他连接。这种核苷酸间的键可以，例如，包括一个磷酸(phospho)或亚磷酸酯基团，并且可能包括一些连接，在这些连接中磷酸或亚磷酸基团的一个或多个氧原子或被一个取代基修饰、或被另一种原子取代，例如硫原子或者单或二烷基氨基中的氮原子。典型的核苷酸间的键是磷酸的二酯类或其衍生物，例如磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯以及硫代磷酰胺酯。在本发明中，这种核苷酸间的键总体上被一种合适的保护基团保护。一个β-氰基乙基基团是一种合适的保护基团的例子。
术语“核苷”应理解为具体表示由连接到一个糖上的核碱基构成的一种化合物。糖类包括但不限于呋喃糖环，如核糖以及2’-脱氧核糖，以及非呋喃糖环，如环己烯基、脱水己糖醇以及吗啉基。在核苷中所包括的糖中，在下文中指出的修饰、取代以及位置是参考呋喃糖而讨论的，但是相同的修饰和位置也适用于其他糖环的类似的位置。该糖可以被进一步修饰。作为糖的修饰的非限制性例子，值得注意地可以提及例如在2’-或3’-位置的修饰，特别是在一个呋喃糖环的2’-位置的修饰，包括例如氢；羟基；烷氧基，如甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、甲氧乙基、烷氧基、苯氧基；叠氮基；氨基；烷氨基；氟、氯和溴；2’-4’-和3’-4’-连接的呋喃糖环修饰，在该呋喃糖环中的修饰包括例如针对环的4’-O被S、CH2、NR、CHF或CF2取代。
术语“核碱基“应理解为具体表示能够与特别是一种互补的核碱基或核碱基类似物成对的含氮的杂环部分。典型的核碱基是天然存在的核碱基，包括嘌呤碱基中的腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基中的胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)，以及修饰过的核碱基，包括其他合成和天然核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫脲嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-氮杂尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-氟-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤、以及氟化的碱基。进一步被修饰的核碱基包括三环的嘧啶类，例如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G字夹型物例如一种被取代的吩噁嗪胞苷(如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)，吡啶吲哚胞苷(H-吡啶并[3’，2’:4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮)。其他可能的合适碱基包括通用碱基、疏水碱基、混杂碱基(promiscuous bases)和尺寸扩大碱基(size-expanded bases)。
为了本发明的目的，术语“寡核苷酸衍生物”是指一类分子例如“肽核酸”(PNA)，吗啉代磷二酰胺、肽-寡核苷酸结合物。根据本发明的方法可以适合用于阳离子PNA。
本发明的方法可以施用的另一类生物分子是阳离子多糖类，例如阳离子纤维素或阳离子淀粉或阳离子环糊精。阳离子多糖是例如使用至少一种上述的阳离子基团官能化的多糖，特别是使用至少一种季(铵)基团官能化。
含一个胍基团或一个氨基基团的肽的典型实例是包括至少一个氨基酸基团的肽，该氨基酸选自精氨酸、高精氨酸以及赖氨酸的氨基酸。含有至少一个氨基酸的肽是优选的，该氨基酸选自精氨酸以及高精氨酸。
一个胍基团或一个氨基基团的肽的典型实例是包括至少一个核苷的寡核苷酸，该核苷选自腺苷、鸟苷以及胞嘧啶以及以上列出的它们的衍生物。
根据本发明的方法总体上包括将一种TBP盐加入到含有该生物分子的一种液体介质中。该TBP盐可以以固体的形式、或优选作为一种溶液例如一种水性溶液提供。向含有该生物分子的液体介质中加入TBP盐总体上导致了形成生物分子的TPB盐。
在根据本发明的方法中，在该生物分子中阳离子基团的数目是至少为1。可以根据本发明的方法分离的生物分子的具体例子包括从2至20、经常是从3至15个阳离子基团。
在根据本发明的方法中，从该液体介质中分离出的生物分子总体上是处于一种固体生物分子TPB盐的形式或处于适合用于另一个反应步骤的有机溶液的形式。
当一种固体的生物分子TPB盐是希望的时，根据本发明的方法总体上包括将该固体的生物分子TPB盐从含有该生物分子的一种液体介质中沉淀或结晶出来。在这种情况下，液相可以适当地与一种水性溶液接触。这样的水溶液可以是例如水，盐水，或其他水性无机盐溶液。在这种情况下，特别有利的是控制水性溶液的pH。该水性溶液的pH值优选控制在小于或等于10，更优选小于或等于9，仍然更优选地小于或等于7.5。该水性溶液的pH值优选控制在大于或等于5，更优选大于或等于6.0，最优选地大于或等于6.5。该水性溶液的pH值可以通过加入矿物盐来控制。可以使用的合适的盐包括碱或碱土金属的氯化物，特别是氯化钠；碱或碱土金属的硫酸盐，特别是硫酸钾，碱或碱土金属的碳酸氢盐，特别是碳酸氢钠。特别优选的是包括氯化钠的盐水溶液，优选处于按重量计5％的盐水溶液。
总体上，沉淀或结晶是在从0℃至20℃，优选地从0℃至5℃的温度下进行的。
沉淀或结晶的生物分子-TPB盐可以例如通过过滤、倾析、离心作用或喷雾干燥从该水性溶液中分离出。
根据一个合适的方法，该生物分子-TPB盐是通过过滤收集并且任选地进行洗涤。该生物分子-TPB盐优选地在任选地经受另一个处理步骤(例如，进一步的反应步骤、冷冻干燥、包装和/或存储)之前进行干燥。
本发明现在关于具体实施方案进行进一步说明。
在根据本发明的一个第一具体的实施方案中，该液体介质是一种水性溶液。
在本发明的这个第一方面，含有至少一种阳离子基团的生物分子的水性溶液可以例如通过将一种水性溶液加入到用于制造在一种有机溶剂或溶剂混合物的所述生物分子的合成溶液中来获得。
含有至少一种阳离子基团的生物分子的所述水性溶液然后总体上使用一种有机洗涤溶剂洗涤。该有机洗涤溶剂优先选自与水不互溶的化合物。合适的有机洗涤溶剂的非限制性例子是选自卤烃，例如二氯甲烷(DCM)以及氯仿，酯类，例如乙酸乙酯(AcOEt)以及乙酸异丙酯(AcOiPr)以及醚类，例如乙醚、二异丙基醚以及甲基叔丁基醚(MTBE)。
任选的洗涤步骤允许与该有机相一起除去在该反应介质中使用的反应溶剂，例如N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、反应物和/或起始试剂。
在本发明的第一实施方案的一个第一方面，将该含有至少一种阳离子基团的生物分子在水性溶液中从该水性溶液中作为一种固体生物分子四苯基硼酸盐(TPB)的盐[生物分子-TPB盐]沉淀或结晶出，如以上所描述的。这种沉淀或结晶可以例如通过将含有该生物分子的水性溶液倾倒到一种含该TPB盐的水性溶液中获得。在另一个实例中，将含该TPB盐的水性溶液加入到该生物分子的水性溶液中。这种沉淀或结晶的生物分子TPB盐可以进一步进行处理，如以上所描述的。
在根据本发明的方法的第一实施方案的一个第二方面，将该含有至少一种阳离子基团的生物分子在水性溶液中作为一种生物分子-TPB盐提取到一个第一有机溶液中。该提取总体上通过使该水性溶液与TPB盐和一种合适的有机溶剂或溶剂混合物接触来进行。优选的有机溶剂选自卤烃，例如二氯甲烷(DCM)以及氯仿，酯类，例如乙酸乙酯(AcOEt)以及乙酸异丙酯(AcOiPr)以及醚类，例如乙醚、二异丙基醚以及MTBE，单独地或与醇(例如像正丁醇、异丁醇以及仲丁醇)相结合。使用二氯甲烷获得了良好的结果。
在根据本发明的方法的第一实施方案的这个方面，特别有利地是控制该含生物分子的水性溶液的pH。该水性溶液的pH值优选控制在小于或等于10，更优选小于或等于9，仍然更优选地小于或等于7.5。该水性溶液的pH值优选控制在大于或等于5，更优选大于或等于6.0，最优选地大于或等于6.5。这种水性溶液的pH值可以通过例如加入一种水性矿物盐溶液控制。在以上提到的盐水溶液中可以使用的合适的盐包括碱或碱土金属的氯化物，特别是氯化钠；碱或碱土金属的硫酸盐，特别是硫酸钾；碱或碱土金属的碳酸氢盐，特别是碳酸氢钠。
在根据本发明的方法的第一实施方案的一个第三方面，本发明涉及用于制造一种含有至少一种阳离子基团的生物分子的生物分子-TPB盐的一种方法，该方法包括：
(a)提供含有至少一种阳离子基团的生物分子的一种水性溶液
(b)将一种TPB盐加入到该水性溶液中
(c)从该水性溶液中回收该生物分子-TPB盐。
在根据本发明的方法的一个第二实施方案中，该液体介质是一种有机溶液。
在这个第二方面该液体介质是一种有机溶液，在任选地用一种水性溶液洗涤之后向其中加入四苯基硼酸盐的盐由此提供一种含有该生物分子-TPB盐的一个第一有机溶液。含有至少一种阳离子基团的生物分子的有机溶液可以例如通过在完成一个合成步骤之后使用一种有机稀释溶剂稀释一种用于制造在一种有机溶剂或溶剂混合物(特别是如以上所述的一种反应溶剂)中的生物分子的合成溶液获得。该有机稀释溶剂优先选自与水不互溶的化合物。优选的有机稀释溶剂选自卤烃，例如二氯甲烷(DCM)以及氯仿，酯类，例如乙酸乙酯(AcOEt)以及乙酸异丙酯(AcOiPr)以及醚类，例如乙醚、二异丙基醚以及MTBE，单独地或与醇(例如像正丁醇、异丁醇、仲丁醇)相结合。使用二氯甲烷获得了良好的结果。
所述含有至少一种阳离子基团的生物分子的有机溶液可以任选地用一种水性溶液洗涤，如以上所描述的，并且进一步使用含有一种TPB盐的水性溶液洗涤，由此提供一个第一有机溶液，其中该生物分子作为一种生物分子-TPB盐仍然是溶解。不同的洗涤步骤允许降低杂质以及其他不想要的化合物在该第一有机溶液中的含量。
在根据本发明的方法的第二实施方案的一个第一有利的方面，将获得的第一有机溶液经受一个进一步的反应步骤而无需分离该生物分子-TPB盐。
根据本发明的方法的第二实施方案的一个第二有利方面涉及用于制造一种含有至少一种阳离子基团的生物分子的生物分子-TPB盐的一种方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供含有至少一种阳离子基团的生物分子的一种有机溶液
(b)将一种TPB盐加入到该有机溶液中
(c)从该第一有机溶液中回收该生物分子-TPB盐。
在根据本发明的方法的一个第三实施方案中，例如如以上在该第一以及第二实施方案中描述可获得的含有该生物分子-TPB盐的第一有机溶液可以使用另一种有机溶剂或溶剂混合物来处理以获得含有该生物分子-TPB盐的一种第二有机溶液。该另一种有机溶剂或溶剂混合物可以直接加入到含有该生物分子-TPB盐的第一有机溶液中或者可以在任选地进一步处理所述第一有机溶液之后加入。在这种优选的后者的情况下，将含有该生物分子-TPB盐的第一有机溶液可以在加入该另一种有机溶剂或溶剂混合物之前例如特别是通过真空蒸发进行浓缩。该另外的有机溶剂优选地包括至少一种组分，该组分选自醇，例如优选甲醇或甲氧乙醇、酰胺型溶剂例如N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)，卤烃，例如二氯甲烷(DCM)以及氯仿，酯类，例如乙酸乙酯(AcOEt)以及乙酸异丙酯(AcOiPr)以及醚类，例如乙醚、二异丙基醚、二噁烷、四氢呋喃(THF)以及MTBE；吡啶、乙腈或它们的混合物。更优选地，该另一种有机溶剂选自甲醇、甲氧乙醇、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。使用甲醇或甲氧乙醇获得了良好的结果。
在根据本发明的方法的第三实施方案的一个第一有利的方面，将获得的第二有机溶液经受一个进一步的反应步骤而无需分离该生物分子-TPB盐。
在根据本发明的方法的第三实施方案的一个第二有利的方面，将该生物分子-TPB盐作为一种固体生物分子-TPB盐从该第二有机溶液中通过沉淀或结晶分离出，如以上描述的。这种沉淀或结晶可以通过将含有该生物分子-TPB盐的第二有机溶液加入到一种水性溶液中进行。作为替代方案，沉淀或结晶还可以通过将一种水性溶液加入到所述第二有机溶液中进行。这种沉淀或结晶的生物分子TPB盐可以进一步进行处理，如以上所描述的。
在根据本发明的方法的第三实施方案的一个第三有利的方面，将含有该生物分子-TPB盐的第二有机溶液进一步经受一个浓缩步骤。该浓缩步骤经常通过真空蒸发进行。
在根据本发明的方法的一个第四实施方案中，例如如以上在该第一以及第二实施方案中描述可获得的含有该生物分子-TPB盐的第一有机溶液可以经受一个浓缩步骤(如在此之前描述的)以提供一种含有该生物分子-TPB盐的浓缩的有机溶液。
该生物分子-TPB盐可以从浓缩的有机溶液中分离出，它可以如在第三和第四实施方案中描述的例如通过沉淀或结晶获得，如以上描述的。这种沉淀或结晶可以通过将含有该生物分子-TPB盐的浓缩的有机溶液倒入一种水性溶液中进行。作为替代方案，沉淀或结晶还可以通过将一种水性溶液加入到所述浓缩的有机溶液中进行。这种沉淀或结晶的生物分子TPB盐可以进一步进行处理，如以上所描述的。
产生的含有该生物分子-TPB盐的浓缩的有机溶液可以直接用于另一个反应步骤。任选地，所述浓缩的有机溶液可以使用另一种在此之前描述的有机溶剂稀释并且然后经受另一个反应步骤。
根据本发明的方法的不同实施方案可以优选地施用于一种生物分子，它选自下组，其构成为含有至少一种阳离子基团的肽或其衍生物，更优选含有一种胍基团或一种氨基基团的肽或肽衍生物。含一个胍基团或一个氨基基团的肽或肽衍生物的典型实例是包括至少一个氨基酸基团的肽，该氨基酸选自精氨酸(Arg)、高精氨酸(homo Arg)以及赖氨酸(Lys)的氨基酸。
本发明因此涉及用于制造一种肽或其衍生物的方法的另一个具体方面，该肽或其衍生物包括一个或多个含有一个阳离子基团的氨基酸单元，该方法包括以下步骤：
(a)在一种有机溶液中将一种第一氨基酸或一种第一肽连接到一种第二氨基酸或第二肽上，其中该第一和/或该第二氨基酸或肽含有一个阳离子基团，以生产一种含有一个阳离子基团的肽；
(b)完成该连接步骤之后加入一种TPB盐；并且
(c)如之前描述的将含有一个阳离子基团的肽或其衍生物从一种水性溶液或一种有机溶液中分离出。
如果在该肽上的阳离子基团的数目是从2至20，优选从3至15，则根据本发明的方法是尤其有利的。
当该连接步骤涉及含有氨基酸Arg或Har的一个肽时，则本发明的方法是尤其有益的。已经出人意料地发现了当在步骤(b)和(c)中存在一种四苯基硼酸盐时，使用一种对于Arg或Har中的侧链的保护基团可以忽略。根据本发明的制造肽的方法可以有利地施用于制造奥米加南(SEQ ID NO：1)或依替巴肽(SEQ ID NO：5)。
在本发明的肽的制造方法的步骤(a)中，保护基团总体上可以用于所涉及的氨基酸或肽中间物中的一个或多个氨基基团。
通过说明，本发明的肽的制造方法中可以使用以下的保护基团：酰基-类型的保护基团，例如甲酰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、4-甲苯磺酰、苯磺酰基以及2-硝基苯基次磺酰基、芳香族的氨基甲酸酯-型保护基团，例如取代的或未取代的苄氧基羰基(Z)、对溴苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基、二苯甲氧基羰基、2-(4-二苯基)丙-2-基-氧基羰基、2-(3，5-二甲基氧基苯基)丙-2-基-氧基羰基、以及三苯基膦酰基乙氧基羰基、脂肪族的氨基甲酸酯-型保护基团，特别是叔丁氧羰基(BOC)、二异丙基甲氧羰基、异丙氧基羰基、乙氧碳酰基、烯丙氧羰基、9-芴甲氧羰基(Fmoc)、2-甲磺酰乙氧基羰基以及2，2，3-三氯乙氧基羰基。
环烷基氨基甲酸酯-类型保护基团，例如环戊氧基羰基、金刚烷基氧基羰基、环己氧基羰基、叔戊氧基羰基以及异冰片基氧基羰基、硫代氨基甲酸酯-类型保护基团，特别是苯基硫代羰基、烷基-类型保护基团，例如尤其是三苯甲基(trityl)以及苄基三烷基硅烷基团，例如像，叔丁基-二甲基硅烷基以及烷氧基基团，例如像甲基酯、乙基酯、叔丁基酯以及苄基酯以及对硝基苄基酯。
在本发明的肽的制造方法中，该第一氨基酸或肽总体上具有一个活化的羧基基团。在本发明的方法中可以使用不同的活化基团，例如像衍生自N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺(EDC)、新戊酰氯(PivCl)、异丁基氯甲酸酯(IBCF)。除了这些活化基团之外有时候还有利地使用添加剂。优选的添加剂是N-羟基丁二酰亚胺(Suc-OH)、N-羟基苯并三唑(HOBt)或3，4-二氢-3-羟基-4-氧-1，2，3苯并三嗪(HOOBt)。
根据本发明的肽的制造方法的另一个具体方面涉及一种方法，其中含有至少一个阳离子基团的肽或其衍生物的水性或有机溶液通过将一种水性溶液加入到用于制造在一种有机溶剂中的所述肽的合成溶液中，在完成一个连接步骤之后获得。
总体来说，肽连接步骤之后的合成溶液可以或可以不包括一种碱。结果是，随后的步骤可以取决于是否存在一种碱。
在根据本发明的肽的制造方法的一个第一实施方案中，其中在合成溶液中不存在碱，优选的是将该合成溶液用一种酸例如盐酸的水性溶液稀释。该溶液然后优选地使用一种有机溶剂或其混合物洗涤。该有机溶剂优先选自与水不互溶的化合物。此种合适的有机溶剂的非限制性例子是选自卤烃，例如二氯甲烷(DCM)以及氯仿，酯类，例如乙酸乙酯(AcOEt)以及乙酸异丙酯(AcOiPr)以及醚类，例如乙醚、二异丙基醚以及MTBE。可以使用多种不同的溶剂。尤其有利的是使用二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、二异丙醚以及MTBE，单独地或组合地。该洗涤步骤允许与在反应介质(例如，DMF、DMA、NMP)中使用的有机相有机溶剂一起除去反应物(例如HOBt、HOOBt)和/或起始的氨基酸或肽。
在本发明的这个实施方案中，含有至少一种阳离子基团的肽或其衍生物在该水性溶液中存在并且将一种TPB盐加入到该水性溶液中并且回收该肽或其衍生物的四苯基硼酸盐(TPB)的盐可以根据如以上描述的本发明的方法(具体是在根据本发明的方法的第一实施方案中描述的)来进行。
在根据本发明的制造肽的方法的一个第二实施方案中，其中在合成溶液中存在一种碱，优选的是使用如上所述的一种稀释溶剂稀释一种合成溶液。在一个第二步骤中，含有有机溶剂(有机相)的有机溶液可以有利地洗涤至一种酸的水性溶液。这种洗涤步骤可以允许通过水相除去起始化合物尤其是当它包括Arg时，连同某些碱性添加剂(例如TEA、DIPEA)以及可能会与TPB形成盐的反应物(例如EDU)。
在本发明的这个实施方案中，含有至少一种阳离子基团的肽或其衍生物在该有机溶液中存在并且将一种TPB盐加入到该水性溶液中并且回收该肽或其衍生物的四苯基硼酸盐(TPB)的盐可以根据如以上在不同的实施方案中描述的本发明的方法来实现。
在一个特别适合奥米加南(SEQ ID NO：1)的合成的框架的具体的实施方案中，根据本发明的肽的合成方法包括形成含有Arg的肽的一种四苯基硼酸盐。典型地所述含Arg的肽的四苯基硼酸盐通过将一种包括含Arg的肽的连接步骤的反应介质(经常通过根据本发明的方法的连接步骤获得)与一种四苯基硼酸盐阴离子来源接触来形成。四苯基硼酸盐的盐适合作为四苯基硼酸盐阴离子的来源。
在此，优选的是在一种四苯基硼酸盐的盐(TPB)的存在下进行至少一个步骤，该盐优选地在完成至少一个连接步骤之后加入。
在四苯基硼酸盐(TPB)的盐中的阳离子可以是无机的或有机的。有机离子的例子是四乙基铵、二异丙基乙铵、N-乙基哌啶鎓、N-甲基吗啉鎓、N-乙基吗啉鎓。例如合适的无机离子是钠(Na+)或锂(Li+)。最优选地，使用能形成一种水性溶液的四苯基硼酸盐。优选LiTPB和NaTPB。最优选使用的四苯基硼酸盐的盐是NaTPB。
这种TPB阴离子可以是在苯环上被取代的或者它可以以未取代的形式使用。优选地，TPB阴离子是未取代的。合适的取代的TPB阴离子的例子包括例如四[3，5-双(三氟甲苯基)硼酸盐。
所使用的四苯基硼酸盐的盐的量可以在宽限制内变化。优选地，含Arg的肽中的每Ar单元使用从1至10当量、优选从1至1.5当量的四苯基硼酸盐的盐。
这种四苯基硼酸盐的盐优选地在根据本发明的方法中在完成至少一个连接步骤之后的工作进程过程中在一种溶剂或多种溶剂的混合物的存在下使用。合适的溶剂尤其是甲醇、甲氧乙醇、二氯甲烷、正丁醇、异丁醇、仲丁醇以及叔丁醇。使用甲氧乙醇获得了良好的结果。
在这个实施方案中，一种含Arg的肽的所述四苯基硼酸盐的盐可以有利地经受至少另一个合成步骤而无需分离。经常，一种含Arg的肽的所述四苯基硼酸盐的盐经受至少一个脱保护步骤接着一个连接步骤。
本发明涉及一种固体的含有至少一种阳离子基团的生物分子-TPB盐。肽，具体是在此描述的并且更具体地是含Arg或Har的肽是在根据本发明的固体生物分子-TPB盐中的优选的生物分子，可以值得注意地通过本发明的方法获得。
已经出人意料地发现了当存储时该固体的生物分子-TPB盐基本上是稳定的。
“基本上稳定的”应理解为具体表示以下事实，当将该生物分子-TPB盐的含量在存储之前和之后比较时，发现在存储之后的生物分子-TPB盐含量是至少98％、优选至少99％的存储之前的该生物分子的含量。
本发明因此还涉及一种存储根据本发明的固体的生物分子-TPB盐的方法。
该固体的生物分子-TPB盐的存储总体上在小于或等于25℃的温度下进行，更优选小于或等于22℃，仍然更优选小于或等于20℃。该固体的生物分子-TPB盐的存储总体上在大于或等于-90℃、经常是大于或等于-80℃的温度下进行。优选地，该存储在大于或等于-20℃、更优选是大于或等于0℃的温度下进行。
已经发现了使用根据本发明的固体的生物分子TPB盐允许以相对低的能量消耗的长期存储。
根据本发明的固体的生物分子TPB盐经常存储大于24小时的一个时间段，例如大于1周。可以观察到稳定性持续了长达1年或更长的时间段。经常存储时间段会超过6个月。
本发明还涉及使用固体的生物分子TPB盐作为生物分子合成中的中间物来源。根据本发明的用途优选地施用于在一个连接、脱保护或纯化步骤中待使用的肽片段。
本发明还涉及用于制造含有至少一种阳离子基团的生物分子的一种盐的方法，包括(a)提供该生物分子的TPB盐的一种溶液(b)将所述溶液与一种反离子盐接触，其阳离子与四苯基硼酸盐形成了一种盐，该盐在该溶液中比该生物分子的TPB盐是更少溶解的，以便将该四苯基硼酸盐阴离子交换成该反离子(c)任选地从该溶液中回收该生物分子的反离子盐。
在一个实施方案中，这种离子交换可以通过加入一种反离子(其阳离子与该四苯基硼酸盐离子形成了一种盐)溶液来实现。总的来说，该阳离子和溶剂被选择为一经将该溶液与反离子盐接触，则该阳离子TPB盐会从该溶液中沉淀出。合适的反离子盐总体上选自钾盐，例如氯化钾和乙酸钾并且优选季铵盐，例如四烷基乙酸铵以及氯化铵。一种四烷基氯化铵，例如苄基三甲基氯化铵给出了良好的结果。在本发明的这个具体的实施方案中，该生物分子-TPB盐总体上溶解在一种有机溶剂中。该有机溶剂优先选自醇类，例如甲醇或乙醇。甲醇是最优选的醇。一种选自季铵阳离子例如苄基三甲基铵阳离子的阳离子与一种醇的组合是特别优选的。
在这个实施方案中使用的反离子盐/TPB阴离子的摩尔比总体上是约1，优选从1至1.1。
在另一个实施方案中，该离子交换使用一种离子交换树脂进行。在这个实施方案中，该交换优选地通过将该生物分子-TPB盐溶液通过一个含有交换树脂的柱进行。交换树脂的合适的例子含有如以上所述的固定的氨基阳离子基团，特别是具有所希望的反离子的季(铵)基团，特别是乙酸酯或氯化物。合适的离子交换树脂的一个具体例子在名称RA 958下由Rohm和Haas商品化。这种离子交换树脂可以任选地使用优先选自醇(例如甲醇、乙醇)的有机溶剂洗涤。甲醇是最优选的醇。
以下实例旨在说明本发明而非限制其范围。
所指明的比例是指体积比。如果另外没有指明任何事项，该化合物的纯度是大于按重量计98％并且所指明的比是指体积比。在其中使用异丁醇的情况下，也可以使用仲丁醇。
在这些实例中并且贯穿本说明书使用的缩写定义如下：Boc是叔丁氧基羰基，n-BuOH是正丁醇，DCM是二氯甲烷，DIPEA是N，N-二异丙基乙胺，DMF是N，N-二甲基甲酰胺，DMA是N，N-二甲基乙酰胺，Fmoc是芴甲氧羰基，HBTU是N，N，N′，N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲鎓-六氟磷酸酯)，HOBt是1-羟基苯并三唑，HOOBT是3，4-二氢-3-羟基-4-氧-1，2，3-苯并三嗪，EDC是N，N-二甲氨基丙基碳二亚胺，DCC是二环己基碳二亚胺，i-BuOH是异丁醇，IPE是二异丙醚，MeCN是乙腈，MeOH是甲醇，NMM是N-甲基吗啉，NMP是1-甲基-2-吡咯烷酮，THF是四氢呋喃，pNA是对硝基苯胺酰胺，Tos是甲苯磺酰基，MTBE是甲基-叔丁基醚。
实例1：HCl.H-Arg-Lys(Boc)-NH2的合成
将1,02当量的Z-Arg-OH.HCl(Mw＝344,8)在室温下加入到一种DMA和CH2Cl2的混合物(6/4)中。此后，加入1,03当量的HOBt(N-羟基苯并三唑，Mw＝135,12)以及1,00当量的H-Lys(Boc)-NH2(Mw＝245,3；纯度：99％)。将溶液冷却至0±5℃之后，加入1,03当量的EDC.HCl(Mw 191,7)。
在0±5℃继续搅拌另外的30分钟并且然后在室温下搅拌2小时。通过HPLC检测反应完全之后，将反应混合物用CH2Cl2/iso-BuOH(6/4)混合物稀释并且使用0,5eq.的HCl溶液萃取。酸性水相用CH2Cl2/iso-BuOH的混合物(6/4)第二次萃取。将合并的有机相首先使用一种5％(重量)的含1,05当量的四苯基硼酸钠的Na2CO3水性溶液(TPBNa)(Mw＝342g)、并且然后用5％(重量)的水性NaCl溶液洗涤四次。
该有机相在真空中浓缩之后，分几次向该浓缩物中加入甲氧乙醇以除去痕量的异丁醇。然后将其进一步蒸发。最后将浓缩物使用甲氧乙醇洗涤并且缓慢地加入到一个冷的(0至5℃)的5％(重量)的水性NaCl溶液中。将该肽沉淀并且在低温下保持至少30分钟并且然后过滤。
将固体使用冷(0±5℃)的脱矿质水洗涤3次。此后，将固体再溶解在MeOH中并且搅拌直至获得一个轻微浑浊的溶液。将该溶液部分地浓缩并且然后将甲醇的溶液缓慢地加入到一个冷的水性5％(重量)的NaCl溶液中。将该沉淀在其被过滤掉之前在低温下保持至少30分钟。最后，将固体使用冷的脱矿质(0℃±5℃)水洗涤3次并且在真空中干燥(45℃)。最后获得了一种灰白色的固体。基于NMR测量的成分的产量是89％。
HCl.H-Arg-Lys(Boc)-NH2的合成
将1,00当量的TPB.Z-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw＝535,6；纯度＝62,0％)的甲醇溶液几次通过含有一种甲醇洗涤的树脂RA 958(Mw＝1000；3,00当量)的一个柱。通过HPLC检测交换之后，将该树脂过滤并且用甲醇洗涤三次。将合并的有机相部分地在真空中浓缩。将浓缩的溶液使用水洗涤。
加入Pd催化剂(Mw＝106,4；2％重量)并且然后将该悬浮液在35℃±5℃氢化至少5小时。将催化剂过滤掉，用甲醇/水的混合物洗涤两次。将滤液在真空中蒸发，残余物在DMA中悬浮并且在真空中部分地蒸发以除去痕量的水。检测水的含量之后，最终溶液用HCl(0.1N)滴定并且进一步使用，无需任何纯化。
产量(基于滴定)：90％。
实例2：2HCl.H-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO：2)的合成
Z-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2.2TPB(SEQ ID NO：2)的合成
将1,00当量的Z-Trp-Arg-OH(Mw＝494,5；纯度＝85,0％)以及1,10当量的HOOBt(Mw＝163,13)加入到1,15当量的HCl.H-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw＝437,5；纯度＝20,0％；)的DMA溶液中，该溶液之前使用CH2Cl2稀释。将该溶液冷却到-5℃±5℃之后，将1,00当量的HCl/二噁烷4N缓慢地倾倒入其中并且然后加入1,10当量的EDC(Mw＝191,7)。将该反应混合物在-5℃±5℃搅拌至少3小时并且然后在5℃±5℃搅拌至少8小时。通过HPLC检测反应完全之后，将反应混合物用CH2Cl2/仲丁醇混合物(6/4)稀释，首先用5％(重量)的含HCl(0.5eq.)的NaCl水性溶液洗涤，然后用1900ml的5％(重量)的含2.2当量的NaTPB(.Mw＝342)Na2CO3水性溶液洗涤，并且最后用5％(重量)的HCl水性溶液洗涤五次。将有机层浓缩之后，将残余物溶解在甲醇中并且然后在真空中浓缩以除去绝大多数的剩余的CH2Cl2。这个最终溶液通过NMR滴定并且进一步使用，而无需任何纯化。
产率(基于滴定含量)＝83％。
2HCl.H-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO：2)的合成
将1,00当量的2TPB.Z-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw＝878,11)的甲醇溶液几次通过含有6.00当量的一种甲醇洗涤的树脂RA 958(Mw＝1000)的一个柱。通过HPLC检测交换之后，将该树脂过滤并且用甲醇洗涤三次。将合并的有机相部分地在真空中浓缩。将该浓缩的溶液用水洗涤并且加入Pd催化剂。然后将该悬浮液在35℃±5℃氢化至少3小时。将催化剂过滤掉并且用甲醇洗涤两次。将滤液在真空中蒸发，残余物在DMA中溶解并且进一步浓缩以除剩余的水。检测了水含量之后，将沉淀溶解在DMA中并且在真空中部分地蒸发以适配该溶液的重量。这个最终溶液通过0.1N HCl滴定并且进一步使用，而无需任何纯化。
产率(基于滴定)：95％。
实例3：2HCl.H-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO：3)的合成
Z-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2.2TPB(SEQ ID NO：3)的合成
将1,00当量的Z-Trp-Trp-Pro-OH(Mw＝621,7；纯度＝94.0％)加入到先前用CH2Cl2稀释的1,05当量的2HCl.HTrp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw＝816,9；纯度＝15,0％)的DMA溶液中。然后加入1,20当量的N，N’-二异丙基乙胺(DIPEA)(Mw＝129,2)以及1,05当量的2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯)(HBTU)(Mw＝379.24)。将该反应混合物在室温下搅拌至少1小时。通过HPLC检测反应完全之后，将反应混合物用CH2Cl2/异丁醇混合物(8/2)稀释，首先用5％(重量)的NaCl和HCl(1,5eq.)的水性溶液洗涤，然后用5％(重量)的Na2CO3和2,2当量的NaTPB(Mw＝342g/mol)水性溶液洗涤，并且最后用5％(重量)的HCl水性溶液洗涤三次。将有机层浓缩之后，将残余油几次溶解在甲氧乙醇中并且然后在真空中浓缩以除去绝大多数的剩余的异丁醇。GC控制之后，将该浓缩物通过缓慢地将其倾倒到冷的(0±5℃)5％(重量)NaCl的水性溶液中来沉淀。在搅拌至少1小时之后，将该悬浮液过滤并且使用冷水洗涤两次。将沉淀在真空中在45℃干燥。最终获得了一种白色固体。
产率(基于NMR含量)＝98％。
2HCl.H-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO：3)的合成
将1,00当量的2TPB.Z-TrpTrp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO：3)(Mw＝1347,5；纯度＝64,0％)的甲醇溶液几次通过含有一种甲醇洗涤的树脂RA 958(或Amberjet Cl1000；6,00当量)的一个柱。通过HPLC检测交换之后，将该树脂过滤、洗涤三次。将合并的有机相在真空中部分地浓缩并且然后用水稀释。最后加入2％的Pd催化剂(Mw＝106.4；2％重量)并且然后将该悬浮液在40℃氢化至少3小时。将催化剂过滤掉，用甲醇/水的混合物洗涤三次。将合并的滤液在真空中蒸发，残余物在DMA中悬浮并且进一步浓缩以除剩余的水。检测水的含量之后，最终溶液用HCl(0,1N)AgNO3(0,1N)或NMR滴定并且进一步使用，无需任何纯化。
产率(基于滴定)＝82％。
实例4：Z-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2.3TPB(SEQ ID NO：4)的合成
将1,00当量的Z-Arg-Trp-Pro-OH(Mw＝591,65；纯度＝96.0％)、1,00当量的HCI/二噁烷(4N；)以及1,05当量的HOBt(Mw＝135,12；纯度＝98,0％)加入到1.00当量的2HCl.H-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO：3)(Mw＝1213,4；纯度＝85.0％；)在用CH2Cl2稀释的DMA中的溶液中。将该溶液冷却到10℃±5℃之后，加入1,02当量的EDC(Mw＝191,7)。将该反应混合物在10℃±5℃搅拌30分钟并且然后在室温下搅拌至少4小时。通过HPLC确认反应完全之后，将反应混合物用CH2Cl2/异丁醇混合物(8/3)稀释，首先用5％(重量)的具有HCl(0.5eq.)的NaCl水性溶液洗涤，然后用含3当量的NaTPB(Mw＝342)的5％(重量)的Na2CO3水性溶液洗涤，并且最后用5％(重量)的HCl水性溶液洗涤两次。将有机层浓缩之后，将残余油几次溶解在甲氧乙醇中并且然后在真空中浓缩以除去绝大多数的异丁醇。GC控制之后，将该浓缩物通过缓慢地将其倾倒到冷的5％(重量)NaCl的水性溶液中来沉淀。在搅拌至少1小时之后，将该悬浮液过滤、使用冷水洗涤两次。将沉淀在真空中在40℃±5℃干燥。最终获得了一种灰白色固体。
产率(基于NMR含量)＝87％。
将1,00当量的3TPB.Z-Arg-Trp-Pro-TrpTrp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw＝1787,1；纯度＝57,0％)的甲醇溶液几次通过含有一种甲醇洗涤的树脂RA 958(Mw＝1000；9,00当量)的一个柱。通过HPLC检测交换之后，将该树脂过滤并且用甲醇洗涤三次。将合并的有机相部分地在真空中浓缩。然后将该浓缩的溶液用水洗涤并且加入Pd催化剂。然后将该悬浮液在35±5℃氢化至少6小时。将催化剂过滤掉并且用甲醇/水混合物洗涤三次。将合并的滤液在真空中蒸发，残余物在DMA中悬浮并且进一步浓缩以除剩余的水。检测水的含量之后，最终溶液用HCl(0.1N)或NMR滴定并且进一步使用，无需任何纯化。
产率(基于NMR含量测量)＝93％。
实例5：Z-(D)Arg-Gly-Arg-pNA.2HCl的合成
Z-(D)Arg-Gly-Arg-pNA.2HCl的合成
将7.7g的Z-(D)ArgOH(25mmoles)以及13.8g的2HCl.H-Gly-ArgpNA在室温下分散在约100ml的DMA中直至完全溶解。然后将该混合物冷却到0℃并且加入DIPEA(N，N’-二异丙基乙基胺)以中和过量的HCl，接着加入3.6g的HOBt(26.13mmoles)以及5.7g的DCC(27.5mmoles)。将该溶液在被调节到25℃±5℃之前在0℃下搅拌至少1小时。当认为反应完全时(按照HPLC)，将粗制物在真空中浓缩并且然后将浓缩物用水稀释以便沉淀DCU，然后将其通过过滤除去并且用水洗涤。将该水性溶液用DCM洗涤几次直至除去DMA(二甲基乙酰胺)以及HOBt。将二当量的TPBNa以及500ml的DCM倾倒到水性溶液中同时将pH通过控制加入水性NaHCO3溶液调节到6.5与7.5之间。1小时的混合之后，将水相丢弃并且有机相用NaCl水性溶液并且最后用水洗涤几次。将溶剂在真空中除去并且用MeOH替代。
Z-(D)Arg-Gly-Arg-pNA.2TPB的分离
然后将Z-(D)Arg-Gly-Arg-pNA.2TPB的甲醇溶液在0±5℃倾倒到NaCl的5％的水性溶液中以沉淀Z-(D)Arg-Gly-Arg-pNA.2TPB。过滤、用水洗涤并且真空中干燥之后，获得了Z-(D)Arg-Gly-Arg-pNA.2TPB，为一种白色固体。
Z-(D)Arg-Gly-Arg-pNA的二氯水合物(bischlorhydrate)盐的分离
将该TPB盐溶解在甲醇中并且将该溶液几次通过含有一种甲醇洗涤的树脂IRA 958的一个柱。通过HPLC检测交换之后，将该树脂用甲醇洗涤几次。将合并的浓缩的滤液在真空下浓缩并且将获得的固体通过HPLC纯化并且最后冻干以产生Z-(D)Arg-Gly-Arg-pNA，为其二氯水合物的盐。
实例6：Ac-(D)Arg-Gly-Arg-pNA.2HCl的合成
纯化的Ac-(D)Arg-Gly-Arg-pNA.2TPB的分离
将Ac-(D)Arg-Gly-Arp-pNA.2TFA在水/乙腈(31l)中的溶液的pH通过加入NaHCO3水性溶液调节到7±0.5。将乙腈部分在真空中蒸发(溶液的体积通过加入水而保持，若必要的话)。将1kg TPBNa和1.1kg NaHCO3溶解在约20l的水中。将浓缩的肽溶液然后逐渐倾倒到该TPBNa/NaHCO3水性溶液中。Ac-(D)Arg-Gly-Arg-pNA.2TPB沉淀出。过滤、用水(40l)洗涤并且真空下干燥(45℃)之后，获得了1.6kg的Ac-(D)Arg-Gly-Arg-pNA.2TPB。
纯化的Ac-(D)Arg-Gly-Arg-pNA.2HCl的分离
将该TPB盐溶解在20l甲醇中，将其几次通过含有一种甲醇洗涤的树脂958(7.6kg resin)的一个柱。通过HPLC检测交换之后，将树脂用甲醇洗涤几次(每次11l)。将合并的浓缩的滤液在44l冷却的(-5℃±5℃)乙腈中沉淀。使用乙腈(12l)洗涤、真空下干燥之后，该沉淀产生了0.8kg的灰白色固体。如果必要的话，Ac-(D)Arg-Gly-Arg-pNA.2HCl可以沉淀第二次。
实例7：Mpr(*)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(*)-NH2(SEQ ID NO：5)的合成
(*)表明了在巯基丙酸和半胱氨酸(cysteinamid)之间的二硫桥键。
将550ml的46.6g的Mpr(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH2(SEQ ID NO：5)(Mw＝1374.8g/mol，20mmol＝1,00当量)的甲醇溶液使用130g的一种洗涤过的树脂IRA 958(Mw＝1000g/mol；6.72当量)进行处理。通过HPLC检测交换之后，将该树脂过滤并且用340ml的甲醇洗涤几次。将合并的有机相通过加入1500ml的甲醇、5400ml的二氯甲烷并且最后用180ml的水来稀释。将24g碘加入到该稀释的溶液中。通过HPLC检测环化作用，剩余的碘通过在水性溶液中加入700ml的Na2S2O3(3.6％重量)淬灭。将反应混合物然后通过加入190ml的树脂乙酸酯(Mw＝720g/mol；57当量)中和。过滤并且用210ml的甲醇以及1800ml水洗涤该树脂之后，将有机层从水层中分离出。通过加入10000ml的二氯甲烷，将肽(SEQ ID NO：5)用21g的NaTPB(Mw＝342.2g/mol；3当量)从该中和的水性层中萃取出。将有机层分离并且蒸发之后，将残余物溶解在甲醇(900ml)中并且然后在真空中浓缩以除去绝大多数的剩余的二氯甲烷。将甲醇溶液悬浮到2400g的一种洗涤过的树脂IRA 958(Mw＝1000g/mol；12.1当量)中。通过HPLC检测交换并且洗涤树脂之后，将合并的有机相通过加入240ml的乙酸稀释。将这个溶液通过制备型HPLC进一步纯化。
实例8：Mpr(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH2TPB盐(SEQ ID NO：5)的存储
固体Mpr(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH2TPB盐(SEQ ID NO：5)根据本发明的方法通过沉淀获得。将产物在20℃-25℃的温度下存储超过1年。这种固体TPB盐在存储之后基本上保持稳定。
序列表
<110>索尔维公司
<120>TPB盐用于分离生物分子的用途
<130>S200918
<160>5
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>1
Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys
1         5          10
<210>2
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>2
Trp Arg Arg Lys
1
<210>3
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>3
Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys
1        5
<210>4
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>4
Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys
1        5          10
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>巯基丙酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>高精氨酸
<400>5
Xaa Xaa Gly Asp Trp Pro Cys
1       5
Figure IPA00001311102900011
Figure IPA00001311102900021

Claims (18)

1.一种用于将含有至少一种阳离子基团的生物分子从含有所述生物分子的液体介质中分离出的方法，该方法包括使用四苯基硼酸盐(TPB)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该生物分子选自肽、肽衍生物、寡核苷酸、寡核苷酸衍生物以及多糖。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中该阳离子基团选自胍基团或氨基基团。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，包括将四苯基硼酸盐加入到该液体介质中，其中所述液体介质是该生物分子的水性溶液或该生物分子的有机溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其中该液体介质是水性溶液并且其中将该生物分子通过沉淀、结晶或提取到有机溶剂中从所述水性溶液中分离出，所述提取提供了该生物分子TPB盐的第一有机溶液。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在加入该TPB盐之前将该水性溶液用有机洗涤溶剂洗涤，该有机洗涤溶剂基本上不与水混溶并且优选选自卤代烃类、酯类以及醚。
7.根据权利要求4所述的方法，其中该液体介质是有机溶液，在任选地用水性溶液洗涤之后向其中加入四苯基硼酸盐，由此提供含有该生物分子-TPB盐的第一有机溶液。
8.根据权利要求6或7所述的方法，进一步包括通过使用另一种有机溶剂处理该第一有机溶液来提供含有该生物分子的TPB盐的第二有机溶液，该另一种有机溶剂优选选自醇类、酰胺型溶剂、卤代烃类、酯类、醚类，并且其中所述第一有机溶液在加入所述另一种有机溶剂之前任选地经历浓缩步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中使该生物分子作为固体生物分子-TPB盐从该第二有机溶液中沉淀或结晶出。
10.根据权利要求8所述的方法，其包括任选地在进一步处理之后使所述第二溶液经历另一个合成步骤，而无需分离所述生物分子的TPB盐，该进一步处理选自例如浓缩步骤并且任选地随后加入另一种有机溶剂。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该四苯基硼酸盐是NaTPB，优选地与碱剂一起使用，该碱剂优选选自NaHCO3和Na2CO3。
12.一种制造生物分子的方法，其包括根据权利要求1至11中任一项所述的分离过程。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该生物分子是肽，其包含选自精氨酸、高精氨酸以及赖氨酸的至少一种氨基酸。
14.根据权利要求12所述的方法，用于制造肽或其衍生物，该肽或其衍生物包含一个或多个含有阳离子基团的氨基酸单元，该方法包括以下步骤：
(a)在有机溶液中将第一氨基酸或第一肽偶联到第二氨基酸或第二肽上，其中该第一和/或该第二氨基酸或肽含有阳离子基团以生产含有阳离子基团的肽；
(b)完成该偶联步骤之后加入TPB盐；并且
(c)将该含有阳离子基团的肽或衍生物从该有机溶液中分离出。
15.含有至少一种阳离子基团的生物分子的固体四苯基硼酸盐(TPB)。
16.根据权利要求15所述的盐作为在生物分子合成中的中间体来源的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中该盐在其使用之前已经被存储了至少24小时。
18.一种用于制造含有至少一种阳离子基团的生物分子的盐的方法，其包括(a)提供该生物分子的TPB盐的溶液(b)使所述溶液与反离子盐接触，其阳离子与四苯基硼酸盐形成盐，该盐在该溶液中比该生物分子的TPB盐溶解更少，从而将该四苯基硼酸盐阴离子交换成该反离子，(c)任选地从该溶液中回收该生物分子的反离子盐。
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