JP5738871B2 - β３アドレナリン作動性受容体アゴニスト及び抗ムスカリン剤を用いる併用療法 - Google Patents

Description

下部尿路の機能は、尿の貯蔵及び定期的な放出である。これには、中枢及び末梢神経エフェクターメカニズムの調整と、結果として生じる自律神経系の交感神経及び副交感神経成分、並びに体性運動経路の、調和のとれた調節とをもたらす、多様な求心性及び遠心性神経経路を含む、貯蔵及び排尿反射のオーケストレーションが必要である。これらは、膀胱（排尿筋）及び尿道平滑筋、並びに尿道括約筋の収縮状態を、近位で調節する。

過活動膀胱（ＯＡＢ）は、通常は頻度及び夜間頻尿に関連する、切迫性尿失禁を伴うか伴わない、尿意切迫の症状によって特徴づけられる。米国及び欧州におけるＯＡＢの有病率は、１８歳を超える女性及び男性双方の１６ないし１７％と推定されてきた。過活動膀胱は、最も多くの場合、特発性として分類されるが、神経学的症状、膀胱出口閉塞、及び他の原因の二次的なものでもあり得る。病理生理学的見地からは、過活動膀胱症候は、特に切迫尿失禁に付随する場合、排尿筋過活動が示唆される。切迫性は、失禁の有無にかかわらず、社会及び医療福祉の双方に負の影響を与えることが示されてきており、年間の直接及び間接的健康管理支出の面で、かなりの負担である。

抗ムスカリン剤は、ＯＡＢなどの失禁症状を治療するために使用されてきた。例えば、トルテロジン、又は（Ｒ）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−３−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）−３−フェニルプロパンアミンは、切迫尿失禁及び、他の不安定又は過活動性膀胱の症候の治療用に市販されてきた。トルテロジン及びその主要な活性代謝産物、トルテロジンの５−ヒドロキシメチル誘導体は、治療効果に貢献すると考えられている。しかしながら、抗ムスカリン剤を用いたＯＡＢのための今日の医薬療法は、しばしば多くの患者が、今日の治療に対し充分な応答を示さないこと、及び／又は今日の治療によるドライマウスなどの少なからぬ副作用に耐え得ないことから、最適とはいえない場合が多い。

それ故、ＯＡＢのより有効な治療及び／又は副作用の低減を提供する改善された療法に、継続した需要がある。

アイソボログラム分析を示す説明図である。 ＣＬ３１６２４３の、トルテロジン（Ａ）、オキシブチニン（Ｂ）、又はダリフェナシン（Ｃ）との併用により誘導される排尿筋収縮阻害のアイソボログラムを示す説明図である。 化合物１２、及びトルテロジン（Ａ）、及びダリフェナシン（Ｂ）の併用により誘導される排尿筋収縮阻害のアイソボログラムを示す説明図である。 メトクトラミンの前処理の有り無しでの、ＣＬ３１６２４３を示す説明図である。 メトクトラミンの前処理が有る（Ａ）か、又は無し（Ｂ）での、ＣＬ３１６２４３及びダリフェナシンの併用により誘導される排尿筋収縮阻害のアイソボログラムを示す説明図である。 様々な割合での、ＣＬ３１６２４３及びオキシブチニンの併用により誘導される排尿筋収縮阻害のアイソボログラムを示す説明図である。

発明の要旨
驚くべきことに、β３アドレナリン作動性受容体アゴニスト（以降、「β_３−ＡＲアゴニスト」）、抗ムスカリン剤、及び任意の選択的Ｍ_２アンタゴニストを用いた併用療法が、過活動膀胱の治療に相乗効果をもたらすことが判明してきた。β_３−ＡＲアゴニスト、抗ムスカリン剤、及び任意の選択的Ｍ_２アンタゴニストを含んでなる組合せ組成物もまた記載される。

発明の詳細な記載
本明細書に記載されるのは、過活動膀胱の治療法であり、これにおいて該方法は、β_３−ＡＲアゴニスト、抗ムスカリン剤、及び任意の選択的Ｍ_２アンタゴニストを、それを必要とする患者に投与することを含んでなる。かかる併用療法は、相乗効果及びしたがって、効力の改善及び／又は副作用の低減を提供する。

驚くべきことに、現在、β_３−ＡＲアゴニスト及び抗ムスカリン剤を含んでなる併用療法において、抗ムスカリン剤のＭ_２拮抗作用が、ＯＡＢの治療に相乗作用を与える上で重要な役割を果たし得ることが判明してきている。何らの理論にも束縛されることを望むものではないが、抗ムスカリン剤のＭ３拮抗作用がＯＡＢ効力にとり重要であることが、一般に信じられている（例えば、アブラムス（Ａｂｒａｍｓ）及びアンデルソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）、「ＢＪＵ Ｉｎｔ．」、２００７年、第１００巻、ｐ．９８７〜１００６参照）。今、Ｍ３拮抗作用及びβ_３−ＡＲアゴニストと一緒に作用するＭ_２拮抗作用が、相乗作用を提供することが判明してきた。

１つの実施態様においては、相乗効果は、β_３−ＡＲアゴニスト及び抗ムスカリン剤を含んでなる併用療法において得られており、これにおいて、抗ムスカリン剤は、約４０未満のＭ_２／Ｍ_３比を有する。別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は約２０未満のＭ_２／Ｍ_３比を有する。

さらに、抗ムスカリン剤が４０を超えるＭ_２／Ｍ_３比を有するとき、β_３−ＡＲアゴニスト及び抗ムスカリン剤を含んでなる併用療法において、追加の選択的Ｍ_２アンタゴニストを使用することにより、相乗作用が得られることがある。

本明細書で用いるとき、「相乗作用」又は「相乗効果」は、２種以上の活性薬剤の組合せ効果が、個々の活性薬剤の合計よりも大きい場合を記載するのに使用される。言い換えれば、２種以上の活性薬剤は、一方の活性薬剤の存在が第２の効果を増強又は拡大するように相互作用し得る。対照的に、２種以上の活性薬剤の組合せ効果が、個々の活性薬剤の合計に実質的に等しい場合、組合せ効果は単純に相加的であるが、相乗的ではない。また、２種以上の活性薬剤の組合せ効果が個々の活性薬剤の合計よりも低い場合、組合せ効果は相加的以下であり、これもまた相乗的ではない。

１つの実施態様においては、併用療法は、β_３−ＡＲアゴニスト及び抗ムスカリン剤を、それを必要とする患者に投与することを含んでなり、ここで、抗ムスカリン剤は、約４０未満のＭ_２／Ｍ_３比を有する。別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、約３０未満のＭ_２／Ｍ_３比を有する。別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、約２０未満のＭ_２／Ｍ_３比を有する。別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、約１５未満のＭ_２／Ｍ_３比を有する。なお別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、約１０未満のＭ_２／Ｍ_３比を有する。さらに別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、約１のＭ_２／Ｍ_３比を有する。

別の実施態様においては、併用療法における抗ムスカリン剤は、約０．１より大きいＭ_２／Ｍ_３比を有する。別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、約０．５より大きいＭ_２／Ｍ_３比を有する。別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、約０．８より大きいＭ_２／Ｍ_３比を有する。

別の実施態様においては、併用療法における抗ムスカリン剤は、約０．１ないし約４０のＭ_２／Ｍ_３比を有する。別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、約０．５ないし約３０のＭ_２／Ｍ_３比を有する。別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、約０．８ないし約２０のＭ_２／Ｍ_３比を有する。別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、約１ないし約２０のＭ_２／Ｍ_３比を有する。なお別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、約１ないし約１５のＭ_２／Ｍ_３比を有する。さらに別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、約１ないし約１０のＭ_２／Ｍ_３比を有する。

１つの実施態様においては、Ｍ_２／Ｍ_３比は、オータケ（Ｏｈｔａｋｅ）ら（「Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．」、２００７年、第３０巻、ｐ．５４〜５８）（これは、その記載全体が本明細書に援用される）において記載された受容体結合アッセイを使用して測定される。別の実施態様においては、Ｍ_２／Ｍ_３比は、ヘグデ（Ｈｅｇｄｅ）ら（「Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｒｕｇｓ」、２００４年、第５巻、ｐ．４０〜４９）（これは、その記載全体が本明細書に援用される）において記載されたアッセイを使用して測定される。

オータケ（Ｏｈｔａｋｅ）ら（「Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．」、２００７年、第３０巻、ｐ．５４〜５８）において報告された、いくつかの代表的な抗ムスカリン剤のＭ_１−Ｍ_４活性を、表１に示す。

ヘグデ（Ｈｅｇｄｅ）ら（「Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｒｕｇｓ」、２００４年、第５巻、ｐ．４０〜４９）は、いくつかの抗ムスカリン剤のＭ_１〜Ｍ_４活性を記載しており、トロスピウムのＭ_１〜Ｍ_４活性は、表２に示される。

併用療法に適した抗ムスカリン剤は、これに限定されないが：トルテロジン、オキシブチニン（Ｓ−オキシブチニンを含む）、ヒオシアミン、プロパンテリン、プロピベリン、トロスピウム（塩化トロスピウムを含む）、ソリフェナシン、ダリフェナシン、ジシクロミン、イプラトロピウム、オキシトロール、イミダフェナシン、フェソテロジン、テミベリン、ＳＶＴ−４０７７６、グラクソスミスクライン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）による２０２４０５、ＴＤ６３０１、ＲＢＸ９８４１、ＤＤＰ２００、及びＰＬＤ１７９を包含する。

１つの実施態様においては、抗ムスカリン剤は：トルテロジン、フェソテロジン、オキシブチニン、ソリフェナシン、プロピベリン、トロスピウム、イミダフェナシン、及びＴＤ６３０１からなる群より選択される。１つの実施態様においては、適切な抗ムスカリン剤のＭ_２／Ｍ_３比は、４０未満である。別の実施態様においては、Ｍ_２／Ｍ_３比は、３０未満である。別の実施態様においては、Ｍ_２／Ｍ_３比は、２０未満である。なお別の実施態様においては、Ｍ_２／Ｍ_３比は、１５未満である。１つの実施態様においては、Ｍ_２／Ｍ_３比は、オータケ（Ｏｈｔａｋｅ）ら、において記載された結合アッセイを用いて測定される。

別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は：トルテロジン、フェソテロジン、オキシブチニン、ソリフェナシン、プロピベリン、及びトロスピウムからなる群より選択される。

別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は：トルテロジン及びオキシブチニンからなる群より選択される。

なお別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、トルテロジンである。

適切なβ_３−ＡＲアゴニストは、これに限定されないが、ＣＬ３１６２４３、及び表３に示した化合物を包含する。

別の実施態様においては、β_３−ＡＲアゴニストは、表４に列記された化合物から選択される：

別の実施態様においては、β_３−ＡＲアゴニストは、

及び

からなる群より選択される。

なお別の実施態様においては、β_３−ＡＲアゴニストは、

である。

表３の化合物は、以下に記載された方法を用いて調製し得る。

本出願全体を通して、以下の用語は、別に記されない限り、示された意味を有する。

中間体１
ベンジル［３−（２−オキソブタ−３−エン−１−イル）フェニル］カルバメート（ｉ−１）：

工程Ａ： エチル（３−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝フェニル）アセタート

無水ＤＣＭ ２５０ｍＬ中のメチル（３−アミノフェニル）アセタート（２５ｇ、１４０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（２８．５ｍＬ、１５５ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を０℃に冷却し、窒素雰囲気下に置いた。この冷却された溶液に、次いでベンジルクロロホルマート（２１．１ｍＬ、１４８ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を一晩攪拌して、室温に温めさせた。反応物を、１Ｍ ＨＣｌ、水、及び次に食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。さらなる精製は不要であり、この物質（４４ｇ、９９％）をそのまま次の工程反応に使用した。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）３１４（ＭＨ）^＋，３３６（ＭＮａ）^＋．

工程Ｂ： （３−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝フェニル）酢酸

ＴＨＦ、エタノール、及び水（１：１：１、１５００ｍＬ）中のエチル（３−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝フェニル）アセタート（工程Ａより）４４．０ｇ（１４０ｍｍｏｌ）の溶液に、固体ＬｉＯＨ（１６．８ｇ、７００ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を油浴により６０℃で３時間加熱した。混合物を室温に一晩冷却し、次に濃ＨＣｌ ４０ｍＬを、２５℃未満の温度を維持しながら、溶液がおよそｐＨ２〜３になるまで徐々に添加した。酢酸エチル（３ｘ７５０ｍＬ）で抽出し、次に合わせ、有機物質を水で、次いで食塩水で洗浄した。有機物質を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。標題化合物（２４．７ｇ、８７％）を、さらに精製することなく次の工程反応に使用した。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）２８６（ＭＨ）^＋，３０８（ＭＮａ）^＋．

工程Ｃ： ベンジル（３−｛２−［メトキシ（メチル）アミノ］−２−オキソエチ
ル｝フェニル）カルバメート

ジクロロメタン ２００ｍＬ中の（３−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝フェニル）酢酸（工程Ｂより）２４．７ｇ（８７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、トリエチルアミン（３０．２ｍＬ、１７３ｍｍｏｌ）を添加し、これにより若干の発熱（＋５℃）を生じ、懸濁液は溶液化した。１０分間の冷却後、ＨＯＢｔ（１３．２ｇ、８７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンＨＣｌ（８．５ｇ、８７ｍｍｏｌ）を、続いてＥＤＣ（１６．６ｇ、８７ｍｍｏｌ）を溶液に添加し、得られた混合物を窒素雰囲気下、室温で一晩攪拌した。溶液を分液漏斗に移し、１Ｍ ＨＣｌで洗浄し、これによりエマルジョンを生じた。メタノールを添加して、エマルジョンを破壊し、水性物質を分配した。有機物質を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。残渣を７０％ヘキサン（酢酸エチル中）１０００ｍＬから再結晶化して（加熱還流し、次に室温に一晩冷却）、標題化合物（２１ｇ、７４％）を白色固体として得た。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）３２９（ＭＨ）＋．

工程Ｄ： ベンジル［３−（２−オキソブタ−３−エン−１−イル）フェニル］カルバメート（ｉ−１）
氷／水浴により０℃に冷却された、無水ＴＨＦ １０００ｍＬ中のベンジル（３−｛２−［メトキシ（メチル）アミノ］−２−オキソエチル｝フェニル）カルバメート（工程Ｃより）１５ｇ（４５．７ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下で、ビニルマグネシウムブロミドの１．０Ｍ溶液（ＴＨＦ中１００ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）をカニューレにより滴下添加し、得られた溶液を０℃で１時間攪拌した。５℃未満の温度を保ちながら１Ｍ ＨＣｌ ５００ｍＬを徐々に添加することにより、反応物をクエンチし、３０分間攪拌した。次に混合物を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機物質を水で、続いて食塩水で洗浄した。次いで有機物質を、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をバイオタージ（Ｂｉｏｔａｇｅ）７５Ｍフラッシュにより、３０％酢酸エチル（ヘキサン中）で溶出して精製し、標題化合物（１１ｇ、７８％）を明黄色の固体として得た。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）３１０（ＭＨ）^＋，３３２（ＭＮａ）^＋．^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：７．４４−７．３６（ｍ，７Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），６．７０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），６．４４（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，１７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．３２（ｄｄ，Ｊ＝１．１，１７．６Ｈｚ，１Ｈ），５．８５（ｄｄ，Ｊ＝１．１，１０．５Ｈｚ，１Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ），３．８６（ｓ，２Ｈ）．

中間体２
（（１Ｒ）−１−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（３−クロロフェニル）メチル］プロパ−２−エン−１−イル）カルバメート
（ｉ−２）

工程Ａ： １−（３−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オール

無水ＴＨＦ １００ｍＬ中の３−クロロベンズアルデヒド（２２．５ｇ、１６０ｍｍｏｌ）の冷却された溶液に、不活性窒素雰囲気下で、ＴＨＦ中のビニルマグネシウムクロリドの１．６Ｍ溶液（１００ｍＬ、１６０ｍｍｏｌ）を、シリンジにより徐々に添加し、溶液を室温に温めながら３時間攪拌した。反応物を、塩化アンモニウムの飽和溶液でクエンチし、有機層を分離し、酢酸エチル（２ｘ２００ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせ、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。４０Ｍ＋シリカゲルカラムを用いたホライズン（Ｈｏｒｉｚｏｎ）ＭＰＬＣにより、０〜４０％酢酸エチル（ヘキサン中）の勾配溶出液を用いて精製し、標題化合物（２２．４ｇ、４４％）を得た。
ｍ／ｚ（ＥＳ）１６８，１７０（Ｍ，Ｍ＋２）^＋，１９０，１９２（ＭＮａ，ＭＮａ＋２）^＋．^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：７．３８（ｓ，１Ｈ），７．３５−７．２２（ｍ，３Ｈ），５．９０（ｄｄｄ，Ｊ＝７．３，１０．０，１７．４Ｈｚ，１Ｈ），５．３８（ｄ，Ｊ＝１７．５Ｈｚ，１Ｈ），５．１８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），５．１５（ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，１Ｈ），０．９６（ｓ，９Ｈ），０．１８（ｓ，３Ｈ），０．０８（ｓ，３Ｈ）．

工程Ｂ： Ｔｅｒｔ−ブチル｛［１−（３−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−イル］オキシ｝ジメチルシラン

無水ＤＭＦ ９０ｍＬ中の１−（３−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オール（工程Ａより）２２．４ｇ（１３３ｍｍｏｌ）の溶液に、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（２０．０ｇ、１３３ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（１８．１ｇ、２６６ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を窒素下、室温で一晩攪拌した。水で洗浄し、酢酸エチルで抽出した。有機物質を分離し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。残渣を、フラッシュシリカゲルカラムにより、０〜１５％酢酸エチル（ヘキサン中）の勾配溶出液で溶出して精製し、標題化合物（１６．６ｇ、４６％）を得た。
ｍ／ｚ（ＥＳ）２８２，２８４（Ｍ，Ｍ＋２）^＋；１５１，１５３（Ｍ−ＯＴＢＳ，Ｍ−ＯＴＢＳ＋２）^＋．

工程Ｃ： ｛［Ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（３−クロロフェニル）アセトアルデヒド

ドライアイス／アセトン浴により−７８℃に冷却された、ジクロロメタン中のｔｅｒｔ−ブチル｛［１−（３−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−イル］オキシ｝ジメチルシラン（工程Ｂより）４．０ｇ（１４．２ｍｍｏｌ）の溶液に、溶液が淡い青色を維持するまでオゾンを通気した。次に、溶液が透明になるまで窒素ガスを通気した。溶液に硫化メチルを添加し、得られた混合物を室温で一晩攪拌した。この物質を真空下で濃縮し、残渣を、４０Ｍ＋シリカゲルカラムを用いたホライズンＭＰＬＣにより、０〜５０％酢酸エチル（ヘキサン中）の勾配溶出液で溶出して精製し、生成物（３．５７ｇ、８９％）を得た。

工程Ｄ： Ｎ−［（１Ｅ）−２−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−２−（３−クロロフェニル）エチリデン］−２−メチルプロパン−２−スルフィンアミド

無水ジクロロメタン ５０ｍＬ中の、｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（３−クロロフェニル）アセトアルデヒド（工程Ｃより）３．０ｇ（１０．６ｍｍｏｌ）及び（Ｒ又はＳ）−２−メチル−２−プロパンスルフィンアミド １．３ｇ（１０．６ｍｍｏｌ）の溶液に、硫酸銅（ＩＩ）（３．４ｇ、２１．２ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を、窒素雰囲気下、室温で１６時間攪拌した。反応物を水で洗浄し、ジクロロメタンで抽出した。有機物質を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。残渣を、４０Ｍ＋シリカゲルカラムを用いたホライズンＭＰＬＣにより、０〜２５％酢酸エチル（ヘキサン中）の勾配溶出液系で溶出して精製し、標題化合物（３．２６ｇ、８０％）を得た。
ｍ／ｚ（ＥＳ）３８７，３９０（Ｍ，Ｍ＋２）^＋．

工程Ｅ： Ｎ−｛１−［｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（３−クロロフェニル）メチル］−プロパ−２−エン−１−イル｝２−メチルプロパン−２−スルフィンアミド

窒素雰囲気下で０℃に冷却された、無水ＴＨＦ ２０ｍＬ中のＮ−［（１Ｅ）−２−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−２−（３−クロロフェニル）エチリデン］−２−メチルプロパン−２−スルフィンアミド（工程Ｄより）２．４ｇ（６．２０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ中のビニルマグネシウムクロリドの１．６Ｍ溶液（３．９０ｍＬ、６．２ｍｍｏｌ）をシリンジにより添加し、得られた混合物を１時間攪拌した。混合物を室温に温めさせ、さらに１時間攪拌した。反応物を塩化アンモニウム飽和溶液でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機物質を、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。残渣を、４０Ｍ＋シリカゲルカラムを用いたホライズンＭＰＬＣにより、０〜３５％酢酸エチル（ヘキサン中）の勾配溶出液系で溶出して精製し、４つのジアステレオマーを単一の異性体として得た。

ＮＭＲにより、得られた４つの生成物は、互いにジアステレオマーであった。異性体は、それらがシリカゲルカラムを溶出した際に標識付けした。溶出された最初の異性体を、異性体１とし、次に異性体２、３、及び最後に異性体４と命名した。

異性体１：ｍ／ｚ（ＥＳ）４１６，４１８（Ｍ，Ｍ＋２）^＋，４３８，４４０（ＭＮａ，ＭＮａ＋２）^＋．^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：７．３２（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．５，１Ｈ），７．２６（ｂｒ ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），７．２２−７．１８（ｍ，１Ｈ），５．６０（ｄｄｄ，Ｊ＝７．３，１０．３，１７．４Ｈｚ，１Ｈ），５．１５（ｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，１Ｈ），５．００（ｄ，Ｊ＝１７．３Ｈｚ，１Ｈ），４．５７（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９８−３．９４（ｍ，２Ｈ），１．６４（ｂｒ ｓ，１Ｈ），１．２３（ｓ，９Ｈ），０．９１（ｓ，９Ｈ），０．０８（ｓ，３Ｈ），−０．１８（ｓ，３Ｈ）．
異性体２：ｍ／ｚ（ＥＳ）４１６，４１８（Ｍ，Ｍ＋２）^＋，４３８，４４０（ＭＮａ，ＭＮａ＋２）^＋．^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：７．３３−７．３１（ｍ，２Ｈ），７．２６（ｂｒ ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），７．２０−７．１６（ｍ，１Ｈ），５．４４（ｄｄｄ，Ｊ＝７．２，１０．０，１７．４Ｈｚ，１Ｈ），５．２６（オーバーラップｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），５．２５（オーバーラップｄ，Ｊ＝１７．３Ｈｚ，１Ｈ），４．８４（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），４．０２（ｄｔ，Ｊ＝４．４，７．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８０（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），１．２０（ｓ，９Ｈ），０．９４（ｓ，９Ｈ），０．１４（ｓ，３Ｈ），−０．１２（ｓ，３Ｈ）．
異性体３：ｍ／ｚ（ＥＳ）４１６，４１８（Ｍ，Ｍ＋２）^＋，４３８，４４０（ＭＮａ，ＭＮａ＋２）^＋．^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：７．３２−７．２９（ｍ，２Ｈ），７．２６−７．２４（ｍ，２Ｈ），７．２２−７．２０（ｍ，１Ｈ），６．０４（ｄｄｄ，Ｊ＝７．１，１０．４，１７．４Ｈｚ，１Ｈ），５．４０（ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，１Ｈ），５．３２（ｄ，Ｊ＝１７．３Ｈｚ，１Ｈ），４．８０（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），３．８８−３．８０（ｍ，１Ｈ），３．５５（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ），１．０９（ｓ，９Ｈ），０．９５（ｓ，９Ｈ），０．０９（ｓ，３Ｈ），−０．１０（ｓ，３Ｈ）．
異性体４：ｍ／ｚ（ＥＳ）４１６，４１８（Ｍ，Ｍ＋２）^＋，４３８，４４０（ＭＮａ，ＭＮａ＋２）^＋．^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：７．３２（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．５，１Ｈ），７．２７−７．２５（ｍ，２Ｈ），７．２１−７．１８（ｍ，１Ｈ），５．９２（ｄｄｄ，Ｊ＝７．１，１０．３，１７．４Ｈｚ，１Ｈ），５．２３（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），５．１８（ｄ，Ｊ＝１７．４Ｈｚ，１Ｈ），４．７５（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８８−３．８２（ｍ，１Ｈ），３．３３（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ），１．１９（ｓ，９Ｈ），０．９４（ｓ，９Ｈ），０．０９（ｓ，３Ｈ），−０．１４（ｓ，３Ｈ）．

工程Ｆ： （（１Ｒ）−１−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（３−クロロフェニル）メチル］プロパ−２−エン−１−イル）カルバメート（ｉ−２）
Ｎ−｛１−［｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（３−クロロフェニル）メチル］−プロパ−２−エン−１−イル｝２−メチルプロパン−２−スルフィンアミドの異性体１（工程Ｅより）（５１０ｍｇ、２．２２ｍｍｏｌ）に、ジオキサン中の無水４Ｍ ＨＣｌ ５ｍＬを添加し、溶液を室温で１５分間攪拌した。反応物を濃縮乾燥し、トルエン（２ｘ５ｍＬ）と共沸させて、過剰のＨＣｌを除去した。次いで残渣を、窒素雰囲気下に置かれ、氷／水浴で０℃に冷却された、無水ジクロロメタン中に溶解し、次にベンジルクロロホルマート（０．３２ｍＬ、２．２２ｍｍｏｌ）をシリンジにより、続いてジイソプロピルエチルアミン（１．１９ｍＬ、６．６６ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を０℃で２時間攪拌した。溶液を真空下で濃縮乾燥し、残渣を分取用プレート（４ｘ１０００μＭ）により、２０％酢酸エチル（ヘキサン中）で溶出して精製し、標題化合物（７０３ｍｇ、７１％）を得た。
ｍ／ｚ（ＥＳ）４４６，４４８（Ｍ，Ｍ＋２）^＋，４６８，４７０（ＭＮａ，ＭＮａ＋２）^＋．^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：７．３２（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．５，１Ｈ），７．２７−７．２５（ｍ，２Ｈ），７．２１−７．１８（ｍ，１Ｈ），５．９２（ｄｄｄ，Ｊ＝７．１，１０．３，１７．４Ｈｚ，１Ｈ），５．２３（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），５．１８（ｄ，Ｊ＝１７．４Ｈｚ，１Ｈ），４．７５（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８８−３．８２（ｍ，１Ｈ），３．３３（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ），１．１９（ｓ，９Ｈ），０．９４（ｓ，９Ｈ），０．０９（ｓ，３Ｈ），−０．１４（ｓ，３Ｈ）．

上記記載のものに関連した、立体化学を異にする中間体は、適切な出発物質から、上記記載の方法を用いて調製し得る。

中間体３
Ｔｅｒｔ−ブチル（５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（ｉ−３）

工程Ａ： ベンジル｛４−［（３Ｅ，５Ｒ，６Ｒ）−５−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ−６−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−６−（３−クロロフェニル）−２−オキソヘキサ−３−エン−１−イル］フェニル｝カルバメート

無水ジクロロメタン ７ｍＬ中の、ベンジル［３−（２−オキソブタ−３−エン−１−イル）フェニル］カルバメート（ｉ−１）（８２０ｍｇ、２．８０ｍｍｏｌ）及び（（１Ｒ）−１−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（３−クロロフェニル）メチル］プロパ−２−エン−１−イル）カルバメート
（ｉ−２）（５００ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、チャン（Ｚｈａｎ）Ｉ触媒（７４０ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を添加し、得られた緑色の溶液を、窒素雰囲気下、４０℃で一晩加熱した。反応物を濃縮乾燥し、残渣を分取用プレート（４ｘ１０００μＭ）により、４０％酢酸エチル（ヘキサン中）で溶出して精製し、標題化合物（３４８ｍｇ、５０％）を得た。
ｍ／ｚ（ＥＳ）７１３，７１５（Ｍ，Ｍ＋２）^＋，７３５，７３７（ＭＮａ，ＭＮａ＋２）^＋．

工程Ｂ： ４−（｛（５Ｒ）−５−［（Ｒ）−（［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ）（フェニル）メチル］ピロリジン−２−イル｝メチル）アニリン

エタノール ２５ｍＬ中のベンジル｛４−［（３Ｅ，５Ｒ，６Ｒ）−５−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ−６−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−６−（３−クロロフェニル）−２−オキソヘキサ−３−エン−１−イル］フェニル｝カルバメート（工程Ａより）３２８ｍｇ（０．４６ｍｍｏｌ）の溶液に、１０％パラジウム炭素を添加し、水素ガスのバルーンにより、懸濁液を水素雰囲気下に置いた。反応物を、水素下、室温で１時間攪拌した。ＴＬＣは、反応が完了したことを示した。ギルメン（Ｇｉｌｍｅｎ）０．４５μＭ ＰＴＦＥシリンジフィルターを用いて触媒を濾去し、エタノール（４ｘ５ｍＬ）で洗浄した。濾液を真空下で濃縮乾燥し、残渣を分取用プレート（３ｘ１０００μＭ）により、５％メタノール（ジクロロメタン中）で溶出して精製し、標題化合物（１２１ｍｇ、６６％）を得た。
ｍ／ｚ（ＥＳ）３９７（ＭＨ）^＋．

工程Ｃ： Ｔｅｒｔ−ブチル（５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−
５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（ｉ−３）
無水ＴＨＦ ５ｍＬ中の４−（｛（５Ｒ）−５−［（Ｒ）−（［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ）（フェニル）メチル］ピロリジン−２−イル｝メチル）アニリン（工程Ｂより）１２１ｍｇ（０．３１５ｍｍｏｌ）の溶液に、ｔｅｒｔ−ブチルカルボナート（６９ｍｇ、０．３１５ｍｍｏｌ）を、続いてＴＥＡ（４４μＬ、０．３１５ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を、窒素雰囲気下、室温で一晩攪拌した。反応混合物を直接、分取用プレート（１５００μＭ）にのせ、３０％酢酸エチル（ヘキサン中）で溶出して、標題化合物（１００ｍｇ、６４％）を得た。
ｍ／ｚ（ＥＳ）４９７（ＭＨ）^＋，３９７（Ｍ−Ｂｏｃ）^＋．^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：７．４０−７．３０（ｍ，５Ｈ），６．７５−６．６８（ｍ，２Ｈ），６．５６−６．５１（ｍ，２Ｈ），５．５２−５．４８（ｍ，１Ｈ），５．３２−５．２８（ｍ，１Ｈ），４．１６−４．０６（ｍ，２Ｈ），３．８８−３．８２（ｍ，１Ｈ），３．７６−３．７０（ｍ，１Ｈ），３．５５−３．４８（ｍ，２Ｈ），２．７４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ），２．４４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ），２．０５−１．９４（ｍ，１Ｈ），１．９０−１．８２（ｍ，１Ｈ），１．６０（ｓ，９Ｈ），１．５０−１．４２（ｍ，１Ｈ），１．３２−１．２２（ｍ，２Ｈ），１．１０−１．０２（ｍ，１Ｈ），０．９５（ｓ，９Ｈ），０．０８（ｓ，３Ｈ），−０．１５（ｓ，３Ｈ）．

中間体４ａ及び中間体４ｂの分離
Ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ，５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（ｉ−４ａ）；
Ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（ｉ−４ｂ）

工程Ａ： Ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ，５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（ｉ−４ａ）及びｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（ｉ−４ｂ）
中間体ｉ−３（ｔｅｒｔ−ブチル（５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（シス及びトランスの４：１混合物）を、メタノール中に溶解し、バージャー（Ｂｅｒｇｅｒ）マルチグラム（Ｍｕｌｔｉｇｒａｍ）ＳＦＣ（超臨界）により、３０％メタノール：６０％二酸化炭素の溶出液を用いて精製し、２つのジアステレオマーを分離した。カラムの最初の異性体を、副異性体１とし、２番目の異性体を主異性体２と標識した。
ｉ−４ａ：ｍ／ｚ（ＥＳ）４９７（ＭＨ）^＋，３９７（Ｍ−Ｂｏｃ）^＋．^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：７．４０−７．３０（ｍ，５Ｈ），６．７５−６．６８（ｍ，２Ｈ），６．５６−６．５１（ｍ，２Ｈ），５．５２−５．４８（ｍ，１Ｈ），５．３２−５．２８（ｍ，１Ｈ），４．１６−４．０６（ｍ，２Ｈ），３．８８−３．８２（ｍ，１Ｈ），３．７６−３．７０（ｍ，１Ｈ），３．５５−３．４８（ｍ，２Ｈ），２．７４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ），２．４４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ），２．０５−１．９４（ｍ，１Ｈ），１．９０−１．８２（ｍ，１Ｈ），１．６０（ｓ，９Ｈ），１．５０−１．４２（ｍ，１Ｈ），１．３２−１．２２（ｍ，２Ｈ），１．１０−１．０２（ｍ，１Ｈ），０．９５（ｓ，９Ｈ），０．９２（ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ），０．１２（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ，３Ｈ），−０．０４（ｓ，３Ｈ）．ＳＦＣで８．７０ｍｉｎに溶出、異性体２。
ｉ−４ｂ：ｍ／ｚ（ＥＳ）４９７（ＭＨ）^＋，３９７（Ｍ−Ｂｏｃ）^＋．^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：７．４０−７．３０（ｍ，５Ｈ），６．７６−６．６８（ｍ，２Ｈ），６．５６−６．５１（ｍ，２Ｈ），５．５２−５．４８（ｍ，１Ｈ），５．３２−５．２８（ｍ，１Ｈ），４．１６−４．０６（ｍ，２Ｈ），３．８８−３．８２（ｍ，１Ｈ），３．７６−３．７０（ｍ，１Ｈ），３．６０−３．４６（ｍ，２Ｈ），２．７２（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ），２．４４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１Ｈ），２．０５−１．９４（ｍ，１Ｈ），１．９０−１．８２（ｍ，１Ｈ），１．６４（ｓ，９Ｈ），１．５０−１．４２（ｍ，１Ｈ），１．３２−１．２２（ｍ，２Ｈ），１．１０−１．０２（ｍ，１Ｈ），０．９５（ｓ，９Ｈ），０．１４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１３．８Ｈｚ，３Ｈ），０．０９（ｓ，３Ｈ）．ＳＦＣで７．７８ｍｉｎに溶出、異性体１。

中間体４ａ及び中間体４ｂの合成
Ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ，５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（ｉ−４ａ）；
Ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（ｉ−４ｂ）

工程Ａ： （４Ｓ）−３−ヘキサ−５−イノイル−４−フェニル−１，３−オキサゾリジン−２−オン

無水テトラヒドロフラン １．０Ｌ中の、５−ヘキシン酸 ６９．０ｇ（６１５ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン ２１４ｍＬ（１５４０ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下、−２５℃で、トリメチルアセチルクロリド ８３．０ｍＬ（６７７ｍｍｏｌ）を２０分間にわたり添加した。添加により白色沈殿が生成され、得られた懸濁液を２時間攪拌した。次に、無水塩化リチウム ２８．７ｇ（６７７ｍｍｏｌ）及び、（４Ｓ）−４−フェニル−１，３−オキサゾリジン−２−オン １００．０ｇ（６１５．０ｍｍｏｌ）を連続的に添加し、混合物を１２時間で徐々に室温に温めた。全揮発性物質を真空中で除去し、残渣を水（１Ｌ）で希釈し、酢酸エチル（３ｘ３００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を食塩水（２５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。粗残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、５〜５０％酢酸エチル（ヘキサン中）の勾配で溶出して精製し、標題化合物を無色の固体として得た（１３５ｇ、８５．４％）。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ７．４０−７．３７（ｍ，２Ｈ），７．３６−７．３２（ｍ，１Ｈ），７．３１−７．２８（ｍ，２Ｈ），５．４２（ｄｄ，Ｊ＝８．９，３．７Ｈｚ，１Ｈ），４．６９（ｔ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），４．２８（ｄｄ，Ｊ＝９．２，３．７Ｈｚ，１Ｈ），３．１３−３．０２（ｍ，２Ｈ），２．２４−２．２１（ｍ，２Ｈ），１．９４（ｔ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），１．８４（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）．
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）２５８．２（ＭＨ）^＋．

工程Ｂ： （４Ｓ）−３−｛（２Ｒ）−２−［（Ｓ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ヘキサ−５−イノイル｝−４−フェニル−１，３−オキサゾリジン−２−オン

無水酢酸エチル ２６５ｍＬ中の上記工程Ａよりの（４Ｓ）−３−ヘキサ−５−イノイル−４−フェニル−１，３−オキサゾリジン−２−オン ５６．８ｇ（２２１ｍｍｏｌ）の攪拌された溶液に、窒素雰囲気下、室温で、無水塩化マグネシウム ６．３１ｇ（６６．２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン ６１．５ｍＬ（４４２ｍｍｏｌ）、ベンズアルデヒド ２６．９ｍＬ（２６５ｍｍｏｌ）、及びクロロトリメチルシラン ４２．３ｍＬ（３３１ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を７２時間攪拌した。不均一な反応混合物を、シリカゲル３００ｍＬのプラグを通し、さらに酢酸エチル １Ｌで溶出して濾過した。濾液を真空中で蒸発乾燥させ、残渣をメタノール ２６５ｍＬ及びトリフルオロ酢酸 １０ｍＬ中に懸濁した。得られた混合物を、窒素下、室温で５時間攪拌し、この間に反応は均一化した。次に全揮発性物質を真空中で除去し、残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーにより、５〜１５％酢酸エチル（ヘキサン中）の勾配で溶出して精製し、標題化合物を白色固体として得た（６５．０ｇ、８１．２％）。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ７．３０−７．２８（ｍ，８Ｈ），７．０９−７．０７（ｍ，２Ｈ），５．４２（ｄｄ，Ｊ＝８．７，３．７Ｈｚ，１Ｈ），４．７６−４．７２（ｍ，１Ｈ），４．７２−４．６７（ｍ，１Ｈ），４．６５（ｔ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），４．１８（ｄｄ，Ｊ＝８．７，３．７Ｈｚ，１Ｈ），３．０５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），２．２４（ｔｄ，Ｊ＝７．１，２．５Ｈｚ，２Ｈ），２．００−１．９３（ｍ，２Ｈ），１．６７−１．６１（ｍ，１Ｈ）．
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）３４６．１（ＭＨ−Ｈ_２Ｏ）^＋，３８６．０（ＭＮａ）^＋．

工程Ｃ： （２Ｒ）−２−［（Ｓ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ヘキサ−５−イン酸

無水テトラヒドロフラン対水の、２０対１混合物 １０５０ｍＬ中の上記工程Ｂよりの（４Ｓ）−３−｛（２Ｒ）−２−［（Ｓ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ヘキサ−５−イノイル｝−４−フェニル−１，３−オキサゾリジン−２−オン ６５．０ｇ（１７９ｍｍｏｌ）の攪拌された溶液に、窒素雰囲気下、０℃で、３５％過酸化水素水溶液 ７７．０ｍＬ（８９４ｍｍｏｌ）を、内部温度を３℃未満に維持するべく充分遅い速度で添加した。次に、１．０Ｍ 水酸化リチウム水溶液 ３９５ｍＬ（３９５ｍｍｏｌ）を、反応の内部温度を５℃未満に維持するべく充分遅い速度で添加し、得られた混合物を０℃で３時間攪拌した。混合物の内部温度を５℃未満に維持するべく充分遅い速度での１．３Ｍ 亜硫酸ナトリウム水溶液 ７５５ｍＬ（９８４ｍｍｏｌ）により、反応物をクエンチした。全揮発性物質を真空中で除去し、残留する水相を酢酸エチル（３ｘ２００ｍＬ）で抽出した。水相を０℃に冷却し、６Ｍ 塩化水素水溶液でｐＨ３に達するまで酸性化した。次に水相を酢酸エチル（３ｘ３００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物質を食塩水（１００ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、真空蒸発させた。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーにより、５〜１０％酢酸エチル及び３％酢酸（ヘキサン中）の勾配で溶出して精製し、標題化合物を無色のガムとして得た（３２．０ｇ、８２．０％）。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ７．３９−７．２８（ｍ，５Ｈ），４．８５（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ），３．０３−２．９７（ｍ，１Ｈ），２．２９−２．１５（ｍ，２Ｈ），１．９７（ｔ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），１．９３−１．８２（ｍ，１Ｈ），１．６２−１．５５（ｍ，１Ｈ）．
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）２０１．０（ＭＨ−Ｈ_２Ｏ）^＋．

工程Ｄ： （２Ｒ）−２−［（Ｓ）−｛［Ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ヘキサ−５−イン酸

無水アセトニトリル ５００ｍＬ中の上記工程Ｃよりの（２Ｒ）−２−［（Ｓ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ヘキサ−５−イン酸 ３２．０ｇ（１４７ｍｍｏｌ）の攪拌された溶液に、窒素雰囲気下、室温で、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン ７７．０ｍＬ（５１３ｍｍｏｌ）、２２ｍＬ、続いてｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド ６６．３ｇ（４４０ｍｍｏｌ）を３回に分けて１０分間で添加した。反応混合物を４時間攪拌し、真空蒸発させて、全揮発性物質を除去した。残渣を、ジクロロメタン ３００ｍＬ及び水 １００ｍＬで希釈した。１．０Ｍ 塩化水素水溶液を、水層においてｐＨ３が達成されるまで混合物に添加した。相を分離し、水相をジクロロメタン（２ｘ１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物質を、水（５０ｍＬ）、食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、次に硫酸マグネシウム上で乾燥した。濾過及び真空蒸発の後、残渣を、メタノール ３５０ｍＬ中に溶解し、０．８Ｍ炭酸カリウム水溶液 ３５０ｍＬ（２８０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を１．５時間攪拌し、次いで真空蒸発させて、全揮発性物質を除去した。残渣を、ジクロロメタン ３００ｍＬで希釈し、水相を５．０Ｍ 塩化水素水溶液でｐＨ３に達するまで酸性化した。相を分離し、ジクロロメタン（２ｘ１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物質を、水（５０ｍＬ）、食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、次に硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、真空蒸発させた。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーにより、３〜１５％酢酸エチル（ヘキサン中）の勾配で溶出して精製し、標題化合物を無色の固体として得た（４２．３ｇ、８６．６％）。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ７．３６−７．２７（ｍ，５Ｈ），４．７８（ｄ，Ｊ＝８．７，１Ｈ），２．９０−２．８６（ｍ，１Ｈ），２．１９−２．１１（ｍ，１Ｈ），２．１０−２．０３（ｍ，１Ｈ），１．９０（ｔ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），１．７５−１．６７（ｍ，１Ｈ），１．４１−１．３４（ｍ，１Ｈ），０．８３（ｓ，９Ｈ），０．０２（ｓ，３Ｈ），−０．２７（ｓ，３Ｈ）．
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）３３３．２（ＭＨ）^＋．

工程Ｅ： ４−メトキシベンジル ｛（１Ｒ）−１−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ペンタ−４−イン−１−イル｝カルバメート

無水トルエン ４００ｍＬ中の、上記工程Ｄよりの（２Ｒ）−２−［（Ｓ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ヘキサ−５−イン酸 ４０．０ｇ（１２０ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン ３３．５ｍＬ（２４１ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下、室温で、ジフェニルホスホリルアジド ３７．５ｍＬ（１３２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を５時間攪拌し、次に４−メトキシベンジルアルコール ３７．５ｍＬ（３０１ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を１０５℃で１６時間加熱し、室温に冷却し、次いで飽和重炭酸塩水溶液 ２５０ｍＬで希釈した。相を分離し、水相を酢酸エチル（２ｘ１５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物質を、水（１００ｍＬ）、食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、次に硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、真空蒸発させた。粗残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーにより、３〜１０％ 酢酸エチル（ヘキサン中）で溶出して精製し、標題化合物を無色の油として得た（５０．９ｇ、９０．５％）。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：７．２８−７．２１（ｍ，７Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），４．９２（ｓ，２Ｈ），４．７７−４．５９（ｍ，２Ｈ），３．８９−３．８４（ｍ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），２．３０−２．２２（ｍ，２Ｈ），１．９５（ｍ，１Ｈ），１．９１−１．８５（ｍ，１Ｈ），１．５７−１．５０（ｍ，１Ｈ），０．８９（ｓ，９Ｈ），０．０６（ｓ，３Ｈ），−０．１５（ｓ，３Ｈ）．
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）４６８．１（ＭＨ）^＋，４９０．０（ＭＮａ）^＋．

工程Ｆ： ４−メトキシベンジル ［（１Ｒ）−１−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］−５−（４−ニトロフェニル）ペンタ−４−イン−１−イル］カルバメート

無水ＤＭＦ（５００ｍｌ）中の、アセチレン（工程Ｅより、４０ｇ、８０ｍｍｏｌ）及び４−ヨードニトロベンゼン（２１．８ｇ、８８ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（１１１ｍＬ、７９７ｍｍｏｌ）を添加した。Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２（１．９５ｇ、２．３９ｍｍｏｌ）、及びヨウ化銅（Ｉ）（９１０ｍｇ、４．７８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を窒素で脱気し（１５分間通気）、得られた溶液を室温で５時間攪拌した。混合物を水（１２００ｍｌ）に注入し、ＥｔＯＡｃ（３ｘ３００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物質を、次に水（２ｘ５００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、真空下で蒸発させた。残渣を、ＭＰＬＣ（ホライズン（Ｈｏｒｉｚｏｎ）バイオタージ（Ｂｉｏｔａｇｅ）２ｘフラッシュ（Ｆｌａｓｈ）６５ｉ）により、０〜３０％酢酸エチル（ヘキサン中）の勾配で溶出して精製し、４１ｇ（８４％）を暗赤色の油として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：８．１１−８．０４（ｍ，２Ｈ），７．９４−８．０１（ｍ，１Ｈ），７．３８−７．２１（ｍ，８Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），４．９８（ｓ，２Ｈ），４．７７−４．５９（ｍ，２Ｈ），４．００−３．９５（ｍ，３Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），２．５６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｈ＝２Ｈ），２．００−１．９５（ｍ，１Ｈ），１．６６−１．６１（ｍ，１Ｈ），０．９３（ｓ，９Ｈ），０．１０（ｓ，３Ｈ），−０．１０（ｓ，３Ｈ）．
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）５８９．３（ＭＨ）^＋，６１１．２（ＭＮａ）^＋．

工程Ｇ： ４−メトキシベンジル［（１Ｒ）−１−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］−５−（４−ニトロフェニル）−４−オキソペンチル］カルバメート

ＤＭＦ（４０ｍＬ）中のニトロフェニルアセチレン（工程Ｆより、４１ｇ、６５．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ピロリジン（１４ｍＬ、１９６．５ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を８０℃で３時間加熱した。混合物を室温に冷却し、１０％酢酸溶液（水中）（１１０ｍｌ）を添加し、得られた混合物を室温でさらに３時間攪拌した。混合物を水（３００ｍｌ）に注入し、ＥｔＯＡｃ（３ｘ２５０ｍｌ）で抽出し；合わせたＥｔＯＡｃ層を水（２ｘ２５０ｍｌ）、飽和ＮａＣｌ（１００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣を、ホライズン・フラッシュ７５により、１００％ヘキサンから５０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）まで上昇する勾配で溶出して精製し、３４ｇ（８１％）を暗橙色の油として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：８．１７−８．１４（ｍ，２Ｈ），７．３２−７．２３（ｍ，９Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），４．９６（ｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１Ｈ），４．９０（ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．７２（ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ，１Ｈ），４．１６−４．１３（ｍ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．７１−３．７７（ｍ，２Ｈ），２．６５−２．５２（ｍ，２Ｈ），１．９７−１．９２（ｍ，１Ｈ），１．７２−１．６０（ｍ，１Ｈ），０．９３（ｓ，９Ｈ），０．０５（ｓ，３Ｈ），−０．１３（ｓ，３Ｈ）．

工程Ｈ： （２Ｒ，５Ｓ）−２−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］−５−（４−ニトロベンジル）ピロリジン（２Ｒ，５Ｒ）−２−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］−５−（４−ニトロベンジル）ピロリジン

ＤＣＭ（３５０ｍｌ）中のＭＯＺ保護されたケトンアミン（工程Ｇより、３４ｇ、５６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（２５６ｍｌ）を添加し、得られた混合物を室温で１．５時間攪拌した。溶液を真空下で蒸発させ、残渣をＤＣＭと飽和ＮａＨＣＯ_３との間で分配した。有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣をＭｅＯＨ（７５０ｍｌ）中に溶解し、氷／水浴で０℃に冷却した。次にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（２１．２ｇ、３３７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を一晩攪拌して室温に温めさせた。水の添加により混合物をクエンチし、有機物質を真空下で除去した。次いで水層をＥｔＯＡｃ（２ｘ）で抽出し、合わせたＥｔＯＡｃ層を飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、真空下で蒸発させた。残渣をシリカ上でのカラムクロマトグラフィー（溶出液：１００％ヘキサンから３５％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）まで上昇する勾配）により精製し、１６．４ｇ（６３．４％）の最初の異性体、（２Ｒ，５Ｓ）−２−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］−５−（４−ニトロベンジル）ピロリジン、及び３．１ｇ（１２％）の２番目の異性体、（２Ｒ，５Ｒ）−２−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］−５−（４−ニトロベンジル）ピロリジンを得た。
異性体１：ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）４２７．３（ＭＨ）^＋
異性体２：ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）４２７．３（ＭＨ）^＋

工程Ｉ： Ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｓ）−２−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］−５−（４−ニトロベンジル）ピロリジン−１−カルボキシラート

無水ＴＨＦ中のｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｓ）−２−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］−５−（４−ニトロベンジル）ピロリジン−１−カルボキシラート（１２ｇ、４２．５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｂｏｃ無水物（９．３ｇ、４２．５ｍｍｏｌ）を、続いてＴＥＡ（１７．７６ｍＬ、１２７．４ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を、窒素雰囲気下、室温で２時間攪拌した。混合物を水（１００ｍＬ）で洗浄し、酢酸エチル（２ｘ２００ｍＬ）で抽出した。有機物質を、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をホライズン・バイオタージＭＰＬＣ（６５ｉシリカゲルカラム）により、２０〜７５％酢酸エチル（ヘキサン中）の勾配で溶出して精製し、所望の生成物を得た。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）５２７．３（ＭＨ）^＋，５４９．２（ＭＮａ）^＋．

工程Ｊ： Ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｒ）−２−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］−５−（４−ニトロベンジル）ピロリジン−１−カルボキシラート

シスピロリジン異性体をトランス異性体、（２Ｒ，５Ｒ）−２−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］−５−（ニトロベンジル）ピロリジンで置き換えたことを除いて、工程Ｉと同様の方法で調製した。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）５２７．３（ＭＨ）^＋，５４９．２（ＭＮａ）^＋．

工程Ｋ： Ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ，５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（ｉ−４ａ）；

５００ｍＬのパー・シェイカー・フラスコに、１０％ Ｐｄ／ｃ（４．７５ｇ）を装入し、これにメタノール １００ｍＬを添加して、触媒を覆った。次いで懸濁液に、メタノール（８０ｍＬ）中の工程Ｉからのニトロ中間体（８．５ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）の溶液を、続いて１．０Ｍの塩化水素（メタノール中）溶液 １５．４ｍＬを添加した。反応容器を５０ＰＳＩの水素ガス下に置き、混合物を一晩振盪した。アリコートを採り、ＬＣ−ＭＳにより分析し、反応完了が示された。

セライトを用いて触媒を濾去し、メタノール（２ｘ１００ｍＬ）で洗浄した。濾液を濃縮乾燥し、生成物をホライズンＭＰＬＣ（６５ｉシリカカラム）により、０％から３０％酢酸エチル（ヘキサン中）まで上昇する勾配を用いて溶出して精製し、標題化合物（６．２ｇ、７２％）を得た。
ｍ／ｚ（ＥＳ）４９７（ＭＨ）^＋，３９７（Ｍ−Ｂｏｃ）^＋．^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：７．３８−７．２９（ｍ，５Ｈ），６．７６−６．６８（ｍ，２Ｈ），６．５５−６．５０（ｍ，２Ｈ），５．５２−５．４９（ｍ，１Ｈ），５．３０−５．２７（ｍ，１Ｈ），４．１５−４．０５（ｍ，２Ｈ），３．８６−３．８１（ｍ，１Ｈ），３．７６−３．７１（ｍ，１Ｈ），３．５５−３．４７（ｍ，２Ｈ），２．７４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），２．４４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），２．０５−１．９３（ｍ，１Ｈ），１．９０−１．８３（ｍ，１Ｈ），１．６０（ｓ，９Ｈ），１．５０−１．４２（ｍ，１Ｈ），１．３１−１．２１（ｍ，２Ｈ），１．１０−１．０２（ｍ，１Ｈ），０．９５（ｓ，９Ｈ），０．９２（ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ），０．１３（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ，３Ｈ），−０．０５（ｓ，３Ｈ）

工程Ｌ： Ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（ｉ−４ｂ）

シスピロリジン異性体をトランス異性体、Ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｒ）−２−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］−５−（４−ニトロベンジル）ピロリジン−１−カルボキシラートで置き換えたことを除いて、工程Ｋと同様の方法で調製した。
ｍ／ｚ（ＥＳ）４９７（ＭＨ）^＋，３９７（Ｍ−Ｂｏｃ）^＋．^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：７．４１−７．３０（ｍ，５Ｈ），６．７３−６．６７（ｍ，２Ｈ），６．５６−６．５０（ｍ，２Ｈ），５．５２−５．４８（ｍ，１Ｈ），５．３３−５．２８（ｍ，１Ｈ），４．１５−４．０６（ｍ，２Ｈ），３．８６−３．８１（ｍ，１Ｈ），３．７６−３．７０（ｍ，１Ｈ），３．５９−３．４６（ｍ，２Ｈ），２．７２（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ），２．４４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ），２．０５−１．９３（ｍ，１Ｈ），１．９０−１．８２（ｍ，１Ｈ），１．６４（ｓ，９Ｈ），１．４９−１．４２（ｍ，１Ｈ），１．３２−１．２０（ｍ，２Ｈ），１．１０−１．０２（ｍ，１Ｈ），０．９５（ｓ，９Ｈ），０．１４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，３Ｈ），０．１０（ｓ，３Ｈ）．

以下の中間体を、適切な出発物質から、中間体ｉ−４ａについて上記に記載した方法を用いて調製した。

以下の中間体を、適切な出発物質から、中間体ｉ−４ｂについて上記に記載した方法を用いて調製した。

中間体５
Ｔｅｒｔ−ブチル（５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（３−クロロフェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（ｉ−５）

工程Ａ： ４−（｛（５Ｒ）−５−［（Ｒ）−（［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ）（３−クロロフェニル）メチル］ピロリジン−２−イル｝メチル）アニリン

酢酸エチル ８ｍＬ中のベンジル｛４−［（３Ｅ，５Ｒ，６Ｒ）−５−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ−６−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−６−（３−クロロフェニル）−２−オキソヘキサ−３−エン−１−イル］フェニル｝カルバメート（ｉ−３、工程Ａより）１００ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）の溶液に、１０％パラジウム炭素を添加し、水素ガスのバルーンにより、懸濁液を水素雰囲気下に置いた。反応物を水素下、室温で８時間攪拌した。触媒を、ギルメン０．４５ｕＭ ＰＴＦＥシリンジフィルターを用いて濾去し、酢酸エチル（４ｘ２ｍＬ）で洗浄した。濾液を真空下で濃縮乾燥し、残渣を分取用プレート（１０００μＭ）により、５％メタノール（ジクロロメタン中）で溶出して精製し、標題化合物（３３ｍｇ、５１％）を得た。
ｍ／ｚ（ＥＳ）４３０，４３２（Ｍ，Ｍ＋２）^＋．

工程Ｂ： Ｔｅｒｔ−ブチル（５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（３−クロロフェニル）メチル］ピロリジン−カルボキシラート（ｉ−５）
無水ＴＨＦ １ｍＬ中の４−（｛（５Ｒ）−５−［（Ｒ）−（［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ）（３−クロロフェニル）メチル］ピロリジン−２−イル｝メチル）アニリン（工程Ａより）３３ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）の溶液に、ｔｅｒｔ−ブチルカルボナート（１５．３ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を、続いてＴＥＡ（１３ｕＬ、０．０７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を、窒素雰囲気下、室温で一晩攪拌した。反応混合物を直接、分取用プレート（５００ｕＭ）にのせ、３０％酢酸エチル（ヘキサン中）で溶出して、標題化合物（２５ｍｇ、７８％）を得た。
ｍ／ｚ（ＥＳ）５３０，５３２（Ｍ，Ｍ＋２）^＋，４３０，４３２（Ｍ−Ｂｏｃ，Ｍ−Ｂｏｃ＋２）^＋．

中間体６
４−｛４−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾール−２−イル｝ベンゼンスルホニルクロリド（ｉ−６）

中間体６は、例えば、イケモト（Ｉｋｅｍｏｔｏ）ら、「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ」、２００３年、第５９巻、ｐ．１３１７〜１３２５の公表された方法に従って調製し得る。

中間体７
２−メチル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［α］［１，３］チアゾール−４−カルボン酸（ｉ−７）

工程Ａ： エチル２−メチル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［α］［１，３］チアゾール−４−カルボキシラート

０℃に冷却されたクロロホルム（５００ｍＬ）中のエチル２−オキソシクロペンタン−２−カルボキシラート（５６ｇ、３５９ｍｍｏｌ）の溶液に、臭素（１８．５ｍＬ、３５９ｍｍｏｌ）を、約２０分間で添加した。添加完了後、混合物を室温に温めさせ、一晩攪拌した。窒素ガスを、混合物を通して９０分間通気して、殆どのＨＢｒを除去した。水（５００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３（２５０ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣をＥｔＯＨ（５００ｍＬ）中に溶解し、チオアセトアミド（２６．９ｇ、３５９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１時間攪拌し、次いで一晩還流した。混合物を冷却し、蒸発させ、残渣をＤＣＭと飽和ＮａＨＣＯ_３との間で分配し、有機層を飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣を、ＭＰＬＣ（Ｂｉｏｔａｇｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ：２ｘ ＦＬＡＳＨ６５ｉ）溶出液：１００％ヘキサン（４５０ｍＬ）、１００％ヘキサンから２５％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）まで上昇する勾配（１４００ｍＬ）、次いで２５％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中））により精製して、標題化合物（３２ｇ、４２％）を暗色の油として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：４．２２（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），３．９６（ｍ，１Ｈ），３．０４（ｍ，１Ｈ），２．８８（ｍ，１Ｈ），２．７６（ｍ，２Ｈ），２．７０（ｓ，３Ｈ），１．３０（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）．

工程Ｂ： ２−メチル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［α］［１，３］チアゾール−４−カルボン酸（ｉ−７）
ＴＨＦ（４５０ｍＬ）及びメタノール（１００ｍＬ）中のエチル２−メチル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［α］［１，３］チアゾール−４−カルボキシラート（工程Ａより）３１．５ｇ（１４９ｍｍｏｌ）の溶液に、水酸化リチウム（１Ｍ溶液を１４９ｍＬ、１４９ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で３時間攪拌した。有機物質を蒸発により除去し、水性残渣をＥｔ_２Ｏ（２ｘ２５０ｍＬ）で抽出し、１Ｍ 塩酸（約１７０ｍＬ）の添加によりｐＨ３に酸性化し、固体ＮａＣｌで飽和させた。ＤＣＭ（３ｘ２５０ｍＬ）で抽出し、合わせたＤＣＭ層をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣をアセトニトリルで粉砕し、濾過し、乾燥させて、標題化合物（７．１ｇ、２６％）を灰白色の固体として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：１１．７５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．０２（ｍ，１Ｈ），３．００（ｍ，１Ｈ），２．９０−２．６６（ｍ，６Ｈ）．

中間体８
２−［（Ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［α］［１，３］チアゾール−４−カルボン酸（ｉ−８）

工程Ａ： エチル２−アミノ−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［α］［１，３］チアゾール−４−カルボキシラート

工程Ａにおいて、チオアセトアミドをチオ尿素で置き換えることにより、中間体（ｉ−７）と同様の方法で調製した。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：５．３０（ｂｒ ｓ，２Ｈ），４．２１（ｑ，Ｊ＝７．０，２Ｈ），３．８１（ｍ，１Ｈ），２．９１（ｍ，１Ｈ），２．７８（ｍ，１Ｈ），２．６６（ｍ，２Ｈ），１．３０（ｔ，Ｊ＝７．０，３Ｈ）．

工程Ｂ： エチル２−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［α］［１，３］チアゾール−４−カルボキシラート

ジクロロメタン（５ｍＬ）中のエチル２−アミノ−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［α］［１，３］チアゾール−４−カルボキシラート（工程Ａより）２３０ｍｇ（１．０８ｍｍｏｌ）の溶液に、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート（２３６ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．１５ｍＬ、１．０８ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（１３ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で２時間攪拌した。混合物を１Ｎ ＨＣｌ（１０ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣を、ＭＰＬＣ（Ｂｉｏｔａｇｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ：ＦＬＡＳＨ２５＋Ｓ）溶出液：１００％ヘキサン（１００ｍＬ）、０〜１５％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）の勾配（９００ｍＬ）、次いで１５％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）（５００ｍＬ）により精製して、標題化合物（１６０ｍｇ、４７％）を白色の泡沫として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：９．２３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．１７（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），３．９５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），３．０４（ｍ，１Ｈ），２．８６（ｍ，１Ｈ），２．７６（ｍ，２Ｈ），１．５５（ｓ，９Ｈ），１．２３（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）．

工程Ｃ： ２−［（Ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［α］［１，３］チアゾール−４−カルボン酸（ｉ−８）
エチル２−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［α］［１，３］チアゾール−４−カルボキシラート（工程Ｂより）から、中間体（ｉ−７）工程Ｂに見られるものと類似の方法を用いて調製した。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：３．９６（ｍ，１Ｈ），３．０６（ｍ，１Ｈ），２．８８（ｍ，２Ｈ），２．７１（ｍ，１Ｈ），１．５５（ｓ，９Ｈ）．

中間体９
２−（４−フルオロフェニル）−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［α］［１，３］チアゾール−４−カルボン酸（ｉ−９）

工程Ａにおいて、チオアセトアミドを４−フルオロチオベンズアミドで置き換えることにより、中間体７（ｉ−７）に見られるものと類似の方法を用いて調製した。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：７．９０（ｍ，２Ｈ），７．２９（ｔ，Ｊ＝８．７，２Ｈ），３．８１（ｍ，１Ｈ），２．９９（ｍ，１Ｈ），２．８６（ｍ，１Ｈ），２．７０−２．５８（ｍ，２Ｈ）．

中間体１０
２−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−１，３−ベンゾチアゾール−４−カルボン酸（ｉ−１０）

工程Ａ： エチル２−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−１，３−ベンゾチアゾール−４−カルボキシラート

０℃に冷却された無水ジエチルエーテル（４０ｍＬ）中のエチル２−オキソシクロヘキサンカルボキシラート（１５ｇ、８８ｍｍｏｌ）の溶液に、臭素（４．５ｍＬ、８８ｍｍｏｌ）を１５分間にわたり滴下添加した。添加完了後、混合物を室温に９０分間温めさせた。混合物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３、飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣をエタノール（１００ｍＬ）中に溶解し、チオアセトアミド（６．６ｇ、８８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１時間攪拌し、次いで一晩還流した。混合物を蒸発させ、残渣をＮａＨＣＯ_３とＤＣＭとの間で分配した。有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣を、ＭＰＬＣ（Ｂｉｏｔａｇｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ：ＦＬＡＳＨ ６５ｉ）溶出液：１００％ヘキサン（５００ｍＬ）、０〜２５％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）の勾配（１２００ｍＬ）、次いで２５％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）（１２００ｍＬ）により精製して、標題化合物（６．１４ｇ、３１％）を淡橙色の油として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：４．２２（ｑ，Ｊ＝７．１，２Ｈ），３．８４（ｔ，Ｊ＝５．５，１Ｈ），２．８０（ｍ，１Ｈ），２．７３（ｍ，１Ｈ），２．６５（ｓ，３Ｈ），２．１８（ｍ，１Ｈ），２．１１−１．９５（ｍ，２Ｈ），１．８５（ｍ，１Ｈ），１．２９（ｔ，Ｊ＝７．１，３Ｈ）．

工程Ｂ： ２−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−１，３−ベンゾチアゾール−４−カルボン酸（ｉ−１０）
エチル２−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−１，３−ベンゾチアゾール−４−カルボキシラート（工程Ａより）から、中間体（ｉ−７）工程Ｂに概説された方法に従って調製した。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：９．２６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．８１（ｑ，Ｊ＝７．３及び５．９，１Ｈ），２．７５（ｍ，２Ｈ），２．６８（ｓ，３Ｈ），２．２４（ｍ，１Ｈ），２．１８−２．０１（ｍ，２Ｈ），１．８２（ｍ，１Ｈ）．

中間体１１
２−［（Ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−４，５，６，７−テトラヒドロ−１，３−ベンゾチアゾール−４−カルボン酸（ｉ−１１）

工程Ａ： エチル２−アミノ−４，５，６，７−テトラヒドロ−１，３−ベンゾチアゾール−４−カルボキシラート

チオアセトアミドをチオ尿素で置き換えることにより、中間体１０（ｉ−１０）工程Ａに概説された方法に従って調製した。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９．２８（ｂｒ ｓ，２Ｈ），４．１１（ｑ，Ｊ＝７．３，２Ｈ），３．７１（ｔ，Ｊ＝５．０，１Ｈ），２．５７−２．３９（ｍ，２Ｈ），１．９０（ｍ，２Ｈ），１．７８（ｍ，１Ｈ），１．５９（ｍ，１Ｈ），１．１７（ｔ，Ｊ＝７．３，３Ｈ）．

工程Ｂ： ２−［（Ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−４，５，６，７−テトラヒドロ−１，３−ベンゾチアゾール−４−カルボン酸（ｉ−１１）
エチル２−アミノ−４，５，６，７−テトラヒドロ−１，３−ベンゾチアゾール−４−カルボキシラート（工程Ａより）から、中間体８（ｉ−８）工程Ｂ及びＣに概説された方法に従って調製した。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：３．７０（ｔ，Ｊ＝５．２，１Ｈ），２．７４（ｍ，１Ｈ），２．６４（ｍ，１Ｈ），２．２５（ｍ，１Ｈ），２．１０−１．９４（ｍ，２Ｈ），１．８７（ｍ，１Ｈ），１．５５（ｓ，９Ｈ）．

中間体１２
インダン−１−カルボン酸（ｉ−１２）

「ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２０００年、第６５巻、第４号、ｐ．１１３２〜１１３８の文献の方法に従って調製した。

中間体１３ａ及び中間体１３ｂ
Ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ，５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（ｉ−１３ａ）；
Ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（ｉ−１３ｂ）

工程Ａ： Ｔｅｒｔ−ブチル（４Ｒ，５Ｒ）−２，２−ジメチル−４−［（１Ｅ）−３−オキソプロパ−１−エン−１−イル］−５−フェニル−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシラート

ＣＨ_２Ｃｌ_２（１５０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（４Ｓ，５Ｒ）−４−ホルミル−２，２−ジメチル−５−フェニル−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシラート（２０．９、８９．１ｍｍｏｌ）の溶液に、（トリフェニルホスホルアニリデン）アセトアルデヒド（２７．１ｇ、８９．１ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で４０時間攪拌した。溶媒の１／３を除去した後、ヘキサンをたっぷり添加し、得られた固体を濾去した。Ｂｉｏｔａｇｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ（登録商標）システム（シリカゲル、０〜２０％酢酸エチル（ヘキサン中）の勾配、次に２０％酢酸エチル（ヘキサン中））でのフラッシュクロマトグラフィーにより、標題化合物 １６．３ｇ（７２％）を黄色の油として得た。
ＬＣ／ＭＳ３５４．３（Ｍ＋２３）．

工程Ｂ： Ｔｅｒｔ–ブチル（４Ｒ，５Ｒ）−２，２−ジメチル−４−（３−オキソプロピル）−５−フェニル−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシラート

アセトン（１５０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（４Ｒ，５Ｒ）−２，２−ジメチル−４−［（１Ｅ）−３−オキソプロパ−１−エン−１−イル］−５−フェニル−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシラート（１９．６ｇ、５９．１ｍｍｏｌ）（工程Ａより）の溶液に、１０％ Ｐｄ／Ｃ １．９ｇを添加し、得られた懸濁液を水素バルーン下、室温で２４時間攪拌した。固体をセライト上で濾去し、濾液を真空下で濃縮した。残渣を、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ（登録商標）システム（シリカゲル、０〜２０％酢酸エチル（ヘキサン中）の勾配、次に２０％酢酸エチル（ヘキサン中））でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物 １１．５ｇ（５８％）を無色の油として得た。
ＬＣ／ＭＳ３５６．３（Ｍ＋２３）．

工程Ｃ： Ｔｅｒｔ−ブチル（４Ｒ，５Ｒ）−２，２−ジメチル−４−［（３Ｅ）−４−（４−ニトロフェニル）ブタ−３−エン−１−イル］−５−フェニル−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシラート及びｔｅｒｔ−ブチル（４Ｒ，５Ｒ）−２，２−ジメチル−４−［（３Ｚ）−４−（４−ニトロフェニル）ブタ−３−エン−１−イル］−５−フェニル−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシラート

ＣＨ_２Ｃｌ_２（２００ｍＬ）中の工程Ｂよりのｔｅｒｔ–ブチル（４Ｒ，５Ｒ）−２，２−ジメチル−４−（３−オキソプロピル）−５−フェニル−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシラート（１０．０ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）の溶液に、（４−ニトロベンジル）トリフェニル−ホスホニウムブロミド（２１．５ｇ、４５．０ｍｍｏｌ）を、続いてＥｔ_３Ｎ（８．３６ｍＬ、６０．０ｍｍｏｌ）を添加した。赤色の反応混合物を、室温で４８時間攪拌した。ヘキサン（２００ｍＬ）を反応混合物に注入し、固体を濾去した。Ｂｉｏｔａｇｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ（登録商標）システム（シリカゲル、０〜１０％酢酸エチル（ヘキサン中）の勾配、次に１０％酢酸エチル（ヘキサン中））でのフラッシュクロマトグラフィーにより、標題化合物（シス トランス混合物） １０．７ｇ（７９％）を淡黄色の泡沫として得た。
ＬＣ／ＭＳ４７５．４（Ｍ＋２３）．

工程Ｄ： Ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｓ）−２−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］−５−（４−ニトロベンジル）ピロリジン−１−カルボキシラート及びｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｒ）−２−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］−５−（４−ニトロベンジル）ピロリジン−１−カルボキシラート

酢酸エチル（１００ｍＬ）中の工程Ｃよりの上記のシス／トランス混合物（７．８６ｇ、１７．４ｍｍｏｌ）の溶液に、２Ｎ ＨＣｌ溶液 ５０ｍＬを添加し、得られた混合物を室温で２時間攪拌し、次に４５℃で３時間加熱した。揮発性物質を、減圧下で除去した。得られた白色固体を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）中に溶解し、^ｉＰｒ_２Ｎｅｔ １５．１ｍＬ（８６．７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で７時間攪拌した。次にジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート（４．５５ｇ、２０．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で一晩攪拌した。水（２００ｍＬ）を添加し、これを酢酸エチル（２００ｍＬｘ３）で抽出した。合わせた有機層を、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ（登録商標）システム（シリカゲル、０〜３０％酢酸エチル（ヘキサン中）の勾配）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物 ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｓ）−２−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］−５−（４−ニトロベンジル）ピロリジン−１−カルボキシラート（シス）１．６１ｇ（２２％）及びｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｒ）−２−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］−５−（４−ニトロベンジル）ピロリジン−１−カルボキシラート（トランス）３．９ｇ（５４％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ４３５．４（Ｍ＋２３）．

工程Ｅ： Ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ，５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（ｉ−１３ａ）
エタノール（２０ｍＬ）中の工程Ｄよりの、上記（シス）ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｓ）−２−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］−５−（４−ニトロベンジル）ピロリジン−１−カルボキシラート（１．５１ｇ、３．６６ｍｍｏｌ）の溶液に、１０％ Ｐｄ／Ｃ ０．１５ｇを添加し、得られた懸濁液を水素バルーン下、室温で５時間攪拌した。セライトを通して濾過し、溶媒を除去して、標題化合物 １．４０ｇ（１００％）を白色泡沫として得て、これをさらに精製することなく使用した。
ＬＣ／ＭＳ４０５．３（Ｍ＋２３）．

工程Ｆ： Ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（ｉ−１３ｂ）
エタノール（４０ｍＬ）中の工程Ｄよりの（トランス）ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｒ）−２−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］−５−（４−ニトロベンジル）ピロリジン−１−カルボキシラート（３．９０ｇ、９．４６ｍｍｏｌ）の溶液に、１０％ Ｐｄ／Ｃ ０．４ｇを添加し、得られた懸濁液を、水素バルーン下、室温で６時間攪拌した。固体を、セライトを通して濾去した。溶媒の除去後、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ（登録商標）システム（シリカゲル、０〜３０％酢酸エチル（ヘキサン中）の勾配、次に３０％酢酸エチル（ヘキサン中））でのフラッシュクロマトグラフィーにより、標題化合物 ２．３０ｇ（６４％）を白色泡沫として得た。
ＬＣ／ＭＳ４０５．３（Ｍ＋２３）．

中間体１４
（２Ｓ）−１−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）ピロリジン−２−カルボン酸（ｉ−１４）：

Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中のＬ−プロリン ２８ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で、２−ブロモベンゾチアゾール ５１ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム １００ｍｇ（０．７２ｍｍｏｌ）、及びヨウ化銅 ６ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１００℃で一晩加熱した。次に、これを濾過し、逆相ＨＰＬＣ（ＴＭＣ Ｐｒｏ−Ｐａｃ Ｃ１８；０〜６０％の、０．１％トリフルオロ酢酸（アセトニトリル中）／０．１％トリフルオロ酢酸（水中）の勾配）により精製した。純粋な分画を一晩凍結乾燥して、３５ｍｇ ６０％の標題化合物を明褐色の固体として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ７．７８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．４８（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），３．５２−３．６１（ｍ，２Ｈ），２．３７（ｍ，１Ｈ），２．０１−２．１１（ｍ，３Ｈ）．ＬＣ／ＭＳ２４９．３（Ｍ＋１）

中間体４４
［（６Ｓ）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロピロロ［１，２−］ピリミジン−６−カルボン酸（ｉ−４４）の調製

工程Ａ： メチル［６（Ｓ）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロピロロ［１，２−］ピリミジン−６−カルボキシラート

メチル（２Ｓ）−５−メトキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール−２−カルボキシラート（４．１９ｇ、２６．６ｍｍｏｌ）及び３−アザトリシクロ［４．２．１．０．^２，５］ノナ−７−エン−４−オン（２．４ｇ、１７．８ｍｍｏｌ）を、１１０℃で一晩加熱した。Ｂｉｏｔａｇｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ（登録商標）システム（０〜１００％酢酸エチル／ヘキサン混合物）を用いて精製し、標題化合物メチル［６（Ｓ）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロピロロ［１，２−^α］ピリミジン−６−カルボキシラート及び中間体メチル（７Ｓ）−９−オキソ−３，８−ジアザテトラシクロ［９．２．１．０^２，１０．０^４，８］テトラデカ−３，１２−ジエン−７−カルボキシラートを得た。中間体を１５０℃で４５分間加熱して、さらに精製することなく標題化合物を得た。
ＬＣ／ＭＳ１９５．２（Ｍ＋１）．

工程Ｂ： ［（６Ｓ）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロピロロ［１，２−］ピリミジン−６−カルボン酸

テトラヒドロフラン（６０ｍＬ）中の、メチル［６（Ｓ）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロピロロ［１，２−^α］ピリミジン−６−カルボキシラート（９．９５ｇ、５１．２ｍｍｏｌ）、メタノール（４０ｍＬ）、及び水（４０ｍＬ）中の水酸化リチウム（３．３２ｇ、７７ｍｍｏｌ）を、室温で１時間攪拌した。２Ｎ 塩酸（３８．５ｍＬ）を添加して反応混合物を中和し、次にこれを直接、逆相ＨＰＬＣ（ＴＭＣ Ｐｒｏ−Ｐａｃ Ｃ１８；０〜４０％ ０．１％トリフルオロ酢酸（アセトニトリル中）／０．１％ トリフルオロ酢酸（水中）の勾配）により精製した。Ｏ−アルキル化生成物が、急速に溶出された。純粋な分画を収集し、一晩凍結乾燥して、標題化合物を淡黄色の固体として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．８９（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），６．２４（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），４．９２（ｄｄ，Ｊ＝１０．０，３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．１２−２．９９（ｍ，２Ｈ），２．５２（ｍ，１Ｈ），２．１１（ｍ，１Ｈ）．ＬＣ／ＭＳ１８１．２（Ｍ＋１）．

中間体４６
（３Ｓ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−３−カルボン酸（ｉ−４６）

工程Ａ： （３Ｓ，９Ｓ）−５−オキソ−１，２，３，５，６，８ａ−ヘキサヒドロインドリジン−３−カルボン酸メチルエステル

この中間体は、ハネシアン（Ｈａｎｅｓｓｉａｎｎ，Ｓ．）；サイレス（Ｓａｉｌｅｓ，Ｈ．）；ムンロ（Ｍｕｎｒｏ，Ａ．）；セリアン（Ｔｈｅｒｒｉｅｎ，Ｅ．）、「Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」、２００３年、第６８巻、ｐ．７２１９、及びバスワニ（Ｖａｓｗａｎｉ，Ｒ．Ｇ．）；チェンバリン（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ｒ．）、「Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」、２００８年、第７３巻、ｐ．１６６１に見られる方法に従って調製した。

工程Ｂ： メチル（３Ｓ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−３−カルボキシラート

ジクロロメタン ５０ｍＬ中の上記工程Ａよりの（３Ｓ，９Ｓ）−５−オキソ−１，２，３，５，６，８ａ−ヘキサヒドロインドリジン−３−カルボン酸メチルエステル ０．８５０ｇ（４．０６ｍｍｏｌ）の攪拌された溶液に、酸化マンガン（ＩＶ） ６．３０ｇ（７２．５ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を還流下で１２時間攪拌した。反応物を室温に冷却し、セライト（Ｃｅｌｉｔｅ）（登録商標）のパッドを通して濾過し、次に固体をジクロロメタン １００ｍＬで洗浄した。濾液を真空中で蒸発乾燥させ、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにより、１０〜５０％酢酸エチル（ヘキサン中）の勾配で溶出して精製し、標題化合物を透明なガムとして得た（０．４７ｇ、５５％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）１９４（ＭＨ）^＋．

工程Ｃ： （３Ｓ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−３−カルボン酸

ＴＨＦ ３ｍＬ中の上記工程Ｂよりのメチル（３Ｓ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−３−カルボキシラート ０．２００ｍｇ（１．００ｍｍｏｌ）の攪拌された溶液に、１．０Ｍ ＬｉＯＨ水溶液 １．５ｍＬ（１．５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で２時間攪拌し、次に１．０Ｍ 塩化水素水溶液 ２．０ｍＬ（２．０ｍｍｏｌ）でクエンチした。全揮発性物質を真空蒸発させ、水相を３０％ ＩＰＡ（クロロホルム中）混合物（３ｘ５ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、真空蒸発させて、標題化合物を白色固体として得た（０．１７ｇ、９２％）。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）：δ７．５３（ｄｄ，Ｊ＝８．９，７．１Ｈｚ，１Ｈ），６．３８−６．３５（ｍ，２Ｈ），５．１１（ｄｄ，Ｊ＝９．７，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．２３−３．１２（ｍ，２Ｈ），２．６２−２．５３（ｍ，１Ｈ），２．３５−２．３０（ｍ，１Ｈ）．
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）１８０（ＭＨ）^＋．

中間体５６
２−（３−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）プロパン酸（ｉ−５６）

工程Ａ： Ｔｅｒｔ−ブチル２−（３−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）プロパノアート

ＤＭＦ（７５ｍＬ）中の３−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（７．３ｇ、８８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ_２ＣＯ_３（６０．７ｇ、４３９ｍｍｏｌ）及び２−ブロモプロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１４．６ｍＬ、８８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩攪拌した。混合物をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）で希釈し、水（ｘ３）で、次に食塩水で洗浄した。ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、そして濃縮した。残渣をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン（２０〜１００％）で溶出して精製し、粗生成物 １３ｇを位置異性体の３：１混合物として得た。混合物をキラルセル（Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ）ＯＤにより、４％から３０％までのＩＰＡ／ヘプタンの勾配で精製した。次に、最初の２つのピークを、Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤカラムで、４％ ＩＰＡ／ヘプタンを用いてイソクラチック溶出で分離した。２番目のピークを、所望の単一立体異性体（Ｒ又はＳ）（２−（３−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル）（３．５ｇ、１９％）として収集した。
^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ８．０５（ｓ，１Ｈ），４．９０（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，１Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．７２（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ）．ＥＳＩ−ＭＳＣ_１０Ｈ_１７Ｎ_３Ｏ_２の計算値：精密質量：２１１．１３；実測値１５６．０５（−ｔＢｕ）．

工程Ｂ： ２−（３−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）プロパン酸

Ｔｅｒｔ−ブチル２−（３−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）プロパノアート（１．０ｇ、４．７ｍｍｏｌ）を、４Ｍ ＨＣｌ（ジオキサン１００ｍＬ中）に溶解し、室温で一晩攪拌した。生成物を減圧下で濃縮し、高真空下で乾燥させて、（Ｒ又はＳ）ｔｅｒｔ−ブチル２−（３−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）プロパノアートを、ＨＣｌ塩（８５０ｍｇ）として得た。
ＥＳＩ−ＭＳＣ_６Ｈ_９Ｎ_３Ｏ_２の計算値：精密質量：１５５．０７；実測値１５６．０５．

化合物１
２−（２−アミノ−１，３−チアゾール−４−イル）−Ｎ−［４−（｛（５Ｒ）−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジニル｝メチル）フェニル］アセトアミド

工程Ａ： Ｔｅｒｔ−ブチル（５Ｒ）−２−（４−｛［（２−アミノ−１，３−チアゾール−４−イル）アセチル］アミノ｝ベンジル）−５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート

無水ＤＭＦ ０．５ｍＬ中の、ｔｅｒｔ−ブチル（５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（ｉ−３）１０ｍｇ（シス／トランス ５：１混合物、０．０２ｍｍｏｌ）及び（２−アミノ−１，３−チアゾール−４−イル）酢酸（３．１８ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の溶液に、０．５Ｍ ＨＯＡｔ溶液（ＤＭＦ中）（０．０４ｍＬ、０．０２ｍｍｏｌ）を、続いてＥＤＣ（５．８ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（３．５μＬ、０．０２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、室温で１６時間攪拌した。混合物を水で洗浄し、ジクロロメタン（２ｘ２ｍＬ）で抽出した。有機物質を合わせ、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。残渣を、分取用ＴＬＣプレート（５００ｕＭ）により、５％ＭｅＯＨ（ジクロロメタン中）で溶出して精製し、生成物（１０．３ｍｇ、８１％）を得た。
ｍ／ｚ（ＥＳ）６３７（ＭＨ）^＋，６５９（ＭＮａ）^＋．

工程Ｂ： ２−（２−アミノ−１，３−チアゾール−４−イル）−Ｎ−［４−（｛（５Ｒ）−［（Ｒ）ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジニル｝メチル）フェニル］アセトアミド

メタノール ０．２０ｍＬ中のｔｅｒｔ−ブチル（５Ｒ）−２−（４−｛［（２−アミノ−１，３−チアゾール−４−イル）アセチル］アミノ｝ベンジル）−５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（工程Ａより）７ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ）の溶液に、濃ＨＣｌ ０．２０ｍＬを添加し、反応混合物を室温で１時間攪拌した。トルエン（２ｘ）で共沸して、水を除去した。残渣を、アセトニトリル／水／ＭｅＯＨ（９：１：１）中に溶解し、ギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）ＨＰＬＣ上で、０〜５０％ アセトニトリル／水（０．０５％ ＴＦＡバッファを含む）の勾配で溶出して精製した。生成物を含有する分画を合わせ、凍結し、凍結乾燥して、白色の泡沫（３．３ｍｇ、７１％）を得た。
ｍ／ｚ（ＥＳ）４２３（ＭＨ）^＋．（約５：１混合物）^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ：７．５６（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４４（ｄ，７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）７．３５−７．３２（ｍ，０．８Ｈ）７．３２−７．２９（ｍ，０．２Ｈ副異性体），７．２６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１．７Ｈ），７．１４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，０．３Ｈ副異性体）６．６７及び６．６６（ｂｒ ｓ，０．２／０．８Ｈ，全１Ｈ）．４．７２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），３．８０−３．７０（ｍ，４Ｈ）３．１４（ｄｄ，Ｊ＝６．１，１３．８Ｈｚ，１Ｈ），２．９５（ｄｄ，Ｊ＝９．１，１３．８Ｈｚ，１Ｈ），２．０８−２．００（ｍ，１Ｈ），１．８６−１．７４（ｍ，３Ｈ）．

本明細書に記載の生物学的アッセイを用いて、化合物１のヒトβ３機能活性は、１ないし１０ｎＭであると測定された。

化合物２
２−（２−アミノ−１，３−チアゾール−４−イル）−Ｎ−［４−（｛（２Ｓ，５Ｒ）−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジニル｝メチル）フェニル］アセトアミド

工程Ａ： Ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ，５Ｒ）−２−（４−｛［（２−アミノ−１，３−チアゾール−４−イル）アセチル］アミノ｝べンジル）−５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート

標題化合物は、ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ，５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（ｉ−４ａ）及び（２−アミノ−１，３−チアゾール−４−イル）酢酸から、化合物１、工程Ａの方法に従って調製した。粗生成物を、分取用ＴＬＣプレートにより、５％ＭｅＯＨ（ジクロロメタン中）で溶出して精製し、生成物（４．１ｍｇ、２１％）を得た。
ｍ／ｚ（ＥＳ）６３７（ＭＨ）^＋，６５９（ＭＮａ）^＋．

工程Ｂ： ２−（２−アミノ−１，３−チアゾール−４−イル）−Ｎ−［４−（｛（２Ｓ，５Ｒ）−［（Ｒ）ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジニル｝メチル）フェニル］アセトアミド

標題化合物は、ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ，５Ｒ）−２−（４−｛［（２−アミノ−１，３−チアゾール−４−イル）アセチル］アミノ｝べンジル）−５−［（Ｒ）−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（工程Ａより）４ｍｇから、化合物１、工程Ｂの方法に従って調製した。粗生成物は、Ｇｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣ上で、０〜５０％ アセトニトリル／水（０．０５％ ＴＦＡバッファを含む）の勾配で溶出して精製した。生成物を含有する分画を合わせ、凍結し、凍結乾燥して、白色の泡沫（３．３ｍｇ、７１％）を得た。
ｍ／ｚ（ＥＳ）４２３（ＭＨ）^＋．^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ：７．５５（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４４（ｄ，７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）７．３５−７．３３（ｍ，１Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），６．６５（ｂｒ ｓ，１Ｈ）．４．７２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），３．８０−３．７２（ｍ，４Ｈ）３．１４（ｄｄ，Ｊ＝６．１，１３．８Ｈｚ，１Ｈ），２．９６（ｄｄ，Ｊ＝９．１，１３．８Ｈｚ，１Ｈ），２．０７−２．００（ｍ，１Ｈ），１．８５−１．７３（ｍ，３Ｈ）．

本明細書に記載の生物学的アッセイを用いて、化合物２のヒトβ３機能活性は、１ないし１０ｎＭであると測定された。

化合物３
２−アミノ−Ｎ−［４−｛（（２Ｓ，５Ｒ）−５−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジン−２−イル）メチル｝フェニル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［α］［１，３］チアゾール−４−カルボキサミド

工程Ａ： Ｔｅｒｔ−ブチル−（２Ｓ，５Ｒ）−２−（４［（｛２−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［α］［１，３］
チアゾール−４−イル｝カルボニル）アミノ］ベンジル）−５−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート

無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中の、ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ，５Ｒ）−２−（４−アミノベンジル）−５−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（ｉ−１３ａ）２２０ｍｇ（０．５８ｍｍｏｌ）及び２−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［α］［１，３］チアゾール−４−カルボン酸（ｉ−８）１６４ｍｇ（０．５８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥＤＣ（１６５ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１３２ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）、及びヒューニッヒ（Ｈｕｎｉｇ）塩基（０．３ｍＬ、１．７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で一晩攪拌した。水（５０ｍＬ）に注入し、ＥｔＯＡｃ（３ｘ３０ｍＬ）で抽出し、合わせたＥｔＯＡｃ層を水（２ｘ５０ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（２５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣を、ＭＰＬＣ（Ｂｉｏｔａｇｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ：ＦＬＡＳＨ ２５＋Ｍ）溶出液：１００％ヘキサン（１００ｍＬ）、０〜３５％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）の勾配（７５０ｍＬ）、次に３５％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）（６００ｍＬ）により精製した。ジアステレオ異性体を、ＡＤカラム上でのキラルＨＰＬＣ（溶出液：２５％ＩＰＡ（ヘプタン中））により、最初に溶出する異性体（１３４ｍｇ、３６％）と２番目に溶出する異性体（１２６ｍｇ、３４％）に、共に白色の泡沫として分離した。

工程Ｂ： ２−アミノ−Ｎ−［４−｛（（２Ｓ，５Ｒ）−５−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジン−２−イル）メチル｝フェニル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［α］［１，３］チアゾール−４−カルボキサミド

ＤＣＭ（３ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル−（２Ｓ，５Ｒ）−２−（４［（｛２−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［α］［１，３］
チアゾール−４−イル｝カルボニル）アミノ］ベンジル）−５−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジン−１−カルボキシラート（工程Ａより、２番目に溶出する異性体）１２６ｍｇ（０．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（３．０ｍＬ、３８ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で４時間攪拌した。混合物を蒸発させ、ＳＣＸカートリッジを通し、２Ｍ ＮＨ_３（メタノール中）で溶出して、塩基を除去した。生成物を、ＰＲＥＰ−ＴＬＣ ２ｘ［２０ｘ２０ｃｍｘ１０００ミクロン］溶出液：１５％ ＭｅＯＨ（ＤＣＭ中）＋１％ＮＨ_４ＯＨ、により精製し、生成物を凍結乾燥して、標題化合物（６５ｍｇ、７５％）を白色の飛散性固体として得た。
ｍ／ｚ（ＥＳ）４４９（ＭＨ）^＋．^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１０．００（ｓ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝８．２，２Ｈ），７．３０（ｍ，４Ｈ），７．２１（ｔ，Ｊ＝６．９，１Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝８．２，２Ｈ），６．８６（ｓ，１Ｈ），４．２３（ｄ，Ｊ＝７．３，１Ｈ），３．７８（ｍ，１Ｈ），３．２１（ｍ，１Ｈ），３．１０（ｍ，１Ｈ）２．７８（ｍ，１Ｈ），２．６６（ｍ，２Ｈ），２．５７（ｍ，２Ｈ），２．４９（ｍ，１Ｈ），１．５９（ｍ，１Ｈ），１．４０（ｍ，１Ｈ），１．３９（ｍ，２Ｈ）．

工程Ａよりの生成物［最初に溶出する異性体］（１３４ｍｇ、０．２０７ｍｍｏｌ）を、同様の方法で脱保護して、標題化合物（４４ｍｇ、４８％）を白色の飛散性固体として得た。
ｍ／ｚ
（ＥＳ） ４４９
（ＭＨ） ^＋．

本明細書に記載された生物学的アッセイを用いて、化合物３のヒトβ３機能活性は、１ｎＭ未満であると測定された。

化合物４−１０
上記記載のものと同様の方法を用いて、化合物４〜１０を適切な出発物質から調製した。

本明細書に記載された生物学的アッセイを用いて、各化合物のヒトβ３機能活性が測定され、以下の表に示された。

化合物１１
Ｎ−（４−（（（２Ｓ，５Ｒ）−５−（（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル）ピロリジン−２−イル）メチル）フェニル）−２−（３−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）プロパンアミド

ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の、ｉ−１３ａ（２．００ｇ、５．２３ｍｍｏｌ）、２−（３−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）プロパン酸ｉ−５６（１．００ｇ、５．２３ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（１．３０７ｍＬ、０．７８４ｍｍｏｌ）、及びＥＤＣ（２．００５ｇ、１０．４６ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で１０分間攪拌した。反応混合物を炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（０〜３％ＭｅＯＨ（１０％ＮＨ４ＯＨ）（ＤＣＭ中）により精製した。蒸発後、生成物をキラルＨＰＬＣ（ＡＤカラム、３０％ＩＰＡ／ヘプタン）によりさらに精製して、ｂｏｃ保護された純粋な中間体を得、これを最少体積のジオキサン中に溶解し、４Ｍ ＨＣｌ（ジオキサン中）を添加した。室温で２時間後、反応混合物を減圧下で濃縮して、標題化合物のＨＣｌ塩を得た。塩基性逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＮＨ_４ＯＨ（Ｈ_２Ｏ中）、ＭｅＣＮ）により、標題化合物の所望の遊離塩基を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ８．５１（ｓ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝１３Ｈｚ，２Ｈ）７．３５−７．２９（ｍ，４Ｈ），７．２６−７．２０（ｍ，４Ｈ），５．２０（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），３．２７−３．２２（ｍ，２Ｈ），２．８０−２．７２（ｍ，２Ｈ），２．３４（ｓ，３Ｈ），１．８２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），１．７９−１７３（ｍ，１Ｈ），１．５２−１．４８（ｍ，３Ｈ）．ＥＳＩ−ＭＳＣ_２４Ｈ_２９Ｎ_５Ｏ_２の計算値：精密質量：４１９．２３，実測値４２０．３５．

本明細書に記載の生物学的アッセイを用いて、化合物１１のヒトβ３機能活性は、１ないし１０ｎＭであると測定された。

化合物１２及び１３
（３Ｓ）−Ｎ−［４−（｛（２Ｓ，５Ｒ）−５−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジン−２−イル｝メチル）フェニル］−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−３−カルボキサミド（化合物１２）及び（３Ｒ）−Ｎ−［４−（｛（２Ｓ，５Ｒ）−５−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジン−２−イル｝メチル）フェニル］−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−３−カルボキサミド（化合物１３）

工程Ａ： Ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｓ）−２−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］−５−［４−（｛［（３Ｓ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−３−イル］カルボニル｝アミノ）ベンジル］ピロリジン−１−カルボキシラート（異性体１）及びｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｓ）−２−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］−５−［４−（｛［（３Ｒ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−３−イル］カルボニル｝アミノ）ベンジル］ピロリジン−１−カルボキシラート（異性体２）

無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド ３．２ｍＬ中の、中間体ｉ−１３ａ ０．６１０ｇ（１．６０ｍｍｏｌ）及び中間体ｉ−４６ ０．３００ｇ（１．６７ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下で、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール ０．０３３ｇ（０．２４ｍｍｏｌ）を、続いて１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩 ０．３３６ｇ（１．７５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた懸濁液を室温で３０分間攪拌し、水でクエンチし、酢酸エチル（３ｘ１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、真空蒸発させた。粗残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーにより、５０〜１００％酢酸エチル（ヘキサン中）の勾配で溶出して精製し、標題化合物を、９７：３の比率のジアステレオマー混合物として得た。２つのジアステレオマーを、ダイセル（Ｄａｉｃｅｌ）ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＡＤ（登録商標）カラムを用いたキラルＨＰＬＣ（溶出液：４０％ＩＰＡ（ヘプタン中））により分離した。最初に溶出するジアステレオマーは、異性体２と命名され、無色の固体である（０．０２０ｇ、２．３％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）５４４．２（ＭＨ）^＋．
２番目に溶出するジアステレオマーは、異性体１と命名され、無色の固体である（０．６５０ｇ、７５％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）５４４．２（ＭＨ）^＋．

工程Ｂ（化合物１２）： （３Ｓ）−Ｎ−［４−（｛（２Ｓ，５Ｒ）−５−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジン−２−イル｝メチル）フェニル］−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−３−カルボキサミド

イソプロパノール ２ｍＬ中の上記工程Ａよりの異性体１ ０．５００ｇ（０．９２０ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素の雰囲気下で、４．０Ｍ 無水塩化水素溶液（１，４−ジオキサン中） ４．０ｍＬを添加した。反応混合物を１時間攪拌し、次に真空中で蒸発乾燥させた。粗反応混合物を、逆相ＨＰＬＣ（ＴＭＣ Ｐｒｏ−Ｐａｃ Ｃ１８；０〜７５％ ０．０１％トリフルオロ酢酸（アセトニトリル中）／０．０１％トリフルオロ酢酸（水中）の勾配）により精製した。純粋な分画を一晩凍結乾燥し、次いでクロロホルム １０ｍＬと飽和重炭酸塩水溶液 ４ｍＬとの混合物中に溶解した。二相混合物を、１０分間激しく攪拌し、次に層を分離させた。水相をクロロホルム（３ｘ１０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、真空蒸発させて、標題化合物（化合物１２）を、白色固体（０．３９ｇ、９５％）として得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ７．８９（ｓ，１Ｈ），７．５４（ｄｄ，Ｊ＝８．８，７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３４−７．２９（ｍ，４Ｈ），７．２６−７．２３（ｍ，１Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），６．３８−３．３６（ｍ，２Ｈ），５．２４（ｄｄ，Ｊ＝９．４，２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），３．３５−３．２３（ｍ，３Ｈ），３．１９−３．１２（ｍ，１Ｈ），２．８２−２．７１（ｍ，２Ｈ），２．６０−２．５１（ｍ，１Ｈ），２．３７−２．３２（ｍ，１Ｈ），１．７９−１．７２（ｍ，１Ｈ），１．５２−１．４３（ｍ，３Ｈ）．
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）４４４．０（ＭＨ）^＋．

工程Ｂ（化合物１３）： （３Ｒ）−Ｎ−［４−（｛（２Ｓ，５Ｒ）−５−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジン−２−イル｝メチル）フェニル］−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−３−カルボキサミド

上記工程Ａよりの、異性体２の脱保護に用いたものと同様の方法により、標題化合物（化合物１３）を単一のジアステレオマーとして得た。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ）４４４．０（ＭＨ）^＋．

本明細書に記載の生物学的アッセイを用いて、化合物１２及び１３のヒトβ３機能活性は、各々１ないし１０ｎＭ、及び１ｎＭ未満であると測定された。

化合物１４
（６Ｓ）−Ｎ−［４−（｛（２Ｓ，５Ｒ）−５−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジン−２−イル｝メチル）フェニル］−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロピロロ［１，２−α］ピリミジン−６−カルボキサミド

工程Ａ： Ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ，５Ｓ）−２−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］−５−［４−（｛［（６Ｓ）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロピロロ［１，２−α］ピリミジン−６−イル］カルボニル｝アミノ）ベンジル］ピロリジン−１−カルボキシラート

Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１００ｍｌ）中のｉ−１３ａ（２１．４ｇ、５５．９ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、［（６Ｓ）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロピロロ［１，２−α］ピリミジン−６−カルボン酸（ｉ−４４、１１．１ｇ、６１．５ｍｍｏｌ）を、続いて１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（７．５５ｇ、５５．９ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（１６．１ｇ、８４．０ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２９．２ｍｌ、１６８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、０℃から室温まで２時間攪拌した。水（６００ｍｌ）を添加し、これをジクロロメタン（６００ｍｌｘ２）で抽出した。合わせた有機層を、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥した。揮発性物質を除去した後、残渣を、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ（登録商標）システム（０〜５％、次に５％メタノール（１０％アンモニア／ジクロロメタン混合物を用いて））を使用することにより精製し、副ジアステレオマーの８％を含有する標題化合物を得た。これをさらに、超臨界液体クロマトグラフィー（キラルＡＳカラム、４０％メタノール）により精製して、標題化合物を淡黄色の固体として得た（２２．０ｇ、７２％）。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ９．６１（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３５−７．２８（ｍ，５Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），６．４０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），５．３６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），４．３８（ｍ，１Ｈ），４．１２−４．０４（ｍ，２Ｈ），３．４６（ｍ，１Ｈ），３．１５−３．０６（ｍ，２Ｈ），２．９１（ｄｄ，Ｊ＝１３．１，９．０Ｈｚ，１Ｈ），２．５５（ｍ，１Ｈ），２．３８（ｍ，１Ｈ），１．７１−１．４９（ｍ，１３Ｈ）．ＬＣ−ＭＳ５６７．４（Ｍ＋２３）．

工程Ｂ： （６Ｓ）−Ｎ−［４−（｛（２Ｓ，５Ｒ）−５−［（Ｒ）−ヒドロキシ（フェニル）メチル］ピロリジン−２−イル｝メチル）フェニル］−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロピロロ［１，２−α］ピリミジン−６−カルボキサミド

ジクロロメタン（４０ｍｌ）中の工程Ａよりの中間体（２．５０ｇ、４．５９ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１５ｍｌ）を添加した。反応混合物を室温で１．５時間攪拌した。揮発性物質を除去した後、飽和ＮａＨＣＯ_３を添加して、ｐＨ値を８〜９とした。次に混合物を、ジクロロメタンで抽出した。合わせた有機層を、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥した。濃縮後、メタノール／アセトニトリルからの結晶化により、標題化合物を白色固体として得た（１．２３ｇ、６０％）。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１０．４０（ｓ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３２−７．２６（ｍ，４Ｈ），７．２１（ｍ，１Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），６．２３（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），５．１１（ｄｄ，Ｊ＝９．６，２．９Ｈｚ，１Ｈ），５．１０（ｂｒ，１Ｈ），４．２１（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），３．２０−３．００（ｍ，４Ｈ），２．６６−２．５１（ｍ，３Ｈ），２．１６（ｍ，１Ｈ），１．５７（ｍ，１Ｈ），１．３８（ｍ，１Ｈ），１．２９−１．２３（ｍ，２Ｈ）．ＬＣ−ＭＳ４４５．３（Ｍ＋１）

本明細書に記載の生物学的アッセイを用いて、化合物１４のヒトβ３機能活性は、１１ないし１００ｎＭであると測定された。

化合物１５〜２９は、上記記載のものと同様の方法を用いて、適切な出発物質から調製した。

β３機能活性のための生物学的アッセイ：
以下のインビトロのアッセイは、選択的β３アゴニスト活性を有する化合物をスクリーニングするのに適している：
機能アッセイ： リガンドに応答するｃＡＭＰ産生を、バートン（Ｂａｒｔｏｎ）ら（「Ａｇｏｎｉｓｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄ２ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｙ−７９ ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ（ヒトＹ−７９網膜芽腫細胞におけるＤ２ドーパミン受容体のアゴニスト誘導性脱感作），Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」、１９９１年、第３２２９巻、ｐ．６５０〜６５８）に従い、以下のように修正して測定する。ｃＡＭＰ産生は、均一時間分解蛍光共鳴エネルギー転移免疫アッセイ（ランス（ＬＡＮＣＥ^ＴＭ）、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を用いて、製造業者の指示に従って測定する。クローニングされたβ−アドレナリン作動性受容体（β１、β２、又はβ３）で安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、継代の３日後に収集する。細胞の収穫は、無酵素解離培地（Ｅｎｚｙｍｅ−ｆｒｅｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ）（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｍｅｄｉａ）を用いて行なう。次に細胞をカウントし、ホスホジエステラーゼ阻害剤（ＩＢＭＸ、０．６ｍＭ）を含有するアッセイバッファ（５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡを補足したハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ））中に再懸濁する。反応は、６μＬ中の６，０００個の細胞を、アレクサフルオル（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）標識ｃＡＭＰ抗体（ＬＡＮＣＥ^ＴＭキット）６μＬと混合することにより開始し、これを次に、化合物（アッセイバッファで２Ｘ最終濃度に希釈）１２μＬを含有するアッセイウェルに添加する。反応は、室温で３０分間進行させ、検出バッファ（ＬＡＮＣＥ^ＴＭキット）２４μＬの添加により終了させる。次にアッセイプレートを、室温で１時間インキュベートし、パーキン・エルマー・エンビジョン・リーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ｒｅａｄｅｒ）又は同等物により、時間分解蛍光を測定する。蛍光レベルを、ｃＡＭＰの標準曲線と比較することにより、未知のｃＡＭＰレベルを測定する。

非選択的、完全アゴニストβ−アドレナリン作動性リガンド イソプロテレノールを、全３種の受容体において使用して、最大刺激を測定する。ヒトβ３アドレナリン作動性受容体（ＡＲ）選択的リガンド（Ｓ）−Ｎ−［４−［２−［［２−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェノキシ）プロピル］アミノ］エチル］−フェニル］−４−ヨードベンゼンスルホンアミドを、対照として全てのアッセイにおいて使用する。イソプロテレノールは、１０−１０Ｍないし１０−５のアッセイ時の終濃度で滴定し、選択的リガンド（Ｓ）−Ｎ−［４−［２−［［２−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェノキシ）プロピル］アミノ］エチル］フェニル］−４−ヨードベンゼンスルホンアミドは、１０−１０Ｍないし１０−５Ｍの濃度のβ３受容体にて滴定する。未知のリガンドは、１０−１０Ｍないし１０−５Ｍのアッセイ時の終濃度の全３種のβ−アドレナリン作動性受容体サブタイプについて滴定し、ＥＣ_５０を測定する。ＥＣ_５０は、それ自体の最大値の５０％の活性化を与える化合物濃度として定義される。データは、マイクロソフト・エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）及びグラフパッド・プリズム（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して分析するか、又は自社開発したデータ分析ソフトウェアパッケージを用いて分析する。

結合アッセイ： 化合物はまた、β１及びβ２受容体においてもアッセイし、選択性を測定する。全ての結合アッセイは、組換えによりβ１又はβ２受容体を発現するＣＨＯ細胞から調製した膜を用いて実施する。細胞は、分離後３〜４日間増殖させ；付着した細胞をＰＢＳで洗浄し、次に氷上で、１ｍＭ トリス、ｐＨ７．２中で１０分間溶解させる。フラスコをこすって細胞を取出し、次にテフロン（登録商標）（Ｔｅｆｌｏｎ）／ガラスホモジナイザーを用いて細胞をホモジナイズする。膜は、４℃において、３８，０００ｘｇで１５分間の遠心分離により収集する。ペレット化された膜を、ＴＭＥバッファ（５０ｍＭ トリス、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中に、１ｍｇタンパク質／ｍＬの濃度に再懸濁する。膜の大きなバッチを調製し、分注し、−７０℃で１年間まで能力の損失なしに貯蔵し得る。結合アッセイは、膜（２〜５μｇのタンパク質）、放射標識トレーサ^１２５Ｉ−シアノピンドロール（^１２５Ｉ−ＣＹＰ、４５ｐＭ）、２００μｇのＷＧＡ−ＰＶＴ ＳＰＡビーズ（ＧＥヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））、及び１０−１０Ｍないし１０−５Ｍの範囲の終濃度での試験化合物と一緒に、０．１％ＢＳＡを含有する最終体積２００μＬのＴＭＥバッファ中でインキュベートすることにより実施する。アッセイプレートは、室温で振盪しながら１時間インキュベートし、次にパーキン・エルマー・トリラックス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｔｒｉｌｕｘ）シンチレーションカウンタに置く。プレートは、カウントする前の約１０時間を、Ｔｒｉｌｕｘカウンター内で暗中に静置する。データは、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア又は自社開発したデータ分析パッケージを使用して、標準的な４パラメータ非線形回帰分析を用いて分析する。ＩＣ_５０は、放射標識されたトレーサ（^１２５Ｉ−ＣＹＰ）の結合を５０％阻害し得る化合物濃度として定義される。β３受容体に対する化合物の選択性は、（ＩＣ_５０β１ ＡＲ、β２ ＡＲ）／（ＥＣ_５０β３ ＡＲ）の比を計算することにより測定してもよい。

β_３−ＡＲアゴニスト及び抗ムスカリン剤は、５００：１ないし１：５０の重量比で、患者に投与し得る。１つの実施態様においては、β_３−ＡＲアゴニスト及び抗ムスカリン剤の重量比は、３００：１ないし１：１０である。別の実施態様においては、重量比は、３００：１ないし１：１である。別の実施態様においては、重量比は、１５０：１ないし１：１である。別の実施態様においては、重量比は、１００：１ないし１：１である。なお別の実施態様においては、重量比は、１５０：１である。さらに別の実施態様においては、重量比は、１００：１である．

併用療法はまた、β_３−ＡＲアゴニスト及び抗ムスカリン剤に加えて、選択的Ｍ_２アンタゴニストをさらに含んでなってもよい。

本明細書で用いるとき、用語「選択的Ｍ_２アンタゴニスト」は、ムスカリンＭ_２サブタイプを、他のムスカリンサブタイプ、例えばＭ３サブタイプに比較して、１０倍より大きい選択性で拮抗する化合物である。デルメンド（Ｄｅｌｍｅｎｄｏ）、「Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」、１９８９年２月、第９６巻、第２号、ｐ．４５７〜６４参照（これは、選択的アンタゴニストの議論に関し、その記載全体が本明細書に援用される）。

１つの実施態様においては、選択的Ｍ_２アンタゴニストは、メトクトラミンである。メトクトラミンは、以下の構造を有するポリメチレンテトラミン誘導体である：

１つの実施態様においては、ＯＡＢの治療法は、β_３−ＡＲアゴニスト、抗ムスカリン剤、及び選択的Ｍ_２アンタゴニストを、それを必要とする患者に投与することを含んでなる。１つの実施態様においては、抗ムスカリン剤は、約４０より大きいＭ_２／Ｍ_３比を有する。別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、約５０より大きいＭ_２／Ｍ_３比を有する。１つの実施態様においては、抗ムスカリン剤は、ダリフェナシンである。１つの実施態様においては、Ｍ_２／Ｍ_３比は、オータケ（Ｏｈｔａｋｅ）らに記載された受容体結合アッセイを用いて測定される。

１つの実施態様においては、ＯＡＢの治療法は、β_３−ＡＲアゴニスト、ダリフェナシン、及びメトクトラミンを、それを必要とする患者に投与することを含んでなる。別の実施態様においては、β_３−ＡＲアゴニストは、表３に示した化合物から選択される。別の実施態様においては、β_３−ＡＲアゴニストは、表４に示した化合物から選択される。なお別の実施態様においては、β_３−ＡＲアゴニストは：

及び

からなる群より選択される。

β_３−ＡＲアゴニスト、抗ムスカリン剤、及び選択的Ｍ_２アンタゴニストが患者に投与される方法においては、β_３−ＡＲアゴニストは、選択的Ｍ_２アンタゴニストで前処理されてもよい。１つの実施態様においては、選択的Ｍ_２アンタゴニストは、メトクトラミンである。別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、ダリフェナシンである。別の実施態様においては、β_３−ＡＲアゴニストは、メトクトラミンで前処理される。なお別の実施態様においては、メトクトラミンで前処理されたβ_３−ＡＲアゴニストは、ダリフェナシンと同時投与される。

１つの実施態様においては、前処理のためのメトクトラミンの濃度は、０．１ないし１０μＭである。別の実施態様においては、前処理のためのメトクトラミンの濃度は、１μＭである。

上記記載の併用療法においては、β_３−ＡＲアゴニスト、抗ムスカリン剤、及び任意の選択的Ｍ_２アンタゴニストは、同時に、連続的に、又は別々に患者に投与し得る。

１つの実施態様においては、β_３−ＡＲアゴニスト、抗ムスカリン剤、及び任意の選択的Ｍ_２アンタゴニストは、同時に患者に投与される。別の実施態様においては、β_３−ＡＲアゴニスト、抗ムスカリン剤、及び任意の選択的Ｍ_２アンタゴニストは、別々に患者に投与される。なお別の実施態様においては、β_３−ＡＲアゴニスト、抗ムスカリン剤、及び任意の選択的Ｍ_２アンタゴニストは、連続的に患者に投与される。

適した患者は、これに限定されないが、過活動膀胱又は下部尿路症状（ＬＵＴＳ）の患者を包含する。１つの実施態様においては、患者は、ＯＡＢ症状のある女性である。別の実施態様においては、患者は、ＯＡＢ症状のある閉経期の女性である。

本発明の別の態様は、β_３−ＡＲアゴニスト、抗ムスカリン剤、及び任意の選択的Ｍ_２アンタゴニストを含んでなる、組合せ医薬組成物を提供する。適切なβ_３−ＡＲアゴニスト、抗ムスカリン剤、及び選択的Ｍ_２アンタゴニストは、上記記載の通りである。

組合せ組成物中のβ_３−ＡＲアゴニストの適量は、約０．０１ｍｇないし約５００ｍｇである。１つの実施態様においては、β_３−ＡＲアゴニストの量は、約０．０５ｍｇないし約２５０ｍｇである。別の実施態様においては、該量は、約０．１ｍｇないし約１５０ｍｇである。別の実施態様においては、該量は、約１ないし約１００ｍｇである。なお別の実施態様においては、該量は、約１ないし約５０ｍｇである。

組合せ組成物中の抗ムスカリン剤の適量は、約０．０１ｍｇないし約５０ｍｇである。１つの実施態様においては、抗ムスカリン剤の量は、約０．０５ｍｇないし約１２ｍｇである。別の実施態様においては、該量は、約０．１ｍｇないし約６ｍｇである。別の実施態様においては、該量は、約０．２ないし約５ｍｇである。なお別の実施態様においては、該量は、約０．２ないし約３ｍｇである。

組合せ組成物中の選択的Ｍ_２アンタゴニストの適量は、約０．０１ｍｇないし約５０ｍｇである。１つの実施態様においては、選択的Ｍ_２アンタゴニストの量は、約０．０５ｍｇないし約１５ｍｇである。

実際の使用では、β_３−ＡＲアゴニスト、抗ムスカリン剤、及び任意の選択的Ｍ_２アンタゴニストは、通常の薬学的調剤技術に従い、薬学的担体との均質な混合物中の活性成分として組合せ得る。担体は、投与、例えば、経口又は非経口（静脈内を含む）用に求められる製剤の形状に依存して、広く多様な形態をとってよい。経口剤形用の組成物の調製においては、例えば懸濁液、エリキシル、及び溶液などといった経口液体製剤の場合には、例えば水、グリコール、油、アルコール、着香剤、保存剤、着色剤などといった任意の通常の薬学的媒体を用いてもよく；又は、例えば粉末、硬及び軟カプセル、及び錠剤といった経口用固形製剤の場合には、デンプン、糖、微結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などといった担体を使用してもよく、液体製剤よりも固形経口製剤が好ましい。

その投与の容易さから、固体の薬学的担体が使用される場合、錠剤及びカプセルが最も有利な経口用単位剤形である。所望であれば、錠剤は、標準的な水性又は非水性の技術によりコートされてもよい、かかる組合せ組成物及び製剤は、０．１〜２０パーセントの各活性成分を含有し得る。これらの組合せ組成物における活性成分のパーセントは、もちろん変更されてもよく、かかる組成物中の活性成分の量は、有効な薬用量が得られるようにするものである。

活性成分はまた、例えば液滴又はスプレーとして、鼻腔内に投与し得る。

錠剤、丸剤、カプセルなどはまた、トラガカントガム、アラビアガム、コーンスターチ、又はゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；及びスクロース、ラクトース、又はサッカリンなどの甘味剤を含有してもよい。単位剤形がカプセルである場合、それは上記のタイプの物質に加えて、脂肪油などの液体担体を含有してもよい。

様々な他の物質が、コーティングとして、又は単位剤形の物理的形態を変更するために存在してもよい。例えば、錠剤を、シェラック、糖、又はその双方でコートしてもよい。シロップ又はエリキシルは、活性成分に加えて、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、色素、及びチェリー又はオレンジフレーバーなどの着香剤を含有してもよい。

活性成分はまた、非経口的に投与してもよい。これらの活性成分の溶液又は懸濁液は、ヒドロキシ−プロピルセルロースなどの界面活性剤と適宜混合された水中に調製し得る。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレンブリコール、及びそれらの油中混合物中に調製し得る。通常の貯蔵及び使用条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有する。

注射用の使用に適した組合せ組成物は、無菌の水溶液又は分散剤、及び無菌の注射用溶液又は分散剤を即時調製するための無菌の粉末を包含する。全ての場合、剤形は無菌でなければならず、注射が容易である程度の液体でなければならない。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、また細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対抗して保存されねばならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、適切なこれらの混合物、及び植物油を含有する、溶媒又は分散媒であってもよい。

１つの実施態様においては、組合せ組成物は、経口組成物である。別の実施態様においては、経口組成物は、カプセルゲルの状態である。なお別の実施態様においては、組合せ組成物は、経口用錠剤組成物である。さらに別の実施態様においては、組合せ組成物は、経口用ビーズ組成物である。

１つの実施態様においては、組合せ組成物は、制御放出用組成物であって、これにおいて、抗ムスカリン剤は、組成物の投与により、２４時間にわたり放出される。別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、１０時間にわたり放出される。なお別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、８時間にわたり放出される。さらに別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、６時間にわたり放出される。

本明細書に開示されたものはまた、β_３−ＡＲアゴニスト、抗ムスカリン剤、及び任意の選択的Ｍ_２アンタゴニストの、過活動膀胱の治療又は予防用医薬の製造における使用も包含する。

実施例
β_３−ＡＲアゴニスト、抗ムスカリン剤、及び任意の選択的Ｍ_２アンタゴニストの同時投与の効果は、以下の実施例において例示される。

ＣＬ３１６２４３、又は二ナトリウム（Ｒ，Ｒ）−５−（２−（（２−（３−クロロフェニル）−２−ヒドロキシエチル）−アミノ）プロピル）−１，３−ベンゾジオキソール−２，３−ジカルボキシラートは、β_３−ＡＲアゴニストである。ＣＬ３１６２４３は、「Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．」、１９９２年８月７日、第３５巻、第１６号、ｐ．３０８１〜４にさらに詳細に記載されている。

トルテロジン、又は２−［（１Ｓ）−３−（ジイソプロピルアミノ）−１−フェニルプロピル］−４−メチルフェノ−ルは、過活動膀胱の治療に使用される抗ムスカリン剤である。トルテロジンは、米国特許第５，３８２，６００、６，６３０，１６２、６，７７０，２９５、及び６，９１１，２１７号にさらに詳細に記載されている。

オキシブチニン、又は４−ジエチルアミノブタ−２−イニル２−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−２−フェニル−エタノアートは、膀胱の筋肉痙攣を低減することにより、頻尿及び排尿制御不能（切迫尿失禁）を含む、尿及び膀胱の障害を緩和するのに使用される抗ムスカリン剤である。

ダリフェナシン、又は（Ｓ）−２−［１−［２−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）エチル］ピロリジン−３−イル］−２，２−ジフェニル−アセトアミドは、尿失禁を治療するために使用される抗ムスカリン剤である。ダリフェナシンは、米国特許第５，０９６，８９０号にさらに詳細に記載されている。

実施例１〜３
材料及び方法
以下の材料及び方法を、実施例１〜３に使用した。雄成体スプラーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットを使用した。ＣＯ_２ガスを用いて安楽死させた後、全膀胱を取出した。三角部外側部分の排尿筋の長軸方向の細片（約６ｍｍｘ３ｍｍ）を用意した。各細片を、酸素化された（９５％Ｏ_２＋５％ＣＯ_２）クレブス（Ｋｒｅｂｓ）溶液を含有する、温めた（３７℃）臓器浴（２５ｍＬ）中に置いた。細片は、一方の端を臓器浴につなげ、他端を等尺性の変換器（ＡＤインスツルメンツ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））に、１０ｍＮの静止張力下で連結した。標本の応答は、多チャンネルデータ収録システム（ＰｏｗｅｒＬａｂ、ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により、１０Ｈｚのサンプリング率で記録し、分析ソフトウェア（Ｃｈａｒｔ、ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で測定した。少なくとも６０分間の平衡化時間の後、各組織細片を、６０Ｈｚ；持続時間、０．３ｍｓ；３秒間；９０Ｖでの電気的フィールド刺激（ＥＦＳ）で誘発し、収縮を誘導した。ＥＦＳにより安定な収縮が得られれば、化合物溶液（２５μＬ）を、次第に増加する様式で臓器浴中に適用した。各化合物による処理の１５分後、ＥＦＳを適用した。

アイソボログラム分析
アイソボログラム分析を使用して、併用療法の相乗効果を評価した。アイソボログラム分析は、２つの異なる薬剤の相互作用について、独立した統計解析を用いて視覚的評価を提供する。統計解析は、各化合物の単一処理及び同じ効果を得るための固定比率組合せからの、いくつかの効力指数の計算から遂行される。アイソボログラム分析は、「ＪＰＥＴ」、２００１年、第２９８巻、ｐ．８６５〜８７２（これは、その記載全体が本明細書に援用される）にさらに詳細に記載されている。

アイソボログラム分析の例示的な説明図を、図１に示す。図１の、ある特定の効果（例えば、最大の５０％）についてのアイソボログラムでは、活性薬剤Ａ単独の用量はＡ＝２０であり、活性薬剤Ｂ単独はＢ＝１００である。これらの切片を結ぶ直線（相加的直線）は、これらの効力に基づき、同じ効果をもたらすはずの、全ての用量ペアの位置である。実際の点Ｑなどの用量ペアは、より少ない量でこの効果を達成し、相乗的（又は超相加的）であり、一方、点Ｒによって示される用量ペアは、より多くの量が必要であることを示し、それ故相加的以下である。直線Ａ−Ｂに近接して出現するＰのような点は、単純に相加的である。相互作用の性質を実証するため、適切な統計解析がしばしば使用される。

実施例２
β _３ −ＡＲアゴニストＣＬ３１６２４３の、トルテロジン、オキシブチニン、及びダリフェナシンから選択される抗ムスカリン剤との併用療法
個別に投与した場合、ＣＬ３１６２４３の、トルテロジン、オキシブチニン、及びダリフェナシンの各々は、ＥＦＳ−誘導性の単離排尿筋収縮を阻害した。表５は、２５％阻害を誘導した各化合物の濃度を示す。これらの値を、以下のアイソボログラム分析に使用した。

併用療法では、ＣＬ３１６２４３は、トルテロジン、オキシブチニン、又はダリフェナシンと、固定重量比において同時投与され、アイソボログラム分析からの結果は図２に示される。図２は、ＣＬ３１６２４３の、トルテロジン（１：２、図２Ａ）、又はオキシブチニン（１：１０、図２Ｂ）との併用が、相乗効果を示したことを表している。一方、ＣＬ３１６２４３のダリフェナシンとの併用（１：２、図２Ｃ）は、単純に相加的である（すなわち、何ら相乗的ではない）ことを示す。

何ら理論に束縛されることを望むものではないが、一般に、抗ムスカリン剤のＭ３拮抗作用が、ＯＡＢ効力に重要であると考えられている（例えば、アブラムス（Ａｂｒａｍｓ）及びアンデルソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）「ＢＪＵ Ｉｎｔ」、２００７年、第１００巻、ｐ．９８７〜１００６参照）。驚くべきことに、今、抗ムスカリン剤のＭ_２／Ｍ_３の相対的選択性が、抗ムスカリン剤及びβ_３−ＡＲアゴニストを用いた併用療法における、ＯＡＢ効力及び／又は副作用の低減に重要な役割を果たし得ることが見出された。

上記の結果からわかるように、抗ムスカリン剤トルテロジンは、ムスカリン受容体のＭ_２及びＭ_３サブタイプに対し、ほぼ等しい選択性（Ｍ_２／Ｍ_３≒１）を有しており、トルテロジンとＣＬ３１６２４３、β_３−ＡＲアゴニストとの、２：１の比での組合せは、相乗効果をもたらした。他の抗ムスカリン剤、約６のＭ_２／Ｍ_３比を有するオキシブチニンもまた、ＣＬ３１６２４３と１０：１の比で組合せた場合、相乗効果をもたらした。

一方、Ｍ_２よりもＭ_３にはるかに高い選択性（Ｍ_２／Ｍ_３≒５０）をもつダリフェナシンは、ＣＬ３１６２４３と２：１の比で組合せた場合、相乗作用をもたらさなかった。

以上をまとめれば、ＣＬ３１６２４３の、その各々が４０未満のＭ_２／Ｍ_３比をもつトルテロジンは又はオキシブチニンとの併用は、排尿筋収縮の阻害に相乗作用をもたらした。一方、ＣＬ３１６２４３の、４０より大きいＭ_２／Ｍ_３比をもつダリフェナシンとの併用は、相乗作用をもたらさなかった。

実施例３
トルテロジン又はダリフェナシンとの併用における、β _３ −ＡＲアゴニスト、化合物１２
この実施例では、異なるβ_３−ＡＲアゴニストを使用して、β_３−ＡＲアゴニストと抗ムスカリン剤との併用療法の相乗効果を調べた。

表３において上記記載のβ_３−ＡＲアゴニスト、化合物１２は、ＩＣ_２５値２７５ｎＭで、ＥＦＳ−誘導性単離排尿筋収縮を阻害した。したがって、化合物１２は、ラット膀胱細片のＥＦＳ−誘導性収縮の阻害において、ＣＬ３１６２４３（ＩＣ_２５ ２．８６ｎＭ、表５参照）よりもほぼ１００倍効力が弱い。このことは、化合物１２の、ラットβ_３−ＡＲにおける弱い効力と一致する。

併用研究においては、化合物１２は、トルテロジン又はダリフェナシンと、固定重量比５０：１で同時投与された。アイソボログラム分析の結果を、図３に示す。図３は、化合物１２の、約１のＭ_２／Ｍ_３比をもつトルテロジンとの併用が、５０：１の比において（図３Ａ）、相乗効果をもたらしたことを示す。

一方、化合物１２の、約５０のＭ_２／Ｍ_３比をもつダリフェナシンとの併用が、５０：１の比において（図３Ｂ）、相乗効果をもたらなかったことを示す（相加的以下）。

上記の結果は、異なるβ_３−ＡＲアゴニスト（ＣＬ３１６２４３）が研究に使用された、実施例１で見られた結果と一致する。これらの結果は、抗ムスカリン剤が４０未満のＭ_２／Ｍ_３比をもつ場合、そのβ_３−ＡＲアゴニストとの併用が、排尿筋収縮の阻害において相乗作用をもたらすことを示唆している。一方、抗ムスカリン剤が４０より大きいＭ_２／Ｍ_３比をもつ場合、そのβ_３−ＡＲアゴニストとの併用は、何ら相乗作用をもたらさない。

実施例４
併用療法の相乗効果に対する選択的Ｍ _２ アンタゴニストの影響
この実施例では、β_３−ＡＲアゴニストと、４０より大きいＭ_２／Ｍ_３比をもつ抗ムスカリン剤との併用療法に対する、選択的Ｍ_２アンタゴニストの影響を調べる。

まず、ＣＬ３１６２４３、β_３−ＡＲアゴニストは、メトクトラミン（１μＭ）で未処理か又は前処理されたかのいずれかであり、結果は図４に示される。図４は、メトクトラミンによるＣＬ３１６２４３の前処理が、ＥＦＳ−誘導性膀胱収縮の阻害に関し、ＣＬ３１６２４３の効力に何ら有意な影響を及ぼさなかったことを示す。この結果は、選択的Ｍ_２アンタゴニスト単独では、β_３−ＡＲアゴニスト及び抗ムスカリン剤がＭ_３拮抗作用を用いて行うようには、予め収縮したラット膀胱細片を弛緩させないという、一般的な考えと一致する。このことは、選択的Ｍ_２アンタゴニスト及びＣＬ３１６２４３の併用では、及びＭ_３拮抗作用なしでは、相乗作用をもたらさなかったことを示唆している。

次に、未処理（Ａ）及び前処理されたＣＬ３１６２４３（Ｂ）の各々が、ダリフェナシンと各々１：２の比で組合され、その結果が図５に示される。図５は、前処理されたＣＬ３１６２４３（１μＭ メトクトラミンで）と、ダリフェナシンとの１：２の比での組合せが、相乗効果をもたらしたことを示す。上記に議論されたように、ダリフェナシンは選択的Ｍ_３アンタゴニストであり、約５０のＭ_２／Ｍ_３比を有する。

一方、未処理のＣＬ３１６２４３と、ダリフェナシンとの同じ比（１：２）での組合せは、単純に相加的であった（すなわち、何ら相乗効果はない）。

これらの結果は、β_３−ＡＲアゴニストと抗ムスカリン剤との間の組合せの相乗効果が、Ｍ_２及びＭ_３拮抗作用の双方の存在を必要とし得るという、実施例１及び２の所見と一致する。

何ら理論に束縛されることを望むものではないが、Ｍ_２受容体は、ｃＡＭＰ依存性のメカニズムによるアドレナリン受容体媒介性の弛緩を逆転させることにより、間接的な収縮応答の媒介において役割を果たし得ると考えられている。Ｍ_２拮抗作用は、β３−ＡＲアゴニスト誘導性のｃＡＭＰ増加及びＢＫチャンネル開放を強化し、排尿筋のさらなる弛緩をもたらす結果となる。

実施例５
相乗効果に対する組合せ比の影響
材料及び方法
動物：雌のＳＤラット（体重２００〜２５０ｇ）（合計７群）。
麻酔：ウレタン（１．０ｇ／ｋｇ、ｉｐ）。
パラメータ：拡張誘導性の律動的膀胱収縮の振幅
化合物：オキシブチニン（ＯＸＹ）、ＣＬ３１６２４３（ＣＬ）。
分析：ＩＤ２０値（振幅を２０％まで低減する用量）を用いたアイソボログラム。

まず、以下の条件で単回投与実験を行ない、オキシブチニン（ＯＸＹ）及びＣＬ３１６２４３（ＣＬ）のＩＤ２０値を計算し、得られたＩＤ２０値が表６に示される。
ビヒクル（生理食塩水）；
ＯＸＹ、０．０１、０．０３、０．１ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ；
ＣＬ、０．００３、０．０１、０．０３ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ。

表６の結果は、オキシブチニン及びＣＬ３１６２４３の双方が、麻酔された雌のラットにおいて、拡張誘導性の律動的膀胱収縮の振幅を低減したことを示す。

次に、以下の表７に示した併用用法を実施して、アイソボログラムを組立てた。合計で９群あった。ＯＸＹ及びＣＬのＩＤ２０値は、各組合せ比率において計算した。

図６は、ＣＬ及びＯＸＹの、１：１及び１：１０の比率の組合せについて、相乗効果が観察されたことを示す。一方、ＣＬ及びＯＸＹの、１：３の比率の組合せは、単純な相加効果をもたらしたが、相乗効果はなかった。

これらの結果は、β３−ＡＲアゴニストＣＬと抗ムスカリン剤ＯＸＹとの間の相乗効果もまた、組合せにおける特定の組合せ比に依存することを示唆している。

実施例６
β３−ＡＲアゴニストと抗ムスカリン剤とを含んでなる組合せ組成物
β３−ＡＲアゴニストと抗ムスカリン剤とを含んでなる、例示的な組合せ組成物を、表８に示す。

１つの実施態様においては、β３−ＡＲアゴニストは、表３に列記された化合物から選択される。別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、トルテロジン、フェソテロジン、オキシブチニン、ソリフェナシン、プロピベリン、トロスピウム、イミダフェナシン、及びＴＤ６３０１から選択される。

１つの実施態様においては、上記の組合せ組成物は、制御放出用（ＣＲ）製剤である。別の実施態様においては、組合せ組成物は、経口投与用のカプセルゲルの状態である。

実施例７
ＣＲ抗ムスカリン剤及びＩＲ β３−ＡＲアゴニストを含んでなる組合せ組成物
制御放出（ＣＲ）部分に抗ムスカリン剤を、そして即時放出（ＣＲ）部分にβ３−ＡＲアゴニストを含んでなる例示的な組合せ組成物を、表９に示す。

１つの実施態様においては、β３−ＡＲアゴニストは、表３に列記された化合物から選択される。別の実施態様においては、抗ムスカリン剤は、トルテロジン、フェソテロジン、オキシブチニン、ソリフェナシン、プロピベリン、トロスピウム、イミダフェナシン、及びＴＤ６３０１から選択される。

１つの実施態様においては、上記組成物は、経口投与用のカプセルゲルである。

実施例８
アカゲザルにおける膀胱容量に対する併用療法の効果
材料及び方法
体重５．３〜６．２ｋｇ（４〜７歳齢）の成体雌のアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）を使用した。被験者は、二匹一組又は単独のいずれかで、１２時間明／１２時間暗のサイクル（７：００ＡＭに点灯）において収容した。彼女らの食餌は、２０５０テクラド（Ｔｅｋｌａｄ）（ハーラン・ラボラトリーズ（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、インディアナ州、インディアナポリス）及び新鮮な果物又は野菜から構成された。水は自由に摂取させた。動物は全て、獣医技術者及び管理人により、健康障害の徴候について毎日観察した。被験者は、＞１３日の休止期間をとって反復使用された。サルは、テラゾール（Ｔｅｌａｚｏｌ）（３〜５ｍｇ／ｋｇ）又はケタミン（１０〜２０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの筋肉内注射と、その後のシリンジポンプ（５５２２２２、ハーバード・アパレイタス（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）、マサチューセッツ州、ホリストン）を用いたケタミン（０．２〜０．８ｍｇ／ｋｇ／分）の静脈内定速輸液によって麻酔した。動物を仰臥位に置き、トリプルルーメンバルーン経尿道カテーテル（７．４Ｆｒ、クック・メディカル（Ｃｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ、インディアナ州、ブルーミントン）を膀胱に挿入し、バルーンを水 １ｍＬで膨らませて、カテーテルの先端を膀胱の基底部に固定した。カテーテルは、膀胱を充填するための輸液ポンプ（ジェミニ（Ｇｅｍｉｎｉ）ＰＣ−２ＴＸ、アラリス・メディカル・システムズ（ＡＬＡＲＩＳ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州、サンディエゴ）、及び膀胱内圧をモニタリングするための圧力変換器に連結した。膀胱内圧は、多チャンネルデータ収録システム（Ｐｏｗｅｒ ｌａｂ、ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、バイオパック・システムズ（Ｂｉｏｐａｃ ｓｙｓｔｅｍｓ）、コロラド州、コロラドスプリングス）を用いて、２０Ｈｚのサンプリング率で連続的に記録した。超音波診断（Ｌｏｇｉｑ ｅ ｖｅｔ、ＧＥメディカル・システムズ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ウィスコンシン州、ウォーキショー、図１Ａ）により膀胱が空であることを確認した後、生理食塩水を１５ｍＬ／分で膀胱内に注入した。排尿反射の圧力指標に急峻な上昇が観察されたとき、膀胱内注入を停止し、膀胱を６０ｍｌシリンジにより手作業で空にした。２回のベースラインシストメトリーの読み取りの後、薬剤を、濃度の上昇するパラダイムを用いて、各投与の１０分後にシストメトリーを実施することにより、３回静脈内投与した。膀胱容量は、各シストメトリーについて測定し、ベースライン容量からの％変化を計算した。本明細書で用いるとき、「ベースライン容量」又は「ベースライン」は、２回の投与前測定値の平均膀胱容量を意味する。

種々の用量における、トルテロジン（“ＴＯＬ”）、ダリフェナシン（ＤＡＲ”）、又は化合物１４（Ｃｐｄ １４”）の単一療法、並びに、表１０に示した種々の用量及び用量比でのＴＯＬ：Ｃｐｄ １４及びＤＡＲ：Ｃｐｄ １４の併用療法を、アカゲザルで試験した。

上記の単一療法及び併用療法を用いることによる、アカゲザルにおける膀胱容量の結果は表１１に要約される。報告された結果は、４〜６匹の動物におけるベースラインからの％変化の平均値である。

表１１から、試験した化合物１４及びトルテロジンの全ての組合せが、各個の単一療法に比較して、より大きい膀胱容量を示したことが理解される。最も低い化合物１４の用量（０．００３ｍｇ／ｋｇ）において、相乗効果がはるかに大きかったことが注目されるべきである。特に、０．００３ｍｇ／ｋｇ：０．０１ｍｇ／ｋｇでのＣｐｄ １４：ＴＯＬの組合せは、それぞれの単一療法についての４．１％及び８．６％に比較して、２８．２％の膀胱容量増加を示した。同様に、０．００３ｍｇ／ｋｇ：０．０３ｍｇ／ｋｇでのＣｐｄ １４：ＴＯＬの組合せは、それぞれの単一療法についての４．１％及び１６．８％に比較して、３５．５％の膀胱容量増加を示した。

化合物１４とダリフェナシンとの併用療法については、より高い用量のダリフェナシン（０．０３、０．１ｍｇ／ｋｇ）において、併用が優れた膀胱容量効果を示した。

非選択的ムスカリンアンタゴニスト、トルテロジンは、調べた組合せにおいて、化合物１４と、改善された効力を明示したが、選択的Ｍ３アンタゴニスト、ダリフェナシンと、化合物１４との組合せでは、相加的効果は高用量にのみ限定された。これらの結果は、β３−ＡＲアゴニストと組合された場合、抗ムスカリン剤のＭ２及びＭ３拮抗作用の双方が、改善された効力にとり重要であり得ることを示唆している。

本発明は、そのいくつかの特定の実施態様について記載しかつ例示してきたが、当業者は、種々の変更、修飾、及び置換が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、これにおいて行なわれ得ることを理解するであろう。例えば、上記の本明細書で示した特定の薬用量以外の有効薬用量を、上記に示した本発明において使用される活性薬剤の任意の指標について、治療される哺乳動物の応答性のバリエーションの結果として適用してもよい。同様に、観察される具体的な薬理学的応答は、選択された特定の活性化合物又は薬学的担体が存在するかどうか、並びに用いた製剤のタイプに従って、及び依存して変化してもよく、結果におけるそのような予想される変動又は差異は、本発明の目的及び実施に従って検討される。それ故、本発明は、以下の請求の範囲によって定義されること及びかかる請求の範囲が合理的である限り広く解釈されることが意図されている。

Claims (18)

1. 過活動膀胱を治療するための医薬組成物またはキットであって、
   β３−ＡＲアゴニスト及び
   抗ムスカリン剤を含み、
   さらに、選択的Ｍ_２アンタゴニストを含んでもよく；
   ここで、前記β３−ＡＲアゴニストが：
   
   
   
   からなる群より選択され、
   前記抗ムスカリン剤が、４０未満のＭ _２ ／Ｍ _３ 比を有する医薬組成物またはキット。
2. 前記抗ムスカリン剤が、２０未満のＭ_２／Ｍ_３比を有する、請求項１に記載の医薬組成物またはキット。
3. 前記抗ムスカリン剤が：トルテロジン、フェソテロジン、オキシブチニン、ソリフェナシン、プロピベリン、トロスピウム、イミダフェナシン、及びＴＤ６３０１からなる群より選択される、請求項１に記載の医薬組成物またはキット。
4. 前記抗ムスカリン剤が、トルテロジン又はオキシブチニンである、請求項３に記載の医薬組成物またはキット。
5. 前記β３−ＡＲアゴニストが：
   
   からなる群より選択される、請求項１に記載の医薬組成物またはキット。
6. 前記β３−ＡＲアゴニスト及び前記抗ムスカリン剤が、３００：１ないし１：１０の重量比で前記患者に投与される、請求項５に記載の医薬組成物またはキット。
7. 前記抗ムスカリン剤が、トルテロジンであり、かつここで、前記β３−ＡＲアゴニスト及びトルテロジンが、３００：１ないし１：１の重量比で前記患者に投与される、請求項５に記載の医薬組成物またはキット。
8. 過活動膀胱を治療するための医薬組成物またはキットであって、
   β３−ＡＲアゴニスト、
   抗ムスカリン剤、及び
   選択的Ｍ_２アンタゴニスト
   を含んでなり；
   ここで、前記β３−ＡＲアゴニストが：
   
   
   
   からなる群より選択される、組成物またはキット。
9. 前記抗ムスカリン剤が、４０より大きいＭ_２／Ｍ_３比を有する、請求項８に記載の医薬組成物またはキット。
10. 前記抗ムスカリン剤が、ダリフェナシンであり、かつ前記選択的Ｍ_２アンタゴニストが、メトクトラミンである、請求項９に記載の医薬組成物またはキット。
11. 過活動膀胱を治療する医薬組成物またはキットであって、
    ＣＬ３１６２４３及び
    オキシブチニン
    を含んでなり；
    ここで、ＣＬ３１６２４３及びオキシブチニンが、１：１又は１：１０の重量比で前記患者に投与される、該医薬組成物またはキット。
12. 前記β３−ＡＲアゴニスト、前記抗ムスカリン剤、及び前記選択的Ｍ_２アンタゴニストが、同時に、別々に、又は連続的に投与される、請求項１または８に記載の医薬組成物またはキット。
13. 前記β３−ＡＲアゴニスト、前記抗ムスカリン剤、及び前記選択的Ｍ_２アンタゴニストが、経口的に投与される、請求項１または８に記載の医薬組成物またはキット。
14. 医薬組成物であって：
    β３−ＡＲアゴニスト及び
    抗ムスカリン剤
    を含んでなり；
    ここで、前記β３−ＡＲアゴニストが：
    
    
    
    
    からなる群より選択され、
    かつ、前記抗ムスカリン剤が、４０未満のＭ _２ ／Ｍ _３ 比を有する該組成物。
15. 前記抗ムスカリン剤が、トルテロジン、オキシブチニン、フェソテロジン、ソリフェナシン、プロピベリン、及びトロスピウムからなる群より選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 医薬組成物であって：
    β３−ＡＲアゴニスト、
    抗ムスカリン剤、及び
    選択的Ｍ_２アンタゴニストを、
    含んでなり；
    ここで、前記β３−ＡＲアゴニストが：
    
    
    
    からなる群より選択され、
    ここで、前記抗ムスカリン剤が、ダリフェナシンであり、かつ
    前記選択的Ｍ_２アンタゴニストが、メトクトラミンである、該医薬組成物。
17. 前記組成物が、経口投与用の錠剤又はカプセルである、請求項１４または１６に記載の医薬組成物。
18. 前記組成物が、抗ムスカリン剤の制御放出を提供する、請求項１４または１６に記載の医薬組成物。