JP5782602B2 - ポリアミン誘導体 - Google Patents
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Description
の化合物を提供する。
n1、n2、n3及びn4は独立して1、2、3又は4であり、
X及びX’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
R1及びR2は独立して、任意で1〜4の二重結合又は三重結合を含有するC8〜C25炭化水素基である。
の化合物を提供する。
n1、n2、n3及びn4は独立して1、2、3又は4であり、
X及びX’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
R1及びR2は独立して、任意で1〜4の二重結合又は三重結合を含有するC8〜C25炭化水素基であり、
G1及びG2は独立して、水素又はポリマー部分である。
の化合物を提供する。
n1、n2、n3及びn4は独立して1、2、3又は4であり、
X及びX’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
R1及びR2は独立して、任意で1〜4の二重結合又は三重結合を含有するC8〜C25炭化水素基であり、
T1及びT2は独立して、水素又はタ−ゲティングリガンドであり、
G1及びG2は独立して、結合又はポリマー部分であり、
T1及びT2の少なくとも一方はタ−ゲティングリガンドである。
の化合物を提供する。
n1、n2、及びn3は独立して1、2、3又は4であり、
X及びX’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
R1及びR2は独立して、任意で1〜4の二重結合又は三重結合を含有するC8〜C25炭化水素基であり、
Gは水素又はポリマー部分である。
の化合物を提供する。
n1、n2、及びn3は独立して1、2、3又は4であり、
X及びX’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
R1及びR2は独立して、任意で1〜4の二重結合又は三重結合を含有するC8〜C25炭化水素基であり、
Tはタ−ゲティングリガンドであり、
Gは結合又はポリマー部分である。
の化合物を提供する。
n1、n2、及びn3は独立して1、2、3又は4であり、
X及びX’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
R1及びR2は独立して、任意で1〜4の二重結合又は三重結合を含有するC8〜C25炭化水素基であり、
RNは、NHR4、NR4R5又はN+R4R5R6を表し、その際、R4、R5及びR6はC1〜C6アルキル基を表す。
の化合物及び薬学上許容可能なその塩を提供する。
n1、n2、n3及びn4は独立して1、2、3又は4であり、
X及びX’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
R1及びR2は独立して、任意で1〜4の二重結合又は三重結合を含有するC8〜C25炭化水素基である。
の化合物を提供する。
n1、n2、n3及びn4は独立して1、2、3又は4であり、
X及びX’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
R1及びR2は独立して、任意で1〜4の二重結合又は三重結合を含有するC8〜C25炭化水素基であり、
G1及びG2は独立して、水素又はポリマー部分である。
である。
は、
アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、複素環及び置換複素環から成る群から選択され、D及びEは、独立して、結合、−O−、CO,−NR3−、−NR3C(O)O−、−OC(O)NR3−、−NR3C(O)−、−C(O)NR3−、−NR3C(O)NR3−、−アルキレン−NR3C(O)O−、−アルキレン−NR3C(O)NR3−、−アルキレン−OC(O)NR3−、−アルキレン−NR3−、−アルキレン−O−、−アルキレン−NR3C(O)−、アルキレン−C(O)NR3−、−NR3C(O)O−アルキレン−、−NR3C(O)NR3−アルキレン−、−OC(O)NR3−アルキレン−、−NR3−アルキレン−、−O−アルキレン−、−NR3C(O)−アルキレン、−NR3C(O)O−アルキレンオキシ−、−NR3C(O)NR3−アルキレンオキシ−、−OC(O)NR3−アルキレンオキシ、−NR3−アルキレンオキシ−、−O−アルキレンオキシ−、−NR3C(O)−アルキレンオキシ−、−C(O)NR3−アルキレンオキシ−、−アルキレンオキシ−NR3C(O)O−アルキレンオキシ−、−C(O)NR3−アルキレン−、−アルキレン−NR3C(O)O−アルキレン−、−アルキレン−NR3C(O)NR3−アルキレン−、−アルキレン−OC(O)NR3−アルキレン−、−アルキレン−NR3−アルキレン−、アルキレン−O−アルキレン−、−アルキレン−NR3C(O)−アルキレン−及び−C(O)NR3−アルキレン−から成る群から選択され、R3は上記で定義されたとおりである。
の化合物を提供する。
n1、n2、n3及びn4は独立して1、2、3又は4であり、
X及びX’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
R1及びR2は独立して、任意で1〜4の二重結合又は三重結合を含有するC8〜C25炭化水素基であり、
T1及びT2は独立して、水素又はタ−ゲティングリガンドであり、
G1及びG2は独立して、結合又はポリマー部分であり、
T1及びT2の少なくとも一方はタ−ゲティングリガンドである。
である。
は、
アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、複素環及び置換複素環から成る群から選択され、D及びEは、独立して、結合、−O−、CO,−NR3−、−NR3C(O)O−、−OC(O)NR3−、−NR3C(O)−、−C(O)NR3−、−NR3C(O)NR3−、−アルキレン−NR3C(O)O−、−アルキレン−NR3C(O)NR3−、−アルキレン−OC(O)NR3−、−アルキレン−NR3−、−アルキレン−O−、−アルキレン−NR3C(O)−、アルキレン−C(O)NR3−、−NR3C(O)O−アルキレン−、−NR3C(O)NR3−アルキレン−、−OC(O)NR3−アルキレン−、−NR3−アルキレン−、−O−アルキレン−、−NR3C(O)−アルキレン、−NR3C(O)O−アルキレンオキシ−、−NR3C(O)NR3−アルキレンオキシ−、−OC(O)NR3−アルキレンオキシ、−NR3−アルキレンオキシ−、−O−アルキレンオキシ−、−NR3C(O)−アルキレンオキシ−、−C(O)NR3−アルキレンオキシ−、−アルキレンオキシ−NR3C(O)O−アルキレンオキシ−、−C(O)NR3−アルキレン−、−アルキレン−NR3C(O)O−アルキレン−、−アルキレン−NR3C(O)NR3−アルキレン−、−アルキレン−OC(O)NR3−アルキレン−、−アルキレン−NR3−アルキレン−、アルキレン−O−アルキレン−、−アルキレン−NR3C(O)−アルキレン−及び−C(O)NR3−アルキレン−から成る群から選択され、R3は上記で定義されたとおりである。
の化合物及び薬学上許容可能なその塩を提供し、式中、
n1、n2、及びn3は独立して1、2、3又は4であり、
X及びX’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
R1及びR2は独立して、任意で1〜4の二重結合又は三重結合を含有するC8〜C25炭化水素基であり、
Gは水素又はポリマー部分である。
である。
は、
アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、複素環及び置換複素環から成る群から選択され、D及びEは、独立して、結合、−O−、CO,−NR3−、−NR3C(O)O−、−OC(O)NR3−、−NR3C(O)−、−C(O)NR3−、−NR3C(O)NR3−、−アルキレン−NR3C(O)O−、−アルキレン−NR3C(O)NR3−、−アルキレン−OC(O)NR3−、−アルキレン−NR3−、−アルキレン−O−、−アルキレン−NR3C(O)−、アルキレン−C(O)NR3−、−NR3C(O)O−アルキレン−、−NR3C(O)NR3−アルキレン−、−OC(O)NR3−アルキレン−、−NR3−アルキレン−、−O−アルキレン−、−NR3C(O)−アルキレン、−NR3C(O)O−アルキレンオキシ−、−NR3C(O)NR3−アルキレンオキシ−、−OC(O)NR3−アルキレンオキシ、−NR3−アルキレンオキシ−、−O−アルキレンオキシ−、−NR3C(O)−アルキレンオキシ−、−C(O)NR3−アルキレンオキシ−、−アルキレンオキシ−NR3C(O)O−アルキレンオキシ−、−C(O)NR3−アルキレン−、−アルキレン−NR3C(O)O−アルキレン−、−アルキレン−NR3C(O)NR3−アルキレン−、−アルキレン−OC(O)NR3−アルキレン−、−アルキレン−NR3−アルキレン−、アルキレン−O−アルキレン−、−アルキレン−NR3C(O)−アルキレン−及び−C(O)NR3−アルキレン−から成る群から選択され、R3は上記で定義されたとおりである。
の化合物を提供する。
n1、n2、及びn3は独立して1、2、3又は4であり、
X及びX’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
R1及びR2は独立して、任意で1〜4の二重結合又は三重結合を含有するC8〜C25炭化水素基であり、
Tはタ−ゲティングリガンドであり、
Gは結合又はポリマー部分である。
である。
は、
アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、複素環及び置換複素環から成る群から選択され、D及びEは、独立して、結合、−O−、CO,−NR3−、−NR3C(O)O−、−OC(O)NR3−、−NR3C(O)−、−C(O)NR3−、−NR3C(O)NR3−、−アルキレン−NR3C(O)O−、−アルキレン−NR3C(O)NR3−、−アルキレン−OC(O)NR3−、−アルキレン−NR3−、−アルキレン−O−、−アルキレン−NR3C(O)−、アルキレン−C(O)NR3−、−NR3C(O)O−アルキレン−、−NR3C(O)NR3−アルキレン−、−OC(O)NR3−アルキレン−、−NR3−アルキレン−、−O−アルキレン−、−NR3C(O)−アルキレン、−NR3C(O)O−アルキレンオキシ−、−NR3C(O)NR3−アルキレンオキシ−、−OC(O)NR3−アルキレンオキシ、−NR3−アルキレンオキシ−、−O−アルキレンオキシ−、−NR3C(O)−アルキレンオキシ−、−C(O)NR3−アルキレンオキシ−、−アルキレンオキシ−NR3C(O)O−アルキレンオキシ−、−C(O)NR3−アルキレン−、−アルキレン−NR3C(O)O−アルキレン−、−アルキレン−NR3C(O)NR3−アルキレン−、−アルキレン−OC(O)NR3−アルキレン−、−アルキレン−NR3−アルキレン−、アルキレン−O−アルキレン−、−アルキレン−NR3C(O)−アルキレン−及び−C(O)NR3−アルキレン−から成る群から選択され、R3は上記で定義されたとおりである。
の化合物を提供する。
n1、n2、及びn3は独立して1、2、3又は4であり、
X及びX’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
R1及びR2は独立して、任意で1〜4の二重結合又は三重結合を含有するC8〜C25炭化水素基であり、
RNは、NHR4、NR4R5又はN+R4R5R6を表し、その際、R4、R5及びR6は独立してC1〜C6アルキル基を表す。
である。
は、
アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、複素環及び置換複素環から成る群から選択され、D及びEは、独立して、結合、−O−、CO,−NR3−、−NR3C(O)O−、−OC(O)NR3−、−NR3C(O)−、−C(O)NR3−、−NR3C(O)NR3−、−アルキレン−NR3C(O)O−、−アルキレン−NR3C(O)NR3−、−アルキレン−OC(O)NR3−、−アルキレン−NR3−、−アルキレン−O−、−アルキレン−NR3C(O)−、アルキレン−C(O)NR3−、−NR3C(O)O−アルキレン−、−NR3C(O)NR3−アルキレン−、−OC(O)NR3−アルキレン−、−NR3−アルキレン−、−O−アルキレン−、−NR3C(O)−アルキレン、−NR3C(O)O−アルキレンオキシ−、−NR3C(O)NR3−アルキレンオキシ−、−OC(O)NR3−アルキレンオキシ、−NR3−アルキレンオキシ−、−O−アルキレンオキシ−、−NR3C(O)−アルキレンオキシ−、−C(O)NR3−アルキレンオキシ−、−アルキレンオキシ−NR3C(O)O−アルキレンオキシ−、−C(O)NR3−アルキレン−、−アルキレン−NR3C(O)O−アルキレン−、−アルキレン−NR3C(O)NR3−アルキレン−、−アルキレン−OC(O)NR3−アルキレン−、−アルキレン−NR3−アルキレン−、アルキレン−O−アルキレン−、−アルキレン−NR3C(O)−アルキレン−及び−C(O)NR3−アルキレン−から成る群から選択され、R3は上記で定義されたとおりである。
(a)約3000Daの分子量を有するポリオキシエチレン基であってもよく;
(b)3つのアミドリンカー(−C(O)NH−)によって互いに共有結合した4つのポリオキシエチレンから成ってもよく、各ポリオキシエチレン基はポリマー部分が約3000Daの分子量を有するように約750Daの分子量を有する;又は
(c)4つのアミドリンカー(−C(O)NH−)によって互いに共有結合した5つのポリオキシエチレンから成ってもよく、5つのポリオキシエチレン基は、それぞれ、約500、1000、250、1000、及び250Daの分子量を有する。
式中、pp及びアルキレンは本明細書で定義されるとおりであり、Rbbは好ましくは、アルキル及び置換アルキルから成る群から選択される。
定義
である。
は、
アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、複素環及び置換複素環から成る群から選択され、D及びEは、独立して、結合、−O−、CO,−NR3−、−NR3C(O)O−、−OC(O)NR3−、−NR3C(O)−、−C(O)NR3−、−NR3C(O)NR3−、−アルキレン−NR3C(O)O−、−アルキレン−NR3C(O)NR3−、−アルキレン−OC(O)NR3−、−アルキレン−NR3−、−アルキレン−O−、−アルキレン−NR3C(O)−、アルキレン−C(O)NR3−、−NR3C(O)O−アルキレン−、−NR3C(O)NR3−アルキレン−、−OC(O)NR3−アルキレン−、−NR3−アルキレン−、−O−アルキレン−、−NR3C(O)−アルキレン、−NR3C(O)O−アルキレンオキシ−、−NR3C(O)NR3−アルキレンオキシ−、−OC(O)NR3−アルキレンオキシ、−NR3−アルキレンオキシ−、−O−アルキレンオキシ−、−NR3C(O)−アルキレンオキシ−、−C(O)NR3−アルキレンオキシ−、−アルキレンオキシ−NR3C(O)O−アルキレンオキシ−、−C(O)NR3−アルキレン−、−アルキレン−NR3C(O)O−アルキレン−、−アルキレン−NR3C(O)NR3−アルキレン−、−アルキレン−OC(O)NR3−アルキレン−、−アルキレン−NR3−アルキレン−、アルキレン−O−アルキレン−、−アルキレン−NR3C(O)−アルキレン−及び−C(O)NR3−アルキレン−から成る群から選択され、R3は上記で定義されたとおりである。
医薬組成物
一般的な手順
本発明の化合物の調製を以下の実施例によってさらに説明するが、それは、そこで記載される特定の手順及び化合物に、範囲又は精神において本発明を限定するとは解釈されるべきではない。本発明の化合物を合成する代表的な方法を以下に提示する。所望の標的化合物に必要とされる置換基の性質が合成の好ましい方法を決定することが理解される。
N.N’−ジオレオイルテトラキス(アミノメチル)メタン(「ジオレオイルクロスアミン」)の合成
既知の手順(Adil, K. et al., Solid State Sciences, 6 (2004), 1229-1235)によってテトラキス(アミノメチル)メタンを調製する。50mLのフラスコに還流コンデンサと磁気撹拌器を装備する。四塩化テトラキス(アミノメチル)メタン(800mg、2.88ミリモル)とメタノール(10mL)とNaOMe/MeOH溶液(5.457Mを2.10g、11.50ミリモル)をフラスコに充填する。混合物を撹拌し、4時間還流し、次いで冷却する。無機塩からメタノール溶液を静かに捨て、塩を無水エタノールに再懸濁する。懸濁液を遠心し、合わせた有機物を真空で濃縮する。残留物を塩化メチレン(15mL)に溶解し、残りの無機塩からシリンジ(0.45ミクロンのフィルター)を用いて濾過する。濾液の濃縮によって白色の半固形物質として定量的収率にて遊離のテトラキス(アミノメチル)メタンを得る(残りのアルコールはNMRによって概算する)。NMR(D2O)δ2.9(s、CH2)。
2.1.葉酸−PEG3400−COOH
170mgのH2N−PEG3400−COOH(Laysanにより製造された)をDMSO(2mL)と無水クロロホルム(2mL)に溶解する。ヒューニッヒの塩基(15μL)を加え、その後葉酸−NHSエステル(60mg、既知の手順、Lee, R. J.; Low, P. S.; “Methods in Molecular Medicine”, 25, 69-76, April 2000によって調製された)を加えた。さらなる80mgの葉酸−NHSをDMSOの溶液(2.5mL)として加える。撹拌した混合物を室温で24時間保持し;真空でクロロホルムを取り除き、残留物を脱イオン水(60mL)で希釈する。3500Dカットオフ膜を用いて、数滴のTFAでpH2〜3にした脱イオン水に対して、得られた均質な黄色の溶液を透析する。透析槽を6回交換した後、黄色の溶液を回収し、真空で濃縮して葉酸−PEG3400−COOHを得る。
150mgの葉酸−PEG3400−COOHを無水DMSO(2mL)に溶解し、NHS(9mg)を加え、次いでDCC(16mg)を加える。混合物を暗所にて20時間反応させ、葉酸−PEG3400−COONHSを得る。この溶液に、無水DMSO(2mL)中30mgのN,N’−ジオレオイルテトラキス(アミノメチル)メタンを加える。反応混合物を24時間反応させた後、脱イオン水(60mL)でそれを希釈する。3500Dのカットオフバッグを用いて脱イオン水に対して、得られた均質の黄色の溶液を透析することによって、未反応の葉酸−PEG3400−COOHとの約50%の混合物として葉酸ペグ化N,N’−ジオレオイルテトラキス(アミノメチル)メタン(「葉酸−PEG−ジオレオイルクロスアミン」)を得る。
N,N’−ジオレオイルトリス(アミノエチル)アミン(「ジオレオイルモノアミン」)(6)の合成
塩化オレオイル(75g、250ミリモル)を、2,2,2−トリフルオロエタノール(60g、600ミリモル)と共に還流にて16時間加熱した。HClの放出が止まった後、真空で過剰のトリフルオロエタノールを除く。残留物の真空蒸留によって、無色の液体として87.6gのオレイン酸2,2,2−トリフルオロエチル、沸点150℃/0.3を得る。
メチル−ジオレオイルモノアミン(6.1)の調製
過剰のヨードメタンによるN,N’−ジオレオイルトリス(アミノエチル)アミン(「ジオレオイルモノアミン」)のメチル化によって表題の化合物を調製する。
N,N’−ジオレオイルN”−アセチルサリチロイルトリス(アミノエチル)アミン(7)の合成
トリフルオロ酢酸N,N’−ジオレオイルトリス(アミノエチル)アミン(80mg、100マイクロモル)を5mLのクロロホルムに溶解し、3mLの10%K2CO3水溶液で処理する。有機相を分離し、乾燥させ、真空にて濃縮して遊離の塩基としてN,N’−ジオレオイルトリス(アミノエチル)アミンを得る。この物質を3mLの無水クロロホルムに溶解し、溶液を塩化アセチルサリチロイル(20mg、100マイクロモル)で処理することによって表題の化合物を得る。
「葉酸−PEG−ジオレオイルモノアミン」(8)を得るための葉酸−PEG3400−COOHとのカップリング
実施例2に記載されたように、葉酸−PEG3400−COOHとジオレオイルモノアミンから葉酸−ジオレオイルモノアミンが原則的に得られる。
siRNAとのジオレオイルクロスアミンの複合体;ナノ粒子の形成
使用するsiRNAは、内因性の血管内皮増殖因子(VEGF)の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質はジオレオイルクロスアミンである。siRNA(3mg/mL)とジオレオイルクロスアミン(5mg/mL)の溶液を注射用水にて別々に調製し、その後、siRNAについては0.3mg/mLに、ジオレオイルクロスアミンについては1.5mg/mLに5%デキストロースで希釈する。マイクロピペットを用いてsiRNAのデキストロース溶液をジオレオイルクロスアミンのデキストロース溶液に加え、5:1(正:負)の電荷比とする。製剤を室温にて15分間インキュベートして複合体を形成させる。
DNAとのジオレオイルクロスアミンの複合体;ナノ粒子の形成
使用する核酸は、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドDNAである。使用するカチオン性脂質はジオレオイルクロスアミンである。プラスミドDNA(3mg/mL)とジオレオイルクロスアミン(5mg/mL)の溶液を注射用水にて別々に調製し、その後、プラスミドDNAについては0.3mg/mLに、ジオレオイルクロスアミンについては1.5mg/mLに5%デキストロースで希釈する。マイクロピペットを用いてプラスミドDNAのデキストロース溶液をジオレオイルクロスアミンのデキストロース溶液に加え、5:1(正:負)の電荷比とする。製剤を室温にて15分間インキュベートして複合体を形成させる。
siRNAとの葉酸−PEG−ジオレオイルクロスアミンの複合体
使用するsiRNAは、内因性の血管内皮増殖因子(VEGF)の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、様々なモル比(1:1)、(2:1)、(4:1)又は(10:1)にて、葉酸リガンドに抱合させた又は葉酸化ジオレオイルクロスアミンと同時製剤化したジオレオイルクロスアミンである。補助製剤化剤をジオレオイルクロスアミンのクロロホルム溶液に加え、実施例9に記載されるようにリポソームの調製を行う。siRNA(3mg/mL)と葉酸−PEG−ジオレオイルクロスアミン(5mg/mL)の溶液を注射用水にて別々に調製し、その後、siRNAについては0.3mg/mLに、葉酸−PEG−ジオレオイルクロスアミンについては1.9mg/mLに5%デキストロースで希釈する。マイクロピペットを用いてsiRNAのデキストロース溶液を葉酸−PEG−ジオレオイルクロスアミンのデキストロース溶液に加え、5:1(正:負)の電荷比とする。製剤を室温にて15分間インキュベートして複合体を形成させる。
siRNAとのジオレオイルモノアミンの複合体;ナノ粒子の形成
使用するsiRNAは、内因性の血管内皮増殖因子(VEGF)の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質はジオレオイルモノアミンである。siRNA(3mg/mL)とジオレオイルモノアミン(5mg/mL)の溶液を注射用水にて別々に調製し、その後、siRNAについては0.3mg/mLに、ジオレオイルモノアミンについては1.5mg/mLに5%デキストロースで希釈する。マイクロピペットを用いてsiRNAのデキストロース溶液をジオレオイルモノアミンのデキストロース溶液に加え、5:1(正:負)の電荷比とする。製剤を室温にて15分間インキュベートして複合体を形成させる。
DNAとのジオレオイルモノアミンの複合体;ナノ粒子の形成
使用する核酸は、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドDNAであり、使用するカチオン性脂質はジオレオイルモノアミンである。プラスミドDNA(3mg/mL)とジオレオイルモノアミン(5mg/mL)の溶液を注射用水にて別々に調製し、その後、プラスミドDNAについては0.3mg/mLに、ジオレオイルモノアミンについては1.5mg/mLに5%デキストロースで希釈する。マイクロピペットを用いてプラスミドDNAのデキストロース溶液をジオレオイルモノアミンのデキストロース溶液に加え、5:1(正:負)の電荷比とする。製剤を室温にて15分間インキュベートして複合体を形成させる。
ジオレオイルクロスアミンによって被包したsiRNAの調製
この実施例は、ジオレオイルクロスアミンを用いたsiRNAのリポソームへの被包を説明する。使用するsiRNAは、内因性の血管内皮増殖因子(VEGF)の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質はジオレオイルクロスアミンである。被包リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの側面上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を先ず100%エタノールに溶解し、次いで50%にする。水に溶解したsiRNAをリポソーム/エタノールの溶液に加える。回転蒸発方式によってリポソーム/siRNAの混合物からエタノールを蒸発させる。等量の10%デキストロースを被包siRNA粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を5%デキストロースに懸濁する。
葉酸−PEG−ジオレオイルクロスアミンによって被包したsiRNAの調製
この実施例は、葉酸−PEG−ジオレオイルクロスアミンを用いたsiRNAのリポソームへの被包を説明する。使用するsiRNAは、内因性の血管内皮増殖因子(VEGF)の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は葉酸−PEG−ジオレオイルクロスアミンである。被包リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの側面上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を先ず100%エタノールに溶解し、次いで50%にする。水に溶解したsiRNAをリポソーム/エタノールの溶液に加える。回転蒸発方式によってリポソーム/siRNAの混合物からエタノールを蒸発させる。等量の10%デキストロースを被包siRNA粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を5%デキストロースに懸濁する。
補助製剤化剤を伴ったジオレオイルモノアミンによるsiRNA形質移入複合体の調製
使用するsiRNAは、内因性の血管内皮増殖因子(VEGF)の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。ジオレオイルモノアミンは、(4:1)のモル比でほかの脂質と共に製剤化する。使用する脂質は、1,2−ジオレオイルsn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2−ステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−550]、1,2−ジオレオイルsn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−ラクトシル、及びコレステロールである。補助製剤化剤をクロロホルム中のジオレオイルモノアミンに加える。実施例9に以前記載したようにリポソームを調製する。siRNA(3mg/mL)とジオレオイルモノアミン(5mg/mL)の溶液を注射用水にて別々に調製し、その後、0.3mg/mLのsiRNAと、1.9mg/mLのジオレオイルモノアミンに5%デキストロースで希釈する。マイクロピペットを用いてsiRNAのデキストロース溶液をジオレオイルモノアミンのデキストロース溶液に加え、5:1(正:負)の電荷比とする。製剤を室温にて15分間インキュベートして複合体を形成させる。
ジオレオイルモノアミンによるDNA形質移入複合体の調製
使用する核酸は、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドDNAであり、ジオレオイルモノアミンが脂質である。プラスミドDNA(3mg/mL)とジオレオイルモノアミン(5mg/mL)の溶液を注射用水にて別々に調製し、その後、プラスミドDNAについては0.3mg/mLに、ジオレオイルモノアミンについては1.9mg/mLに5%デキストロースで希釈する。マイクロピペットを用いてプラスミドDNAのデキストロース溶液をジオレオイルモノアミンのデキストロース溶液に加え、5:1(正:負)の電荷比とする。製剤を室温にて15分間インキュベートして複合体を形成させる。
補助製剤化剤を伴ったジオレオイルモノアミンによるDNA形質移入複合体の調製
使用する核酸は、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドDNAであり、使用するカチオン性脂質はジオレオイルモノアミンである。この実施例で使用されるカチオン性脂質は、(4:1)のモル比でほかの脂質と製剤化されたジオレオイルモノアミンである。使用する脂質は、1,2−ジオレオイルsn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2−ステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−550]、1,2−ジオレオイルsn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−ラクトシル、及びコレステロールである。補助製剤化剤をクロロホルム中のジオレオイルモノアミンに加える。実施例9に以前記載したようにリポソームを調製する。DNA(3mg/mL)とジオレオイルモノアミン補助製剤化剤(5mg/mL)の溶液を注射用水にて別々に調製し、その後、0.3mg/mLのDNAと、1.9mg/mLのジオレオイルモノアミンに5%デキストロースで希釈する。マイクロピペットを用いてDNAのデキストロース溶液をジオレオイルモノアミンのデキストロース溶液に加え、5:1(正:負)の電荷比とする。製剤を室温にて15分間インキュベートして複合体を形成させる。
葉酸−PEG−ジオレオイルモノアミンによって同時製剤化されたジオレオイルモノアミンによるsiRNA形質移入複合体の調製
使用するsiRNAは、内因性の血管内皮増殖因子(VEGF)の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、様々なモル比(1:1)、(2:1)、(4:1)又は(10:1)にて、葉酸−PEG−ジオレオイルモノアミンと同時製剤化したジオレオイルモノアミンである。補助製剤化剤をジオレオイルモノアミンのクロロホルム溶液に加える。実施例9に以前記載されたようにリポソームの調製を行う。siRNA(3mg/mL)とジオレオイルモノアミン/葉酸−PEG−ジオレオイルモノアミン(5mg/mL)の溶液を注射用水にて別々に調製し、その後、0.3mg/mLのsiRNAと、1.9mg/mLのジオレオイルモノアミンに5%デキストロースで希釈する。マイクロピペットを用いてsiRNAのデキストロース溶液をジオレオイルモノアミンのデキストロース溶液に加え、5:1(正:負)の電荷比とする。製剤を室温にて15分間インキュベートして複合体を形成させる。
ジオレオイルモノアミンのリポソームによって被包したsiRNAの調製
使用するsiRNAは、内因性の血管内皮増殖因子(VEGF)の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、ジオレオイルモノアミンである。被包リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの側面上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を先ず100%エタノールに溶解し、次いで50%にする。水に溶解したsiRNAをリポソーム/エタノールの溶液に加える。回転蒸発方式によってリポソーム/siRNAの混合物からエタノールを蒸発させる。等量の10%デキストロースを被包siRNA粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を5%デキストロースに懸濁する。
葉酸−PEG−ジオレオイルモノアミンのリポソームによって被包したsiRNAの調製
使用するsiRNAは、内因性の血管内皮増殖因子(VEGF)の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、葉酸−PEG−ジオレオイルモノアミンである。被包リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの側面上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を先ず100%エタノールに溶解し、次いで50%にする。水に溶解したsiRNAをリポソーム/エタノールの溶液に加える。回転蒸発方式によってリポソーム/siRNAの混合物からエタノールを蒸発させる。等量の10%デキストロースを被包siRNA粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を5%デキストロースに懸濁する。
siRNAとジオレオイルクロスアミンの複合体の形質移入活性
siRNAとジオレオイルクロスアミンの複合体の形質移入活性を以下のように試験管内で測定する。mVEGF又はルシフェラーゼのsiRNA構築物を含有する形質移入複合体を実施例9に記載された方法によって調製する。SCCVII細胞(0.5×105個の細胞/ウェル;マウス扁平上皮癌)を10%ウシ胎児血清(FBS)にて24穴組織培養プレートに播く。総容積250μLのダルベッコ改変イーグル最小必須培地(DMEM)にてFBSの非存在下又は存在下において0.5μgのsiRNAと共に各ウェルを6時間インキュベートする。その培地にFBSを欠く細胞についてインキュベート時間が終了すると、20%のFBSを補完した250μLのDMEMを形質移入した細胞に加え、さらに40時間インキュベートする。その形質移入培地にFBSを伴った細胞には、10%のFBSを補完した250μLのDMEMを形質移入した細胞に加え、さらに40時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、細胞培養培地(タンパク質)又は細胞溶解物(転写物)においてmVEGFのタンパク質及び転写物のノックダウンを評価する。mVEGFのタンパク質レベルの測定については、mVEGFのELISAアッセイによって細胞培養培地を直接分析する。mVEGFの転写物の解析については、トリス試薬を用いて細胞を溶解し、次いでqRT−PCR検出キットを用いてmVEGF転写物のレベルを定量する。
ジオレオイルクロスアミンによって被包されたsiRNAの形質移入活性
この実施例は、ジオレオイルモノアミン、ジオレオイルクロスアミン、又は両方のカチオン剤の混合物を用いたsiRNAのリポソーム被包を説明する。使用するsiRNAは、内因性の血管内皮増殖因子(VEGF)の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、ジオレオイルモノアミン(実施例3)、ジオレオイルクロスアミン(実施例1)、又は両方の混合物である。被包リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの側面上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を先ず100%エタノールに溶解し、次いで50%にする。水に溶解したsiRNAをリポソーム/エタノールの溶液に加える。回転蒸発方式によってリポソーム/siRNAの混合物からエタノールを蒸発させる。等量の10%デキストロースを被包siRNA粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を5%デキストロースに懸濁する。SCCVII細胞(0.5×105個の細胞/ウェル)を10%FBSにて24穴組織培養プレートに播く。総容積250μLDMEMにてFBSの非存在下又は存在下において0.5μgの複合体化siRNAと共に各ウェルを6時間インキュベートする。その培地にFBSを欠く細胞についてインキュベート時間が終了すると、20%のFBSを補完した250μLのDMEMを形質移入した細胞に加え、さらに40時間インキュベートする。その形質移入培地にFBSを伴った細胞には、10%のFBSを補完した250μLのDMEMを形質移入した細胞に加え、さらに40時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、細胞培養培地(タンパク質)又は細胞溶解物(転写物)においてmVEGFのタンパク質及び転写物のノックダウンを評価する。mVEGFのタンパク質レベルの測定については、mVEGFのELISAアッセイによって細胞培養培地を直接分析する。mVEGFの転写物の解析については、トリス試薬を用いて細胞を溶解し、次いでqRT−PCR検出キットを用いてmVEGF転写物のレベルを定量する。
葉酸−PEG−ジオレオイルクロスアミンによって被包されたsiRNAの形質移入活性
この実施例は、葉酸−PEG−ジオレオイルモノアミン、葉酸−PEG−ジオレオイルクロスアミン、又は両方のカチオン剤の混合物を用いたsiRNAのリポソーム被包を説明する。使用するsiRNAは、内因性の血管内皮増殖因子(VEGF)の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、葉酸−PEG−ジオレオイルモノアミン(実施例5)、葉酸−PEG−ジオレオイルクロスアミン(実施例2)、又は両方の混合物である。被包リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの側面上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を先ず100%エタノールに溶解し、次いで50%にする。水に溶解したsiRNAをリポソーム/エタノールの溶液に加える。回転蒸発方式によってリポソーム/siRNAの混合物からエタノールを蒸発させる。等量の10%デキストロースを被包siRNA粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を5%デキストロースに懸濁する。SCCVII細胞(0.5×105個の細胞/ウェル)を10%FBSにて24穴組織培養プレートに播く。総容積250μLDMEMにてFBSの非存在下又は存在下において0.5μgの複合体化siRNAと共に各ウェルを6時間インキュベートする。その培地にFBSを欠く細胞についてインキュベート時間が終了すると、20%のFBSを補完した250μLのDMEMを形質移入した細胞に加え、さらに40時間インキュベートする。その形質移入培地にFBSを伴った細胞には、10%のFBSを補完した250μLのDMEMを形質移入した細胞に加え、さらに40時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、細胞培養培地(タンパク質)又は細胞溶解物(転写物)においてmVEGFのタンパク質及び転写物のノックダウンを評価する。mVEGFのタンパク質レベルの測定については、mVEGFのELISAアッセイによって細胞培養培地を直接分析する。mVEGFの転写物の解析については、トリス試薬を用いて細胞を溶解し、次いでqRT−PCR検出キットを用いてmVEGF転写物のレベルを定量する。
ジオレオイルモノアミン複合体化siRNAの膣内投与に続く子宮VEGFタンパク質のノックダウン
siRNA投与の2日前に、プロゲステロン(ゴマ油に溶解した0.5mg)を皮下投与で2日間、メスICRマウス(17〜22グラム)に与えて動物における発情周期を正常化した。次いでVEGF転写物を標的とする製剤化siRNA又は非標的型の対照siRNAをマウスに膣内投与する。siRNAは、5:1のN:P電荷比にてジオレオイルモノアミンと複合体化する。最終容量30μLにて総量9μgのsiRNA(0.3mg/mL)を投与する。投与後48時間で動物を安楽死させ、膣/頚部と子宮(子宮角を含む)を回収し、ほかの組織から切り離し、液体N2に保存する。プロゲステロン処理に一致する肉眼所見を持った動物の組織のみを解析に使用する。溶解緩衝液で組織をホモジネートし、ELISAによってVEGFタンパク質の判定を行う。
クロスアミンsiRNAの投与後の、腹腔に播種された悪性腫瘍を持つ動物における腹水と腹腔内腫瘍結節での増殖因子のタンパク質及び転写物のノックダウン
疾患の進行に関係しているVEGFのレベルを低下させる尽力において、播種された卵巣癌を持つ動物にsiRNAとジオレオイルクロスアミンを含有する製剤を投与する。播種性卵巣癌を誘導するために、2.5×106個のID8(マウス卵巣癌)細胞をIPでメスC57BL/6マウスに埋め込む。腫瘍の埋め込み後所定の日に、5:1のN:Pの比でジオレオイルクロスアミンと共に製剤化されたsiVEGFを200μgマウスに注射する。処理後24時間で開始して、動物を安楽死させ、腹腔から腫瘍と腹水を回収し、VEGFのタンパク質と転写物のレベルについて解析する。腹水転写物の解析については、試料を先ず、赤血球溶解プロトコールに供し、RNA単離の前に有核細胞について濃縮する。
葉酸−PEG−ジオレオイルクロスアミンを用いた腫瘍標的化siRNA
SCCVII腫瘍の担癌マウスに葉酸−PEG−ジオレオイルクロスアミンによって製剤化したVEGFのsiRNAを静脈内で又は腹腔内で送達する。投与後、特定の時間に腫瘍を回収し、転写物及び標的転写物のタンパク質レベルを判定する。
ペプチド改変のジオレオイルクロスアミンを用いたsiRNAの全身性の取り込みの向上
保存されたArg−Gly−Aspモチーフを有するペプチドの付加によって標的インテグリン受容体に機能的に改変をもたらしたジオレオイルクロスアミンによってsiRNAを製剤化する。担癌マウスに複合体を静脈内で又は腹腔内で送達する。投与後、特定の時間に、種々の組織を回収し、標的とされた転写物/タンパク質の転写物及びタンパク質の定量を行う。
ジオレオイルモノアミン送達剤によって複合体化されたsiRNAの試験管内形質移入に続くタンパク質のノックダウン
siRNAとジオレオイルモノアミン送達剤との共役複合体の形質移入活性を試験管内で測定する。実施例9に以前記載された方法によって、simVEGFのsiRNAの構築物を含有する形質移入複合体を調製する。SCCVII細胞(0.5×105個の細胞/ウェル)を10%FBSにて24穴組織培養プレートに播く。総容積250μLDMEMにて0.5μgの複合体化siRNAと共に各ウェルを6時間インキュベートする。インキュベート時間が終了すると、20%のFBSを補完した250μLのDMEMを形質移入した細胞に加え、さらに40時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、上清のmVEGFのタンパク質の定量を行う。結果は、VEGFタンパク質の有意な(約95%)ノックダウンを示す(図1)。
ジオレオイルモノアミンとメチル−ジオレオイルモノアミンの送達剤によって複合体化されたsiRNAの試験管内形質移入に続くタンパク質のノックダウン
ジオレオイルモノアミン(実施例3)とメチル−ジオレオイルモノアミン(実施例3A)の送達剤とのsiRNAの複合体の形質移入活性を試験管内で測定する。実施例9に以前記載された方法によって、simVEGFのsiRNAの構築物を含有する形質移入複合体を調製する。SCCVII細胞(0.5×105個の細胞/ウェル)を10%FBSにて24穴組織培養プレートに播く。総容積250μLDMEMにて0.5μgの複合体化siRNAと共に各ウェルを6時間インキュベートする。インキュベート時間が終了すると、20%のFBSを補完した250μLのDMEMを形質移入した細胞に加え、さらに40時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、上清のmVEGFのタンパク質の定量を上述のように行う。結果は、VEGFタンパク質の有意な(約95%)ノックダウンを示す(図2)。
葉酸−PEG−ジオレオイルモノアミンによって複合体化されたsiRNAの試験管内形質移入に続くタンパク質及び転写物のノックダウン
siRNAと葉酸−PEG−ジオレオイルモノアミンの共役複合体の形質移入活性を試験管内で測定する。以前記載された方法によって、simVEGFのsiRNAの構築物を含有する形質移入複合体を調製する。SCCVII細胞(0.5×105個の細胞/ウェル)を10%FBSにて24穴組織培養プレートに播く。総容積250μLDMEMにて種々の濃度での葉酸基質の非存在下又は存在下で、0.5μgの複合体化siRNAと共に各ウェルを6時間インキュベートする。インキュベート時間が終了すると、20%のFBSを補完した250μLのDMEMを形質移入した細胞に加え、さらに40時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、mVEGFタンパク質及びmVEGF転写物をそれぞれ、細胞培養培地及び細胞溶解物から測定する。mVEGFのタンパク質レベルの測定については、mVEGFのELISAアッセイによって細胞培養培地を直接測定する。mVEGFの転写物の解析については、トリス試薬を用いて細胞を溶解し、次いでqRT−PCR検出キットを用いてmVEGF転写物のレベルを定量する。非サイレンシング対照のsiRNAで形質移入した細胞に比べて生じるVEGFタンパク質及び転写物のノックダウンの比率を計算する。
ジオレオイルモノアミン送達剤によって複合体化されたsiRNAの投与に続く肺及び肝臓におけるカベオリン−1転写物のノックダウン
カベオリン−1(Cav−1)転写物を標的とする製剤化siRNA又は非標的性のsiRNA対照をメスICRマウス(17〜22グラム)に静脈内注射する。siRNAは、10:1の比でジオレオイルモノアミン送達剤と複合体化させる。合計100μgのsiRNAを最終容量200μL(0.5mg/mL)で注射する。注射後48時間で動物を安楽死させ、qRT−PCRを用いたCav−1転写物の解析のために肺及び肝臓を回収する。内部対照としてのβ−アクチンに対して転写物レベルを標準化する。結果(図3)は、肺(76%ノックダウン)及び肝臓(62%ノックダウン)の双方で標的特異的なCav−1転写物レベルで有意な低下を示す。各群についてn=5。
マウスにおける皮下腫瘍に注射されたジオレオイルモノアミン製剤化siRNAに続く腫瘍阻害を生じるVEGF転写物のノックダウン
この実施例では、5×105個の扁平上皮癌細胞を注射することによりC3Hマウスの後脇腹に腫瘍を埋め込んだ。腫瘍は、それが約40mm3に達するまで増殖することができた。次いで、5:1のN:P比にてジオレオイルモノアミンによって製剤化された市販のVEGFを標的とするsiRNA又は同様に製剤化された非サイレンシング対照のsiRNAを腫瘍に注入した。siRNAの最終濃度は0.3mg/mLだった。合計30μLの製剤化されたsiRNA溶液を腫瘍に注入し、注入は3〜4日ごとに合計6回繰り返した。2回目の製剤化siRNAの注入後48時間に転写物の解析のために一部の動物から腫瘍を回収した。この試験の結果(図4)は、VEGFのsiRNAの投与が非サイレンシング対照群に比べてVEGFの転写で32%の低下を生じたことを示している。最後の腫瘍注入の1週間後では、非サイレンシングsiRNAに比べてVEGFのsiRNA群における腫瘍容積で31%の低下があり、無処理の対照動物に比べて57%の低下があった。VEGFのsiRNA処理はさらに、非サイレンシング対照(siNON)群又は無処理群に比べて動物の生存率中央値で13%の改善を生じた。
濾過により濃縮された、ジオレオイルモノアミンとのsiRNA形質移入複合体の調製
使用するsiRNAは、内因性の血管内皮増殖因子(VEGF)の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。カチオン性脂質のリポソームは実施例9で以前記載されたように調製する。siRNA(20mg/mL)とジオレオイルモノアミン(6.4mg/mL)の溶液を注射用水にて別々に調製する。25μLのsiRNAを500μLのジオレオイルモノアミン溶液と混合する。その後、5%デキストロースで複合体を0.03mg/mLのsiRNAに希釈する。希釈した複合体を25〜50kDaの遠心フィルターユニットに移し、数分間遠心して残余分で所望のsiRNA濃度に達する。
濾過により濃縮された、ジオレオイルクロスアミンとのsiRNA形質移入複合体の調製
使用するsiRNAは、内因性の血管内皮増殖因子(VEGF)の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。カチオン性脂質のリポソームは実施例9で以前記載されたように調製する。siRNA(20mg/mL)とジオレオイルクロスアミン(5mg/mL)の溶液を注射用水にて別々に調製する。5μLのsiRNAを500μLのジオレオイルクロスアミン溶液と混合する。その後、5%デキストロースで複合体を0.03mg/mLのsiRNAに希釈する。希釈した複合体を25〜50kDaの遠心フィルターユニットに移し、数分間遠心して残余分で所望のsiRNA濃度に達する。
ナノ粒子の粒度及びゼータ電位の測定
実施例6及び9のように、ジオレオイルクロスアミン/siRNA及びジオレオイルモノアミン/siRNAを製剤化し、50mMのNaClで適当な濃度に希釈する。次いで試料をポリスチレン製のキュベットに加え、90プラス/BI−MAS粒子サイザーを用いて粒度及びゼータ電位について測定する。観察された粒度は80〜400nmの間であり、観察されたゼータ電位は+10〜+40mVの間である。
ジ−[2−(オレオイルアミノ)エチル][2−[(メトキシドデカエチレングリコールカルボニルアミノ)エチル]アミン「mPEG−ジオレオイルモノアミン」(9)の調製
メトキシ(ドデカエチレングリコール)(MW550、ポリ分散、約12のエチレングリコール単位を含有する、720mg、1.30ミリモル)を8mLの無水トルエンに溶解する。これに、ホスゲンのトルエン溶液(2M溶液を4mL、8ミリモル)を加える。反応混合物を室温にて3時間撹拌し、次いで室温にて真空で濃縮して、810mg(1.31ミリモル)の粗精製のクロロギ酸メトキシ(ドデカエチレングリコール)を得る。
蛍光タガントを持つモノアミンの調製
塩化スルホローダミンBアシル(Fluka、115mg、0.2ミリモル)を4mLの無水クロロホルムに溶解する。5mLの無水クロロホルム中のジオレオイルモノアミン遊離塩基[140mg、約0.2ミリモル、そのTFA塩のクロロホルム溶液を炭酸カリウムで処理することによって上記のように調製された]のよく撹拌された溶液に、この溶液を加える。混合物を室温にて3時間撹拌し、次いで濃縮し、2000ミクロンの厚層シリカゲル分取プレートを用いた[その後、塩化メチレンにおける3〜15%のメタノールで溶出]クロマトグラフィで精製する。精製によって[ローダミンBスルホニル]ジオレオイルモノアミン(120mg、0.1ミリモルが得られる。
実施例36
Fmocアミノ−ω−プロピオン酸−ウンデカエチレングリコールリンカー(Fmoc−PEG11−COOH)(100mg、0.119ミリモル)とp−ニトロフェノール(18mg、0.129ミリモル)を1mLの塩化メチレンに溶解する。DCC(27mg、0.131モリモル)を1mLの塩化メチレンに溶解し、撹拌しているPEG/p−ニトロフェノール溶液に加える。室温にて反応を3時間進め、その後、0.45μmのシリンジフィルターを用いてDCUを取り除く。炭酸カリウム処理によってジオレオイルモノアミンを遊離の塩基に変換し、塩化メチレンで抽出する。有機相を乾燥させて75mg(0.111ミリモル)の乾燥物質を得、それを0.5mLの塩化メチレンに再溶解する。この溶液をp−ニトロフェノール活性化α−Fmocアミノ−ω−プロピオン酸−ウンデカエチレングリコール酸溶液に加える。室温にて反応を18時間進める。粗精製物質を乾燥させ、1.8mLのジメチルホルムアミドに再溶解し、それに200μLのピペリジンを加える。Fmoc切断を15分間進め、その後、高真空下でジメチルホルムアミドとピペリジンを取り除く。メタノール中80%の塩化メチレン、その後75%の塩化メチレンを含有するシリカゲルカラムでの分離によってα−アミノ−ω−プロピオン酸−ウンデカエチレングリコール−ジ−[2−(オレオイルアミノ)エチル](2−アミノエチル)アミンを単離する。適当な分画を乾燥させ、75mg(0.59ミリモル)の茶色の油性物質を得る。
ジ−[2−(オレオイルアミノ)エチル][2−[ω−プロピオニル−LHRH−オクタエチレングリコールアミノ)エチル]アミン、「LHRH−ジオレオイルモノアミン」(11)の合成
オクタエチレングリコールジプロピオン酸(347mg、0.675ミリモル)を8mLの無水塩化メチレンに溶解する。これに、p−ニトロフェノール(210mg、1.5ミリモル)を加え、次いでジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(313mg、1.52ミリモル)を加える。翌日、反応混合物を沈殿したジシクロヘキシルウレアから濾別し、濾液を濃縮し、シリカにおけるクロマトグラフィ(先ずエーテルによる溶出で未反応のp−ニトロフェノールを除き、次いで4%メタノール/塩化メチレン)によって溶出する)によって表題の化合物を精製する。
ジ−[2−(オレオイルアミノ)エチル][2−(ω−プロピオニル−RGD−オクタエチレングリコールプロピオニルアミノ)エチル]アミン、「RGD−ジオレオイルモノアミン」(12)の合成
オクタエチレングリコールジプロピオン酸(347mg、0.675ミリモル)を8mLの無水塩化メチレンに溶解する。これに、p−ニトロフェノール(210mg、1.5ミリモル)を加え、次いでジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(313mg、1.52ミリモル)を加える。翌日、反応混合物を沈殿したジシクロヘキシルウレアから濾別し、濾液を濃縮し、シリカにおけるクロマトグラフィ(先ずエーテルによる溶出で未反応のp−ニトロフェノールを除き、次いで4%メタノール/塩化メチレン)によって溶出する)によって表題の化合物を精製する。
ジオレオイルモノアミンとmPEG−ジオレオイルモノアミンによって複合体化されたsiRNAの調製
使用するsiRNAは、内因性の血管内皮増殖因子(VEGF)の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、ジオレオイルモノアミン(実施例3)とmPEG−ジオレオイルモノアミン(実施例34)の混合物である。リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの壁上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を所望の濃度にて蒸留水で再水和し、数分間激しく撹拌する。溶液を超音波処理槽に1時間入れ、次いで200nmのシリンジフィルターを介して濾過し、最終的なリポソーム溶液を得る。水に溶解したsiRNAをリポソーム溶液に加える。
ジオレオイルモノアミンとmPEG−ジオレオイルモノアミンによって被包されたsiRNAの調製
この実施例は、mPEG−ジオレオイルモノアミンを用いたsiRNAのリポソーム被包を説明する。使用するsiRNAは、内因性の標的転写物及びタンパク質のレベルのノックダウンを生じるように意図されたヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、ジオレオイルモノアミン(実施例3)とmPEG−ジオレオイルモノアミン(実施例34)の混合物である。被包リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの壁上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を先ず100%エタノールに溶解し、次いで50%にする。水に溶解したsiRNAをリポソーム/エタノールの溶液に加える。回転蒸発方式によってリポソーム/siRNAの混合物からエタノールを蒸発させる。等量の10%デキストロースを被包siRNA粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を5%デキストロースに懸濁する。
siRNAとジオレオイルモノアミン/mPEG−ジオレオイルモノアミンの複合体の形質移入活性
siRNAとジオレオイルモノアミン/mPEG−ジオレオイルモノアミンの複合体の形質移入活性を試験管内で以下のように測定する。使用するsiRNAは、内因性カベオリン−1(Cav−1)の転写物レベルのノックダウンを生じるように意図されたヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、ジオレオイルモノアミン(実施例3)とmPEG−ジオレオイルモノアミン(実施例34)の混合物である。リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの壁上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を所望の濃度にて蒸留水で再水和し、数分間激しく撹拌する。溶液を超音波処理槽に1時間入れ、次いで200nmのシリンジフィルターを介して濾過し、最終的なリポソーム溶液を得る。水に溶解したsiRNAをリポソーム溶液に加える。等量の10%デキストロースを被包siRNA粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を5%デキストロースに懸濁する。SCCVII細胞(0.5×105個の細胞/ウェル)を10%FBSにて24穴組織培養プレートに播く。総容積250μLDMEMにてFBSの非存在下又は存在下において0.5μgの複合体化siRNAと共に各ウェルを6時間インキュベートする。その培地にFBSを欠く細胞についてインキュベート時間が終了すると、20%のFBSを補完した250μLのDMEMを形質移入した細胞に加え、さらに40時間インキュベートする。その形質移入培地にFBSを伴った細胞には、10%のFBSを補完した250μLのDMEMを形質移入した細胞に加え、さらに40時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、Cav−1転写物のノックダウンを細胞溶解物で測定する。Cav−1転写物の解析を行うには、トリス試薬を用いて細胞を溶解し、qRT−PCR検出キットを用いてCav−1転写物のレベルについて定量する。非サイレンシング対照に比べて、Cav−1の転写物は90%まで阻害される。
ジオレオイルモノアミン/mPEG−ジオレオイルモノアミンによって被包されたsiRNAの形質移入活性
ジオレオイルモノアミン/mPEG−ジオレオイルモノアミンによって被包されたsiRNAの形質移入活性を試験管内で以下のように測定する。使用するsiRNAは、内因性カベオリン−1(Cav−1)の転写物レベルのノックダウンを生じるように意図されたヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、ジオレオイルモノアミン(実施例3)とmPEG−ジオレオイルモノアミン(実施例34)の混合物である。被包リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの壁上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を先ず100%エタノールに溶解し、次いで50%にする。水に溶解したsiRNAをリポソーム/エタノールの溶液に加える。回転蒸発方式によってリポソーム/siRNAの混合物からエタノールを蒸発させる。等量の10%デキストロースを被包siRNA粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を5%デキストロースに懸濁する。SCCVII細胞(0.5×105個の細胞/ウェル)を10%FBSにて24穴組織培養プレートに播く。総容積250μLDMEMにてFBSの非存在下又は存在下において0.5μgの複合体化siRNAと共に各ウェルを6時間インキュベートする。その培地にFBSを欠く細胞についてインキュベート時間が終了すると、20%のFBSを補完した250μLのDMEMを形質移入した細胞に加え、さらに40時間インキュベートする。その形質移入培地にFBSを伴った細胞には、10%のFBSを補完した250μLのDMEMを形質移入した細胞に加え、さらに40時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、Cav−1転写物のノックダウンを細胞溶解物で測定する。Cav−1転写物の解析については、トリス試薬を用いて細胞を溶解し、次いでqRT−PCR検出キットを用いてCav−1転写物のレベルについて定量する。非サイレンシング対照に比べて、Cav−1の転写物は45%まで阻害される(図5Bを参照)。
ジオレオイルモノアミンとmPEG−ジオレオイルモノアミンによって複合体化されたsiRNAの投与に続く肺におけるカベオリン−1転写物のノックダウン
カベオリン−1(Cav−1)転写物を標的とする以前製剤化されたsiRNAをメスICRマウス(17〜22グラム)に静脈内(IV)注射する。siRNA複合体は、100、60、40、20又は10μgのsiRNAと共にジオレオイルモノアミンとmPEG−ジオレオイルモノアミンの10:0混合物を含有する(N:P比、20:1)(実施例9を参照)。注射後48時間で動物を安楽死させ、qRT−PCRを用いた標的Cav−1転写物の解析及びsiRNAの定量のために肺を回収する。Cav−1転写物のレベル(内部対照としてのβ−アクチンに対して転写物レベルを標準化される)は、未処理の対照動物と比べた発現比率として表される。結果は、100μgのsiRNAを投与された動物での>60%から10μgのsiRNAを投与された動物での約13%までに及ぶ動物の肺におけるCav−1転写物レベルの用量依存性の低下を示す。注射したsiRNAの定量は、肺に分布するsiRNAの絶対量において用量依存性の増加を示す(図6)。最低用量にて、注射されたsiRNAの約5%が肺に分布する。最高用量では、注射されたsiRNAの約50%が肺に分布する。動物の数(「n」)は各群6匹である。
ジオレオイルモノアミン/ラクトビオニル−ジオレオイルモノアミンによって被包されたsiRNAの形質移入活性
オレオイルモノアミン/ラクトビオニル−ジオレオイルモノアミンによって被包されたsiRNAの形質移入活性を試験管内で以下のように測定する。使用するsiRNAは、β−アクチンの転写物レベルのノックダウンを生じるように意図されたヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、ジオレオイルモノアミン(実施例3)とラクトビオニル−ジオレオイルモノアミン(実施例35)の混合物である。被包リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの壁上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を先ず100%エタノールに溶解し、次いで50%にする。水に溶解したsiRNAをリポソーム/エタノールの溶液に加える。回転蒸発方式によってリポソーム/siRNAの混合物からエタノールを蒸発させる。等量の10%デキストロースを被包siRNA粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を5%デキストロースに懸濁する。Hepa16細胞(0.5×105個の細胞/ウェル)を10%FBSにて24穴組織培養プレートに播く。総容積250μLDMEMにてFBSの非存在下又は存在下において0.5μgの複合体化siRNAと共に各ウェルを6時間インキュベートする。その培地にFBSを欠く細胞についてインキュベート時間が終了すると、20%のFBSを補完した250μLのDMEMを形質移入した細胞に加え、さらに40時間インキュベートする。その形質移入培地にFBSを伴った細胞には、10%のFBSを補完した250μLのDMEMを形質移入した細胞に加え、さらに40時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、β−アクチン転写物のノックダウンを細胞溶解物で測定する。β−アクチン転写物の解析については、トリス試薬を用いて細胞を溶解し、次いでqRT−PCR検出キットを用いてβ−アクチン転写物のレベルについて定量する。非サイレンシング対照に比べて、β−アクチンの転写物は90%まで阻害されるが、LBAリガンドを欠く同一の粒子を含有する試料は、非サイレンシング対照に比べて57%の阻害しか示さなかった(図7)。
ジオレオイルモノアミンによって複合体化されたsiRNAの架橋ゲルからの制御された放出
ほかの市販のカチオン性脂質とカチオン性ポリマー系で複合体化したsiRNAと比べたジオレオイルモノアミンとmPEG−ジオレオイルモノアミンで複合体化したsiRNAの投与に続く肺におけるカベオリン−1転写物のノックダウン
カベオリン−1(Cav−1)転写物を標的とする以前製剤化されたsiRNAをメスICRマウス(17〜22グラム)に静脈内(IV)注射する。siRNA複合体は、40μgのsiRNAと共にジオレオイルモノアミンとmPEG−ジオレオイルモノアミンの10:0混合物を含有する(N:P比、20:1)(実施例9を参照)。さらに、20:1のN:P比でのDOTAP:DOPE(1:1)又は25kDaの分枝鎖PEI(10:1)のいずれかと共にsiRNAを製剤化する。DOTAP:DOPEと共に製剤化した合計40μgのsiRNA)(200μLにて)をマウスにIV注射する、又は分枝鎖PEIと共に製剤化した合計20μgのsiRNA)(100μLにて)をIV注射する。この製剤に関連する既知の毒性を試み、緩和するために、低い用量で分枝鎖PEIを用いる。注射の48時間後に動物を安楽死させ、qRT−PCRを用いた標的Cav−1転写物の解析及びsiRNAの定量のために肺及び肝臓を回収する。Cav−1転写物のレベル(内部対照としてのβ−アクチンに対して転写物レベルを標準化される)は、未処理の対照動物と比べた発現比率として表される。動物の数(「n」)は各群5匹である。結果は、肺におけるCav−1発現にて有意な転写物のノックダウン(約60%)及び肝臓における約33%の転写物ノックダウンを示す。DOTAP:DOPEで製剤化したsiRNAについて有意な転写物ノックダウンは言及されない。分枝鎖PEIで製剤化したsiRNAについては、組織を回収する前に製剤に関連する毒性のために動物が死亡したので、解析できなかった;ジオレオイルモノアミンとmPEG−ジオレオイルモノアミンで製剤化したsiRNA及びDOTAP:DOPEで製剤化したsiRNAは、毒性がほとんどなく投与された。
ジオレオイルクロスアミン/PSMAターゲティングアプタマーによって被包されたsiRNAの形質移入活性
ジオレオイルクロスアミン/PSMAターゲティングアプタマーによって被包されたsiRNAの形質移入活性を試験管内で以下のように測定する。使用するsiRNAは、Cav−1の転写物レベルのノックダウンを生じるように意図されたヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、ジオレオイルクロスアミン(実施例1)である。RNAアプタマーは前立腺特異的膜抗原を標的とし、3’末端にssRNAウリジンテイルを含む(PSMAアプタマーの配列:5’−GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUAAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU−3’)。非結合性の変異アプタマーを陰性対照として含める(変異PSMAアプタマーの配列:5’−GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUCCUUACGUCACUCCUAAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU−3’)。被包したリポソームは実施例45で記載されたように調製する。RNAアプタマーを被包リポソームに加え、室温で30分間インキュベートすることによって標的化されたリポソームを調製する。LNCap細胞(2.5×105個の細胞/ウェル)を10%FBSにて24穴組織培養プレートに播く。総容積500μLのRPMI1640にてFBSの非存在下において0.1μgの標的化リポソーム又は非標的化対照リポソームと共に各ウェルを5時間インキュベートする。インキュベート時間が終了すると、10%のFBSを補完した500μLのRPMI1640で培地を置き換え、さらに40時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、Cav−1転写物のノックダウンを細胞溶解物で測定する。転写物の解析については、細胞を溶解し、QiagenのRNEasyキット(Qiagenの製品番号:74106)を用いて全RNAを精製する。qRT−PCR検出キットを用いてCav−1とGAPDH(内部対照)の転写物レベルを定量する。非サイレンシング対照に比べて、Cav−1転写物レベルは、PSMAターゲティングリポソームで処理された細胞では70%枯渇する。これは、非ターゲティング変異PSMAアプタマーで処理した細胞とは対照的であり、それは、非サイレンシング対照と比べてCav−1転写物の枯渇を示さない。前立腺特異的膜抗原を欠く細胞(チャイニーズハムスターの卵巣細胞)の処理は、ターゲティングアプタマーの同一性とは無関係に、非サイレンシング対照と比べてCav−1枯渇の類似したレベル(約35%)を示す(図10)。
Claims (15)
- 式
の化合物であって、式中、
n1、n2、n3及びn4は独立して1、2、3又は4であり、
X及びX’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
R1及びR2は独立して、1〜4の二重結合又は三重結合を含有してもよいし又は含有しなくてもよいC8〜C25炭化水素基であり、
T1及びT2は独立して、水素又はタ−ゲティングリガンドであり、
G1及びG2は独立して、結合又はポリマー部分であり、
ここでターゲティングリガンドが薬学上活性のある小分子、エンドソーム溶解剤、融合性ペプチド、細胞膜透過剤、電荷遮蔽剤、核酸、又は細胞受容体リガンドである、
化合物。 - n1、n2、n3及びn4がすべて1であり、X及びX’が双方共結合である請求項1に記載の化合物。
- G1が結合であり、
G2がポリマー部分であり、
並びにT1及びT2の少なくとも一方はタ−ゲティングリガンドであり、T1及びT2の他方が水素である請求項1に記載の化合物。 - G2が、ポリオキシアルキレン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリビニルアルコ−ル、デキストラン、ポリ(L−グルタミン酸)、スチレン無水マレイン酸、ポリ−N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド、又はポリジビニルエ−テル無水マレイン酸である請求項3に記載の化合物。
- −C(O)X−R1及び−C(O)X’−R2の双方がオレオイル基を表す請求項2に記載の化合物。
- ポリマー部分が、ポリオキシアルキレンである請求項3に記載の化合物。
- 請求項1〜6のいずれかの化合物と、
(a)リボゾームRNA;RNA又はDNAのアンチセンスポリヌクレオチド;アプタマー;リボザイム;siRNA;shRNA;miRNA;及び治療上有用なタンパク質をコードするゲノムDNA、cDNA若しくはmRNAのポリヌクレオチド;
(b)アプタマー;又は
(c)タンパク質、ペプチド、コレステロール、ホルモン、小分子医薬化合物、ビタミン及び補因子
から成る群から選択される分子とを含む製剤。 - 哺乳類対象へのsiRNA又はプラスミドDNAの生体内での送達における利用のための、請求項7に記載の製剤。
- 哺乳類対象の疾患を治療するための、請求項7に記載の製剤。
- 調節されない細胞増殖に特徴付けられる疾患を治療するための、請求項7に記載の製剤。
- 肺組織内の疾患を治療するための、請求項7に記載の製剤。
- 前記疾患が癌である請求項11に記載の製剤。
- 細胞に接触させることにより、細胞における遺伝子の発現を調節するための、請求項7に記載の製剤。
- N,N’−ジオレオイルテトラキス(アミノメチル)メタンである、請求項1に記載の化合物。
- 前記化合物がN,N’−ジオレオイルテトラキス(アミノメチル)メタンである、請求項7に記載の製剤。
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