JP5802644B2 - 修飾されたエリスロポエチン - Google Patents
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Description
本出願は、2006年8月4日に出願された米国仮特許出願第60/835,429号明細書の利益を主張し、上記特許出願の全内容はあらゆる目的のために参照して本明細書に組み込まれる。
改良されたペグ化法の必要性を実証する代表的なタンパク質は、エリスロポエチンである。赤血球生成は、赤血球の産生であり、細胞破壊を相殺するために発生する。赤血球生成は、適正な組織酸化のために十分な赤血球を利用できるようにする、制御された生理学的機序である。天然型ヒトエリスロポエチン(hEPO)は、腎臓で生成されるポリペプチドであり、赤血球産生を刺激する体液血漿因子である(非特許文献14;非特許文献15;非特許文献16;非特許文献17)。天然型EPOは、骨髄内での前駆赤血球始原細胞の分割および分化を刺激し、赤血球前駆細胞上の受容体に結合することによってその生物学的活性を発揮する(非特許文献18)。
本発明のタンパク質接合体は、天然タンパク質の使用と同様に使用できる。例えば、EPEG製剤は、例えばEPOの腎臓疾患、癌合併症、化学療法、またはHIV療法に起因する貧血の治療における使用と同様に使用できる。本発明のこの態様によるその他の特定の潜在的な用途には、赤血球の増大が患者にとって有益であるすべての疾患(例、貧血)が含まれる。接合体の正確な量は、治療される状態の正確なタイプ、治療される患者の状態、ならびに組成物中の他の成分などの因子に支配される、優先的な問題である。
本発明の組成物、例えば、本発明によって調製された複数のタンパク質またはエリスロポエチン糖タンパク質接合体、もしくはこれらの1つまたは複数の成分は、当分野において公知の方法によって追加の薬学的に許容される担体または賦形剤との混合物もしくは組み合わせによって注射するために、さらに適合させることができる。本発明の生成物を調製するための特に薬学的に許容される担体は、食塩液、ヒト血清アルブミン、ヒト血漿タンパク質などである。本発明は、上記に記載した接合体および薬学的に許容される賦形剤および/または担体を含む薬学的組成物にさらに関する。このような薬学的に許容される担体は、水性もしくは非水性の溶液、懸濁液、およびエマルジョンであってもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、食塩液および緩衝液を含む水、アルコール/水溶液、エマルジョンもしくは懸濁液が含まれる。非経口賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲル(Ringer)デキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液もしくは固定油が含まれる。静脈内賦形剤には、水分および栄養素補充液、例えばリンゲルデキストロースなどに基づく電解質補充液などが含まれる。保存料およびその他の添加物、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、不活性気体などもまた存在してもよい。
サクシニミジル炭酸エステル(SC−PEG−12K)として活性化されたモノ−メトキシ化PEG(分子量、12,000kDa)をペグ化試薬として使用した。CHO細胞中で生成されたEPOをポリペプチドとして使用した。EPO−タンパク質(50mg)は、0.15mM NaCl、および10mMリン酸ナトリウム(pH6.9)を含む反応緩衝液中において0.61mg/mLの濃度で調製した。所定の実験のために、反応緩衝液は、15%のDMSOをさらに含んでいた。
SC−PEG(12kDa)を使用して、実施例1のプロトコールによってEPOをペグ化し、生じたEPEG製剤もしくはEPO(対照)を当分野における標準としてトリプシン消化にかけた。100ピコモルのタンパク質を、100mMリン酸ナトリウム(pH8.4)中において4%の基質重量で、37℃で18時間にわたりTPCK−処理トリプシン(Sigma社、ミズーリ州)で消化した。消化物は、C18逆相カラム(Apollo C−18、粒径5μ、4.6×100mm)上で分析した。画分は、100%の0.125%TFA(トリフルオロ酢酸)から75%のアセトニトリル/0.125%のTFAまでの、50分間にわたる線形勾配を用いて溶出させた。溶出させた画分は、230nmのUV波長で分析した。実施例のクロマトグラムは、EPOおよびPEG−EPOについて各々図3Aおよび3Bに示されている。ピークがEPOクロマトグラムには存在したがPEG−EPO溶出プロファイル中では減少もしくは存在しなかったことは、PEG修飾を示しているので、それらのペグ化部位について特性解析した。
EPEGは、DMSOを含む反応緩衝液を用いて、実施例1の方法によって調製した。生成物を0.2μM膜に通して濾過してバイオバーデン(bioburden)を除去し、次にPBS(リン酸緩衝食塩液、pH6.9)を用いて、下記に説明するBCAタンパク質アッセイによって決定されるように、最終濃度50μg/mLに希釈した。生成物は、保管のために除菌濾過して1mLバイアル中へ入れた。最終生成物はLAL試験(リムルス・アメーバ様細胞溶解質発熱性物質アッセイ、Cambrex社、メリーランド州)によって試験し、0.1EU/mL未満のエンドトキシンレベルを有していた。これらのバイアルは、その後の安定性および/または活性試験のために、37℃、25℃、4℃または−20℃で保管した。定期的に、サンプルは、PAGEによる物理的保全、BCAタンパク質アッセイによるタンパク質含量、ならびに幹細胞の増殖およびヘマトクリット産生の刺激によるEPO活性について試験した(例えば、活性アッセイについては実施例3を参照されたい)。
EPEGは、DMSOを含まない反応緩衝液を用いて、実施例1の方法によって調製した。EPEGの有効性は、赤血球系細胞への幹細胞分化を刺激する能力によって評価した。正常ヒト骨髄を幹細胞の起源として使用した。光密度細胞は、Ficoll分離(Poietics社製のキット)後に入手した。細胞は、2%のFBSを含む10mLのIscove培養液中に再懸濁させ、トリパンブルーを用いて生存能力についてチェックした。50μg/mLでのEPEG試験サンプルおよび対照サンプルは、実施例2に記載したBCAタンパク質アッセイによるタンパク質濃度の決定に続く標準125,000単位/mgのEPOを前提とする比較のために、単位/mLに変換した。コロニー形成細胞(CFC)アッセイのためには、300単位/mLのストック液を作製し、2%のFBSを含むIscove培養液中で連続希釈液を調製した。対照として、EPREX(登録商標)(エポエチンα)(20,000IU/mL、ロット番号58B097)の類似のストック液もまたプレーティングのために調製した。標準EPO(EPREX(登録商標)(エポエチンα)およびEPEGは、最終濃度3、1、0.3、0.1および0.03単位/mLになるように加えた。造血コロニーアッセイは、20,000個/培養の骨髄細胞を用いて開始した。全培養は3つずつ準備し、14日間にわたりインキュベートした。第14日に、コロニー数をスコア付けした。コロニーは、当分野においてルーチンであるように、形態に基づいて、以下のカテゴリーのCFU−E、BFU−EおよびCFU−GMに分類した。CFU−Eは、より成熟した前駆細胞に由来する赤芽球コロニーであり、200個未満の赤芽細胞を含む。BFU−Eは、原始細胞に由来する赤芽球コロニーであり、200個超の赤芽細胞を含む。CFU−GMは、40個以上の顆粒球および/またはマクロファージ細胞を備えるコロニーを産生できるコロニー形成細胞(CFC)に由来するコロニーである。全赤血球(CFU−E+BFU−E)ならびに全CFC(全赤血球+CFU−GM)について定量した。培養液を用いるアッセイは、検出不可能な赤芽球コロニーしか生成しなかった。これは、観察されたコロニーが試験サンプルに起因することを確証している。この結果は、前駆細胞アッセイにおいて添加されたサイトカインの非存在下で、対照EPREX(登録商標)(エポエチンα)および試験EPEGの両方について赤芽球前駆細胞増殖に及ぼす用量依存性作用を証明している。3μ/mLの飽和濃度では、EPEG A、B、およびCは、78〜82%のEPREX(登録商標)(エポエチンα)コントロール増殖を誘導する。これらのレベルは、図6に示したように、サブ飽和濃度(1および3単位/mL)ではより低い。このグラフは、3回の示度の平均数を示している。平均変動係数は、3単位/mLについては11%、1単位/mLについては25%、0.3単位/mLについては30%、および0.1単位/mLについては50%である。信頼性のレベルについてのp値は、P<0.01であった。無タンパク質培養液中への数カ月間の保管後、EPEGサンプルは完全な活性を維持した。アッセイ結果は、統計的分析にかけた。同等濃度でEPOおよびPEG−EPOを用いて試験した培養間で生成されたコロニー数における相違を評価するためには、標準t−検定を実施した。0.01未満のp値は有意と見なされる。観察されたデータは、結果がこの有意性レベル内に含まれることを示している。同様の結果が、DMSOを含む反応緩衝液中で調製されたEPEGを用いて得られた。
EPEGの2つの相違するロット(EPO−PEG201およびEPO−PEG202)は、DMSOを含まない反応緩衝液を使用して実施例1の方法によって調製し(即ち、天然型EPOをリシン部位でSC−PEG−12Kによって修飾した)、生じたサンプルのタンパク質濃度は、実施例3に記載したようにBCAアッセイによって決定した。これらのEPEG化合物を使用して、天然、未修飾、天然の機能的EPOおよび高度にグリコシル化されたFDA承認EPO(Amgen社(カリフォルニア州サウザンドオークス)からのARANESP(登録商標)(darbopoietin alfa))と薬物動態学的プロファイルを比較した。ARANESP(登録商標)(darbopoietin alfa)は、FDA承認製品であり、タンパク質の高グリコシル化に起因する長期半減期を有するので、基準物質として使用した。血液中のタンパク質を検出するために、4種のサンプル(EPO−天然型EPO−PEG201、EPO−PEG202およびARANESP(登録商標)(darbopoietin alfa))は、当分野において公知であるクロラミンT法を用いて、それらのチロシン部位を125Iにより標識した。各分子は、結合した約1〜2の125Iを有した。各サンプル(80μg)を標識し、脱塩カラムを用いて残留未結合125Iを分離した。タンパク質の活性を検出し、ポリアクリルアミドゲルおよび逆相カラム上で検証した。ペグ化サンプルは、1PEG分子に結合しているEPOの下位群(1PEG−EPO)、または2PEG分子に結合しているEPOの下位群(2PEG−EPO)について評価した。1PEG−EPO対2PEG−EPO比は、EPO−PEG201においては54:46であり;およびEPO−PEG202においては45:55であった。4つの放射標識タンパク質バッチの薬物動態学的プロファイルを分析するために、4Ci/kg(体重)の用量のタンパク質溶液をSprague−Dawley系雄ラットに皮下注射した。ラットは、各動物について3回より多い血液サンプリングを回避するために、動物各4匹を含む5つのサブグループに分割した。血液サンプルは、注射後の様々な時点(0、0.5、1、2、4、8、12、16、24、36、48、72、96および120時間後)に採取した。血液サンプル中の放射標識タンパク質の量は、シンチレーションカウンタを用いて決定し、生成されたデータを統計学的に評価した。結果を、図7に示す。EPO−PEG201およびEPO−PEG202は、類似の薬物動態学的プロファイルを有する。驚くべきことに、本発明者らは、どちらもARANESP(登録商標)(darbopoietin alfa)または天然型EPOいずれよりも、高度かつ広範囲のPKプロファイルを有することを見いだした。表2は、1区画モデルおよび用量累積を用いたPKパラメータの分析の結果を示している。
複数バッチのEPEGは、DMSOを含まない反応緩衝液を使用し、そして種々様々な活性化PEGを用いて、実施例1の方法によって調製した。ペグ化反応において使用される活性化PEGの量は、最終生成物がほぼ同等量の1PEG−EPOおよび2PEG−EPOを含むように調整した。1PEG−EPOおよび2PEG−EPOは、DEAEカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。カラムは、75mM NaCL、5mMリン酸ナトリウム(pH6.75)を含む緩衝液を用いて平衡化させた。反応後、サンプルは同一緩衝液に対して透析し、次に精製のためにカラムへ装填した。小量の高度に修飾されたPEG−EPOは、カラムに結合せず、洗浄液中へ溶出した。サンプルは、97.5mM NaCL−5mMリン酸ナトリウム(pH6.75)の勾配を用いて溶出した。任意の天然型EPOは、リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.75)中の150mM NaCLを用いて溶出させた。溶出した画分は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって評価した。画分は、1PEG−EPO、2−PEG−PEGおよびこれら2つの当量混合物の、3つの群に分離された。Y501P、1PEG−EPOを備える分枝鎖NHS−PEG(20kDa)によって修飾したEPO;Y502P、2PEG−EPOを備える分枝鎖NHS−PEG(20kDa)によって修飾したEPO;Y5012、同等量の1PEG−EPOおよび2PEG−EPOを備える分枝鎖NHS−PEG(20kDa)によって修飾したEPO;L33、同等量の1PEG−EPOおよび2PEG−EPOを備える直鎖SC−PEG(12kDa)によって修飾したEPO;ならびにX6012、同等量の1PEG−EPOおよび2PEG−EPOを備える分枝状NHS−PEG(40kDa)によって修飾したEPOの、5つの代表サンプルを作成した。最終サンプルのタンパク質濃度は、実施例3に記載したように決定した。
実施例6に記載の作成したEPEGサンプルをラットに投与して、活性を比較および評価した。Y501P(1PEG−EPO)、Y502P(2PEG−EPO)およびY5012(1PEG−EPOおよび2PEG−EPOの混合物)。
実施例6に記載したように生成したEPEG変異体を、実施例7に記載したヘマトクリット誘導のマウスモデルにおいてさらに試験した。本アッセイのために選択したEPEG製剤は、各々ほぼ同等量の1PEG−EPOおよび2PEG−EPO:L33、Y5012、およびX6012を含んでいた(実施例5を参照されたい)。これらのインビボ活性を、ヘマトクリット増加に関してPBSおよび天然型EPOと比較した。上記に記載したように、各動物は、ほぼ5μgの活性物質、即ち全タンパク質を摂取した。図9に示したように、L33およびY5012は類似の作用を有するが、Y5012はわずかにより活性である。より高分子量のPEGは、この活性をそれ以上増加させなかった。試験した全EPEG製剤は、40kの分枝状−PEGを用いて修飾したPEG−EPO(X6012)を除いて、天然型EPOより高い活性を示した。天然型EPOに比較して活性において観察された増加はSC−PEGもしくはNHS−PEGの使用とは無関係で、12kDaもしくは20kDa PEGの使用とは無関係で、もしくは直鎖状または分枝状PEGの使用とは無関係であった。
L33 EPEG(即ち、活性化PEGとしての直鎖状SC−PEG−12K)は、実施例6によって調製し、タンパク質濃度を実施例3に記載したように定量した。EPEG製剤は、実施例7および8によるラットモデルによってインビボ活性を評価した。ヘマトクリットレベルは、0、2、5、7、10および14日後に評価した。対照のための天然型EPOは、バキュロウイルス発現系において生成されたヒト組換えEPO(rhu−EPO)であった(当分野において一般に公知であるように、Rhu−EPOはオリジナルのヒトEPOと同一アミノ酸配列を有するが、グリコシル化パターンは相違する)。EPEGもしくはrhu EPOはラットへ動物1匹(各々およそ250g)当たり2.5もしくは5μg用量で、単回注射で投与した。
DMSOを含む反応緩衝液を用いる実施例1によって調製したEPEG製剤の連続投与の作用を、実施例7および8のラットモデルによってインビボ活性をアッセイした。
Claims (13)
- 複数のエリスロポエチン(EPO)接合体分子であって、前記EPOは天然型EPOおよびrhuEPOからなる群から選択され、前記EPO分子の各々が、少なくとも1つのポリエチレングリコール(PEG)分子と共有結合しており、前記共有結合の50%超が前記EPOタンパク質のN末端のα‐アミノ基でのカルバメート結合を介し、50%未満の共有結合は、前記EPOタンパク質のリシン116、リシン52、もしくはリシン154で又はこれらの組合せでの結合である、複数のEPO接合体分子。
- 前記EPOタンパク質が、1つ又は2つのPEG分子と共有結合している、請求項1記載の複数のEPO接合体分子。
- 前記PEG分子がSC‐PEGである、請求項1又は2記載の複数のEPO分子接合体分子。
- (a)複数のエリスロポエチン(EPO)接合体分子であって、前記EPOは天然型EPOおよびrhuEPOからなる群から選択され、前記EPO分子の各々が、少なくとも1つのポリエチレングリコール(PEG)分子と共有結合しており、前記共有結合の50%超が、前記EPOタンパク質のN末端のα-アミノ基でのカルバメート結合を介し、50%未満の共有結合は、前記EPOタンパク質のリシン116、リシン52、もしくはリシン154で又はこれらの組合せでの結合である、複数のEPO接合体分子と、
(b)薬学的に許容される担体
とを含む、医薬組成物。 - 前記EPOタンパク質が、1つ又は2つのPEG分子と共有結合している、請求項4記載の医薬組成物。
- 前記PEG分子がSC‐PEGである、請求項4又は5記載の医薬組成物。
- 前記PEG分子が、10kD〜40kDの分子量を有し、かつ直鎖状または分枝鎖状のいずれかである、請求項4〜6のいずれか1項記載の医薬組成物。
- 前記薬学的に許容される担体がタンパク質を含まない、請求項4〜7のいずれか1項記載の医薬組成物。
- (a)複数のエリスロポエチン(EPO)接合体分子であって、前記EPOは天然型EPOおよびrhuEPOからなる群から選択され、それぞれのEPO分子が少なくとも1つのポリエチレングリコール(PEG)分子と共有結合しており、前記共有結合の50%超が、前記EPOタンパク質のN末端のα-アミノ基でのカルバメート結合を介し、50%未満の共有結合は、前記EPOタンパク質のリシン116、リシン52、もしくはリシン154で又はこれらの組合せでの結合である、複数のEPO接合体分子と、
(b)薬学的に許容される担体
とを含む治療有効量の組成物の、赤血球欠乏の治療を必要とする患者用の薬剤の調製における使用。 - 前記EPOタンパク質が、1つ又は2つのPEG分子と共有結合している、請求項9記載の使用。
- 前記薬学的に許容される担体がタンパク質を含まない、請求項9又は10に記載の使用。
- (a)複数のエリスロポエチン(EPO)接合体分子であって、前記EPOは天然型EPOおよびrhuEPOからなる群から選択され、それぞれのEPO分子が少なくとも1つのポリエチレングリコール(PEG)分子と共有結合しており、前記共有結合の50%超が、前記EPOタンパク質のN末端のα-アミノ基でのカルバメート結合を介し、50%未満の共有結合は、前記EPOタンパク質のリシン116、リシン52、もしくはリシン154で又はこれらの組合せでの結合である、複数のEPO接合体分子と、
(b)薬学的に許容される担体
とを含む、赤血球欠乏の治療のための医薬組成物。 - 前記共有結合の79%超が、前記EPOタンパク質のN末端のα-アミノ基でのカルバメート結合を介し、21%未満の共有結合は、前記EPOタンパク質のリシン116、リシン52、もしくはリシン154で又はこれらの組合せでの結合である、請求項4又は12記載の医薬組成物。
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