JP5741709B2 - 構造化照明装置、その構造化照明装置の調整方法、コンピュータ実行可能な調整プログラム、構造化照明顕微鏡装置、面形状測定装置 - Google Patents

Description

本発明は、超解像観察に適用される構造化照明装置、その構造化照明装置の調整方法、コンピュータ実行可能な調整プログラム、構造化照明顕微鏡装置、及びパターン投影型の面形状測定装置に関する。

近年、光学顕微鏡の解像限界を超えた顕微鏡法が複数提案され、それらは総称して超解像光学顕微鏡と呼ばれている。超解像光学顕微鏡の一種に、いわゆる構造化照明を用いる顕微鏡（構造化照明顕微鏡）がある。

この構造化照明顕微鏡は、標本又は試料の被観察面（標本面又は試料面）にストライプ状の縞パターン（構造化照明）を投影し、その構造化照明に応じて標本で発生した蛍光（或いは散乱光などの光）を撮像素子で取得する。観察用の結像光学系の解像限界を超える超解像画像を構築するには、縞パターン（構造化照明パターン）の位相の異なる複数の画像を取得し、それら複数画像を解析する必要がある。また、２次元面内において超解像効果を得るためには、構造化照明の方位も変化させる必要がある。

構造化照明を標本面に投影することで、構造化照明の空間周波数と標本の空間周波数とはモアレ縞を生成する。このモアレ縞には、標本の空間周波数情報であって、低周波数に周波数変換された空間周波数情報（＝変換前は結像光学系の解像限界相当の空間周波数を超えていたもの）が含まれる。そのモアレ縞の空間周波数が解像限界相当の空間周波数より低ければ、その空間周波数情報は、その結像光学系で検出することが可能である。従って、構造化照明の位相を変えながら、そのモアレ縞の情報を含む画像を複数枚取得し、それら複数枚の画像へ演算処理を施すことにより、超解像を実現することが可能となる（例えば、特許文献１等を参照）。

特許文献１には、構造化照明顕微鏡を蛍光観察へ適用した例が開示されている。特許文献１の方法では、可干渉光源から射出した光束を回折格子によって２つの光束に分割し、それら２つの光束を対物レンズの瞳上の互いに異なる位置へ個別に集光させる。このとき２つの光束は対物レンズから角度の異なる平行光束として射出し、標本面上で重なり合いストライプ状の干渉縞（構造化照明）を形成する。そして、特許文献１の方法では、構造化照明の位相をステップ状に変化させながら標本の画像を繰り返し取得し、取得した複数の画像に対して、標本の構造と回折格子のパターンとを分離する演算（分離演算）と、分離された複数の画像から超解像画像を復調する演算（復調演算）とを施している。

また、特許文献１の方法の応用として、標本面内の方向と深さ方向との双方に亘って超解像効果を得るために、干渉縞に寄与する光束を３光束化する技術が提案されている。３光束を利用すれば、構造化照明のストライプパターンを標本面内の方向だけでなく標本の深さ方向にも発生させることができるからである。

米国特許第６２３９９０９号明細書

しかしながら、構造化照明の位相をステップ状に変化させる従来の方法のうち、回折格子等の光学素子をステップ移動させる方法では、移動していた光学素子を適当な位置で静止させるのに一定の時間を要するため、必要な画像を全て取得するまでの時間（観察時間）を短縮することが難しい。特に、標本が生体標本である場合は、標本の構造が時々刻々と変化する可能性があるため、画像取得はできるだけ高速に行われることが望ましい。

また、３光束を利用して標本面内の方向と深さ方向との双方に亘って超解像効果を得る従来の方法では、前述した分離演算に必要な画像の枚数が多くなるので、画像取得を高速化する必要性は特に高いと考えられる。

そこで本発明は、照明パターンの切り換えを高速化するのに適した構成の構造化照明装置、その構造化照明装置の調整方法、コンピュータ実行可能な調整プログラム、構造化照明顕微鏡装置、その構造化照明装置を応用した面形状測定装置を提供することを目的とする。

本発明の構造化照明装置は、光源からの射出光束中に配置され、その射出光束を横切る方向に音波伝搬路を配した光変調器と、前記音波伝搬路の媒体を振動させるための駆動信号を前記光変調器へ与えることにより、前記音波伝搬路内に音波定在波を生起させる駆動部と、前記音波伝搬路を通過した前記射出光束の互いに異なる回折成分を干渉させ、その干渉縞を被観察物に形成する照明光学系と、前記音波伝搬路の長さに応じて変化し得る前記干渉縞の状態が予め決められた状態になるように前記駆動部のパラメータを調整する調整部とを備える。

本発明の構造化照明装置の調整方法は、光源からの射出光束中に配置され、その射出光束を横切る方向に音波伝搬路を配した光変調器と、前記音波伝搬路の媒体を振動させるための駆動信号を前記光変調器へ与えることにより、前記音波伝搬路内に音波定在波を生起させる駆動部と、前記音波伝搬路を通過した前記射出光束の互いに異なる回折成分を干渉させ、その干渉縞を被観察物に形成する照明光学系と、を備えた構造化照明装置の調整方法であって、前記音波伝搬路の長さに応じて変化し得る前記干渉縞の状態が予め決められた状態になるように前記駆動部のパラメータを調整する調整手順を含む。

本発明のコンピュータが実行可能な調整プログラムは、光源からの射出光束中に配置され、その射出光束を横切る方向に音波伝搬路を配した光変調器と、前記音波伝搬路の媒体を振動させるための駆動信号を前記光変調器へ与えることにより、前記音波伝搬路内に音波定在波を生起させる駆動部と、前記音波伝搬路を通過した前記射出光束の互いに異なる回折成分を干渉させ、その干渉縞を被観察物に形成する照明光学系と、を備えた構造化照明装置のコンピュータが実行可能な調整プログラムであって、前記音波伝搬路の長さに応じて変化し得る前記干渉縞の状態が予め決められた状態になるように前記駆動部のパラメータを調整する調整手順を含む。

本発明の構造化照明顕微鏡装置は、光源からの射出光束中に配置され、その射出光束を横切る方向に音波伝搬路を配した光変調器と、前記音波伝搬路の媒体を振動させるための駆動信号を前記光変調器へ与えることにより、前記音波伝搬路内に音波定在波を生起させる駆動部と、前記音波伝搬路を通過した前記射出光束の互いに異なる回折成分を干渉させ、その干渉縞を被観察物に形成する照明光学系と、前記音波伝搬路の長さに応じて変化し得る前記干渉縞の状態が予め決められた状態になるように前記駆動部のパラメータを調整する調整部と、前記干渉縞の形成された前記被観察物からの観察光束を結像する結像光学系とを備える。

本発明の面形状測定装置は、光源からの射出光束中に配置され、その射出光束を横切る方向に音波伝搬路を配した光変調器と、前記音波伝搬路の媒体を振動させるための駆動信号を前記光変調器へ与えることにより、前記音波伝搬路内に音波定在波を生起させる駆動部と、前記音波伝搬路を通過した前記射出光束の互いに異なる回折成分を干渉させ、その干渉縞を被観察物に形成する照明光学系と、前記音波伝搬路の長さに応じて変化し得る前記干渉縞の状態が予め決められた状態になるように前記駆動部のパラメータを調整する調整部と、前記干渉縞の形成された前記被観察物の画像を検出する画像検出器とを備える。

第１実施形態の構造化照明顕微鏡システムの構成図である。 図２（Ａ）は、超音波光変調器３の超音波伝搬路Ｒ内に生起する超音波定在波のパターンを示す模式図であり、図２（Ｂ）は、それに対応する構造化照明のパターン（明部及び暗部の配置）を示す模式図である。図２（Ｃ）〜（Ｅ）は、波本数が変化したときの縞本数の変化を説明する図である。 図３（Ａ）は、長さＬと距離Ｄとの関係を説明する図であり、図３（Ｂ）は、スポットＳに対応する構造化照明Ｓ’の概念図であり、図３（Ｃ）は、構造化照明Ｓ’の縞本数のずれを説明する図である。 超音波光変調器３の構成図である。 超音波光変調器３の駆動回路１９Ａを説明する図である。 微小変位測定器９０を説明する模式図である。 第１実施形態のＣＰＵの動作フローチャートである。 第２実施形態の微少変位測定器９０を説明する模式図である。 第２実施形態のＣＰＵの動作フローチャートである。 第３実施形態の構造化照明顕微鏡システムの構成図である。 第３実施形態のＣＰＵの動作フローチャートである。 超音波光変調器３の変形例である。 第４実施形態の面形状測定装置の構成図である。 超音波光変調器３’の構成図である。

［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態について図を用いて説明する。本実施形態は、蛍光観察に適用される構造化照明顕微鏡システムの実施形態である。

図１は、本実施形態の構造化照明顕微鏡システムの構成図である。図１に示すとおり構造化照明顕微鏡システムには、光ファイバー１、コレクタレンズ２、超音波光変調器３、レンズ４、０次光カットマスク５Ａ、レンズ６、視野絞り５Ｂ、レンズ７、ダイクロイックミラー８、第二対物レンズ１１、撮像装置（ＣＣＤカメラなど）１２、制御装置１９、画像記憶・演算装置（コンピュータなど）１３、画像表示装置１４、対物レンズ９、微小変位測定器９０などが配置される。図１中に符号１０で示すのは、不図示のステージ上に載置された標本の観察対象面（標本面）であり、その標本は、蛍光染色された生体標本である。

図１において光ファイバー１は、不図示の可干渉光源からの光を導光し、その出射端に二次点光源（過干渉な二次点光源）を形成する。なお、不図示の可干渉光源の波長は、標本の励起波長と同じ波長に設定されている。その二次点光源から射出した光は、コレクタレンズ２によって平行光に変換され、超音波光変調器３へ入射する。

超音波光変調器３は、光軸と垂直な方向に超音波を伝搬する超音波伝搬路Ｒを有しており、その超音波伝搬路Ｒに超音波の平面定在波（以下、「超音波定在波」という。）を生起させることにより、超音波伝搬路Ｒに正弦波状の屈折率分布を付与している。このような超音波光変調器３は、入射光に対して位相型回折格子の働きをし、その光を各次数の回折光に分岐する。図１において実線で示したのは０次回折光であり、点線で示したのは±１次回折光である。

超音波光変調器３から射出した各次数の回折光は、レンズ４を通過した後に瞳共役面を形成する。ここで、瞳共役面は、レンズ４の焦点位置（後ろ側焦点位置）であって、後述する対物レンズ９の瞳Ｐ（±１次回折光が集光する位置）に対してレンズ７、レンズ６を介して共役な位置をいう（なお、「共役な位置」の概念には、当業者が対物レンズ９、レンズ６、７の収差、ビネッティング等、設計上必要な事項を考慮して決定した位置も含まれる。）。

この瞳共役面の近傍には０次光カットマスク５Ａが配置されており、これは０次回折光及び２次以降の高次回折光をカットし±１次回折光のみを通過させる機能を有している。０次光カットマスク５Ａは、基板に複数の開口部又は透過部を形成したものであり、開口部又は透過部の位置は、瞳共役面において±１次回折光が通過する領域に対応する。

これによって、２光束干渉による構造化照明が可能となる。２光束干渉による構造化照明は、標本面内方向にストライプパターンを有しており、面内方向の超解像効果（２次元の超解像効果）を得るための照明である。

因みに、±１次回折光と共に０次回折光を通過させたならば、３光束干渉による構造化照明が実現する。３光束干渉による構造化照明は、面内方向だけでなく深さ方向にもストライプパターンを有しており、面内方向及び深さ方向の超解像効果（３次元の超解像効果）を得ることを可能とする。ここでは、２次元の超解像効果を得る場合について説明する。

０次光カットマスク５Ａを通過した±１次回折光は、レンズ６を介して標本１０の共役面を形成する。この標本共役面の近傍には視野絞り５Ｂが配置されており、これは標本面１０上の照明領域（観察領域）のサイズを制御する機能を有している。

視野絞り５Ｂを通過した±１次回折光は、レンズ７を通過した後にダイクロイックミラー８へ入射し、そのダイクロイックミラー８を反射する。ダイクロイックミラー８を反射した±１次回折光は、対物レンズ９の瞳Ｐ上の互いに異なる位置にそれぞれスポットを形成する。なお、瞳Ｐにおける２つのスポットの形成位置は、瞳Ｐの概ね最外周部であって、対物レンズ９の光軸に関して互いに対称な位置である。因みに、後述するように印加電圧の周波数を微小に変更させた結果、回折格子のピッチ（１周期）が微小に変化した場合には、２つのスポットの形成位置は極めて微小に変化する。

したがって、対物レンズ９の先端から射出する±１次回折光は、対物レンズ９のＮＡに相当する角度で互いに反対の方向から標本面１０を照射する。

前述したとおりこれらの±１次回折光は互いに可干渉な光であるので、標本面１０には縞ピッチが一様なストライプ状の干渉縞が投影される。よって、標本面１０の照明パターンは、縞構造を持った照明パターンとなる。このように縞構造を持った照明パターンによる照明が、構造化照明である。構造化照明された標本面１０の蛍光領域（前述した蛍光染色された領域）では蛍光物質が励起され、蛍光を発する。

ここで、構造化照明によると、構造化照明の構造周期と蛍光領域の構造周期（標本の構造周期に相当）との差に相当するモアレ縞が標本面１０に現れる。このモアレ縞上では、蛍光領域の構造の空間周波数が変調されており、実際よりも低い空間周波数にシフトしている。したがって構造化照明によると、蛍光領域の構造のうち空間周波数の高い成分を示す蛍光、すなわち対物レンズ９の解像限界を超える大角度で射出した蛍光までもが対物レンズ９へ入射できる。

標本面１０から射出し対物レンズ６へ入射した蛍光は、対物レンズ６により平行光に変換された後にダイクロイックミラー８へ入射する。その蛍光は、ダイクロイックミラー８を透過した後、第二対物レンズ１１を通過することにより撮像装置１２の撮像面上に標本面１０の蛍光像を形成する。但し、この蛍光像には、標本面１０の蛍光領域の構造情報だけでなく構造化照明の構造情報も含まれており、この蛍光像では、標本面１０の蛍光領域の構造の空間周波数は変調されたままである（つまり実際よりも低い空間周波数にシフトしたままである）。

制御装置１９は、各種の回路（後述する駆動回路１９Ａなど）と、回路を制御するＣＰＵと、ＣＰＵの動作プログラムを格納した記憶部とを備え、超音波光変調器３の超音波伝搬路Ｒに生起する超音波定在波を制御することにより、構造化照明の位相シフト量を２π／３ずつステップ状に変化させる（詳細は後述。）。そして、制御装置１９は、構造化照明の位相が各状態にあるときに撮像装置１２を駆動して３種類の画像データＩ_−１、Ｉ_０、Ｉ_＋１を取得し、それらの画像データＩ_−１、Ｉ_０、Ｉ_＋１を順次に画像記憶・演算装置１３へ送出する。

画像記憶・演算装置１３は、取り込まれた画像データＩ_−１、Ｉ_０、Ｉ_＋１に対して分離演算を施すことにより、構造化照明の構造情報の除去された画像データＩを取得する。さらに画像記憶・演算装置１３は、その画像データＩに対して復調演算を施すことにより、蛍光領域の構造情報の空間周波数が実際の空間周波数に戻された画像データＩ’を取得し、その画像データＩ’を画像表示装置１４へ送出する。なお、画像記憶・演算装置１３による具体的な演算には、例えば米国特許第８１１５８０６号明細書に開示された方法を用いることができる。したがって、画像表示装置１４には、対物レンズ９の解像限界を超えた解像画像（超解像画像）が表示される。

なお、詳細は後述するが、本実施形態では構造化照明の方向を切り替えることが可能であって、構造化照明の方向の異なる複数の状態の各々において画像データＩ’の取得が行われる。そして、それら複数の画像データＩ’を適切に合成したものが超解像画像として取得される。

図２（Ａ）は、超音波伝搬路Ｒ内に生起する超音波定在波のパターンを示す模式図であり、図２（Ｂ）は、それに対応する構造化照明のパターン（明部及び暗部の配置）を示す模式図である（但し、超音波伝搬路Ｒのパターンのうち、実際の構造化照明に反映されるのは、有効な光束が通過する部分のパターンのみである。）。また、図２（Ａ）では、説明をわかりやすくするため、超音波伝搬路Ｒに生起する超音波定在波の波本数を実際よりも少ない「２」とした。

図２（Ａ）に示すとおり、超音波定在波の波本数（位相変化２πで波本数１本とカウントする）が「２」であるときには、図２（Ｂ）に示すとおり、±１次光の干渉による構造化照明の縞本数（明部又は暗部の本数）は「４」となる。つまり、構造化照明の縞本数は、それに対応する超音波定在波の波本数の２倍となる。

したがって、図２（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）に示すとおり超音波定在波の波本数を２、（２＋１／２）、３のように１／２ずつ３通りに変化させたならば（即ち、超音波定在波の波長を変化させたならば）、それに対応する構造化照明の縞本数は４、５、６のように１ずつ３通りに変化する。

ここで、図２中に白矢印で示すとおり超音波伝搬路Ｒの一端から１／２だけずれた部分のみに着目すると、その着目部分に対応する構造化照明の位相は、「π」ずつ３通りに変化している。

また、図２中に黒矢印で示すとおり超音波伝搬路Ｒの一端から１／３だけずれた部分のみに着目すると、その着目部分に対応する構造化照明の位相は、「２π／３」ずつ３通りに変化している。

よって、仮に、超音波伝搬路Ｒに対する有効な光の入射領域を白矢印で示した位置のみに制限したならば、超音波定在波の波本数を１／２ずつ変化させるだけで、構造化照明の位相を「π」ずつ変化させることができる。

また、仮に、超音波伝搬路Ｒに対する有効な光の入射領域を黒矢印で示した位置のみに制限したならば、超音波定在波の波本数を１／２ずつ変化させるだけで、構造化照明の位相を「２π／３」ずつ変化させることができる。

そこで本実施形態では、１ステップ当たりの位相シフト量を２π／３とするべく、図３（Ａ）に示すとおり、超音波伝搬路Ｒへ入射する有効な光のスポット（有効径）Ｓの中心から超音波伝搬路Ｒの一端までの距離Ｄは、超音波伝搬路Ｒの伝搬方向の長さＬの１／３倍に設定される（Ｄ＝Ｌ／３）。

但し、超音波伝搬路Ｒに生起する超音波定在波の波本数が１／２だけ変化すると、スポットＳの内部に生起する超音波定在波の波本数も少しずれるので、図３（Ｂ）に示すとおりスポットＳに対応する構造化照明Ｓ’の縞本数も少しずれてしまう（但し、図３に示した波パターン及び縞パターンは模式図であって、波本数及び縞本数は実際の本数に一致しているとは限らない。）。

そこで本実施形態では、超音波伝搬路Ｒの長さＬは、構造化照明Ｓ’の縞本数のズレがほぼゼロとみなせるよう、スポットＳの径φに比べて十分に大きく設定される。

具体的には、超音波伝搬路Ｒの長さＬと、スポットＳの径φとは、構造化照明Ｓ’の縞本数のズレの許容量δとに対して、φ／Ｌ＜δの関係を満たすように設定される。例えば、構造化照明Ｓ’の縞本数のズレを０．１５本以下に抑える必要があったならば、その関係式は、φ／Ｌ≦０．１５となる。

また、超音波光変調器３の超音波伝搬路Ｒ上でスポットＳの径φがφ／Ｌ＜δの関係を必ずしも満たしてなくてもよく、例えば、超音波光変調器３から射出した±１次回折光を視野絞り５Ｂで絞った場合は、超音波伝搬路Ｒの長さＬ、標本面１０における照明領域（観察領域、視野領域）の直径φ’、標本面１０から超音波光変調器３への光学倍率ｍが、構造化照明Ｓ’の縞本数のズレの許容量δに対して、φ’×ｍ／L＜δの関係を満たすように設定されればよい。

本実施形態では、スポットＳの径φを４ｍｍと仮定する。この場合、超音波伝搬路Ｒの長さＬを３０ｍｍに設定すれば、図３（Ｃ）に示すとおり、構造化照明Ｓ’の両端における縞のズレは、０．０６８本分程度に抑えられ、構造化照明Ｓ’の全域における縞本数のズレは０．６８＋０．６８＝０．１３本程度に抑えられる。なお、図３（Ｃ）において点線で示したのは構造化照明Ｓ’の理想パターン（縞本数のズレがゼロである場合のパターン）であり、実線で示したのは構造化照明Ｓ’の実際のパターンであるが、わかりやすくするために両者のずれを強調して描いた。

図４は、超音波光変調器３の構成図である。図４（Ａ）は、超音波光変調器３を正面（光軸方向）から見た図であり、図４（Ｂ）は、超音波光変調器３を側面（光軸に垂直な方向）から見た図である。

図４に示すように、超音波光変調器３は、音響光学媒体１５を備え、その音響光学媒体１５は、互いに対向する平行な側面対を３対有した角柱状に整えられている。これら３対の側面対の各々の一方に３つのトランスデューサ１８ａ、１８ｂ、１８ｃが個別に設けられており、これによって１つの音響光学媒体１５内に３つの超音波伝搬路が形成される。以下、トランスデューサ１８ａの形成面とそれに相対する側面１５ａとの間に形成される超音波伝搬路を「超音波伝搬路Ｒａ」とおき、トランスデューサ１８ｂの形成面とそれに相対する側面１５ｂとの間に形成される超音波伝搬路を「超音波伝搬路Ｒｂ」とおき、トランスデューサ１８ｃの形成面とそれに対応する側面１５ｃとの間に形成される超音波伝搬路を「超音波伝搬路Ｒｃ」とおく。

なお、音響光学媒体１５の材質は、例えば石英ガラス、テルライトガラス、重フリントガラス、フリントガラスなどであり、３対の側面対及び２つの底面は、それぞれ十分な精度で研磨されている。

ここで、３つの超音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃの各々の長さＬは共通であり（Ｌ＝３０ｍｍ）、その長さＬは前述したスポットＳの径φに対して前述した条件を満たしている。また、３つの超音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃは、各々の一端からＬ／３だけ離れた位置において６０°ずつ異なる角度で交差している。その交差位置に前述したスポットＳの中心が位置する。

なお、超音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃの交差する領域は、光軸方向から見ると六角形になっており、その六角形の内部にスポットＳが収まっているものとする。また、音響光学媒体１５の姿勢は、入射光に対して超音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃの各々がほぼ垂直になるように予め調整されているものとする。また、音響光学媒体１５の姿勢誤差は、±１°以内であることが望ましい。なぜなら、姿勢誤差の大きさが１°よりも大きくなると、±１次回折光の光量差が大きくなり、構造化照明Ｓ’のコントラストが低下する虞があるからである。

トランスデューサ１８ａは、圧電体１６ａと、圧電体１６ａの上下面に個別に形成された２つの電極１７ａとを有した超音波トランスデューサであり、そのうち一方の電極１７ａを介して音響光学媒体１５の１つの側面に接合されている。このトランスデューサ１８ａの２つの電極１７ａの間に高周波の交流電圧が印加されると、圧電体１６ａが厚み方向に振動し、超音波伝搬路Ｒａ内を平面超音波が往復する。２つの電極１７ａの間に印加される交流電圧の周波数が特定の周波数（適正周波数）に設定された場合、その超音波は定在波となるので、超音波伝搬路の屈折率には、超音波の伝搬方向にかけて正弦波状の分布が付与される。これによって、超音波伝搬路Ｒａは、超音波の伝搬方向と垂直な位相格子を持った位相型回折格子となる。以下、この超音波伝搬路Ｒａの伝搬方向を、「第１方向」と称す。

また、トランスデューサ１８ｂも、トランスデューサ１８ａと同じ構成をしており、圧電体１６ｂと、圧電体１６ｂの上下面に個別に形成された２つの電極１７ｂとを有し、そのうち一方の電極１７ｂを介して音響光学媒体１５の１つの側面に接合されている。

したがって、トランスデューサ１８ｂの２つの電極１７ｂの間に適正周波数の交流電圧が印加されると、超音波伝搬路Ｒｂ内を平面超音波が伝搬するので、超音波伝搬路Ｒｂは、超音波の伝搬方向と垂直な位相格子を持った位相型回折格子となる。以下、この超音波伝搬路Ｒｂの伝搬方向を、「第２方向」と称す。この第２方向は、第１方向に対して６０°の角度を成す。

また、トランスデューサ１８ｃも、トランスデューサ１８ａと同じ構成をしており、圧電体１６ｃと、圧電体１６ｃの上下面に個別に形成された２つの電極１７ｃとを有し、そのうち一方の電極１７ｃを介して音響光学媒体１５の１つの側面に接合されている。

したがって、トランスデューサ１８ｃの２つの電極１７ｃの間に適正周波数の交流電圧が印加されると、超音波伝搬路Ｒｃ内を平面超音波が伝搬するので、超音波伝搬路Ｒｃは、超音波の伝搬方向と垂直な位相格子を持った位相型回折格子となる。以下、この超音波伝搬路Ｒｃの伝搬方向を、「第３方向」と称す。この第３方向は、第１方向に対して−６０°の角度を成す。

図５は、超音波光変調器３の駆動回路１９Ａを説明する図である。この駆動回路１９Ａは、図１に示した制御装置１９の一部である。

図５に示すとおり駆動回路１９Ａは、高周波交流電源１９Ａ−１と切り換えスイッチ１９Ａ−２とを備える。

高周波交流電源１９Ａ−１は、超音波光変調器３へ供給されるべき交流電圧を生成する。その交流電圧の周波数は、制御装置１９内のＣＰＵによって適正周波数（例えば、数十ＭＨｚ〜１００ＭＨｚ内の何れかの値）に制御される。

本実施形態では、前述した構造化照明Ｓ’の位相シフト量を−２π／３、０、＋２π／３の３通りにステップ状に変化させるために、ＣＰＵは、その交流電圧の周波数を、周波数の異なる３通りの適正周波数ｆ_−１、ｆ_０、ｆ_＋１の間で切り換えることができるものとする。

例えば、適正周波数ｆ_０は、長さＬが３０ｍｍである超音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃに１００本の超音波定在波（それに対応する構造化照明の縞本数は２００）を生起させるための適正周波数（８０ＭＨｚ）である。この適正周波数ｆ_０によると、構造化照明Ｓ’の位相シフト量はゼロとなる。

この場合、適正周波数ｆ_−１は、長さＬが３０ｍｍである超音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃに（１００−１／２）本の超音波定在波（それに対応する構造化照明の縞本数は１９９）を生起させるための適正周波数（７９．９４６ＭＨｚ）となる。この適正周波数ｆ_−１によると、構造化照明Ｓ’の位相シフト量は−２π／３となる。

また、適正周波数ｆ_＋１は、長さＬが３０ｍｍである超音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃに（１００＋１／２）本の超音波定在波（それに対応する構造化照明の縞本数は２０１）を生起させるための適正周波数（８０．０５４ＭＨｚ）となる。この適正周波数ｆ_＋１によると、構造化照明Ｓ’の位相シフト量は＋２π／３となる。

切り換えスイッチ１９Ａ−２は、高周波交流電源１９Ａ−１と超音波光変調器３との間に配置され、超音波光変調器３の側の接続先を、超音波光変調器３の３つのトランスデューサ１８ａ、１８ｂ、１８ｃの間で切り換えることが可能である。スイッチ１９Ａ−２の接続先は、制御装置１９内のＣＰＵによって適宜に切り換えられる。

切り換えスイッチ１９Ａ−２の接続先がトランスデューサ１８ａの側であるとき、交流電圧はトランスデューサ１８ａの２つの電極の間に印加されるので、３つの超音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃのうち超音波伝搬路Ｒａのみが有効となる。

また、切り換えスイッチ１９Ａ−２の接続先がトランスデューサ１８ｂの側であるとき、交流電圧はトランスデューサ１８ｂの２つの電極の間に印加されるので、３つの超音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃのうち超音波伝搬路Ｒｂのみが有効となる。

また、切り換えスイッチ１９Ａ−２の接続先がトランスデューサ１８ｃの側であるとき、交流電圧はトランスデューサ１８ｃの２つの電極の間に印加されるので、３つの超音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃのうち超音波伝搬路Ｒｃのみが有効となる。

このように、有効な超音波伝搬路を３つの超音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃの間で切り換えれば、構造化照明Ｓ’の方向を第１方向に対応する方向（以下「第１方向Ｄａ」と称す。）と、第２方向に対応する方向（以下、「第２方向Ｄｂ」と称す。）と、第３方向に対応する方向（以下、「第３方向Ｄａ」と称す。）との間で切り換えることができる。

ここで、超音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃの媒体である音響光学媒体１５の材質は、ガラスなどであり、これは温度によって膨張したり収縮したりする可能性があるので、超音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃの長さ（実際の長さ）は必ずしも設計値（＝Ｌ）に一致しない。そして、超音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃの長さＬａ、Ｌｂ、Ｌｃが設計値Ｌから外れると、構造化照明Ｓ’のコントラストが低下したり、構造化照明Ｓ’の縞本数が変化したりする虞がある。

但し、長さＬａ、Ｌｂ、Ｌｃが設計値Ｌから外れたとしても、トランスデューサ１８ａに与えるべき交流電圧の適正周波数ｆａ_−１、ｆａ_０、ｆａ_＋１、トランスデューサ１８ｂに与えるべき交流電圧の適正周波数ｆｂ_−１、ｆｂ_０、ｆｂ_＋１、トランスデューサ１８ｃに与える交流電圧の周波数ｆｃ_−１、ｆｃ_０、ｆｃ_＋１の各々を適切に調節すれば、構造化照明Ｓ’の縞本数及びコントラストを維持できると考えられる。本実施形態の構造化照明顕微鏡システムが微小変位測定器９０を備えているのは、これらを維持するためである。

図６は、微小変位測定器９０を説明する模式図である。図６に示すとおり微小変位測定器９０は、超音波光変調器３の超音波伝搬路Ｒａの長さＬａを測定する微小変位測定器９０ａと、超音波伝搬路Ｒｂの長さＬｂを測定する微小変位測定器９０ｂと、超音波伝搬路Ｒｃの長さＬｃを測定する微小変位測定器９０ｃとを備える。これらの微小変位測定器９０ａ、９０ｂ、９０ｃは、互いに同じ原理、かつ互いに同じ特性の変位計であって、物体の高さを０．１μm（望ましくは０．０１μm）の分解能で測定することができる。０．１μｍの分解能は、超音波の波長（例えば４０μｍ）の１／１００以下に相当し、０．０１μｍの分解能は、１／１０００以下に相当する。このような変位計としては、例えば、ニコン製デジマイクロＭＦ−５０１などの接触型変位計を適用することができる。これらの微小変位測定器９０ａ、９０ｂ、９０ｃの各々は、制御装置１９内のＣＰＵによって適当なタイミングで駆動される。

制御装置１９内のＣＰＵは、適正周波数ｆａ_−１、ｆａ_０、ｆａ_＋１を長さＬａに応じて調節し、適正周波数ｆｂ_−１、ｆｂ_０、ｆｂ_＋１を長さＬｂに応じて調節し、適正周波数ｆｃ_−１、ｆｃ_０、ｆｃ_＋１を長さＬｃに応じて調節する。また、それを可能とするため、制御装置１９内のＣＰＵは、以下の３つのルックアップテーブルを予め記憶している。

第１のルックアップテーブルは、適正周波数ｆａ_−１、ｆａ_０、ｆａ_＋１の値を長さＬａの値ごとに記憶したテーブル（Ｌａ−ｆａテーブル）であり、第２のルックアップテーブルは、適正周波数ｆｂ_−１、ｆｂ_０、ｆｂ_＋１の値を長さＬｂの値ごとに記憶したテーブル（Ｌｂ−ｆｂテーブル）であり、第３のルックアップテーブルは、適正周波数ｆｃ_−１、ｆｃ_０、ｆｃ_＋１の値を長さＬｃの値ごとに記憶したテーブル（Ｌｃ−ｆｃテーブル）である。

なお、Ｌａ−ｆａテーブルにおいて、長さＬａの値に対応づけられた適正周波数ｆａ_−１、ｆａ_０、ｆａ_＋１の値は、超音波伝搬路Ｒａの長さがＬａであるときに、第１方向Ｄａの構造化照明Ｓ’の縞本数を所定値に保ち、第１方向Ｄａの構造化照明Ｓ’コントラストを最高に保ちながら、第１方向Ｄａの構造化照明Ｓ’の位相のみを−２π／３、０、＋２π／３というパターンで切り替えるための値である。

また、Ｌｂ−ｆｂテーブルにおいて、長さＬｂの値に対応づけられた適正周波数ｆｂ_−１、ｆｂ_０、ｆｂ_＋１の値は、超音波伝搬路Ｒｂの長さがＬｂであるときに、第２方向Ｄｂの構造化照明Ｓ’の縞本数を所定値に保ち、第２方向Ｄｂの構造化照明Ｓ’コントラストを最高に保ちながら、第２方向Ｄｂの構造化照明Ｓ’の位相のみを−２π／３、０、＋２π／３というパターンで切り替えるための値である。

また、Ｌｃ−ｆｃテーブルにおいて、長さＬｃに対応づけられた適正周波数ｆｃ_−１、ｆｃ_０、ｆｃ_＋１は、超音波伝搬路Ｒｃの長さがＬｃであるときに、第３方向Ｄｃの構造化照明Ｓ’の縞本数を所定値に保ち、第３方向Ｄｃの構造化照明Ｓ’コントラストを最高に保ちながら、第３方向Ｄｃの構造化照明Ｓ’の位相のみを−２π／３、０、＋２π／３というパターンで切り替えるための値である。

図７は、本実施形態のＣＰＵの動作フローチャートである。以下、各ステップを順に説明する。

ステップＳ１１：ＣＰＵは、微小変位測定器９０ａを駆動することにより超音波伝搬路Ｒａの長さＬａを測定する。

ステップＳ１２：ＣＰＵは、測定した長さＬａに応じてＬａ−ｆａテーブルを参照することにより、第１方向Ｄａの適正周波数ｆａ_−１、ｆａ_０、ｆａ_＋１を決定する。

ステップＳ１３：ＣＰＵは、切り換えスイッチ１９Ａ−２の接続先をトランスデューサ１８ａの側に設定することにより、構造化照明Ｓ’の方向を第１方向Ｄａに設定する。

ステップＳ１４：ＣＰＵは、トランスデューサ１８ａに与える交流電圧の周波数をｆａ_−１、ｆａ_０、ｆａ_＋１の間で変化させると共に、その変化の前後のタイミングで撮像装置１２を駆動することにより、画像データＩａ₁、Ｉａ₂、Ｉａ₃を取得する。

ステップＳ１５：ＣＰＵは、微小変位測定器９０ｂを駆動することにより超音波伝搬路Ｒｂの長さＬｂを測定する。

ステップＳ１６：ＣＰＵは、測定した長さＬｂに応じてＬｂ−ｆｂテーブルを参照することにより、第２方向Ｄｂの適正周波数ｆｂ_−１、ｆｂ_０、ｆｂ_＋１を決定する。

ステップＳ１７：ＣＰＵは、切り換えスイッチ１９Ａ−２の接続先をトランスデューサ１８ｂの側に切り換えることにより、構造化照明Ｓ’の方向を第２方向Ｄｂに切り換える。

ステップＳ１８：ＣＰＵは、トランスデューサ１８ａに与える交流電圧の周波数をｆｂ_−１、ｆｂ_０、ｆｂ_＋１の間で変化させると共に、その変化の前後のタイミングで撮像装置１２を駆動することにより、画像データＩｂ₁、Ｉｂ₂、Ｉｂ₃を取得する。

ステップＳ１９：ＣＰＵは、微小変位測定器９０ｃを駆動することにより超音波伝搬路Ｒｂの長さＬｃを測定する。

ステップＳ２０：ＣＰＵは、測定した長さＬｃに応じてＬｃ−ｆｃテーブルを参照することにより、第３方向Ｄｃの適正周波数ｆｃ_−１、ｆｃ_０、ｆｃ_＋１を決定する。

ステップＳ２１：ＣＰＵは、切り換えスイッチ１９Ａ−２の接続先をトランスデューサ１８ｃの側に切り換えることにより、構造化照明Ｓ’の方向を第３方向Ｄｃに切り換える。

ステップＳ２２：ＣＰＵは、トランスデューサ１８ｃに与える交流電圧の周波数をｆｃ_−１、ｆｃ_０、ｆｃ_＋１の間で変化させると共に、その変化の前後のタイミングで撮像装置１２を駆動することにより、画像データＩｃ₁、Ｉｃ₂、Ｉｃ₃を取得し、フローを終了する。

なお、以上のフローにより取得された一連の９つの画像データＩａ₁、Ｉａ₂、Ｉａ₃、Ｉｂ₁、Ｉｂ₂、Ｉｂ₃、Ｉｃ₁、Ｉｃ₂、Ｉｃ₃は、画像記憶・演算装置１３へ取り込まれる。

画像記憶・演算装置１３は、一連の３つの画像データＩａ₁、Ｉａ₂、Ｉａ₃に対して線形演算からなる分離演算を施すことにより、構造化照明の構造情報を含まない画像データＩａを取得し、その画像データＩａに対して復調係数の乗算からなる復調演算を施すことにより、第１方向Ｄａに亘る超解像画像の復調画像データＩａ’を取得する。

また、画像記憶・演算装置１３は、一連の３つの画像データＩｂ₁、Ｉｂ₂、Ｉｂ₃に対して線形演算からなる復調演算を施すことにより、構造化照明の構造情報を含まない画像データＩｂを取得し、その画像データＩｂに対して復調係数の乗算からなる復調演算を施すことにより、第２方向Ｄｂに亘る超解像画像の復調画像データＩｂ’を取得する。

また、画像記憶・演算装置１３は、一連の３つの画像データＩｃ₁、Ｉｃ₂、Ｉｃ₃に対して線形演算からなる復調演算を施すことにより、構造化照明の構造情報を含まない画像データＩｃを取得し、その画像データＩｃに対して復調係数の乗算からなる復調演算を施すことにより、第３方向Ｄｃに亘る超解像画像の復調画像データＩｃ’を取得する。

そして画像記憶・演算装置１３は、３つの復調画像データＩａ’、Ｉｂ’、Ｉｃ’を波数空間上で合成してから再び実空間に戻すことにより、第１方向Ｄａ、第２方向Ｄｂ、第３方向Ｄｃに亘る超解像画像の画像データＩを取得し、その画像データＩを画像表示装置１４へ送出する。したがって、画像表示装置１４には、標本面１０の蛍光領域の構造を詳細に示す超解像画像が表示される。

以上、本実施形態の構造化照明顕微鏡システムは、光源からの射出光束中に配置され、その射出光束を横切る方向に音波伝搬路を配した光変調器（超音波光変調器３）と、音波伝搬路の媒体を振動させるための駆動信号を光変調器へ与えることにより、音波伝搬路内に音波定在波を生起させる駆動部（制御装置１９）と、音波伝搬路を通過した射出光束の互いに異なる回折成分を干渉させ、その干渉縞（構造化照明Ｓ’）を被観察物（標本面１０）に形成する照明光学系（レンズ４、０次光カットマスク５Ａ、レンズ６、視野絞り５Ｂ、レンズ７、ダイクロイックミラー８、対物レンズ９）とを備える。したがって、本実施形態の構造化照明顕微鏡システムの構成は、照明パターンの切り替えを高速化するのに適している。

しかも、本実施形態の構造化照明顕微鏡システムは、干渉縞の状態が所定の状態になるように駆動部（制御装置１９）のパラメータを調整する調整部（微少変位測定器９０、制御装置１９）を更に備えるので、環境に左右されやすい干渉縞の状態を所定の状態に保ち、超解像に必要な一連の画像の各々の変調状態を良好に保つことができる。

また、本実施形態の調整部（微少変位測定器９０、制御装置１９）による調整の対象（パラメータ）は、駆動信号の周波数（交流電圧の適正周波数ｆ）であるので、干渉縞（構造化照明Ｓ’）の縞本数、位相、コントラストなどを調整することができる。

また、本実施形態の調整部（微少変位測定器９０、制御装置１９）は、音波伝搬路の長さを検出し、検出した長さに応じて駆動信号の周波数を調整するので、音波伝搬路の長さ変化に起因した干渉縞の状態変化を抑えることができる。

また、本実施形態の調整部（微少変位測定器９０、制御装置１９）は、音波伝搬路の長さと駆動信号の適正周波数との関係を予め記憶し、検出した長さとその関係とに基づき駆動信号の周波数を適正周波数に設定するので、調整に要する時間を短く抑えることができる。

また、本実施形態の適正周波数は、干渉縞の縞本数が所定値となるような周波数であるので、超解像に必要な複数の画像の各々の変調度を良好に保つことができる。

また、本実施形態の適正周波数は、干渉縞の縞本数が所定値となり、かつ干渉縞のコントラストが最高となるような周波数であるので、超解像に必要な複数の画像の各々の変調度及び画質を良好に保つことができる。

また、本実施形態の光変調器（超音波光変調器３）は、互いに交差した複数の音波伝搬路を有した光変調器であり、調整部は、複数の音波伝搬路の各々に関する駆動信号の周波数を調整する。

したがって、本実施形態の構造化照明顕微鏡システムは、干渉縞の方向を高速に切り換えることができると共に、干渉縞の方向の異なる複数の画像の各々の変調状態を保つことができる。

また、本実施形態の駆動部は、駆動信号の周波数を所定のパターンで変化させることにより、被観察物上の観察対象領域に形成される干渉縞の位相を所定のパターンで変化させることが可能であり、調整部が駆動信号の周波数を調整するタイミングは、駆動部が位相を所定のパターンで変化させる期間から外される。

したがって、本実施形態の構造化照明顕微鏡システムは、干渉縞の位相シフトピッチを確実に保つことができる。因みに、位相シフトピッチが少しでもずれてしまうと、前述した分離演算が正しく行われない可能性があるので、位相シフトピッチを維持することは極めて重要である。

［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態について説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみ説明する。

図８は、本実施形態の微少変位測定器９０を説明する模式図である。

図８に示すとおり本実施形態の微少変位測定器９０では、超音波伝搬路Ｒｂの実際の長さＬｂを測定する微小変位測定器９０ｂと、超音波伝搬路Ｒｃの実際の長さＬｃを測定する微小変位測定器９０ｃとが省略される。

そして、本実施形態のＣＰＵが予め記憶するルックアップテーブルは、適正周波数ｆａ_−１、ｆａ_０、ｆａ_＋１の値を長さＬａの値ごとに記憶したテーブル（Ｌａ−ｆａテーブル）と、適正周波数ｆｂ_−１、ｆｂ_０、ｆｂ_＋１の値を長さＬａの値ごとに記憶したテーブル（Ｌａ−ｆｂテーブル）と、適正周波数ｆｃ_−１、ｆｃ_０、ｆｃ_＋１の値を長さＬａの値ごとに記憶したテーブル（Ｌａ−ｆｃテーブル）とである。

図９は、本実施形態のＣＰＵの動作フローチャートである。以下、各ステップを順に説明する。

ステップＳ１１：ＣＰＵは、微小変位測定器９０ａを駆動することにより超音波伝搬路Ｒａの長さＬａを測定する。

ステップＳ１２：ＣＰＵは、測定した長さＬａに応じてＬａ−ｆａテーブルを参照することにより、第１方向Ｄａの適正周波数ｆａ_−１、ｆａ_０、ｆａ_＋１を決定する。

ステップＳ１３：ＣＰＵは、切り換えスイッチ１９Ａ−２の接続先をトランスデューサ１８ａの側に設定することにより、構造化照明Ｓ’の方向を第１方向Ｄａに設定する。

ステップＳ１４：ＣＰＵは、トランスデューサ１８ａに与える交流電圧の周波数をｆａ_−１、ｆａ_０、ｆａ_＋１の間で変化させると共に、その変化の前後のタイミングで撮像装置１２を駆動することにより、画像データＩａ₁、Ｉａ₂、Ｉａ₃を取得する。

ステップＳ１５’：ＣＰＵは、微小変位測定器９０ａを駆動することにより超音波伝搬路Ｒａの長さＬａを測定する。

ステップＳ１６’：ＣＰＵは、測定した長さＬａに応じてＬａ−ｆｂテーブルを参照することにより、第２方向Ｄｂの適正周波数ｆｂ_−１、ｆｂ_０、ｆｂ_＋１を決定する。

ステップＳ１７：ＣＰＵは、切り換えスイッチ１９Ａ−２の接続先をトランスデューサ１８ｂの側に切り換えることにより、構造化照明Ｓ’の方向を第２方向Ｄｂに切り換える。

ステップＳ１８：ＣＰＵは、トランスデューサ１８ａに与える交流電圧の周波数をｆｂ_−１、ｆｂ_０、ｆｂ_＋１の間で変化させると共に、その変化の前後のタイミングで撮像装置１２を駆動することにより、画像データＩｂ₁、Ｉｂ₂、Ｉｂ₃を取得する。

ステップＳ１９’：ＣＰＵは、微小変位測定器９０ａを駆動することにより超音波伝搬路Ｒａの長さＬａを測定する。

ステップＳ２０’：ＣＰＵは、測定した長さＬａに応じてＬａ−ｆｃテーブルを参照することにより、第３方向Ｄｃの適正周波数ｆｃ_−１、ｆｃ_０、ｆｃ_＋１を決定する。

ステップＳ２１：ＣＰＵは、切り換えスイッチ１９Ａ−２の接続先をトランスデューサ１８ｃの側に切り換えることにより、構造化照明Ｓ’の方向を第３方向Ｄｃに切り換える。

ステップＳ２２：ＣＰＵは、トランスデューサ１８ｃに与える交流電圧の周波数をｆｃ_−１、ｆｃ_０、ｆｃ_＋１の間で変化させると共に、その変化の前後のタイミングで撮像装置１２を駆動することにより、画像データＩｃ₁、Ｉｃ₂、Ｉｃ₃を取得し、フローを終了する。

以上、本実施形態の構造化照明顕微鏡システムは、３つの方向の適正周波数の決定に、１つの微少変位測定器９０ａを兼用する。したがって、本実施形態の構造化照明顕微鏡システムの構成は、第１実施形態の構造化照明顕微鏡システムの構成よりも簡略化される。

［第１実施形態又は第２実施形態の変形例］
なお、第１実施形態又は第２実施形態のＣＰＵは、位相シフトに必要な３つの適正周波数の全てをルックアップテーブルに格納したが、一部の適正周波数（代表周波数）のみをルックアップテーブルに格納し、他の適正周波数については、代表周波数から計算により求めてもよい。

また、第１実施形態又は第２実施形態のＣＰＵは、超音波伝搬路の長さと適正周波数との関係をルックアップテーブルとして記憶したが、演算式として記憶してもよい。一般に、長さＬの超音波伝搬路に対して波本数ｎの超音波定在波を生成するために必要な適正周波数ｆは、ｆ＝v・ｎ／Ｌの式で表される（但し、vは媒体中の音速）。

また、第１実施形態又は第２実施形態において、適正周波数を決定・調整する手順は、構造化照明顕微鏡システムが観察の度に実行してもよいし、構造化照明顕微鏡システムが必要なときにのみ実行してもよいし、システムのユーザが任意のタイミングで実行してもよいし、構造化顕微鏡システムの製造者が出荷前に実行してもよい。

なお、調整の必要性は、例えば次のようにして判断すればよい。すなわち、ＣＰＵは、観察期間中に超音波伝搬路の長さを定期的又は継続的に測定し、測定した長さが前回の調整直後の長さから閾値以上変化していたときには、調整の必要性ありと判断し、そうでなかったときには、調整の必要性なしと判断する。

また、第１実施形態又は第２実施形態では、適正周波数の調整に関する手順の全部が自動で行われたが、その手順の一部を手動で行ってもよいことは言うまでもない。

［第３実施形態］
以下、本発明の第３実施形態について説明する。ここでは、第１実施形態又は第２実施形態との相違点のみ説明する。

図１０は、本実施形態の構造化照明顕微鏡システムの構成図である。

図１０に示すとおり、本実施形態の構造化照明顕微鏡システムでは、微少変位測定器９０の代わりにミラー２００が備えられる。ミラー２００は、標本１００と共通のステージ３００上に並べて配置されている。

本実施形態のＣＰＵは、ステージ３００を所定方向かつ所定距離だけ駆動することにより、標本１００の標本面１０の代わりにミラー２００の反射面２０を顕微鏡の光路（対物レンズ９の視野）へ挿入することができる。この状態でＣＰＵは、標本化照明Ｓ’の単体の輝度分布を画像（縞画像）として得ることが可能である。

また、ＣＰＵは、ステージ３００を反対方向に等距離だけ駆動することにより、標本１００の標本面１０及びミラー２００の反射面２０をそれぞれ元の位置に戻すこともできる。

図１１は、本実施形態のＣＰＵの動作フローチャートである。なお、ここでは、第１方向Ｄａに関するフローのみを説明し、第２方向Ｄｂ、第３方向Ｄｃに関するフローの説明は、第１方向Ｄａに関するフローと同様であるので省略する。

ステップＳ１０１：ＣＰＵは、ステージ３００を駆動することにより、標本１００の標本面１０の代わりにミラー２００の反射面２０を光路へ挿入する。

ステップＳ１０２：ＣＰＵは、切り換えスイッチ１９Ａ−２の接続先をトランスデューサ１８ａの側に設定することにより、構造化照明Ｓ’の方向を第１方向Ｄａに設定する。

ステップＳ１０３：ＣＰＵは、トランスデューサ１８ａに与える交流電圧の周波数を複数通りに変化させながら、撮像装置１２を繰り返し駆動することにより、複数の画像データを取得する。これら複数の画像データは、構造化照明Ｓ’の単体の輝度分布を示す「縞画像」である。これら複数の縞画像の間では、縞本数が異なるものとする。

ステップＳ１０４：ＣＰＵは、取得した複数の縞画像に対して共通の画像処理（縞本数を計数するための画像処理）を施すことにより、複数の縞画像の各々の縞本数を計数し、縞本数が所定値に一致していたときの交流電圧の周波数を見いだし、その周波数を第１方向Ｄａの適正周波数ｆａ_０とする。これによって、適正周波数ｆａ_０が仮決定されたことになる。

ステップＳ１０５：ＣＰＵは、トランスデューサ１８ａに与える交流電圧の周波数をｆａ_０の近傍で複数通りに変化させながら、撮像装置１２を繰り返し駆動することにより、複数の縞画像を取得する。なお、これら複数の縞画像の間では、縞本数は共通であるが、コントラストが異なるものとする。

ステップＳ１０６：ＣＰＵは、複数の縞画像に対して共通の画像処理（コントラストを計算するための画像処理）を施すことにより、複数の縞画像の各々のコントラストを計算し、コントラストが最大となったときの交流電圧の周波数を見いだし、その周波数を第１方向Ｄａの適正周波数ｆａ_０とする。これによって、適正周波数ｆａ_０が本決定されたことになる。

ステップＳ１０７：ＣＰＵは、本決定した適正周波数ｆａ_０に基づき適正周波数ｆａ_−１、ｆａ_＋１を決定する。なお、この決定は、計算によって行われてもよいし、予め用意したルックアップテーブル（ｆａ_０−ｆａ_−１テーブル、ｆａ_０−ｆａ_＋１テーブル）に基づき行われてもよい。

ステップＳ１０８：ＣＰＵは、ステージ３００を駆動することにより、ミラー２００の反射面２０の代わりに標本１００の標本面１０を光路へ挿入する。

ステップＳ１０９：トランスデューサ１８ａに与える交流電圧の周波数をｆａ_−１、ｆａ_０、ｆａ_＋１の間で変化させると共に、その変化の前後のタイミングで撮像装置１２を駆動することにより、画像データＩａ₁、Ｉａ₂、Ｉａ₃を取得する。

以上、本実施形態の調整部（微少変位測定器９０、制御装置１９）は、干渉縞（構造化照明Ｓ’）の画像である縞画像を検出し、検出した縞画像に応じて駆動信号の周波数（交流電圧の適正周波数ｆ）を調整するので、音波伝搬路の長さを検出せずとも、超解像に必要な一連の画像の各々の変調状態を保つことができる。

また、本実施形態の調整部は、検出した縞画像の縞本数が所定値となるように駆動信号の周波数を調整するので、超解像に必要な一連の画像の各々の変調度を良好に保つことができる。

また、本実施形態の調整部は、検出した縞画像の縞本数が所定値となり、かつ縞画像のコントラストが最高となるように駆動信号の周波数を調整するので、超解像に必要な複数の画像の各々の変調度及び画質を良好に保つことができる。

［第３実施形態の変形例］
なお、第３実施形態における周波数の決定には、ミラーの挿脱を要するため、第１実施形態における周波数の決定よりも時間がかかる。このため、第３実施形態のＣＰＵは、全方向の適正周波数の決定を、全方向の画像データの取得前に纏めて実行してもよい。このように纏めて実行すれば、ミラーの挿脱の回数を１回のみとすることができるので効率的である。

また、第３実施形態のＣＰＵは、各方向の縞画像に基づき各方向の適正周波数を決定したが、一部の方向の縞画像に基づき各方向の適正周波数を決定してもよい。

また、第３実施形態のＣＰＵは、位相シフトに必要な３つの適正周波数の一部（代表周波数）のみを縞画像に基づき決定し、他の適正周波数については代表周波数から計算により求めたが、位相シフトに必要な３つの適正周波数の全てを縞画像に基づき決定してもよい。その場合、ＣＰＵは、縞画像の縞本数が所定値となり、縞画像のコントラストが最大となり、しかも、縞画像の位相が所定値となるような周波数を、適正周波数とすればよい。

また、第３実施形態において、適正周波数を決定・調整する手順は、構造化照明顕微鏡システムが観察の度に実行してもよいし、構造化照明顕微鏡システムが必要なときにのみ実行してもよいし、システムのユーザが任意のタイミングで実行してもよいし、構造化顕微鏡システムの製造者が出荷前に実行してもよい。

なお、調整の必要性は、例えば次のようにして判断すればよい。すなわち、ＣＰＵは、観察期間中に撮像装置が取得する画像データのコントラストを計算し、計算したコントラストが前回の調整直後のコントラストから閾値以上低下していたときには、調整の必要ありと判断し、そうでなかったときには、調整の必要性なしと判断する。

また、第３実施形態では、適正周波数の調整に関する手順の全部が自動で行われたが、その手順の一部を手動で行ってもよいことは言うまでもない。

例えば、標本面と反射面とを入れ替える手順（Ｓ１０１、Ｓ１０８）や、周波数を変化させる手順（Ｓ１０３、Ｓ１０５）や、適正周波数を見いだす手順（Ｓ１０４、Ｓ１０６）などは、手動で行うことも可能である。

なお、周波数を変化させながら適正周波数を見いだす手順を手動で行う場合は、周波数の変化期間中における縞画像の縞本数やコントラストをヒトが監視できるよう、周波数の変化期間中に縞画像をリアルタイムで表示する必要がある。

また、標本面と反射面との入れ替えの手順を手動で行う場合は、標本の位置及び姿勢が変化しないよう、標本を光路に挿入したまま標本の直上に厚さの薄いミラーを置いたり外したりしてもよい。

［その他の変形例］
また、上述した実施形態の音響光学媒体１５は、３つの超音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃをスポットＳの中心に関して非対称な関係で配置していたが（図４参照）、例えば図１２に示すとおり対称な関係で配置してもよい。因みに、図４に示す例の利点は、音響光学媒体１５の外形の凹凸が少ないところにあり、図１２に示す例の利点は、３つの超音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃの環境が完全に一致するところにある。

また、上記説明では、超音波伝播路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃの長さを共通とし、トランスデューサ１８ａ、１８ｂ、１８ｃに与えられる交流電圧の周波数の変化パターンを共通としたが、これに限定されることは無い。

また、上記説明では、トランスデューサ１８ａ、１８ｂ、１８ｃの各々に与えられる交流電圧の周波数の変化パターンを、超音波定在波の波本数が１／２本ずつ変化するようなパターンとしたが、これに限定されることは無い。

また、上記説明では、第１方向及び第２方向及び第３方向の各々の構造化照明Ｓ’の位相シフトピッチを２π／３とするために、スポット（有効径）Ｓの中心から超音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃの各々の端部までの距離Ｄは、超音波伝搬路Ｒの伝搬方向の長さＬの１／３倍に設定した（Ｄ＝Ｌ／３）が、これに限定されることはない。

具体的には、超音波伝播路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃの各々は以下の条件を個別に満たしていればよい。

先ず、トランスデューサに与えられる交流電圧の周波数の変化パターンは、超音波定在波の波本数がＭ／２本ずつ変化するようなパターンであればよい（但し、｜Ｍ｜は１以上の整数）。

また、構造化照明Ｓ’の位相シフトピッチを任意の値Δψに設定するために、超音波伝搬路の何れか一方の端部から部分領域（例えばスポットＳ）の中心までの距離Ｄと、超音波伝搬路の全長Ｌとは、Ｄ：Ｌ＝Δψ／Ｍ：２πの関係を満たせばよい。
なお、標本面１０に干渉縞を形成するために、超音波光変調器３の超音波伝搬路Ｒ上で射出光束の通過領域（スポット）が、必ずしも超音波伝搬路Ｒの両端から離れた部分領域に制限されていなくともよく、例えば、超音波伝搬路Ｒを通過した光束を視野絞り５Ｂで絞った場合は、標本面１０における照明領域（観察領域、視野領域）に形成される干渉縞（構造化照明Ｓ’）に寄与する射出光束が通過したであろう超音波伝搬路Ｒの部分領域が、Ｄ：Ｌ＝Δψ／Ｍ：２πの関係を満たしていればよい。

因みに、Ｍ＝１とすれば、超音波定在波の本数が１／２本ずつしか変化しないので、その変化に起因して構造化照明Ｓ’の縞本数に生じるズレを極めて小さく抑えることができる。

また、Δψ＝２π／ｋ（但し、｜ｋ｜は２以上の整数）とすれば、上述した分離演算に必要な画像データ（複数枚の画像データ）を確実に取得することができる（なお、上記の説明では、位相シフトピッチΔψを２π／３としたので、画像データの必要枚数は３であったが、位相シフトピッチΔψが他の値であった場合には、画像データの必要枚数が３以外になることもある。）。

また、上記説明では、±１次回折光による干渉縞（２光束構造化照明）を標本面１０（光軸をZ方向とするとＸ-Ｙ面内）に形成する例を用いて説明しているが、本発明は、０次回折光及び±１次回折光による干渉縞（光軸方向にも干渉縞が形成される３光束構造化照明）を標本に形成する場合にも当然適用することができる。また、その場合の演算にも、例えば米国特許第８１１５８０６号明細書に開示された方法を用いることができる。

また、上記説明では、干渉縞（２光束干渉縞、３光束干渉縞）を形成するための回折光として、±１次回折光及び０次回折光の組み合わせを用いたが、他の組み合わせを用いてもよい。３光束干渉縞を形成するためには、回折次数の間隔が等間隔な３つの回折光による３光束干渉を生起させればよいので、例えば、０次回折光、１次回折光、２次回折光の組み合わせ、±２次回折光及び０次回折光の組み合わせ、±３次回折光及び０次回折光の組み合わせ、などを用いることが可能である。

また、本実施形態の説明では、±１次回折光による干渉縞の位相を変化させるために、超音波伝播路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃで生起される超音波定在波の波本数、即ち、超音波定在波の波長を、所定のパターンで変化させる一つの方法として、超音波光変調器３のトランスデューサ１８ａ、１８ｂ、１８ｃに与えられる交流電圧の周波数を所定のパターンで変化させることを説明したが、この方法限られないことは言うまでもない。

［第４実施形態］
以下、本発明の第４実施形態について図を用いて説明する。本実施形態は、第１実施形態の照明系を応用した面形状測定装置の実施形態である。

図１３は、本実施形態の面形状測定装置（パターン投影型の面形状測定装置）の構成図である。図１３に示すとおり面形状測定装置には、可干渉光源（レーザ光源）１１１と、制御装置１９’と、レンズ１１３と、ピンホール部材１１４と、超音波光変調器３’と、コリメータレンズＬと、撮像部１２０と、微小変位測定器９０と、が配置される。図１３中に符号１０’で示すのは、不図示のステージに配置された測定物の表面（測定対象面）１０’である。このうち、可干渉光源１１１と、レンズ１１３と、ピンホール部材１１４と、超音波光変調器３’と、コリメータレンズＬと、制御装置１９’とが、測定対象面１０’へ縞パターンを投影する投影部であり、不図示のステージの基準面に対して光軸が斜めになるように配置されている。

超音波光変調器３’には、第１実施形態で説明した超音波光変調器と同様の超音波光変調器が適用される。前述したＬ、φ、Ｄ、Ｍ、Δψ、ｋなどの各パラメータは、第１実施形態と同様の最適な関係に設定されている。

但し、本実施形態の超音波光変調器３’は光の分岐方向を切り換える必要が無いので、例えば図１４に示すとおり超音波光変調器３’の音響光学媒体１５’を四角柱状にし、その内部に形成される超音波伝搬路Ｒの数を１としても構わない。

超音波光変調器３’は、第１実施形態と同様、超音波伝搬路Ｒに超音波定在波を生起させることによって位相型回折格子の働きをする。超音波光変調器３’で分岐した回折光は、測定対象面１０’上に干渉縞を形成する。

微小変位測定器９０は、超音波光変調器３’の超音波伝搬路Ｒの実際の長さを測定する変位計である。この変位計は、第１実施形態で説明した微小変位測定器９０ａ、９０ｂ、９０ｃの何れか１つと同じ変位計である。

制御装置１９’は、超音波光変調器３’に与える交流電圧の周波数を第１実施形態で説明したのと同様のパターンで切り換えることが可能である。これによって、測定対象面１０’に投影される縞の位相は、第１実施形態における構造化照明Ｓ’の位相と同様に切り換わる。

撮像部１２０は、不図示のステージの基準面に対して光軸が垂直となるように配置されており、縞の投影された測定対象面１０’の像を撮像する。この撮像部１２０は、測定対象面１０’からの反射光を結像する結像光学系と、測定対象面１０’の画像を撮像する撮像素子とを有している。

撮像部１２０は、縞の位相が各状態にあるときに測定対象面１０’を撮像し、それによって取得した複数の画像データ（位相シフトピッチが２π／３であった場合は３つの画像データ）を不図示の演算装置へ送出する。その演算装置は、それら複数の画像データを所定の演算式（位相シフトピッチが２π／３であった場合は３バケット法の式）に当てはめることにより、測定対象面１０’の各位置の高さを算出する。

制御装置１９’は、第１実施形態の制御装置１９と同様、微小変位測定器９０により超音波光変調器３’の超音波伝搬路の長さを検出し、その長さに応じて、超音波光変調器３’に与える交流電圧の周波数を調整する。なお、調整に関する制御装置１９’の動作は、第１実施形態又はその変形例にて制御装置１９の動作として説明したものと同様である（但し、本実施形態では第１実施形態とは異なり縞の方向は１方向のみとなる。）。

以上、本実施形態の面形状測定装置は、光源（レーザ光源１１１）からの射出光束中に配置され、その射出光束を横切る方向に音波伝搬路を配した光変調器（超音波光変調器３’）と、音波伝搬路の媒体を振動させるための駆動信号を光変調器へ与えることにより、音波伝搬路内に音波定在波を生起させる駆動部（制御装置１９’）と、音波伝搬路を通過した射出光束の互いに異なる回折成分を干渉させ、その干渉縞を被観察物（測定対象面１０’）に形成する照明光学系（コリメータレンズＬ）とを備える。したがって、本実施形態の面形状測定装置の構成は、照明パターンの切り替えを高速化するのに適している。

しかも、本実施形態の面形状測定装置は、干渉縞の状態が所定の状態になるように駆動部（制御装置１９’）のパラメータを調整する調整部（微少変位測定器９０、制御装置１９’）を更に備えるので、環境に左右されやすい干渉縞の状態を所定の状態に保ち、面形状算出に必要な一連の画像の各々における縞の状態を良好に保つことができる。

なお、ここでは第１実施形態を応用した面形状測定装置を説明したが、第３実施形態を応用した面形状測定装置も同様に実現できることは言うまでもない。

なお、上述の各実施形態の要件は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した装置などに関する全ての公開公報及び米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。

１：光ファイバー、２：コレクタレンズ、３、３’：超音波光変調器、４：レンズ、５Ａ：０次光カットマスク、５Ｂ：視野絞り、９：対物レンズ、１０：標本面、１０’：測定対象面、１２：撮像装置、１３：画像記憶・演算装置、１９：制御装置、１４：画像表示装置、９０：微少変位測定器、１５、１５’：音響光学媒体、１６：圧電体、１８：トランスデューサ、１９Ａ：駆動回路、１９Ａ−１：高周波交流電源、１９Ａ−２：切り換えスイッチ

Claims (15)

1. 光源からの射出光束中に配置され、その射出光束を横切る方向に音波伝搬路を配した光変調器と、
   前記音波伝搬路の媒体を振動させるための駆動信号を前記光変調器へ与えることにより、前記音波伝搬路内に音波定在波を生起させる駆動部と、
   前記音波伝搬路を通過した前記射出光束の互いに異なる回折成分を干渉させ、その干渉縞を被観察物に形成する照明光学系と、
   前記音波伝搬路の長さに応じて変化し得る前記干渉縞の状態が予め決められた状態になるように前記駆動部のパラメータを調整する調整部と
   を備えたことを特徴とする構造化照明装置。
2. 請求項１に記載の構造化照明装置において、
   前記調整部による前記調整の対象は、
   前記駆動信号の周波数である
   ことを特徴とする構造化照明装置。
3. 請求項２に記載の構造化照明装置において、
   前記調整部は、
   前記音波伝搬路の長さを検出し、検出した長さに応じて前記駆動信号の周波数を調整する
   ことを特徴とする構造化照明装置。
4. 請求項３に記載の構造化照明装置において、
   前記調整部は、
   前記音波伝搬路の長さと前記駆動信号の適正周波数との関係を予め記憶し、検出した長さと前記関係とに基づき前記駆動信号の周波数を適正周波数に設定する
   ことを特徴とする構造化照明装置。
5. 請求項４に記載の構造化照明装置において、
   前記適正周波数は、
   前記干渉縞の縞本数が所定値となるような周波数である
   ことを特徴とする構造化照明装置。
6. 請求項５に記載の構造化照明装置において、
   前記適正周波数は、
   前記干渉縞の縞本数が所定値となり、かつ前記干渉縞のコントラストが最高となるような周波数である
   ことを特徴とする構造化照明装置。
7. 請求項２に記載の構造化照明装置において、
   前記調整部は、
   前記干渉縞の画像である縞画像を検出し、検出した縞画像に応じて前記駆動信号の周波数を調整する
   ことを特徴とする構造化照明装置。
8. 請求項７に記載の構造化照明装置において、
   前記調整部は、
   検出した縞画像の縞本数が所定値となるように前記駆動信号の周波数を調整する
   ことを特徴とする構造化照明装置。
9. 請求項７に記載の構造化照明装置において、
   前記調整部は、
   検出した縞画像の縞本数が所定値となり、かつ前記縞画像のコントラストが最高となるように前記駆動信号の周波数を調整する
   ことを特徴とする構造化照明装置。
10. 請求項２〜請求項９の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
    前記光変調器は、
    互いに交差した複数の前記音波伝搬路を有した光変調器であり、
    前記調整部は、
    複数の前記音波伝搬路の各々に関する前記駆動信号の周波数を調整する
    ことを特徴とする構造化照明装置。
11. 請求項２〜請求項１０の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
    前記駆動部は、
    前記駆動信号の周波数を所定のパターンで変化させることにより、前記被観察物上の観察対象領域に形成される前記干渉縞の位相を所定のパターンで変化させることが可能であり、
    前記調整部が前記駆動信号の周波数を調整するタイミングは、
    前記駆動部が前記位相を前記所定のパターンで変化させる期間から外される
    ことを特徴とする構造化照明装置。
12. 光源からの射出光束中に配置され、その射出光束を横切る方向に音波伝搬路を配した光変調器と、
    前記音波伝搬路の媒体を振動させるための駆動信号を前記光変調器へ与えることにより、前記音波伝搬路内に音波定在波を生起させる駆動部と、
    前記音波伝搬路を通過した前記射出光束の互いに異なる回折成分を干渉させ、その干渉縞を被観察物に形成する照明光学系と、
    を備えた構造化照明装置の調整方法であって、
    前記音波伝搬路の長さに応じて変化し得る前記干渉縞の状態が予め決められた状態になるように前記駆動部のパラメータを調整する調整手順を含む
    ことを特徴とする構造化照明装置の調整方法。
13. 光源からの射出光束中に配置され、その射出光束を横切る方向に音波伝搬路を配した光変調器と、
    前記音波伝搬路の媒体を振動させるための駆動信号を前記光変調器へ与えることにより、前記音波伝搬路内に音波定在波を生起させる駆動部と、
    前記音波伝搬路を通過した前記射出光束の互いに異なる回折成分を干渉させ、その干渉縞を被観察物に形成する照明光学系と、
    を備えた構造化照明装置のコンピュータが実行可能な調整プログラムであって、
    前記音波伝搬路の長さに応じて変化し得る前記干渉縞の状態が予め決められた状態になるように前記駆動部のパラメータを調整する調整手順を含む
    ことを特徴とするコンピュータが実行可能な調整プログラム。
14. 光源からの射出光束中に配置され、その射出光束を横切る方向に音波伝搬路を配した光変調器と、
    前記音波伝搬路の媒体を振動させるための駆動信号を前記光変調器へ与えることにより、前記音波伝搬路内に音波定在波を生起させる駆動部と、
    前記音波伝搬路を通過した前記射出光束の互いに異なる回折成分を干渉させ、その干渉縞を被観察物に形成する照明光学系と、
    前記音波伝搬路の長さに応じて変化し得る前記干渉縞の状態が予め決められた状態になるように前記駆動部のパラメータを調整する調整部と、
    前記干渉縞の形成された前記被観察物からの観察光束を結像する結像光学系と
    を備えたことを特徴とする構造化照明顕微鏡装置。
15. 光源からの射出光束中に配置され、その射出光束を横切る方向に音波伝搬路を配した光変調器と、
    前記音波伝搬路の媒体を振動させるための駆動信号を前記光変調器へ与えることにより、前記音波伝搬路内に音波定在波を生起させる駆動部と、
    前記音波伝搬路を通過した前記射出光束の互いに異なる回折成分を干渉させ、その干渉縞を被観察物に形成する照明光学系と、
    前記音波伝搬路の長さに応じて変化し得る前記干渉縞の状態が予め決められた状態になるように前記駆動部のパラメータを調整する調整部と、
    前記干渉縞の形成された前記被観察物の画像を検出する画像検出器と
    を備えたことを特徴とする面形状測定装置。

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