CN102638987A - 使用β3肾上腺素能受体激动剂和抗毒蕈碱药剂的组合疗法 - Google Patents

使用β3肾上腺素能受体激动剂和抗毒蕈碱药剂的组合疗法 Download PDF

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Abstract

本文描述了改进的治疗膀胱过动症的方法，其中所述方法包括给予需要该治疗的患者：β3肾上腺素能受体激动剂、抗毒蕈碱剂和可选的选择性M2拮抗剂。此类组合治疗可提供改善的疗效和/或降低副作用。

Description

使用β3肾上腺素能受体激动剂和抗毒蕈碱药剂的组合疗法
背景技术
下尿路的功能是储存和周期性地排放尿。这要求储存和排尿反射的协调，涉及各种输入和输出神经途径，导致中枢和周围神经作用机理的调节和由此产生的植物神经系统以及身体运动原途径的交感神经和副交感神经组成部分的协同调控。这些可以近似地调节膀胱(逼尿肌)和尿道平滑肌及尿道括约肌横纹肌的收缩状态。
膀胱过度活动症的特点在于尿急的症状(有或者没有急迫性尿失禁现象)，通常与尿频和夜尿症有关。在美国和欧洲，在年龄超过18岁的女性和男性中，OAB的发病率估计为16至17%。最通常把膀胱过度活动症归类为自发病，但还可以是神经病症、膀胱出口阻塞及其它病因的继发性病症。从病理生理观点来看，膀胱过度活动症综合症状暗示了逼尿肌机能过度(尤其是当与急迫性尿失禁有关时)。已经显示，尿急(有或者没有失禁)对社会和医学健康造成负面冲击，并且在每年的直接和间接保健费用方面具有重大负担。
现已使用抗毒蕈碱药剂治疗失禁病症，例如OAB。例如，托特罗定或(R)-N,N-二异丙基-3-(2-羟基-5-甲基苯基)-3-苯基丙胺，已经销售用于治疗急迫性尿失禁及其它膀胱不稳定或活动过度的症状。托特罗定和其主要的活性代谢物，托特罗定的5-羟甲基衍生物，被认为是促使实现该治疗效果的原因。然而，利用抗毒蕈碱剂治疗OAB的现行的医学疗法通常是非最佳的，因为许多患者对现行治疗没有表现出充分的响应，和/或不能忍受大量的副作用，例如与现行疗法有关的口腔干燥。
因此，持续需要可提供更有效治疗OAB和/或减轻副作用的改进疗法。
附图说明
图1(FIG.1)是显示等效线图分析的图。
图2(FIG.2)是显示由CL316243与托特罗定(A)、奥昔布宁(B)或达非那新(C)的组合诱导的抑制迫尿肌收缩的等效线图的图。
图3(FIG.3)是显示由化合物12和托特罗定(A)及达非那新(B)的组合诱导的抑制迫尿肌收缩的等效线图的图。
图4(FIG.4)是显示用或不用美索托明预处理的CLA316243图。
图5(FIG.5)是表示用(A)或不用(B)美索托明预处理的由CL316543和达非那新的组合诱导的抑制迫尿肌收缩的等效线图的图。
图6(FIG.6)是表示由不同比值的CL316243和奥昔布宁的组合诱导的抑制迫尿肌收缩的等效线图的图。
发明概述
现在意外地发现，利用β3肾上腺素激动剂 (在下文中，“β3-AR激动剂”)、抗毒蕈碱剂和任选的选择性的M2拮抗剂的组合治疗可提供用于治疗膀胱过度活动症的协同效应。还描述了包含β3-AR激动剂、抗毒蕈碱剂和任选的选择性的M2拮抗剂的组合物的组合。
发明详述
本文描述了治疗膀胱过度活动症的方法，其中该方法包括给予需要的患者β3-AR激动剂、抗毒蕈碱剂和任选的选择性的M2拮抗剂。这种组合治疗提供了协同效应并由此提高了效果和/或减轻了副作用。
现在意外地发现，在用于治疗OAB的包含β3-AR激动剂和抗毒蕈碱剂的组合治疗中，抗毒蕈碱剂的M2拮抗作用在提供协同作用中起重要作用。尽管不希望被理论所束缚，但普遍认为抗毒蕈碱剂的M3拮抗作用对OAB效果是重要的(参见，例如，Abrams和Andersson. BJU Int,100，987-1006(2007))。现在发现M2拮抗作用与M3拮抗作用, 和β3-AR激动剂一起工作, 提供协同作用。
在一个实施方案中，协同效应是在包括β3-AR激动剂和抗毒蕈碱剂的组合治疗中获得的，其中所述抗毒蕈碱剂具有小于约40的M2/M3比值。在另一个实施方案中，所述抗毒蕈碱剂具有小于约20的 M2/M3比值。
另外，当抗毒蕈碱剂具有大于40的M2/M3比值时，协同作用可以在包括β3-AR激动剂协和抗毒蕈碱剂的组合治疗中，通过利用额外的选择性的M2拮抗剂获得。
在本文中，用术语“协同作用”或“协同效应”是用于描述一种情况，其中两种或多种活性剂的联合效应大于单个的活性剂的总和。换句话说，两种或多种活性剂可以以一种活性剂的存在增强或放大第二种的效果的方式相互作用。与此相反，当两种或多种活性剂的联合效应基本上等于单个活性剂的和时，该联合效应只是简单的加和，而不是协同作用。而当两种或多种活性剂的联合效应小于单个活性剂的和时，该联合效应是次加性的，也不是协同作用的。
在一个实施方案中，该组合治疗包括给予需要的患者β3-AR激动剂和抗毒蕈碱剂，其中所述抗毒蕈碱剂具有小于约40的M2/M3比值。在另一个实施方案中，所述抗毒蕈碱剂具有小于约30的M2/M3比值。在另一个实施方案中，所述抗毒蕈碱剂具有小于约20的M2/M3比值。在另一个实施方案中，所述抗毒蕈碱剂具有小于约15的M2/M3比值。在又一个实施方案中，所述抗毒蕈碱剂具有小于约10的M2/M3比值。在再一个实施方案中，所述抗毒蕈碱剂具有约1的M2/M3比值。
在另一个实施方案中，在所述组合治疗中的所述抗毒蕈碱剂具有大于约0.1的M2/M3比值。在另一个实施方案中，所述抗毒蕈碱剂具有大于约0.5的M2/M3比值。在另一个实施方案中，所述抗毒蕈碱剂具有大于约0.8的M2/M3比值。
在另一个实施方案中，在所述组合治疗中的所述抗毒蕈碱剂具有从约0.1至约40的M2/M3比值。在另一个实施方案中，所述抗毒蕈碱剂具有从约0.5至约30的M2/M3比值。在另一个实施方案中，所述抗毒蕈碱剂具有从约0.8至约20的M2/M3比值。在另一个实施方案中，所述抗毒蕈碱剂具有从约1至约20的M2/M3比值。在又一个实施方案中，所述抗毒蕈碱剂具有从约1至约15的M2/M3比值。在还另一个实施方案中，所述抗毒蕈碱剂具有从约1至约10的M2/M3比值。
在一个实施方案中，M2/M3比例是利用ohtake等人描述的受体结合试验测定的，(Biol. Pharm. Bull. 30，54-58，2007)，本文以引证的方式结合其全部内容。在另一个实施方案中，M2/M3比值是利用Hegde等人描述的试验测定的，(Curr. Opin Invest Drugs.5, 40-49(2004)，本文以引证的方式结合其全部内容。
Ohtake等人(Biol. Pharm. Bull. 30，54-58(2007))报道的某些举例的抗毒蕈碱剂的M1-M4活性如表1所示。
表1. 某些抗毒蕈碱剂的M1 - M4活性 --- Ohtake等人
Figure 461468DEST_PATH_IMAGE001
Hegde等人，(Curr Opin Invest Drugs. 5，40-49(2004))描述的某些抗毒蕈碱剂的M1-M4活性和曲司铵（trospium,托斯必姆）的M1-M4活性如表2所示。
表2. 曲司铵(trospium)的M2和M3活性-Hegde等人。
用于所述组合治疗的合适的抗毒蕈碱剂包括，但不局限于∶托特罗定、奥昔布宁(包括S-奥昔布宁)、天仙子胺、普鲁本辛、丙哌维平、曲司铵(包括曲司铵氯化物)、索非那新、达非那新、双环维林、异丙托品、奥昔布宁(贴片,oxytrol)、咪达那新、非索罗定、替米维林、SVT-40776、GlaxoSmithKline的202405、TD6301、RBX9841、DDP200和PLD179。
在一个实施方案中，所述抗毒蕈碱剂选自∶托特罗定、非索罗定、奥昔布宁、索非那新、丙哌维林、曲司铵、咪达那新和TD6301。在一种实施方案中，合适的抗毒蕈碱剂的M2/M3的比值小于40。在另一个实施方案中，M2/M3的比值小于30。在另一个实施方案中，M2/M3的比值小于20。在又一个实施方案中，M2/M3的比值小于15。在一个实施方案中，所述M2/M3比值是利用Ohtake等人描述的结合试验测定的。
在另一个实施方案中，所述抗毒蕈碱剂选自∶托特罗定、非索罗定、奥昔布宁、索非那新、丙哌维林和曲司铵。
在另一个实施方案中，所述抗毒蕈碱剂选自∶托特罗定和奥昔布宁。
在又一个实施方案中，所述抗毒蕈碱剂是托特罗定。
合适的β3-AR激动剂包括，但不局限于，CL316243和示于表3中的化合物。
表3 用于组合治疗的合适的β3-AR激动剂
Figure 615872DEST_PATH_IMAGE004
Figure 430244DEST_PATH_IMAGE005
在另一个实施方案中，所述β3-AR激动剂选自列于表4中的化合物∶
表4 用于组合治疗的合适的β3-AR激动剂
Figure 380270DEST_PATH_IMAGE006
在另一个实施方案中，所述β3-AR激动剂选自由
Figure 834254DEST_PATH_IMAGE007
和
Figure 970837DEST_PATH_IMAGE008
构成的组。
在又一个实施方案中，所述β3-AR激动剂是
Figure 826667DEST_PATH_IMAGE008
。
表3中的化合物可使用如下所述的方法制备。
在本申请中，除非另有说明，下述术语具有如下含义：
术语 含义
Ac 乙酰基(CH3C(O)-)
Aq. 含水的
Bn 苄基
Boc (Boc) 叔丁氧羰基
BOP 苯并三唑-1-基-氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐
℃ 摄氏度
Calc. 或calc’d 计算值
Celite CeliteTM 硅藻土
DCC 二环己基碳二亚胺
DCM 二氯甲烷
DIEA N,N-二异丙基-乙基胺
DMAP 4-二甲基氨基吡啶
DMF N,N-二甲基甲酰胺
EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
Eq.或equiv. 当量
ES-MS和ESI-MS 电喷雾离子质谱
Et 乙基
EtOAc 乙酸乙酯
g 克
h或hr 小时
HATU O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸盐
HOAc 乙酸
HOAT 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HOBT 1-羟基苯并三唑
HPLC 高效液相色谱
LC/MS或LC-MASS 液相色谱质谱联用
L 升
M 摩尔
Me 甲基
MeOH 甲醇
MF 分子式
min 分钟
mg 毫克
mL 毫升
mmol 毫摩尔
MOZ (Moz) 对甲氧基苄氧基羰基
MP 熔点
MS 质谱
nM 纳摩尔
OTf 三氟甲磺酰基
Ph 苯基
Prep. 制备
Ref. 参比
r.t.或rt 室温
Sat. 饱和的
SCF CO2 S 超临界流体二氧化碳
TBAF 四丁基氟化铵
TBAI 四丁基碘化铵
TBDPS 叔丁基二苯基甲硅烷基
TBS, TBDMS 叔丁基二甲基甲硅烷基
TEA或Et3N 三乙胺
Tf 三氟甲磺酸盐或三氟甲烷磺酸盐
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TLC 薄层色谱
TMS 三甲基甲硅烷基
中间体 1
[3-(2-氧代丁-3-烯-1-基)苯基]氨基甲酸苄酯(i-1)：
Figure 757713DEST_PATH_IMAGE009
步骤 A ： (3-{ [( 苄氧基 ) 羰基 ] 氨基 } 苯基 ) 乙酸乙酯
Figure 698994DEST_PATH_IMAGE010
向(3-氨基苯基)乙酸甲酯(25g，140 mmol)的250 mL无水DCM 溶液中加入DIEA(28.5 mL，155 mmol)，将得到的溶液冷却至0℃ 并置于氮气氛下。然后向此冷却溶液中加入氯甲酸苄酯(21.1 mL，148 mmol)，将得到的混合物搅拌过夜并升至室温。用1 M HCl、水和然后盐水洗涤反应液。有机相用硫酸钠干燥、过滤并减压浓缩。无需进一步纯化，该物质(44g，99%)直接用于下一步反应。LC-MS：m/z(ES)314(MH)+，336(MNa)+。
步骤 B ： (3-{[( 苄氧基 ) 羰基 ] 氨基 } 苯基 ) 乙酸
Figure 436005DEST_PATH_IMAGE011
向44.0 g (140 mmol)(3-{[(苄氧基)羰基]氨基}苯基)乙酸乙酯(来自步骤A)的THF、乙醇和水(1:1:1，1500 mL)溶液中加入固体LiOH(16.8 g，700 mmol)，将得到的溶液用油浴加热至60℃，保温3 h。将混合物冷却至室温过夜，然后缓慢加入40 mL浓盐酸，保持温度低于25℃，直至溶液的pH值约为2-3。用乙酸乙酯(3x750ml)萃取，合并有机物，并用水和然后盐水洗涤。有机相经硫酸钠干燥、过滤并减压浓缩。标题化合物(24.7 g，87%)不经进一步纯化直接用于下步反应。LC-MS：m/z(ES)286(MH)+，308(MNa)+。
步骤 C ： (3-{2-[ 甲氧基 ( 甲基 ) 氨基 ]-2- 氧代乙基 } 苯基 ) 氨基甲酸苄酯
Figure 897074DEST_PATH_IMAGE012
向24.7 g(87 mmol)(3-{[(苄氧基)羰基]氨基}苯基)乙酸的200 mL二氯甲烷悬浮液(来自步骤B)中加入三乙胺 (30.2 mL，173 mmol)，这会导致一些放热(+5℃)，悬浮液转变为溶液。冷却10分钟后，向该溶液中加入HOBt(13.2 g，87 mmol)、N,O-二甲基羟胺盐酸盐(8.5 g，87 mmol)，接着加入EDC(16.6g，87 mmol)，得到的混合物在氮气氛下、在室温下搅拌过夜。将该溶液转移至分液漏斗中，用1 M HCl洗涤，这引起乳化。加入甲醇破乳，并将水相分出。有机相经硫酸钠干燥、过滤并减压浓缩。残余物在1000 mL70%己烷的乙酸乙酯溶液中重结晶(加热至回流，然后冷却至室温过夜) ，得到标题化合物(21 g，74%)，为白色固体。LC-MS：m/z (ES)329(MH)+。
步骤 D ： [3-(2- 氧代丁基 -3- 烯 -1- 基 ) 苯基 ] 氨基甲酸苄酯 (i-1)
在氮气氛中，用冰/水浴冷却至0℃后，向15g(45.7 mmol)(3-{2-[甲氧基(甲基)氨基]-2-氧代乙基}苯基)氨基甲酸苄酯(来自步骤C)的1000 mL无水THF溶液中用套管滴加1.0 M的 乙烯基溴化镁溶液(100 mL的THF溶液，100 mmol)，并将得到的溶液在0℃搅拌1h。保持温度低于5℃，缓慢加入500 mL 1M HCl淬灭反应，并搅拌30分钟。用乙酸乙酯萃取该混合物，合并有机物，并用水和然后盐水洗涤。有机物经硫酸钠干燥、过滤并减压浓缩。残余物用Biotage 75M flash、以30%乙酸乙酯的己烷溶液洗脱纯化，得标题化合物(11 g，78%)，为浅黄色固体。LC-MS：m/z(ES)310(MH)+，332(MNa)+。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ:7.44-7.36(m，7H)，7.18(d，J = 8.4 Hz，2H)，6.70(br s，1H)，6.44(dd，J = 10.5，17.6 Hz，1H)，6.32(dd，J = 1.1，17.6 Hz，1H)，5.85(dd，J = 1.1，10.5 Hz，1H)，5.22(s，2H)，3.86(s，2H)。
中间体 2
((1R)-1-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 )(3- 氯苯基 ) 甲基 ] 丙 -2- 烯 -1- 基 } 氨基甲酸酯 (i-2)
Figure 326918DEST_PATH_IMAGE013
步骤 A ： 1-(3- 氯苯基 ) 丙 -2- 烯 -1- 醇
Figure 758424DEST_PATH_IMAGE014
在惰性氮气保护下，利用注射器向3-氯苯甲醛(22.5 g，160 mmol)的100 mL无水THF冷溶液中缓慢加入1.6M的乙烯基氯化镁THF溶液(100 mL，160 mmol)，将该溶液搅拌三小时并升至室温。用饱和氯化铵溶液终止反应，分离有机层、用乙酸乙酯(2 x 200 mL)萃取、并合并有机层，用硫酸镁干燥、过滤并真空浓缩。用配备有40M+硅胶柱的Horizon MPLC进行纯化，用0-40%的乙酸乙酯己烷溶液梯度洗脱，得标题化合物(22.4 g，44%)。m/z(ES)168，170(M，M+2)+，190，192(MNa，MNa+2)+。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.38(s，1H)，7.35-7.22(m，3H)，5.90(ddd，J = 7.3，10.0，17.4 Hz，1H)，5.38(d，J = 17.5 Hz，1H)，5.18(d，J = 7.2 Hz，1H)，5.15(d，J = 10.1 Hz，1H)，0.96(s，9H)，0.18(s，3H)，0.08(s，3H)。
步骤 B ：叔丁基 {[1-(3- 氯苯基 ) 丙 -2- 烯 -1- 基 ] 氧基 } 二甲基硅烷
Figure 33547DEST_PATH_IMAGE015
向22.4 g(133 mmol)1-(3-氯苯基)丙-2-烯-1-醇(来自步骤A)的90 mL无水DMF溶液中加入叔丁基二甲基甲硅烷基氯(20.0 g，133 mmol)和咪唑(18.1 g，266 mmol)，将得到的溶液在氮气保护下、在室温下搅拌过夜。水洗并用乙酸乙酯萃取。分离有机物，用硫酸镁干燥、过滤并减压浓缩。残余物用快速硅胶柱色谱纯化，用0-15%的乙酸乙酯己烷溶液梯度洗脱，得标题化合物(16.6 g，46%)。m/z(ES)282，284(M，M+2)+；151，153(M-OTBS，M-OTBS+2)+。
步骤 C ： {[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧 }(3- 氯苯基 ) 乙醛
Figure 614701DEST_PATH_IMAGE016
向用干冰/丙酮浴冷却至-78℃的、4.0g(14.2 mmol)叔丁基 {[1-(3-氯苯基)丙-2-烯-1-基]氧}二甲基硅烷 的二氯甲烷溶液(来自步骤B)中鼓入臭氧 ，直至溶液保持淡蓝色。然后鼓入氮气直至溶液变为无色。向溶液中加入甲硫醚，并将得到的混合物在室温下搅拌过夜。将其真空浓缩，残余物用配备有40M+硅胶柱的Horizon MPLC进行纯化，用0-50%的乙酸乙酯己烷溶液梯度洗脱，得产物(3.57 g，89%)。
步骤 D ： N-[(1E)-2-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧 }-2-(3- 氯苯基 ) 亚乙基 ]-2- 甲基丙烷 -2- 亚磺酰胺
Figure 949868DEST_PATH_IMAGE017
向3.0 g(10.6 mmol){[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧}(3-氯苯基)乙醛(来自步骤C)和1.3 g(10.6 mmol)(R 或 S)-2-甲基-2-丙烷亚磺酰胺的50 mL无水二氯甲烷溶液中加入硫酸铜(II)(3.4 g，21.2 mmol)，将得到混合物在氮气保护下、在室温搅拌16h。用水洗涤反应液并用二氯甲烷萃取。有机物用硫酸镁干燥、过滤并真空浓缩。残余物用配备有40M+硅胶柱的Horizon MPLC进行纯化，用0-25%的乙酸乙酯己烷溶液梯度洗脱，得标题化合物(3.26 g，80%)。%)。m/z(ES)387，390(M，M+2)+。
步骤 E ： N-{1-[{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧 }(3- 氯苯基 ) 甲基 ]- 丙 -2- 烯 -1- 基 }2- 甲基丙烷 -2- 亚磺酰胺
Figure 865740DEST_PATH_IMAGE018
氮气保护下，用注射器向冷却至0℃的 2.4 g(6.20 mmol)N-[(1E)-2-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧}-2-(3-氯苯基)亚乙基]-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺的20 mL无水THF溶液(来自步骤D)中加入 1.6M的乙烯基氯化镁THF溶液(3.90 mL，6.2 mmol)，将得到的混合物搅拌1h。该混合物升温至室温并再搅拌一小时。用饱和氯化铵溶液淬灭反应，并用乙酸乙酯萃取。合并有机物，用硫酸镁干燥、过滤并真空浓缩。残余物用配备有40M+硅胶柱的Horizon MPLC进行纯化，用0-35%的乙酸乙酯己烷溶液梯度洗脱，以单一异构体的形式得到全部四个非对映异构体。
借助NMR可知得到的四个产物互为非对映异构体。以它们从硅胶柱上洗脱出的顺序对异构体标记。第一个洗脱出的异构体命名为异构体1，然后是异构体2、3，最后是异构体4。
Figure 882238DEST_PATH_IMAGE019
异构体1：m/z(ES)416，418(M，M+2)+，438，440(MNa，MNa+2)+。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ:7.32(s，1H)，7.30(br d，J = 7.5，1H)，7.26(br d，J = 6.2 Hz，2H)，7.22-7.18(m，1H)， 5.60(ddd，J = 7.3，10.3，17.4 Hz，1H)，5.15(d，J = 10.3 Hz，1H)，5.00(d，J = 17.3 Hz，1H)，4.57(d，J = 7.4 Hz，1H)，3.98-3.94(m，2H)，1.64(br s，1H)，1.23(s，9H)，0.91(s，9H)，0.08(s，3H)，-0.18(s，3H)。
异构体2:m/z(ES)416，418(M，M+2)+，438，440(MNa，MNa+2)+。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.33-7.31(m，2H)，7.26(br d，J = 5.0 Hz，2H)，7.20-7.16(m，1H)， 5.44(ddd，J = 7.2 ，10.0，17.4 Hz，1H)，5.26(重叠 d，J = 7.3 Hz，1H)，5.25(重叠 d，J = 17.3 Hz，1H)，4.84(d，J = 4.4Hz，1H)，4.02(dt，J = 4.4，7.8 Hz，1H)，3.80(d，J = 4.4 Hz，1H)，1.20(s，9H)，0.94(s，9H)，0.14(s，3H)，-0.12(s，3H)。
异构体3：m/z(ES)416，418(M，M+2)+，438，440(MNa，MNa+2)+。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.32-7.29(m，2H)，7.26-7.24(m，2H)，7.22-7.20(m，1H)， 6.04(ddd，J = 7.1 ，10.4，17.4 Hz，1H)，5.40(d，J = 10.2 Hz，1H)，5.32(d，J = 17.3 Hz，1H)，4.80(d，J = 4.0 Hz，1H)，3.88-3.80(m，1H)，3.55(d，J = 9.4 Hz，1H)，1.09(s，9H)，0.95(s，9H)，0.09(s，3H)，-0.10(s，3H)。
异构体4：m/z(ES)416，418(M，M+2)+，438，440(MNa，MNa+2)+。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.32(s，1H)，7.30(br d，J = 7.5，1H)，7.27-7.25(m，2H)，7.21-7.18(m，1H)，5.92(ddd，J = 7.1，10.3，17.4 Hz，1H)，5.23(d，J = 10.4 Hz，1H)，5.18(d，J = 17.4 Hz，1H)，4.75(d，J = 4.2 Hz，1H)，3.88-3.82(m，1H)，3.33(d，J = 9.4 Hz，1H)，1.19(s，9H)，0.94(s，9H)，0.09(s，3H)，-0.14(s，3H)。
步骤 F ： ((1R)-1-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧 )(3- 氯苯基 ) 甲基 ] 丙 -2- 烯 -1- 基 } 氨基甲酸酯 (i-2)
向N-{1-[{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧}(3-氯苯基)甲基]-丙-2-烯-1-基}2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(来自步骤E)的异构体1(510 mg，2.22 mmol)中加入5 mL无水4 M HCl的二噁烷溶液，并在室温下搅拌该溶液15分钟。将反应液浓缩至干，并与甲苯(2 x 5 mL)共沸以除去过量的HCl。然后将残余物溶于无水二氯甲烷，置于氮气氛中，用冰/水浴冷却至0℃，然后用注射器缓慢加入氯甲酸苄酯(0.32 mL，2.22 mmol)和二异丙基乙基胺(1.19 mL，6.66 mmol)，并将得到的溶液在0℃下搅拌2h。将该溶液真空浓缩至干，残余物用制备板(4 x 1000 μM)纯化，以20%的乙酸乙酯己烷溶液展开，得标题化合物(703 mg，71%)。m/z(ES)446，448(M，M+2)+，468，470(MNa，MNa+2)+。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.32(s，1H)，7.30(br d，J = 7.5，1H)，7.27-7.25(m，2H)，7.21-7.18(m，1H)，5.92(ddd，J = 7.1，10.3，17.4 Hz，1H)，5.23(d，J = 10.4 Hz，1H)，5.18(d，J = 17.4 Hz，1H)，4.75(d，J = 4.2 Hz，1H)，3.88-3.82(m，1H)，3.33(d，J = 9.4 Hz，1H)，1.19(s，9H)，0.94(s，9H)，0.09(s，3H)，-0.14(s，3H)。
与上述不同的立体化学相关的中间体可利用上述方法以合适起始原料制备得到。
Figure 567166DEST_PATH_IMAGE020
中间体 3
(5R)-2-(4- 氨基苄基 )-5-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧 }
( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 (i-3)
Figure 463446DEST_PATH_IMAGE021
步骤 A ： {4-[(3E,5R,6R)-5-{[( 苄氧基 ) 羰基 ] 氨基 -6-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }-6-(3- 氯苯基 )-2- 氧代己 -3- 烯 -1- 基 ] 苯基 } 氨基甲酸苄基酯
Figure 351768DEST_PATH_IMAGE022
向苄基 [3-(2-氧代丁-3-烯-1-基)苯基] 氨基甲酸酯(i-1)(820 mg，2.80 mmol)和((1R)-1-[(R)-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基)(3-氯苯基)甲基]丙-2-烯-1-基}氨基甲酸酯(i-2)(500 mg，1.12 mmol)的 7 mL 无水二氯甲烷 溶液中加入Zhan I催化剂(740 mg，1.12 mmol)，在氮气保护下将得到的绿色溶液加热至40℃过夜。反应液浓缩至干，残余物用制备板(4 x 1000 μM)纯化，以40%的乙酸乙酯己烷溶液展开，得标题化合物(348 mg，50%)。m/z(ES)713，715(M，M+2)+，735，737(MNa，MNa+2)+。
步骤 B ： 4-({(5R)-5-[(R)-([ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -2- 基 } 甲基 ) 苯胺
Figure 435873DEST_PATH_IMAGE023
向328 mg(0.46 mmol){4-[(3E,5R,6R)-5-{[(苄氧基)羰基]氨基-6-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-6-(3-氯苯基)-2-氧代己-3-烯-1-基]苯基}氨基甲酸苄基酯(来自步骤A)的25 mL乙醇溶液中加入10%钯碳，用氢气球将该悬浮液置于 氢气氛中。在室温下反应液在氢气氛中搅拌1h。TLC确认反应完成。利用Gilmen 0.45 µM PTFE针筒式过滤器将催化剂滤除，并用乙醇洗涤(4 x 5 mL)。滤液真空浓缩至干，残余物用制备板(3 x 1000 μM)纯化，以5%的甲醇二氯甲烷溶液展开，得标题化合物(121 mg，66%)。m/z(ES)397(MH)+。
步骤 C ： (5R)-2-(4- 氨基苄基 )-5-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 (i-3)
向121 mg(0.315 mmol)4-({(5R)-5-[(R)-([叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}(苯基)甲基]吡咯烷-2-基}甲基)苯胺的5 mL 无水THF(来自步骤B)溶液中加入叔丁基 碳酸酯(69 mg，0.315 mmol)及 TEA(44 µL，0.315 mmol)，氮气保护下将得到的溶液在室温下搅拌过夜。直接将反应液上样至制备板(1500 µM)，用30%的乙酸乙酯己烷溶液展开，得标题化合物(100 mg，64%)。m/z(ES)497(MH)+，397(M-Boc)+。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.40-7.30(m，5H)，6.75-6.68(m，2H)，6.56-6.51(m，2H)，5.52-5.48(m，1H)，5.32-5.28(m，1H)，4.16-4.06(m，2H)，3.88-3.82(m，1H)，3.76-3.70(m，1H)，3.55-3.48(m,2H)，2.74(br d，J = 11.8 Hz，1H)，2.44(br d，J = 11.8 Hz，1H)，2.05-1.94(m，1H)，1.90-1.82(m，1H)，1.60(s，9H)，1.50-1.42(m，1H)，1.32-1.22(m，2H)，1.10-1.02(m,1H)，0.95(s，9H)，0.08(s，3H)，-0.15(s，3H)。
中间体 4a 和中间体 4b 的分离
(2S ， 5R) -2-(4- 氨基苄基 )-5-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 (i-4a) ；
(2R,5R)-2-(4- 氨基苄基 )-5-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 (i-4b)
步骤 A ： (2S ， 5R)-2-(4- 氨基苄基 )-5-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 (i-4a) 和 (2R,5R)-2-(4- 氨基苄基 )-5-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 (i-4b)
将中间体i-3(5R)-2-(4-氨基苄基)-5-[(R)-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}(苯基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(顺式和反式的4:1混合物)溶于甲醇中，并用Berger Multigram SFC(超临界)纯化，以30%甲醇：60%二氧化碳为洗脱剂分离两个非对映体。柱分离的第一个异构体标记为次要异构体1，第二个异构体标记为主要异构体2。
i-4a：m/z(ES)497(MH)+，397(M-Boc)+。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.40-7.30 (m，5H)，6.75-6.68(m，2H)，6.56-6.51(m，2H)，5.52-5.48(m，1H)，5.32-5.28(m，1H)，4.16-4.06(m，2H)，3.88-3.82(m，1H)，3.76-3.70(m，1H)，3.55-3.48(m,2H)，2.74(br d，J = 11.8 Hz，1H)，2.44(br d，J = 11.8 Hz，1H)，2.05-1.94(m，1H)，1.90-1.82(m，1H)，1.60(s，9H)，1.50-1.42(m，1H)，1.32-1.22(m，2H)，1.10-1.02(m,1H)，0.95(s，9H)，0.92(d，J = 11.8 Hz，1H)，0.12(br d，J = 14.0 Hz，3H)，-0.04(s，3H)。洗出 8.70 min , SFC，异构体2
i-4b:m/z(ES)497(MH)+，397(M-Boc)+。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.40-7.30(m，5H)，6.76-6.68(m，2H)，6.56-6.51(m，2H)，5.52-5.48(m，1H)，5.32-5.28(m，1H)，4.16-4.06(m，2H)，3.88-3.82(m，1H)，3.76-3.70(m，1H)，3.60-3.46(m,2H)，2.72(br d，J = 12.0 Hz，1H)，2.44(br d，J = 12.2 Hz，1H)，2.05-1.94(m，1H)，1.90-1.82(m，1H)，1.64(s，9H)，1.50-1.42(m，1H)，1.32-1.22(m，2H)，1.10-1.02(m,1H)，0.95(s，9H)，0.14(br d，J = 13.8 Hz，3H)，0.09(s，3H)。洗出 7.78 min , SFC，异构体1。
中间体 4a 和中间体 4b 的合成
(2S ， 5R)-2-(4- 氨基苄基 )-5-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 (i-4a);
(2R,5R)-2-(4- 氨基苄基 )-5-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 (i-4b)
Figure 793222DEST_PATH_IMAGE025
步骤 A ： (4S)-3- 己 -5- 炔酰基 -4- 苯基 -1,3- 噁唑烷 -2- 酮
Figure 231156DEST_PATH_IMAGE026
在氮气保护下，在-25℃下于20分钟内向69.0 g(615 mmol)5-己炔酸和214 mL(1540 mmol)三乙胺的1.0 L无水四氢呋喃溶液中加入83.0 mL(677 mmol)三甲基乙酰氯。伴随加入形成白色沉淀，并将得到的悬浮液搅拌2h。然后，依次加入 28.7 g(677 mmol)无水氯化锂和100.0 g(615.0 mmol)(4S)-4-苯基-1,3-噁唑烷-2-酮，该混合物在12h内逐渐升温至室温。真空除去所有挥发物，残余物用水(1 L)稀释并用乙酸乙酯(3 x 300 mL)萃取。合并的有机层用盐水(250 mL)洗涤、硫酸镁干燥、过滤并真空浓缩。粗残余物用硅胶色谱纯化，用5-50%的乙酸乙酯己烷溶液梯度洗脱，得标题化合物为无色固体(135 g，85.4%)。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ 7.40-7.37(m，2H)，7.36-7.32(m，1H)，7.31-7.28(m，2H)，5.42(dd，J = 8.9，3.7 Hz，1H)，4.69(t，J = 8.9 Hz，1H)，4.28(dd，J = 9.2，3.7 Hz，1H)，3.13-3.02(m，2H)，2.24-2.21(m，2H)，1.94(t，J = 2.6 Hz，1H)，1.84(五重峰，J = 7.1 Hz，2H)。LC-MS：m/z(ES)258.2(MH)+。
步骤 B ： (4S)-3-{(2R)-2-[(S)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 己 -5- 炔酰基 }-4- 苯基 -1,3- 噁唑烷 -2- 酮
Figure 776407DEST_PATH_IMAGE027
室温下、在氮气保护下，向搅拌下的来自上述步骤A的56.8 g(221 mmol)(4S)-3-己-5-炔酰基-4-苯基-1,3-噁唑烷-2-酮的 265 mL无水乙酸乙酯溶液中加入6.31 g(66.2 mmol)无水氯化镁、61.5 mL(442 mmol)三乙胺、26.9 mL(265 mmol)苯甲醛和42.3 mL(331 mmol) 三甲基氯硅烷 ，将得到混合物搅拌72h。非均相的反应混合物通过300 mL硅胶塞过滤，并另外用1L乙酸乙酯洗脱。滤液在真空下蒸干，将残余物悬浮于265 mL甲醇和10 mL三氟乙酸中。得到的混合物在氮气保护下、在室温下搅拌5h，在此期间反应液变为均相。真空除去所有挥发物，残余物用硅胶色谱纯化，用5-15%的乙酸乙酯己烷溶液梯度洗脱，得标题化合物为白色固体(65.0 g，81.2%)。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ 7.30-7.28(m，8H)，7.09-7.07(m，2H)，5.42(dd，J = 8.7，3.7 Hz，1H)，4.76-4.72(m，1H)，4.72-4.67(m，1H)，4.65(t，J = 8.7 Hz，1H)，4.18(dd，J = 8.7，3.7 Hz，1H)，3.05(d，J = 7.8 Hz，1H)，2.24(td，J = 7.1，2.5 Hz，2H)，2.00-1.93(m，2H)，1.67-1.61(m，1H)。LC-MS：m/z(ES)346.1(MH-H2O)+，386.0(MNa)+。
步骤 C ： (2R)-2-[(S)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 己 -5- 炔酸
Figure 248977DEST_PATH_IMAGE028
0 ℃下、在氮气保护下，向搅拌下的来自上述步骤B的65.0 g(179 mmol)(4S)-3-{(2R)-2-[(S)-羟基(苯基)甲基]己-5-炔酰基}-4-苯基-1,3-噁唑烷-2-酮的1050 mL无水四氢呋喃/水20比1的混合物溶液中加入77.0 mL(894 mmol)的 35% 双氧水水溶液，加入速度应足够慢以保持内部温度低于3℃。然后，加入395 mL(395 mmol)的1.0 M氢氧化锂水溶液，加入速度应足够慢以保持反应内部温度低于5℃，并将得到混合物在0℃下搅拌3h。用755 mL(984 mmol)1.3 M的亚硫酸钠水溶液淬灭反应，其加入速度应足够慢以保持内混合物部温度低于5℃。真空除去所有挥发物，剩余的水相用乙酸乙酯萃取(3 x 200 mL)。然后将水相冷却至0℃，并用6 M盐酸水溶液酸化至pH为3。然后用乙酸乙酯(3 x 300 mL)萃取水相，合并的有机物用盐水(100 mL)洗涤、硫酸镁干燥、过滤并真空浓缩。残余物用硅胶色谱纯化，用5-10%的乙酸乙酯和3%的乙酸的己烷溶液梯度洗脱，得标题化合物，为无色胶状物(32.0 g，82.0%)。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ 7.39-7.28(m，5H)，4.85(d，J = 8.2，1H)，3.03-2.97(m，1H)，2.29-2.15(m，2H)，1.97(t，J = 2.5 Hz，1H)，1.93-1.82(m，1H)，1.62-1.55(m，1H)。LC-MS：m/z(ES)201.0(MH-H2O)+。
步骤 D ： (2R)-2-[(S)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ] 己 -5- 炔酸
Figure 549377DEST_PATH_IMAGE029
室温下，在氮气保护下，向搅拌下的来自上述步骤C的32.0 g(147 mmol)(2R)-2-[(S)-羟基(苯基)甲基]己-5-炔酸的500 mL无水乙腈溶液中加入77.0 mL(513 mmol)1,8-二氮杂环[5.4.0]十一-7-烯22 mL，接着在10分钟内分三批加入 66.3 g(440 mmol)叔丁基二甲基甲硅烷基氯。将反应混合物搅拌4h，然后真空下蒸发除去所有挥发物。残余物用300 mL二氯甲烷和100 mL水稀释。向该混合物中加入1.0 M盐酸水溶液直至水层的pH值达到3。使各相分离，并用二氯甲烷(2 x 100 mL)萃取水相。合并的有机物用水(50 mL)、盐水(50 mL)洗涤，然后用硫酸镁干燥。过滤并真空浓缩后，残余物溶解在350 mL甲醇中，并加入350 mL(280 mmol)0.8 M碳酸钾水溶液。将得到的混合物搅拌1.5h，然后真空蒸除所有挥发物。残余物用300 mL二氯甲烷稀释，并用5 M盐酸水溶液酸化水相至pH为3。使各相分离，并用二氯甲烷(2 x 100 mL)萃取水相。合并的有机物用水(50 mL)、盐水(50 mL)洗涤，然后用硫酸镁干燥，过滤并真空蒸发。残余物用硅胶色谱纯化，用3-15%的乙酸乙酯己烷溶液梯度洗脱，得标题化合物，为无色固体 (42.3 g，86.6%)。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ 7.36-7.27(m，5H)，4.78(d，J = 8.7，1H)，2.90-2.86(m，1H)，2.19-2.11(m，1H)，2.10-2.03(m，1H)，1.90(t，J = 2.6 Hz，1H)，1.75-1.67(m，1H)，1.41-1.34(m，1H)，0.83(s，9H)， 0.02(s，3H)，-0.27(s，3H)。LC-MS：m/z(ES)333.2(MH)+。
步骤 E ： {(1R)-1-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ] 戊 -4- 炔 -1- 基 } 氨基甲酸 4- 甲氧基苄基酯
Figure 602171DEST_PATH_IMAGE030
室温下，在氮气保护下，向来自上述步骤D的40.0 g(120 mmol)(2R)-2-[(S)-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}(苯基)甲基]己-5-炔酸和33.5 mL(241 mmol)三乙胺的400 mL无水甲苯溶液加入37.5 mL(132 mmol)叠氮磷酸二苯酯。将该混合物搅拌5h，然后加入37.5 mL(301 mmol)4-甲氧基苄醇。将得到的混合物在105℃下搅拌16 h，冷却至室温，然后用250 mL饱和碳酸氢盐水溶液稀释。使各相分离，水相用乙酸乙酯(2 x 150 mL)萃取。合并的有机物用水 (100 mL)、盐水(100 mL)洗涤，然后用硫酸镁干燥、过滤并真空蒸发。粗残余物用硅胶色谱纯化，用3-10%的乙酸乙酯己烷溶液洗脱，得标题化合物，为无色油状物 (50.9 g，90.5%)。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：7.28-7.21(m，7H)，6.87(d，J = 8.4 Hz，2H)，4.92(s，2H)，4.77-4.59(m，2H)，3.89-3.84(m，1H)，3.81(s，3H)，2.30-2.22(m，2H)，1.95(m，1H)，1.91-1.85(m，1H)，1.57-1.50(m，1H)，0.89(s，9H)，0.06(s，3H)，-0.15(s，3H)。LC-MS：m/z(ES)468.1(MH)+，490.0(MNa)+。
步骤 F ： [(1R)-1-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ]-5-(4- 硝基苯基 ) 戊 -4- 炔 -1- 基 ] 氨基甲酸 4- 甲氧基苄基酯
Figure 764162DEST_PATH_IMAGE031
向乙炔(来自步骤E，40g，80 mmol)和4-碘代硝基苯(21.8 g，88 mmol)的无水DMF(500 ml)溶液中加入三乙胺(111 mL，797 mmol)。加入Pd(dppf)Cl2(1.95 g，2.39 mmol)和碘化亚铜(I)(910 mg，4.78 mmol)，混合物用氮气 (鼓泡15分钟)脱气，并将得到的溶液在室温下搅拌5h。将混合物倾入水(1200 m)中，并用EtOAc(3 x 300 mL)萃取。合并的有机物用水(2 x 500 mL)，饱和NaCl(200 mL)洗涤，硫酸镁干燥、过滤并真空蒸发。残余物用MPLC(Horizon Biotage 2x Flash 65i)纯化，用0-30%的乙酸乙酯己烷溶液梯度洗脱，得41g(84%)深红色油状物。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：8.11-8.04(m，2H)，7.94-8.01(m，1H)，7.38-7.21(m，8H)，6.87(d，J = 8.4 Hz，2H)，4.98(s，2H)，4.77-4.59(m，2H)，4.00-3.95(m，3H)，3.81(s，3H)，2.56(t，J = 7.1 Hz，H = 2H)，2.00-1.95(m，1H)，1.66-1.61(m，1H)，0.93(s，9H)，0.10(s，3H)，-0.10(s，3H)。LC-MS：m/z(ES)589.3(MH)+，611.2(MNa)+。
步骤 G ： [(1R)-1-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ]-5-(4- 硝基苯基 )-4- 氧代戊基 ] 氨基甲酸 4- 甲氧基苄基酯
Figure 12610DEST_PATH_IMAGE032
向硝基苯乙炔(来自步骤F，41 g，65.5 mmol)的DMF(40 ml)溶液中加入吡咯烷(14 mL，196.5 mmol)，得到的混合物在80℃下加热3 h。将混合物冷却至室温，并加入10%乙酸水溶液(110 ml)，得到的溶液在室温下再搅拌3 h。将混合物倾入水(300ml)中，并用EtOAc(3 x 250 ml)萃取；合并的EtOAc层用水(2 x 250ml)、饱和NaCl(100ml)洗涤，MgSO4干燥、过滤并蒸发。残余物用Horizon Flash 75纯化，用100%己烷至50% EtOAc己烷溶液梯度洗脱，得 34 g(81%)暗橙色油状物。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：8.17-8.14(m，2H)，7.32-7.23(m，9H)，6.87(d，J = 8.4 Hz，2H)，4.96(d，J = 12.2 Hz，1H)，4.90(d，J = 12.1 Hz，1H)，4.72(d，J = 3Hz，1H)，4.16-4.13(m，1H)，3.81(s，3H)，3.71-3.77(m，2H)，2.65-2.52(m，2H)，1.97-1.92(m，1H)，1.72-1.60(m，1H)，0.93(s，9H)，0.05(s，3H)，-0.13(s，3H)。
步骤 H ： (2R,5S)-2-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ]-5-(4- 硝基苄基 ) 吡咯烷 (2R,5R)-2-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ]-5-(4- 硝基苄基 ) 吡咯烷
Figure 234644DEST_PATH_IMAGE033
向MOZ保护的酮胺(来自步骤G，34 g，56 mmol)的DCM(350 mL)溶液中加入TFA(256 mL)，所得混合物在室温下搅拌1.5小时。将该溶液真空蒸发并使残留物在DCM和饱和NaHCO3之间分配。有机层经MgSO4干燥，过滤和蒸发。将该残留物溶解在MeOH(750 mL)中并经冰/水浴冷却至0℃。随后加入氰基硼氢化钠(21.2 g，337 mmol)并将所得混合物搅拌过夜以升温至室温。通过添加水来猝灭该混合物并在真空下除去有机物。随后用EtOAc萃取水层(x2)并用饱和NaCl洗涤该合并的EtOAc层，经MgSO4干燥，过滤和真空蒸发。残留物通过在二氧化硅上的柱色谱法提纯(洗脱剂：从100％己烷升至35％EtOAc的己烷溶液的梯度)，得到16.4 g(63.4％)第一异构体(2R,5S)-2-[(R)-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}(苯基)甲基]-5-(4-硝基苄基)吡咯烷和3.1 g(12％)第二异构体(2R,5R)-2-[(R)-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}(苯基)甲基]-5-(4-硝基苄基)吡咯烷。
异构体1：LC-MS：m/z(ES)427.3(MH)+
异构体2：LC-MS：m/z(ES)427.3(MH)+
步骤 I ： (2R,5S)-2-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ]-5-(4- 硝基苄基 ) 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯
Figure 647170DEST_PATH_IMAGE034
向(2R,5S)-2-[(R)-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}(苯基)甲基]-5-(4-硝基苄基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(12 g，42.5 mmol)的无水THF溶液中加入Boc酐(9.3 g，42.5 mmol)，接着加入TEA(17.76 mL，127.4 mmol)，并将所得溶液在室温下在氮气氛下搅拌2小时。用水(100 mL)洗涤该混合物并用乙酸乙酯(2x200 mL)萃取。有机物经硫酸钠干燥，过滤和真空浓缩。该残留物通过Horizon Biotage MPLC(65i硅胶柱)提纯，用20-75％乙酸乙酯的己烷溶液梯度洗脱，得到所需产物。LC-MS：m/z(ES)527.3(MH)+，549.2(MNa)+。
步骤 J ： (2R,5R)-2-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ]-5-(4- 硝基苄基 ) 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯
Figure 862120DEST_PATH_IMAGE035
以与步骤I相同的方式制备,但将顺式吡咯烷异构体换成反式异构体(2R,5R)-2-[(R)-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}(苯基)甲基]-5-(硝基苄基)吡咯烷。LC-MS：m/z(ES)527.3(MH)+，549.2(MNa)+。
步骤 K ： (2S ， 5R)-2-(4- 氨基苄基 )-5-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 (i-4a);
Figure 981386DEST_PATH_IMAGE036
在500 mLparr摇振烧瓶中装入10％Pd/c(4.75 g)并向其中加入100 mL甲醇以覆盖该催化剂。随后将来自步骤I的硝基中间体(8.5 g，18.5 mmol)的甲醇(80 mL)溶液添加到该悬浮液中，接着加入15.4 mL1.0M氯化氢的甲醇溶液。将反应容器置于50PSI氢气下并将该混合物搅拌过夜。提取等分试样并通过LC-MS分析，其表明完全反应。
使用硅藻土滤出催化剂并用甲醇(2x100 mL)洗涤。将该滤液浓缩至干，产物通过Horizon MPLC(65i二氧化硅柱)提纯，用从0％升至30％的乙酸乙酯的己烷溶液梯度洗脱以提供标题化合物(6.2g，72％)。m/z(ES)497(MH)+，397(M-Boc)+。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.38-7.29(m，5H)，6.76-6.68(m，2H)，6.55-6.50(m，2H)，5.52-5.49(m，1H)，5.30-5.27(m，1H)，4.15-4.05(m，2H)，3.86-3.81(m，1H)，3.76-3.71(m，1H)，3.55-3.47(m,2H)，2.74(br d，J = 11.7 Hz，1H)，2.44(br d，J = 11.7 Hz，1H)，2.05-1.93(m，1H)，1.90-1.83(m，1H)，1.60(s，9H)，1.50-1.42(m，1H)，1.31-1.21(m，2H)，1.10-1.02(m,1H)，0.95(s，9H)，0.92(d，J = 11.8 Hz，1H)，0.13(br d，J = 14.0 Hz，3H)，-0.05(s，3H)
步骤 L:(2R,5R)-2-(4- 氨基苄基 )-5-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 (i-4b)
Figure 358009DEST_PATH_IMAGE037
以与步骤K相同的方式制备，但将顺式吡咯烷异构体换成反式异构体(2R,5R)-2-[(R)-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}(苯基)甲基]-5-(4-硝基苄基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。m/z(ES)497(MH)+，397(M-Boc)+。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.41-7.30(m，5H)，6.73-6.67(m，2H)，6.56-6.50(m，2H)，5.52-5.48(m，1H)，5.33-5.28(m，1H)，4.15-4.06(m，2H)，3.86-3.81(m，1H)，3.76-3.70(m，1H)，3.59-3.46(m,2H)，2.72(br d，J = 12.0 Hz，1H)，2.44(br d，J = 12.0 Hz，1H)，2.05-1.93(m，1H)，1.90-1.82(m，1H)，1.64(s，9H)，1.49-1.42(m，1H)，1.32-1.20(m，2H)，1.10-1.02(m,1H)，0.95(s，9H)，0.14(br d，J = 13.7 Hz，3H)，0.10(s，3H)。
利用上文对中间体i-4a描述的方法由适当的起始原料制备下列中间体。
Figure 257832DEST_PATH_IMAGE038
Figure 823943DEST_PATH_IMAGE039
利用上文对中间体i-4b描述的方法由适当的起始原料制备下列中间体。
Figure 253174DEST_PATH_IMAGE040
中间体 5
(5R)-2-(4- 氨基苄基 )-5-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }
(3- 氯苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 (i-5)
Figure 125501DEST_PATH_IMAGE042
步骤 A ： 4-({(5R)-5-[(R)-([ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }(3- 氯苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -2- 基 } 甲基 ) 苯胺
向100 mg(0.15 mmol){4-[(3E,5R,6R)-5-{[(苄氧基)羰基]氨基-6-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-6-(3-氯苯基)-2-氧代己-3-烯-1-基]苯基}氨基甲酸苄酯(来自步骤A，i-3)的8 mL乙酸乙酯溶液中加入10％载钯碳，并经由氢气球将该悬浮液置于氢气氛下。该反应在氢气下在室温下搅拌8小时。使用Gilmen 0.45uM PTFE针筒式过滤器滤出催化剂并用乙酸乙酯(4x2 mL)洗涤。滤液在真空下浓缩至干且残留物通过制备板(1000μM)提纯，用二氯甲烷中5％的甲醇洗脱以提供标题化合物(33 mg，51％)。m/z(ES)430，432(M，M+2)+。
步骤 B ： (5R)-2-(4- 氨基苄基 )-5-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }(3- 氯苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 - 甲酸叔丁酯 (i-5)
向33 mg(0.07 mmol)4-({(5R)-5-[(R)-([叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}(3-氯苯基)甲基]吡咯烷-2-基}甲基)苯胺的1 mL无水THF溶液(来自步骤A)中加入碳酸叔丁酯(15.3 mg，0.07 mmol)，接着加入TEA(13微升，0.07 mmol)，并将所得溶液在室温下在氮气氛下搅拌过夜。将反应混合物直接置于制备板(500uM)上并用30％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱以提供标题化合物(25 mg，78％)。m/z(ES)530，532(M，M+2)+，430，432(M-Boc，M-Boc+2)+。
中间体 6
4-{4-[4-( 三氟甲基 ) 苯基 ]-1,3- 噻唑 -2- 基 } 苯磺酰氯 (i-6)
Figure 323582DEST_PATH_IMAGE044
可以根据公开的方法，例如Ikemoto等人，Tetrahedron 2003，59，1317-1325制备中间体6。
中间体 7
2- 甲基 -5 ， 6- 二氢 -4H- 环戊并 [ α ][1 ， 3] 噻唑 -4- 甲酸 (i-7)
步骤 A ： 2- 甲基 -5 ， 6- 二氢 -4H- 环戊并 [ α ][1 ， 3] 噻唑 -4- 甲酸乙酯
Figure 916423DEST_PATH_IMAGE046
经～20分钟向在0℃下冷却的2-氧代环戊烷-2-甲酸乙酯(56 g，359 mmol)的氯仿(500 mL)溶液中加入溴(18.5 mL，359 mmol)。在完全添加后，使混合物升温至室温并搅拌过夜。将氮气鼓入混合物90分钟以除去大部分HBr。用水(500 mL)、饱和NaHCO3(250 mL)、饱和NaCl(200 mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤和蒸发。残留物溶解在EtOH(500 mL)中，加入硫代乙酰胺(26.9 g，359 mmol)，将混合物在室温下搅拌1小时，随后回流过夜。将该混合物冷却和蒸发，并使残留物在DCM和饱和NaHCO3之间分配，有机层用饱和NaCl洗涤，经MgSO4干燥，过滤和蒸发。残留物通过MPLC(Biotage Horizon®：2x FLASH 65i)提纯，洗脱剂：100％己烷(450 mL)，梯度从100％己烷升至25％EtOAc的己烷溶液(1400 mL)，随后25％EtOAc的己烷溶液，以得到深色油状的标题化合物(32 g，42％)。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ：4.22(q，J = 7.0 Hz，2H)，3.96(m，1H)，3.04(m，1H)，2.88(m，1H)，2.76(m，2H)，2.70(s，3H)，1.30(t，J = 7.0Hz，3H)。
步骤 B ： 2- 甲基 -5 ， 6- 二氢 -4H- 环戊并 [ α ][1 ， 3] 噻唑 -4- 甲酸 (i-7)
向31.5 g(149 mmol)2-甲基-5，6-二氢-4H-环戊并[α][1，3]噻唑-4-甲酸乙酯的THF(450 mL)和甲醇(100 mL)溶液(来自步骤A)中加入氢氧化锂溶液(149 mL1M溶液，149 mmol)并将所得混合物在室温下搅拌3小时。蒸发除去有机物，水性残留物用Et2O(2x250 mL)萃取和通过添加1M HCl(～170 mL)来酸化至pH 3，并用固体NaCl饱和。用DCM(3x250 mL)萃取，合并的DCM层经MgSO4干燥，过滤和蒸发。用DCM(3x250 mL)萃取，合并的DCM层经MgSO4干燥，过滤和蒸发。残留物用乙腈研制，过滤和干燥以得到灰白色固体状的标题化合物(7.1 g，26％)。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ：11.75(br s，1H)，4.02(m，1H)，3.00(m，1H)，2.90-2.66(m，6H)。
中间体 8
2-[( 叔丁氧基羰基 ) 氨基 ]-5 ， 6- 二氢 -4H- 环戊并 [ α ][1 ， 3] 噻唑 -4- 甲酸 (i-8)
步骤 A ： 2- 氨基 -5 ， 6- 二氢 -4H- 环戊并 [ α ][1 ， 3] 噻唑 -4- 甲酸乙酯
以与中间体(i-7)相同的方式制备，将步骤A中的硫代乙酰胺换成硫脲。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.30(br s，2H)，4.21(q，J = 7.0，2H)，3.81(m，1H)，2.91(m，1H)，2.78(m，1H)，2.66(m，2H)，1.30(t，J = 7.0，3H)。
步骤 B ： 2-[( 叔丁氧基羰基 ) 氨基 ]-5 ， 6- 二氢 -4H- 环戊并 [ α ][1 ， 3] 噻唑 -4- 甲酸乙酯
Figure 320750DEST_PATH_IMAGE049
向230 mg(1.08 mmol)2-氨基-5，6-二氢-4H-环戊并[α][1，3]噻唑-4-甲酸乙酯的二氯甲烷(5 mL)溶液(来自步骤A)中加入二碳酸二叔丁酯(236 mg，1.08 mmol)、三乙胺(0.15 mL，1.08 mmol)和DMAP(13 mg，0.11 mmol)并将所得混合物在室温下搅拌2小时。混合物用1N HCl(10 mL)、饱和NaCl(5 mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤和蒸发。残留物通过MPLC(Biotage Horizon：FLASH 25+S)提纯，洗脱剂：100％己烷(100 mL)，梯度为0-15％EtOAc的己烷溶液(900 mL)，随后15％EtOAc的己烷溶液(500 mL)以得到白色泡沫状的标题化合物(160 mg，47％)。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ：9.23(br s，1H)，4.17(q，J = 7.1 Hz，2H)，3.95(t，J = 6.6 Hz，1H)，3.04(m，1H)，2.86(m，1H)，2.76(m，2H)，1.55(s，9H)，1.23(t，J = 7.1 Hz，3H)。
步骤 C ： 2-[( 叔丁氧基羰基 ) 氨基 ]-5 ， 6- 二氢 -4H- 环戊并 [ α ][1 ， 3] 噻唑 -4- 甲酸 (i-8)
使用与中间体(i-7)步骤B中类似的方法由2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5，6-二氢-4H-环戊并[α][1，3]噻唑-4-甲酸乙酯(来自步骤B)制备。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.96(m，1H)，3.06(m，1H)，2.88(m，2H)，2.71(m，1H)，1.55(s，9H)。
中间体 9
2-(4- 氟苯基 )-5 ， 6- 二氢 -4H- 环戊并 [ α ][1 ， 3] 噻唑 -4- 甲酸 (i-9)
Figure 416882DEST_PATH_IMAGE050
使用与中间体7(i-7)中类似的方法制备，在步骤A中将硫代乙酰胺换成4-氟硫代苯甲酰胺。1HNMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.90(m，2H)，7.29(t，J = 8.7，2H)，3.81(m，1H)，2.99(m，1H)，2.86(m，1H)，2.70-2.58(m，2H)。
中间体 10
2- 甲基 -4 ， 5 ， 6 ， 7- 四氢 -1 ， 3- 苯并噻唑 -4- 甲酸 (i-10)
步骤 A ： 2- 甲基 -4 ， 5 ， 6 ， 7- 四氢 -1 ， 3- 苯并噻唑 -4- 甲酸乙酯
Figure 118308DEST_PATH_IMAGE052
经15分钟向在0℃下冷却的2-氧代环己烷甲酸乙酯(15 g，88 mmol)的无水乙醚(40 mL)溶液中逐滴加入溴(4.5 mL，88 mmol)。在完全添加后，使混合物经90分钟升温至室温。混合物用EtOAc(100 mL)稀释并用饱和NaHCO3、饱和NaCl洗涤，经MgSO4干燥，过滤和蒸发。将残留物吸收于乙醇(100 mL)中并加入硫代乙酰胺(6.6 g，88 mmol)。混合物在室温下搅拌1小时，随后回流过夜。将混合物蒸发，且残留物在饱和NaHCO3和DCM之间分配。有机层经MgSO4干燥，过滤和蒸发。残留物通过MPLC(Biotage Horizon：FLASH 65i)提纯，洗脱剂：100％己烷(500 mL)，梯度为0至25％EtOAc的己烷溶液(1200 mL)，随后25％EtOAc的己烷溶液(1200 mL)以得到浅橙色油状的标题化合物(6.14 g，31％)。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ：4.22(q，J = 7.1，2H)，3.84(t，J = 5.5，1H)，2.80(m，1H)，2.73(m，1H)，2.65(s，3H)，2.18(m，1H)，2.11-1.95(m，2H)，1.85(m，1H)，1.29(t，J = 7.1，3H)。
步骤 B ： 2- 甲基 -4 ， 5 ， 6 ， 7- 四氢 -1 ， 3- 苯并噻唑 -4- 甲酸 (i-10)
根据中间体(i-7)步骤B中阐述的方法由2-甲基-4，5，6，7-四氢-1，3-苯并噻唑-4-甲酸乙酯(来自步骤A)制备。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ：9.26(br s，1H)，3.81(q，J = 7.3和5.9，1H)，2.75(m，2H)，2.68(s，3H)，2.24(m，1H)，2.18-2.01(m，2H)，1.82(m，1H)。
中间体 11
2-[( 叔丁氧基羰基 ) 氨基 ]-4 ， 5 ， 6 ， 7- 四氢 -1 ， 3- 苯并噻唑 -4- 甲酸 (i-11)
Figure 381799DEST_PATH_IMAGE053
步骤 A ： 2- 氨基 -4 ， 5 ， 6 ， 7- 四氢 -1 ， 3- 苯并噻唑 -4- 甲酸乙酯
Figure 902910DEST_PATH_IMAGE054
根据中间体10(i-10)步骤A中阐述的方法制备，将硫代乙酰胺换成硫脲。1HNMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：9.28(br s，2H)，4.11(q，J = 7.3，2H)，3.71(t，J = 5.0，1H)，2.57-2.39(m，2H)，1.90(m，2H)，1.78(m，1H)，1.59(m，1H)，1.17(t，J = 7.3，3H)。
步骤 B ： 2-[( 叔丁氧羰基 ) 氨基 ]-4,5,6,7- 四氢 -1,3- 苯并噻唑 -4- 甲酸 (i-11)
根据中间体8(i-8)步骤B和C中阐述的方法由2-氨基-4，5，6，7-四氢-1，3-苯并噻唑-4-甲酸乙酯(来自步骤A)制备。1HNMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.70(t，J = 5.2，1H)，2.74(m，1H)，2.64(m，1H)，2.25(m，1H)，2.10-1.94(m，2H)，1.87(m，1H)，1.55(s，9H)。
中间体 12
茚满 -1- 甲酸
Figure 339576DEST_PATH_IMAGE055
根据文献方法Journal of Organic Chemistry(2000)，65(4)，1132-1138制备。
中间体 13a 和中间体 13b
(2S ， 5R)-2-(4- 氨基苄基 )-5-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 (i-13a);
(2R,5R)-2-(4- 氨基苄基 )-5-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 (i-13b)
Figure 324850DEST_PATH_IMAGE056
步骤 A ： (4R,5R)-2 ， 2- 二甲基 -4-[(1E)-3- 氧代丙 -1- 烯 -1- 基 ]-5- 苯基 -1 ， 3- 噁唑烷 -3- 甲酸叔丁酯
Figure 572291DEST_PATH_IMAGE057
向(4S，5R)-4-甲酰基-2，2-二甲基-5-苯基-1，3-噁唑烷-3-甲酸叔丁酯(20.9，89.1 mmol)的CH2Cl2(150 mL)溶液中加入(三苯基膦烯(triphenylphosphoranylidene))乙醛(27.1 g，89.1 mmol)并将所得混合物在环境温度下搅拌40小时。在除去1/3溶剂后，加入充分的己烷并滤出所得固体。在Biotage Horizon®系统上的快速色谱法(硅胶，梯度为0至20％乙酸乙酯的己烷溶液，随后20％乙酸乙酯的己烷溶液)得到16.3 g(72％)黄色油状的标题化合物。LC/MS 354.3(M+23)。
步骤 B ： (4R,5R)-2 ， 2- 二甲基 -4-(3- 氧代丙基 )-5- 苯基 -1 ， 3- 噁唑烷 -3- 甲酸叔丁酯
Figure 821177DEST_PATH_IMAGE058
向(4R,5R)-2，2-二甲基-4-[(1E)-3-氧代丙-1-烯-1-基]-5-苯基-1，3-噁唑烷-3-甲酸叔丁酯(19.6 g，59.1 mmol)(来自步骤A)的丙酮(150 mL)溶液中加入1.9 g10％Pd/C并将所得悬浮液在氢气球下在环境温度下搅拌24小时。在硅藻土上滤除固体，将滤液真空浓缩。残留物通过在Biotage Horizon®系统上的快速色谱法提纯(硅胶，梯度为0至20％乙酸乙酯的己烷溶液，随后20％乙酸乙酯的己烷溶液)以得到11.5 g(58％)无色油状的标题化合物。LC/MS 356.3(M+23)。
步骤 C ： (4R,5R)-2 ， 2- 二甲基 -4-[(3E)-4-(4- 硝基苯基 ) 丁 -3- 烯 -1- 基 ]-5- 苯基 -1 ， 3- 噁唑烷 -3- 甲酸叔丁酯和 (4R,5R)-2 ， 2- 二甲基 -4-[(3Z)-4-(4- 硝基苯基 ) 丁 -3- 烯 -1- 基 ]-5- 苯基 -1 ， 3- 噁唑烷 -3- 甲酸叔丁酯
Figure 999218DEST_PATH_IMAGE059
向来自步骤B的(4R,5R)-2，2-二甲基-4-(3-氧代丙基)-5-苯基-1，3-噁唑烷-3-甲酸叔丁酯(10.0 g，30.0 mmol)的CH2Cl2(200 mL)溶液中加入(4-硝基苄基)三苯基-溴化
Figure 838998DEST_PATH_IMAGE060
(21.5 g，45.0 mmol)，接着加入Et3N(8.36 mL，60.0 mmol)。该红色反应混合物在环境温度下搅拌48小时。将己烷(200 mL)倒入反应混合物中并滤除固体。在Biotage Horizon®系统上的快速色谱法(硅胶，梯度为0至10％乙酸乙酯的己烷溶液，随后10％乙酸乙酯的己烷溶液)得到10.7 g(79％)浅黄色泡沫状的标题化合物(顺式反式混合物)。LC/MS 475.4(M+23)。
步骤 D ： (2R,5S)-2-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ]-5-(4- 硝基苄基 ) 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯和 (2R,5R)-2-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ]-5-(4- 硝基苄基 ) 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯
Figure 257341DEST_PATH_IMAGE061
向来自步骤C的上述顺式/反式混合物(7.86 g，17.4 mmol)的乙酸乙酯(100 mL)溶液中加入50 mL2N HCl溶液并将所得混合物在环境温度下搅拌2小时，随后加热至45℃达3小时。在减压下除去挥发物。将所得白色固体溶解在N，N-二甲基甲酰胺(100 mL)中并加入15.1 mL(86.7 mmol)iPr2Net。将反应混合物在环境温度下搅拌7小时。随后加入二碳酸二叔丁酯(4.55 g，20.8 mmol)并将反应混合物在环境温度下搅拌过夜。加入水(200 mL)，其用乙酸乙酯(200 mLx3)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤和减压浓缩。残留物通过在Biotage Horizon®系统上的快速色谱法提纯(硅胶，梯度为0至30％乙酸乙酯的己烷溶液)以得到1.61 g(22％)标题化合物(2R,5S)-2-[(R)-羟基(苯基)甲基]-5-(4-硝基苄基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(顺式)和3.9 g(54％)(2R,5R)-2-[(R)-羟基(苯基)甲基]-5-(4-硝基苄基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(反式)。LC/MS 435.4(M+23)。
步骤 E ： (2S ， 5R)-2-(4- 氨基苄基 )-5-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 (i-13a)
向来自步骤D的上述(顺式)(2R,5S)-2-[(R)-羟基(苯基)甲基]-5-(4-硝基苄基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.51 g，3.66 mmol)的乙醇(20 mL)溶液中加入0.15 g10％Pd/C并将所得悬浮液在氢气球下在环境温度下搅拌5小时。经硅藻土过滤和除去溶剂以得到1.40 g(100％)白色泡沫状的标题化合物，其不经进一步提纯即使用。LC/MS 405.3(M+23)。
步骤 F ： (2R,5R)-2-(4- 氨基苄基 )-5-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 (i-13b)
向来自步骤D的(反式)(2R,5R)-2-[(R)-羟基(苯基)甲基]-5-(4-硝基苄基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(3.90 g，9.46 mmol)的乙醇(40 mL)溶液中加入0.4 g10％Pd/C并将所得悬浮液在氢气球下在环境温度下搅拌6小时。经硅藻土滤除固体。除去溶剂后，在Biotage Horizon®系统上的快速色谱法(硅胶，梯度为0至30％乙酸乙酯的己烷溶液，随后30％乙酸乙酯的己烷溶液)得到2.30 g(64％)白色泡沫状的标题化合物。LC/MS 405.3(M+23)。
中间体 14
(2S)-1-(1 ， 3- 苯并噻唑 -2- 基 ) 吡咯烷 -2- 甲酸 (i-14):
Figure 736733DEST_PATH_IMAGE062
在环境温度下向28 mg(0.24 mmol)L-脯氨酸的N，N-二甲基甲酰胺(3 mL)溶液中加入51 mg(0.24 mmol)2-溴苯并噻唑、100 mg(0.72 mmol)碳酸钾和6 mg(0.03 mmol)碘化铜。该反应混合物在100℃下搅拌过夜。随后将其过滤并通过反相HPLC提纯(TMC Pro-Pac C18；0-60％ 0.1％三氟乙酸的乙腈溶液/0.1％三氟乙酸的水溶液梯度)。将纯馏分冻干过夜以得到35 mg 60％的浅棕色固体状的标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)：δ 7.78(d，J = 8.0 Hz，1 H)，7.45(d，J = 8.0 Hz，1 H)，7.28(t，J = 7.8 Hz，1 H)，7.08(t，J = 7.8 Hz，1 H)，4.48(d，J = 7.3 Hz，1 H)，3.52-3.61(m，2 H)，2.37(m，1 H)，2.01-2.11(m，3 H)。LC/MS 249.3(M+1)
中间体 44
[(6S)-4- 氧代 -4 ， 6 ， 7 ， 8- 四氢吡咯并 [1 ， 2-] 嘧啶 -6- 甲酸 (i-44) 的制备
步骤 A ： [6(S)-4- 氧代 -4 ， 6 ， 7 ， 8- 四氢吡咯并 [1 ， 2-] 嘧啶 -6- 甲酸甲酯
将(2S)-5-甲氧基-3，4-二氢-2H-吡咯-2-甲酸甲酯(4.19 g，26.6 mmol)和3-氮杂三环[4.2.1.0.2,5]壬-7-烯-4-酮(2.4 g，17.8 mmol)在110℃下加热过夜。使用Biotage Horizon®系统(0-100％乙酸乙酯/己烷混合物)提纯得到标题化合物[6(S)-4-氧代-4，6，7，8-四氢吡咯并[1，2-α]嘧啶-6-甲酸甲酯和中间体(7S)-9-氧代-3，8-二氮杂四环[9.2.1.02,10.04,8]十四烷-3，12-二烯-7-甲酸甲酯。这些中间体在150℃下加热45分钟以得到标题化合物，不经进一步提纯。LC/MS 195.2(M+1)。
步骤 B ： [(6S)-4- 氧代 -4 ， 6 ， 7 ， 8- 四氢吡咯并 [1 ， 2-] 嘧啶 -6- 甲酸
将在四氢呋喃(60 mL)、甲醇(40 mL)和氢氧化锂(3.32 g，77 mmol)的水(40 mL)溶液中的[6(S)-4-氧代-4，6，7，8-四氢吡咯并[1，2-α]嘧啶-6-甲酸甲酯(9.95 g，51.2 mmol)在环境温度下搅拌1小时。添加2N盐酸(38.5 mL)以中和反应混合物，其随后通过反相HPLC直接提纯(TMC Pro-Pac C18；0-40％ 0.1％三氟乙酸的乙腈溶液/0.1％三氟乙酸的水溶液梯度)。O-烷基化产物被快速洗脱。收集纯馏分并冻干过夜以得到浅黄色固体状的标题化合物。1H NMR(DMSO-d6 )：δ 7.89(d，J = 6.6 Hz，1H)，6.24(d，J = 6.6 Hz，1H)，4.92(dd，J = 10.0，3.1 Hz，1H)，3.12-2.99(m，2H)，2.52(m，1H)，2.11(m，1H)。LC/MS 181.2(M+1)。
中间体 46
(3S)-5- 氧代 -1 ， 2 ， 3 ， 5- 四氢中氮茚 -3- 甲酸 (i-46)
Figure 237191DEST_PATH_IMAGE066
步骤 A ： (3S ， 9S)-5- 氧代 -1 ， 2 ， 3 ， 5 ， 6 ， 8a- 六氢中氮茚 -3- 甲酸甲基酯
Figure 570084DEST_PATH_IMAGE067
根据Hanessian，S.；Sailes，H.；Munro，A.；Therrien，E. J. Org. Chem. 2003，68，7219和Vaswani，R.G.；Chamberlin，R.J.Org.Chem.2008，73，1661中所述的方法制备该中间体。
步骤 B ： (3S)-5- 氧代 -1 ， 2 ， 3 ， 5- 四氢中氮茚 -3- 甲酸甲酯
Figure 305828DEST_PATH_IMAGE068
向搅拌下的0.850 g(4.06 mmol)来自上述步骤A的(3S，9S)-5-氧代-1，2，3，5，6，8a-六氢中氮茚-3-甲酸甲酯的50 mL二氯甲烷溶液中加入6.30 g(72.5 mmol)氧化锰(IV)，并将所得混合物在回流下搅拌12小时。将该反应冷却至环境温度，经Celite®垫过滤，随后用100 mL二氯甲烷洗涤该固体。将该滤液在真空中蒸发至干，残留物通过硅胶色谱法提纯，用10-50％乙酸乙酯的己烷溶液梯度洗脱以得到透明胶状的标题化合物(0.47 g，55％收率)。LC-MS：m/z(ES)194(MH)+。
步骤 C ： (3S)-5- 氧代 -1 ， 2 ， 3 ， 5- 四氢中氮茚 -3- 甲酸
Figure 331552DEST_PATH_IMAGE069
向搅拌下的0.200 mg(1.00 mmol)来自上述步骤B的(3S)-5-氧代-1，2，3，5-四氢中氮茚-3-甲酸甲酯的3 mLTHF溶液中加入1.5 mL(1.5 mmol)1.0M LiOH水溶液。将所得混合物在环境温度下搅拌2小时，随后用2.0 mL(2.0 mmol)1.0M氯化氢水溶液猝灭。真空蒸发所有挥发物并用30％IPA在氯仿中的混合物(3x5 mL)萃取水相。该合并的萃取物用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤和真空蒸发以得到白色固体状的标题化合物(0.17 g，92％)。1H NMR(500 MHz，CD3OD)：δ 7.53(dd，J = 8.9，7.1 Hz，1H)，6.38-6.35(m，2H)，5.11(dd，J = 9.7，2.7 Hz，1H)， 3.23-3.12(m，2H)， 2.62-2.53(m，1H)，2.35-2.30(m，1H)。LC-MS：m/z(ES)180(MH)+。
中间体 56
2-(3- 甲基 -1H-1 ， 2 ， 4- 三唑 -1- 基 ) 丙酸 (i-56)
步骤 A ： 2-(3- 甲基 -1H-1 ， 2 ， 4- 三唑 -1- 基 ) 丙酸叔丁酯
Figure 922120DEST_PATH_IMAGE071
向3-甲基-1H-1，2，4-三唑(7.3 g，88 mmol)的DMF(75 mL)溶液中加入K2CO3(60.7 g，439 mmol)和2-溴丙酸叔丁基酯(14.6 mL，88 mmol)。将该反应在室温下搅拌过夜。该混合物用EtOAc(500 mL)稀释，用水(x3)，随后盐水洗涤。经MgSO4干燥和浓缩。残留物通过在硅胶上的柱色谱法提纯，用EtOAc/异己烷(20至100％)洗脱以得到13 g粗产物，为区域异构体的3∶1混合物。该混合物通过Chiralcel OD以从4％到30％IPA/庚烷的梯度提纯。随后用Chiracel OD柱分离前两个峰，用4％IPA/庚烷等度洗脱。收集第二峰作为所需的单一立体异构体(R或S)(2-(3-甲基-1H-1，2，4-三唑-1-基)丙酸叔丁酯(3.5 g，19％)。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ 8.05(s，1 H)，4.90(q，J = 7 Hz，1 H)，2.35(s，3 H)，1.72(d，J = 7 Hz，3 H)，1.40(s，9 H)。C10H17N3O2的计算值,ESI-MS：精确质量：211.13；实测值156.05(-tBu)。
步骤 B ： 2-(3- 甲基 -1H-1 ， 2 ， 4- 三唑 -1- 基 ) 丙酸
Figure 512370DEST_PATH_IMAGE072
将2-(3-甲基-1H-1，2，4-三唑-1-基)丙酸叔丁酯(1.0 g，4.7 mmol)溶解在4M HCl的二氧杂环己烷(100 mL)中并在室温下搅拌过夜。将产物减压浓缩并在高真空下干燥以得到HCl盐形式的(R或S)2-(3-甲基-1H-1，2，4-三唑-1-基)丙酸叔丁酯(850 mg)。C6H9N3O2的计算值,ESI-MS：精确质量：155.07；实测值156.05。
化合物 1
2-(2- 氨基 -1,3- 噻唑 -4- 基 )-N-[4-({(5R)-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷基 } 甲基 ) 苯基 ] 乙酰胺
Figure 708996DEST_PATH_IMAGE073
步骤 A ： (5R)-2-(4-{[(2- 氨基 -1,3- 噻唑 -4- 基 ) 乙酰基 ] 氨基 } 苄基 )-5-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯
Figure 653206DEST_PATH_IMAGE074
向10 mg(5∶1 混合物顺式/反式，0.02 mmol)(5R)-2-(4-氨基苄基)-5-[(R)-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}(苯基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(i-3)和(2-氨基-1，3-噻唑-4-基)乙酸(3.18 mg，0.02 mmol)的0.5 mL无水DMF溶液中加入HOAt的0.5 M DMF溶液(0.04 mL，0.02 mmol)，接着加入EDC(5.8 mg，0.03 mmol)和DIEA(3.5微升，0.02 mmol)。将所得混合物在室温下在氮气氛下搅拌16小时。该混合物用水洗涤并用二氯甲烷(2x2 mL)萃取。合并有机物，经硫酸钠干燥，过滤和真空浓缩。该残留物通过制备TLC板(500uM)提纯，用二氯甲烷中5％MeOH洗脱，以得到产物(10.3 mg，81％)。m/z(ES)637(MH)+，659(MNa)+。
步骤 B ： 2-(2- 氨基 -1,3- 噻唑 -4- 基 )-N-[4-({(5R)-[(R) 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷基 } 甲基 ) 苯基 ] 乙酰胺
Figure 327901DEST_PATH_IMAGE075
向7 mg(0.01 mmol)(5R)-2-(4-{[(2-氨基-1，3-噻唑-4-基)乙酰基]氨基}苄基)-5-[(R)-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}(苯基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯的0.20 mL甲醇溶液(来自步骤A)中加入0.20 mL浓HCl并将反应混合物在室温下搅拌1小时。与甲苯共沸(2x)以除去水。将该残留物置于乙腈/水/MeOH(9∶1∶1)中并在Gilson HPLC上提纯，用0-50％梯度的含0.05％TFA缓冲液的乙腈/水洗脱。合并含产物的馏分，冷冻和冻干以得到白色泡沫(3.3 mg，71％)。 m/z (ES) 423 (MH) +, (~5:1混合物) 1HNMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.56(br d，J = 8.2 Hz，2H)，7.44(d，7.8 Hz，2H)，7.39(t，J = 7.6 Hz，2H)7.35-7.32(m，0.8H)7.32-7.29(m，0.2H 次要异构体)，7.26(d，J = 8.0 Hz，1.7H)，7.14(d，J = 8.1 Hz，0.3H 次要异构体)6.67和6.66(br s，0.2/0.8H, 总计 1H)。4.72(d，J = 8.5 Hz，1H)，3.80-3.70(m，4H)3.14(dd，J = 6.1，13.8 Hz，1H)，2.95(dd，J = 9.1，13.8 Hz，1H)，2.08-2.00(m，1H)，1.86-1.74(m，3H)。
使用本文所述的生物测定法，测得化合物1的人β3官能活性为1至10nM。
化合物 2
2-(2- 氨基 -1,3- 噻唑 -4- 基 )-N-[4-({(2S ， 5R)-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷基 } 甲基 ) 苯基 ] 乙酰胺
Figure 38237DEST_PATH_IMAGE076
步骤 A ： (2S ， 5R)-2-(4-{[(2- 氨基 -1,3- 噻唑 -4- 基 ) 乙酰基 ] 氨基 } 苄基 )-5-[(R)-{[ 叔丁基 ( 二甲基 ) 甲硅烷基 ] 氧基 }( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯
Figure 405764DEST_PATH_IMAGE077
由(2S，5R)-2-(4-氨基苄基)-5-[(R)-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}(苯基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(i-4a)和(2-氨基-1，3-噻唑-4-基)乙酸根据化合物1，步骤A的方法制备标题化合物。该粗产物通过制备TLC板提纯，用5％MeOH的二氯甲烷溶液洗脱，以得到产物(4.1 mg，21％)。m/z(ES)637(MH)+，659(MNa)+。
步骤 B ： 2-(2- 氨基 -1,3- 噻唑 -4- 基 )-N-[4-({(2S ， 5R)-[(R) 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷基 } 甲基 ) 苯基 ] 乙酰胺
Figure 381810DEST_PATH_IMAGE078
由4 mg(2S，5R)-2-(4-{[(2-氨基-1，3-噻唑-4-基)乙酰基]氨基}苄基)-5-[(R)-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}(苯基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(来自步骤A),根据化合物1、步骤B的方法，制备标题化合物。该粗产物在Gilson HPLC上提纯，用0-50％梯度的含0.05％TFA缓冲液的乙腈/水洗脱。合并含产物的馏分，冷冻和冻干以得到白色泡沫(3.3 mg，71％)。m/z(ES)423(MH)+。1HNMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.55(br d，J = 8.2 Hz，2H)，7.44(d，7.8 Hz，2H)，7.39(t，J = 7.6 Hz，2H)7.35-7.33(m，1H)，7.25(d，J = 8.0 Hz，2H)，6.65(br s,1H)。4.72(d，J = 8.5 Hz，1H)，3.80-3.72(m，4H)3.14(dd，J = 6.1，13.8 Hz，1H)，2.96(dd，J = 9.1，13.8 Hz，1H)，2.07-2.00(m，1H)，1.85-1.73(m，3H)。
使用本文所述的生物测定法，测得化合物2的人β3官能活性为1至10nM。
化合物 3
2- 氨基 -N-[4-{((2S ， 5R)-5-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -2- 基 ) 甲基 ) 苯基 ]-5,6- 二氢 -4H- 环戊并 [ α ] [1,3] 噻唑 -4- 甲酰胺
步骤 A ： (2S ， 5R)-2-(4[({2-[( 叔丁氧羰基 ) 氨基 ]-5,6- 二氢 -4H- 环戊并 [ α ] [1,3] 噻唑 -4- 基 } 羰基 ) 氨基 ] 苄基 }-5-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯
Figure 690618DEST_PATH_IMAGE080
向220 mg(0.58 mmol)(2S，5R)-2-(4-氨基苄基)-5-[(R)-羟基(苯基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(i-13a)和164 mg(0.58 mmol)2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5，6-二氢-4H-环戊并[α][1，3]噻唑-4-甲酸(i-8)的无水DMF(5 mL)溶液中加入EDC(165 mg，0.86 mL)、HOBt(132 mg，0.86 mmol)和Hunig’s碱(0.3 mL，1.7 mmol)并将所得混合物在室温下搅拌过夜。倾入水(50 mL)中并用EtOAc(3x30 mL)萃取，合并的EtOAc层用水(2x50 mL)、饱和NaCl(25 mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤和蒸发。残留物通过MPLC提纯(Biotage Horizon：FLASH 25+M)洗脱剂：100％己烷(100 mL)，梯度为0至35％EtOAc的己烷溶液(750 mL)，随后35％EtOAc的己烷溶液(600 mL)。在AD柱上通过手性HPLC分离非对映异构体(洗脱剂：25％IPA的庚烷溶液)，第一洗脱异构体(134 mg，36％)第二洗脱异构体(126 mg，34％)均为白色泡沫形式。
步骤 B ： 2- 氨基 -N-[4-{((2S ， 5R)-5-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -2- 基 ) 甲基 ) 苯基 ]-5,6- 二氢 -4H- 环戊并 [ α ] [1,3] 噻唑 -4- 甲酰胺
向126 mg(0.19 mmol)(2S，5R)-2-(4[({2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5，6-二氢-4H-环戊并[α][1，3]噻唑-4-基}羰基)氨基]苄基}-5-[(R)-羟基(苯基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(来自步骤A，第二洗脱异构体)的DCM(3 mL)溶液中加入三氟乙酸(3.0 mL，38 mmol)。将所得混合物在室温下搅拌4小时。蒸发该混合物并通过SCX柱，用2M NH3的甲醇溶液洗脱以释放碱。产物通过PREP-TLC 2x[20x20cm x 1000微米]提纯，洗脱剂：15％MeOH的DCM溶液+1％NH4OH，并将产物冻干以得到标题化合物(65 mg，75％)白色松软固体。m/z(ES)449(MH)+。1HNMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：10.00(s，1H)，7.51(d，J = 8.2，2H)，7.30(m，4H)，7.21(t，J = 6.9，1H)，7.12(d，J = 8.2，2H)，6.86(s，1H)，4.23(d，J = 7.3，1H)，3.78(m，1H)，3.21(m，1H)，3.10(m，1H)2.78(m，1H)，2.66(m，2H)，2.57(m，2H)，2.49(m，1H)，1.59(m，1H)，1.40(m，1H)，1.39(m，2H)。
来自步骤A的产物[第一洗脱异构体](134 mg，0.207 mmol)以类似方式脱保护以得到标题化合物(44 mg，48％)白色松软固体。m/z(ES)449(MH)+。
使用本文所述的生物测定法，测得化合物3的人β3官能活性小于1nM。
化合物 4-10
使用上述类似的方法，从合适的的起始原料可制得化合物4-10。
使用本文所述的生物测定法，测定每个化合物的人β3官能活性并示于下表中。
Figure 148034DEST_PATH_IMAGE083
化合物 11
N -(4-(((2S,5R)-5-((R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ) 吡咯烷 -2- 基 ) 甲基 ) 苯基 )-2-(3- 甲基 -1H-1,2,4- 三唑 -1- 基 ) 丙酰胺
Figure 583695DEST_PATH_IMAGE084
将在DMF(20 mL)中的i-13a(2.00 g，5.23 mmol)、2-(3-甲基-1H-1，2，4-三唑-1-基)丙酸i-56(1.00 g，5.23 mmol)、HOAt(1.307 mL，0.784 mmol)和EDC(2.005 g，10.46 mmol)的混合物在室温下搅拌10分钟。该反应混合物用碳酸氢钠水溶液猝灭并用EtOAc萃取。该粗产物通过柱色谱法(0-3％MeOH的DCM溶液(10％NH4OH))提纯。在蒸发后，该产物通过手性HPLC(AD柱，30％IPA/庚烷)进一步提纯以得到纯的Boc保护的中间体，将其溶解在最低体积的二氧杂环己烷中并加入4M 的HCl/二氧杂环己烷溶液。在室温下2小时后，将该反应混合物减压浓缩以得到标题化合物的HCl盐。碱性反相HPLC(0.1％NH4OH的H2O、MeCN溶液)得到标题化合物的所需游离碱。1H-NMR(500 MHz，CD3OD) δ 8.51(s，1 H)，7.49(d，J = 13 Hz，2 H) 7.35-7.29(m，4 H)，7.26-7.20(m ,4 H)，5.20(q，J = 7.5 Hz，1 H)，4.20(d，J = 7.5 Hz，1 H)，3.27-3.22(m，2 H)，2.80-2.72(m，2 H)，2.34(s，3 H)，1.82(d，J = 7.5 Hz，3 H)，1.79-173(m，1 H)，1.52-1.48(m，3 H)。C24H29N5O2的计算值,ESI-MS：精确质量：419.23，实测值420.35。
使用本文所述的生物测定法，测得化合物11的人β3官能活性为1至10 nM。
化合物 12 和 13
(3S)-N-[4-({(2S,5R)-5-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -2- 基 } 甲基 ) 苯基 ]-5- 氧代 -1,2,3,5- 四氢中氮茚 -3- 甲酰胺 ( 化合物 12) 和 (3R)-N-[4-({(2S,5R)-5-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -2- 基 } 甲基 ) 苯基 ]-5- 氧代 -1,2,3,5- 四氢中氮茚 -3- 甲酰胺 ( 化合物 13)
Figure 276713DEST_PATH_IMAGE085
步骤 A:(2R,5S)-2-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ]-5-[4-({[(3S)-5- 氧代 -1,2,3,5- 四氢中氮茚 -3- 基 ] 羰基 } 氨基 ) 苄基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 ( 异构体 1) 和 (2R,5S)-2-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ]-5-[4-({[(3R)-5- 氧代 -1,2,3,5- 四氢中氮茚 -3- 基 ] 羰基 } 氨基 ) 苄基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯 ( 异构体 2)
Figure 430614DEST_PATH_IMAGE086
在氮气氛下向0.610 g(1.60 mmol)中间体i-13a和0.300 g(1.67 mmol)中间体i-46的3.2 mL无水N，N-二甲基甲酰胺溶液中加入0.033 g(0.24 mmol)1-羟基-7-氮杂苯并三唑，接着加入0.336 g(1.75 mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。将所得悬浮液在环境温度下搅拌30分钟，用水猝灭和用乙酸乙酯(3x10 mL)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤和真空蒸发。粗制残留物通过硅胶色谱法提纯，用50-100％梯度的乙酸乙酯的己烷溶液洗脱以得到97∶3比率的非对映体混合物形式的标题化合物。通过使用Daicel CHIRALPAK® AD® 柱(洗脱剂：40％IPA的庚烷溶液)的手性HPLC分离这两种非对映体。第一洗脱非对映体被标作异构体2并且是无色固体(0.020 g，2.3％)。LC-MS：m/z(ES)544.2(MH)+。第二洗脱非对映体被标作异构体1并且是无色固体(0.650 g，75％)。LC-MS：m/z(ES)544.2(MH)+。
步骤 B( 化合物 12):(3S)-N-[4-({(2S,5R)-5-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -2- 基 } 甲基 ) 苯基 ]-5- 氧代 -1,2,3,5- 四氢中氮茚 -3- 甲酰胺
Figure 500070DEST_PATH_IMAGE087
在氮气氛下向0.500 g(0.920 mmol)来自上述步骤A的异构体1的2 mL异丙醇溶液中加入4.0 mL4.0 M的无水氯化氢的1，4-二氧杂环己烷溶液。将该反应混合物搅拌1小时，随后在真空中蒸发至干。该粗制反应混合物通过反相HPLC提纯(TMC Pro-Pac C18；0-75％ 0.01％三氟乙酸的乙腈溶液/0.01％三氟乙酸的水溶液的梯度)。将纯馏分冻干过夜，随后溶解在10 mL氯仿和4 mL饱和碳酸氢盐水溶液的混合物中。将该双相混合物剧烈搅拌10分钟，随后分离层。用氯仿(3x10 mL)萃取水相，合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤和真空蒸发以得到白色固体状的标题化合物(化合物12)(0.39g，95％)。1H-NMR(500 MHz，CD3OD) δ 7.89(s，1 H)，7.54(dd，J = 8.8，7.2 Hz，1H)，7.50(d，J = 8.2 Hz，2H)，7.34-7.29(m，4H)，7.26-7.23(m，1H)，7.20(d，J = 8.2 Hz，2H)，6.38-3.36(m，2H)，5.24(dd，J = 9.4，2.8 Hz，1H)，4.20(d，J = 7.8 Hz，1H)，3.35-3.23(m，3H)，3.19-3.12(m，1H)，2.82-2.71(m，2H)，2.60-2.51(m，1H)，2.37-2.32(m，1H)，1.79-1.72(m，1H)，1.52-1.43(m，3H)。.LC-MS：m/z(ES)444.0(MH)+。
步骤 B( 化合物 13):(3R)-N-[4-({(2S,5R)-5-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -2- 基 } 甲基 ) 苯基 ]-5- 氧代 -1,2,3,5- 四氢中氮茚 -3- 甲酰胺
Figure 790237DEST_PATH_IMAGE088
利用相同方法将来自上述步骤A的异构体2脱保护以得到单一非对映体形式的标题化合物(化合物13)。LC-MS：m/z(ES)444.0(MH)+。
使用本文所述的生物测定法，测得化合物12和13的人β3官能活性分别为1至10 nM之间和小于1 nM。
化合物 14
(6S)-N-[4-({(2S ， 5R)-5-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -2- 基 } 甲基 ) 苯基 ]-4- 氧代 -4,6,7,8- 四氢吡咯并 [1,2- α ] 嘧啶 -6- 甲酰胺
步骤 A ： (2R,5S)-2-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ]-5-[4-({[(6S)-4- 氧代 -4,6,7,8- 四氢吡咯并 [1,2- α ] 嘧啶 -6- 基 ] 羰基 } 氨基 ) 苄基 ] 吡咯烷 -1- 甲酸叔丁酯
0℃下向i-13a(21.4 g，55.9 mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(100 mL)溶液中加入[(6S)-4-氧代-4，6，7，8-四氢吡咯并[1，2-α]嘧啶-6-甲酸(i-44，11.1 g，61.5 mmol)，接着加入1-羟基苯并三唑(7.55 g，55.9 mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(16.1 g，84.0 mmol)和N，N-二异丙基乙胺(29.2 mL，168 mmol)。将反应混合物从0℃至环境温度搅拌2小时。加入水(600 mL)并将其用二氯甲烷(600 mLx2)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥。除去挥发物后，使用Biotage Horizon®系统提纯该残留物(0-5％，随后5％甲醇和10％氨/二氯甲烷的混合物)以得到标题化合物，其含有8％次要非对映体。其通过超临界流体色谱法进一步提纯(手性AS柱，40％甲醇)以得到浅黄色固体状的标题化合物(22.0 g，72％)。1H NMR(CDCl3)：δ 9.61(s，1H)，7.93(d，J = 6.6 Hz，1H)，7.49(d，J = 8.4 Hz，2H)，7.35-7.28(m，5H)，7.13(d，J = 8.5 Hz，2H)，6.40(d，J = 6.7 Hz，1H)，5.36(d，J = 8.6 Hz，1H)，4.38(m，1H)，4.12-4.04(m，2H)，3.46(m,1H)，3.15-3.06(m，2H)，2.91(dd，J = 13.1，9.0 Hz，1H)，2.55(m，1H)，2.38(m，1H)，1.71-1.49(m，13H)。LC-MS 567.4(M+23)。
步骤 B:(6S)-N-[4-({(2S ， 5R)-5-[(R)- 羟基 ( 苯基 ) 甲基 ] 吡咯烷 -2- 基 } 甲基 ) 苯基 ]-4- 氧代 -4,6,7,8- 四氢吡咯并 [1,2- α ] 嘧啶 -6- 甲酰胺
Figure 667753DEST_PATH_IMAGE091
向来自步骤A的中间体(2.50 g，4.59 mmol)的二氯甲烷(40 mL)溶液中加入三氟乙酸(15 mL)。该反应混合物在环境温度下搅拌1.5小时。除去挥发物后，添加饱和NaHCO3以使PH值为8-9。随后用二氯甲烷萃取该混合物。合并的有机层经Na2SO4干燥。浓缩后，从甲醇/乙腈中结晶以得到白色固体状的标题化合物(1.23 g，60％)。1H NMR(DMSO-d6 )：δ 10.40(s，1H)，7.91(d，J = 6.7 Hz，1H)，7.49(d，J = 8.3 Hz，2H)，7.32-7.26(m，4H)，7.21(m，1H)，7.15(d，J = 8.4 Hz，2H)，6.23(d，J = 6.7 Hz，1H)，5.11(dd，J = 9.6，2.9 Hz，1H)，5.10(br，1H)，4.21(d，J = 7.1 Hz，1H)，3.20-3.00(m，4H)，2.66-2.51(m，3H)，2.16(m，1H)，1.57(m，1H)，1.38(m，1H)，1.29-1.23(m，2H)。LC-MS 445.3(M+1)。
使用本文所述的生物测定法，测得化合物14的人β3官能活性为11至100 nM之间。
使用类似的上述方法、从合适的起始原料可制得化合物15-29 。
β 3 功能活性的生物学测定：下列体外测定法适用于筛选具有选择性β3激动剂活性的化合物：
功能测定：根据Barton等人，(1991，Agonist-induced desensitization of D2 dopamine receptorsin human Y-79 retinoblastoma cells. Mol. Pharmacol. v3229：650-658)(做如下修改)测量在对配体进行响应的cAMP生成。使用均匀时间分辨的荧光共振能量转移免疫测定法(LANCETMTM，Perkin Elmer)根据制造商的说明测量cAMP生成。在传代培养3天后获取用克隆的β-肾上腺素能受体(β1、β2或β3)稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。用无酶离解培养基(Specialty Media)获取细胞。随后计数细胞并再悬浮在含有磷酸二酯酶抑制剂(IBMX，0.6mM)的分析缓冲液(补充了5mM HEPES，0.1％BSA的Hank′s平衡盐溶液)中。通过将在6μL中6,000个细胞与6μL Alexa Fluor标记的cAMP抗体(LANCETM试剂盒)混合，随后添加到含有12微升化合物(在分析缓冲液中稀释至2X最终浓度)的检测孔中，引发该反应。该反应在室温下进行30分钟并通过添加24微升检测缓冲液(LANCETM试剂盒)来终止。随后将该检测板在室温下培养1小时，并在Perkin Elmer Envision读数器或等效物上测量时间分辨的荧光。通过将荧光水平与cAMP标准曲线进行比较，测定未知cAMP水平。
在所有三种受体上使用非选择性的完全激动剂β-肾上腺素能配体异丙基肾上腺素测定最大刺激。在所有测定中使用人β3肾上腺素能受体(AR)选择性配体(S)-N-[4-[2-[[2-羟基-3-(4-羟基苯氧基)丙基]氨基]乙基]-苯基]-4-碘苯磺酰胺作为对照。异丙基肾上腺素在该测定中以10-10M至10-5的最终浓度滴定，并以10-10M至10-5M的β3受体浓度滴定选择性配体(S)-N-[4-[2-[[2-羟基-3-(4-羟基苯氧基)丙基]氨基]乙基]苯基]-4-碘苯磺酰胺。在该测定中在所有3β-肾上腺素能受体亚型上以10-10M至10-5M的最终浓度滴定未知配体以测定EC50。EC50是指实现其自身最大值的50％激活时的化合物浓度。使用Microsoft Excel和Graphpad Prism或内部开发的数据分析软件包分析数据。
结合测定：也在β1和β2受体上检测化合物以测定选择性。所有结合测定使用由重组表达β1或β2受体的CHO细胞制成的膜运行。细胞在分裂后生长3-4天；用PBS洗涤附着的细胞，随后在冰上在1mM Tris，pH 7.2中溶胞10分钟。刮擦烧瓶以取下细胞，随后使用Teflon/玻璃匀浆器将细胞匀浆。通过在4℃下以38,000xg离心15分钟，收集膜。将成丸的膜以1 mg蛋白质/ mL的浓度再悬浮在TME缓冲液(50mM Tris，pH 7.4，5mM MgCl2，2mM EDTA)中。可以制备大批膜，等分，在-70℃下储存最多一年,没有损失效能。通过在最终体积200微升的含0.1％BSA的TME缓冲液中一起培养膜(2-5μg蛋白质)、放射性标记的示踪剂125I-氰基吲哚洛尔(125I-CYP，45pM)、200μgWGA-PVT SPA球(GE Healthcare)和最终浓度为10-10M至10-5M的受试化合物，进行该结合测定法。将检测板在室温下在摇振下培养1小时，随后置于Perkin Elmer Trilux闪烁计数器中。在计数之前，使板在Trilux计数器中在暗处放置大约10小时。使用标准4-参数非线性回归分析，使用Graphpad Prism软件或内部开发的数据分析包分析数据。IC50是指能够抑制放射性标记示踪剂(125I-CYP)的结合的50％时的化合物浓度。通过计算比率(IC50 β1 AR，β2 AR)/(EC50 β3 AR)来测定化合物对β3受体的选择性。
β3-AR激动剂和抗毒蕈碱剂可以重量比500:1至1:50给药于患者。在一个实施方案中，β3-AR激动剂和抗毒蕈碱剂的重量比为300:1至1:10。在另一个实施方案中，所述重量比为300:1至1:1。在另一个实施方案中，所述重量比为150:1至1:1。在另一个实施方案中，所述重量比为100:1至1:1。在又一个实施方案中，所述重量比为150:1。在再一个实施方案中，所述重量比为100:1。
除了β3-AR激动剂和抗毒蕈碱剂，该组合治疗可进一步包含选择性M2拮抗剂。
在此使用，术语“选择性M2 拮抗剂”是指对毒蕈M2亚型的拮抗相比于对另一毒蕈亚型(例如，M3亚型)具有大于10倍的选择性的化合物。参见Delmendo，Br J Pharmacol. 1989 2月；96(2)：457-64，本文以引证的方式结合其全部内容，用于讨论选择性拮抗剂。
在一个实施方案中，所述选择性M2 拮抗剂是美索托明(methoctramine)。美索托明是多亚甲基四胺衍生物，具有如下结构：
Figure 264956DEST_PATH_IMAGE092
。
在一个实施方案中，治疗OAB的方法包括给予需要的患者β3-AR激动剂、抗毒蕈碱剂和选择性M2 拮抗剂。在一个实施方案中，抗毒蕈碱剂具有大于约40的M2/M3比值。在另一个实施方案中，抗毒蕈碱剂具有大于约50的M2/M3比值。在一个实施方案中，抗毒蕈碱剂为达非那新(darifenacin)。在一个实施方案中，所述M2/M3比值用Ohtake等人所述的受体结合实验进行测定。
在一个实施方案中，治疗OAB的方法包括给予需要的患者β3-AR激动剂、达非那新和美索托明。在另一个实施方案中，所述β3-AR激动剂选自表3中所示的化合物。在另一个实施方案中，所述β3-AR激动剂 选自表4中所示的化合物。在又一个实施方案中，所述β3-AR激动剂选自由
Figure 299777DEST_PATH_IMAGE093
和
Figure 162691DEST_PATH_IMAGE094
构成的组。
在一种方法中，其中给予患者β3-AR激动剂、抗毒蕈碱剂和选择性M2 拮抗剂，所述β3-AR激动剂可用选择性M2 拮抗剂进行预处理。在一个实施方案中，所述选择性M2 拮抗剂是美索托明。在另一个实施方案中，抗毒蕈碱剂为达非那新。在另一个实施方案中，所述β3-AR激动剂经美索托明预处理。在又一个实施方案中，经美索托明预处理的β3-AR激动剂与达非那新一同服用。
在一个实施方案中，用于预处理的美索托明的浓度为0.1-10 μM。在另一个实施方案中，用于预处理的美索托明的浓度为1 μM。
在如上所述的组合治疗中，所述β3-AR激动剂、抗毒蕈碱剂和可选的(optional)选择性M2 拮抗剂可同时、顺序或分别给予患者。
在一个实施方案中，所述β3-AR激动剂、抗毒蕈碱剂和可选的选择性M2 拮抗剂同时给予患者。在另一个实施方案中，所述β3-AR激动剂，抗毒蕈碱剂和可选的选择性M2 拮抗剂分别给予患者。在又一个实施方案中，所述β3-AR激动剂，抗毒蕈碱剂和可选的选择性M2 拮抗剂按顺序给予患者。
合适的患者包括，但不局限于，患有膀胱过动症或下尿路症状(LUTS)的人。在一个实施方案中，所述患者是患有OAB症状的女人。在另一个实施方案中，所述患者是患有OAB症状的更年期女人。
本发明的另一方面提供了组合药物组合物，其包括β3-AR激动剂、抗毒蕈碱剂和可选的选择性M2 拮抗剂。合适的β3-AR激动剂、抗毒蕈碱剂和选择性M2 拮抗剂如上所述。
在组合的组合物中，β3-AR激动剂的合适含量为从约0.01 mg至约500 mg。在一个实施方案中，β3-AR激动剂的含量为从约0.05 mg至约250 mg。在另一个实施方案中，所述含量为从约0.1 mg至约150 mg。在另一个实施方案中，所述含量为从约 1至约100 mg。在又一个实施方案中，所述含量为从约1至约50 mg。
在组合的组合物中，抗毒蕈碱剂合适含量为从约0.01 mg至约50 mg。在一个实施方案中，抗毒蕈碱剂的合适含量为从约0.05 mg至约12 mg。在另一个实施方案中，所述含量为从约0.1 mg至约6 mg。在另一个实施方案中，所述含量为从约0.2至约5 mg。在又一个实施方案中，所述含量为从约0.2至约3 mg。
选择性M2 拮抗剂的合适含量为从约0.01 mg至约50 mg。在一个实施方案中，选择性M2 拮抗剂的合适含量为从约0.05 mg至约15 mg。
在实际应用中，可根据常规药物配制技术将所述β3-AR激动剂、抗毒蕈碱剂和可选的选择性M2 拮抗剂作为活性成分与药用载体密切混合。载体可为多种形式，取决于给药，例如，口服或非肠道(包括静脉内)给药所需的制剂形式。在制备口服剂型的组合物时，可使用任何普通药学介质，例如，在口服液体制剂如悬浮液、酏剂和溶液的情况下使用水、二醇、油类、醇类、调味剂、防腐剂、着色剂等；或在口服固体制剂如粉剂、硬胶囊和软胶囊及片剂的情况下使用载体如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等，其中固体口服制剂优于液体制剂。
由于它们易于给药，片剂和胶囊代表最有利的口服单位剂型，在这种情况下，使用固体药物载体。如果需要，片剂可通过标准的含水或非水技术进行包衣。这类组合的组合物和制剂可含有0.1-20百分数的每种活性成分。当然，这些组合的组合物中活性化合物的百分比可以变化，并且在这类组合物中的活性成分的量是获得有效剂量的量。
该活性成分也可以例如液体滴剂或喷雾剂鼻内给药。
片剂、丸剂、胶囊等还可以含有粘合剂，如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸；润滑剂，如硬脂酸镁；和甜味剂，如蔗糖、乳糖或糖精。当单位剂型为胶囊时，其除上述类型的材料外还可以含有液体载体，如脂肪油。
可存在各种其它材料作为包衣或用于改变单位剂型的物理形式。例如，片剂可用虫胶和/或糖进行包衣。糖浆剂或酏剂除活性成分外还可以含有作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂，如樱桃调味剂或橙调味剂。
活性成分也可非肠道给药。可以在与表面活性剂如羟丙基纤维素适当混合的水中制备这些活性成分的溶液或悬浮液。也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物在油类中制备分散体。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
适于注射用的组合的组合物包括无菌水溶液或分散体以及用于临时配制无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况中，剂型必须是无菌的，且流动性必须达到容易注射性能的程度。其必须在制造和储存条件下稳定并且必须防腐以防止微生物，如细菌和真菌的污染。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其适当的混合物，以及植物油。
在一个实施方案中，所述组合的组合物是口服组合物。在另一个实施方案中，所述口服组合物在胶囊中。在又一个实施方案中，所述组合的组合物为口服片剂组合物。在再一个实施方案中，所述组合的组合物是口服丸剂组合物。
在一个实施方案中，所述组合的组合物是控释组合物，其中抗毒蕈碱剂在服用该组合物后用24小时释放。在另一个实施方案中，抗毒蕈碱剂用10小时释放。在又一个实施方案中，抗毒蕈碱剂用8小时释放。在再一个实施方案中，抗毒蕈碱剂用6小时释放。
本文还公开了β3-AR激动剂、抗毒蕈碱剂和可选的选择性M2 拮抗剂在制备用于治疗或预防膀胱过动症状的药物中的用途。
实施例
一同服用β3-AR激动剂、抗毒蕈碱剂和可选的选择性M2 拮抗剂的效应在下述实施例中进行说明。
CL 316243，或(R,R)-5-(2-((2-(3-氯苯基)-2-羟基乙基)-氨基)丙基)-1,3-苯并二噁茂-2,3-二甲酸二钠，为β3-AR激动剂。CL 316243在J. Med. Chem. 1992 8月7日；35(16)：3081-4中有更详细的描述。
托特罗定，或2-[(1S)-3-(二异丙基氨基)-1-苯基丙基]-4-甲基苯酚，是用于治疗膀胱过动症的抗毒蕈碱剂。托特罗定在US专利No. 5,382,600、6,630,162、6,770,295和 6,911,217中有更详细的描述。
奥昔布宁，或2-环己基-2-羟基-2-苯基-乙酸 4-二乙基氨基丁-2-炔基酯，是通过减少膀胱的肌肉痉挛而用于缓解排尿和膀胱困难(包括尿频和不能控制排尿(尿失禁))的抗毒蕈碱剂。
达非那新，或(S)-2-[1-[2-(2,3-二氢苯并呋喃-5-基)乙基] 吡咯烷-3-基]-2,2-二苯基-乙酰胺，是用于治疗尿失禁的抗毒蕈碱剂。达非那新在US专利No. 5,096,890中有更详细的描述。
实施例 1-3
材料和方法
下述材料和方法用于实施例1-3。使用雄性成熟Sprague-Dawley大鼠。使用CO2气体安乐死后，将整个膀胱摘除。制备逼尿肌的外三角部分的纵向长条(约6 mm × 3 mm)。将每个长条置于盛有含氧(95% O2 + 5% CO2)的Krebs溶液的加热(37℃)器官浴槽(25 mL)中。将长条的一段固定在器官浴槽上，另一端在10 mN的静止张力下连接至等长传感器(AD Instruments)。利用多通道数据采集系统(PowerLab，AD Instruments)在10 Hz的采样频率下记录制备样品的响应，并利用分析软件(Chart，AD Instruments)进行测量。在平衡时间达到至少60分钟后，向每个组织长条施加60 Hz的电场刺激(EFS)；持续，0.3 ms；3秒；90 V以诱导收缩。当利用EFS获得稳定收缩后，以累计的方式向器官浴槽内加入化合物溶液(25 μL)。每个化合物处理15分钟后，施加EFS。
等效线图分析
利用等效线图分析评价组合治疗的协同效应。利用独立统计分析，等效线图提供了两种不同药剂的相互作用的直观评价。统计分析可由对得自每个化合物单独处理和具有相同效果的固定比例组合的某些效力指数的计算完成。等效线图分析在 JPET 298:865-872，2001中有更详细的描述，本文以引证的方式结合其全部内容。
等效线图分析的一个示例性图如图1所示。在图1中，某些特殊效应(例如，最大值的50%)的等效线图，其中单独的活性试剂A的剂量为A=20，且单独的活性试剂B为B=100。连接这些截点(相加线)的直线是基于这些效力能达到相同效果的所有剂量组的轨迹。一个实际的剂量组如点Q在较少量下可达到此效果，且是协同效应的(或超加和性的)，而点R代表的剂量组意味着需要更多的量，且因此是次加和性的。看起来接近A-B线的如P的点是简单加和的。常使用合适的统计分析来展示相互作用的性质。
实施例 2
β 3 -AR 激动剂 CL316243 与选自托特罗定、奥昔布宁和达非那新的抗毒蕈碱剂的组合治疗
当单独给药时，CL316243、托特罗定、奥昔布宁和达非那新均可抑制EFS-诱导的分离的逼尿肌收缩。表5显示了诱导25%抑制的每个化合物的浓度。这些值用于下面的等效线图分析。
表5. CL316243、托特罗定、奥昔布宁和达非那新的逼尿肌收缩抑制
Figure 511633DEST_PATH_IMAGE095
在组合治疗中，CL316243与托特罗定、奥昔布宁和达非那新一起以固定的重量比给药，由等效线图分析的结果如图2所示。图2显示 CL316243与托特罗定(1:2，图2A)或奥昔布宁(1:10，图2B)表现出协同效应。而另一方面,CL316243与达非那新(1:2，图2C)显示简单的加和(即，无协同效应)。
尽管不希望被理论所束缚，但普遍认为抗毒蕈碱剂的M3拮抗活性对OAB效果是重要的(参见，例如，Abrams和Andersson. BJU Int,100，987-1006(2007))。现在意外地发现，在利用抗毒蕈碱剂和β3-AR激动剂的组合治疗中，抗毒蕈碱剂的M2/M3的相对选择性可能对于OAB效率和/或降低副作用方面起重要作用。
从上述结果可知，抗毒蕈碱剂托特罗定对毒蕈碱受体的M2和M3亚型具有大致相同的选择性(M2/M3 ≈ 1) ，而托特罗定与一个β3-AR激动剂CL316243以2:1的比例组合提供了协同效应。另一个抗毒蕈碱剂奥昔布宁，其具有约6的M2/M3比值，以10:1的比值与CL316243组合时也提供了协同效应。
另一方面，和对M2相比较,对M3具有高得多的选择性(M2/M3 ≈ 50)的达非那新，与CL316243以2:1的比值组合时不产生协同效应。
总之，CL316243与托特罗定或奥昔布宁的组合-均具有小于40的M2/M3比值-在抑制逼尿肌收缩方面提供了协同作用。另一方面，CL316243与达非那新的组合-其具有大于40的M2/M3比值-不提供协同效应。
实施例 3
β 3 -AR 激动剂化合物 12 与托特罗定或达非那新的组合
在本实施例中，使用不同的β3-AR激动剂来研究β3-AR激动剂和抗毒蕈碱剂的组合治疗的协同作用。
上述表3所述的β3-AR激动剂化合物12抑制EFS-诱导的分离的逼尿肌收缩的IC25值为275 nM。因此，化合物12在抑制大鼠膀胱长条的EFS-诱导的收缩方面比 CL316243(IC25 2.86 nM，见表5)低100倍。这与化合物12对大鼠β3-AR的低效力活性是一致的。
在组合研究中，化合物12以50:1的固定重量比例与托特罗定或达非那新一起给药。等效线图分析结果如图3所示。图3表明化合物12与具有约1的M2/M3的托特罗定的50:1的组合(图3A)产生了协同效应。
另一方面，化合物12与具有约50的M2/M3的达非那新的50:1比例的组合(图3B)不产生协同效应(次加和性的)。
上述结果与实施例1中观测到的结果是一致的，其中使用不同的β3-AR激动剂(CL316243)进行研究。这些结果表明当抗毒蕈碱剂具有小于40 的M2/M3比值时，其与β3-AR激动剂的组合在抑制逼尿肌收缩方面产生协同效应。另一方面，当抗毒蕈碱剂具有大于40 的M2/M3比值时，其与β3-AR激动剂的组合不产生协同效应。
实施例 4
选择性 M2 拮抗剂对组合治疗的协同效应的影响
在本实施例中，研究了选择性M2 拮抗剂对β3-AR激动剂和具有大于40的M2/M3比值的抗毒蕈碱剂的组合治疗的影响。
首先，β3-AR激动剂CL 316243不处理或用美索托明(1 μM)预处理，且结果如图4所示。图4显示了用美索托明预处理CL316243未显著影响CL316243对抑制EFS-诱导的膀胱收缩的效力。该结果与选择性M2 拮抗剂单独不能使预收缩的大鼠膀胱长条放松、而β3-AR激动剂和具有M3拮抗作用的抗毒蕈碱剂可以做到这一普遍观点是一致的。这表明选择性M2 拮抗剂和CL316243的组合而不存在M3拮抗作用，不产生协同作用。
接下来，未处理(A)的和预处理的CL316243(B)分别以1:2的比例与达非那新组合，结果示于图5中。图5表明预处理的CL316243(用1 μM美索托明)和达非那新的1:2比例的组合提供了协同效应。如上面所讨论的，达非那新是选择性M3拮抗剂，并具有约50的M2/M3比值。
另一方面，未处理的CL316243和达非那新的相同比例（1：2）的组合仅是简单相加(即，无协同效应)。
这些结果与在实施例1和2中所观察到的一致，β3-AR激动剂和抗毒蕈碱剂之间的组合的协同效应可能需要M2和M3拮抗作用的同时存在。
尽管不希望被理论所束缚，但据信M2受体可能在通过cAMP-依赖机制而反转肾上腺素受体-介导的松弛进而调节间接的收缩响应中起作用。M2拮抗作用可能增强β3-AR激动剂诱导的cAMP增加和BK通道打开，从而导致逼尿肌的进一步松弛。
实施例 5
组合比例对协同效应的影响
材料和方法
动物：雌性SD大鼠(200-250 g BW)(共七组)。
麻醉：尿烷(1.0 g/kg，ip)。
参数：膨胀-诱导的规律性膀胱收缩的振幅。
化合物：奥昔布宁(OXY)，CL 316243(CL)。
分析：利用ID20值的等效线图(降低20%振幅的剂量)。
首先，在如下条件下进行单剂量研究以计算奥昔布宁(OXY)和CL316243(CL)的ID20值，并将得到的ID20值列于表6中：
载体(生理盐水)；
OXY，0.01，0.03，0.1 mg/kg，iv；
CL，0.003，0.01，0.03 mg/kg，iv。
表6. CL316243和奥昔布宁的ID20值。
Figure 838709DEST_PATH_IMAGE096
表6中的结果表明奥昔布宁和CL316243均降低了麻醉的雌性大鼠的膨胀-诱导的规律性膀胱收缩的振幅。
接下来，按下述表7中的组合剂量方案进行实施以制作等效线图。共9组。在每个组合比例下计算OXY和CL的ID20值。
表7. 剂量方案(mg/kg).
图6表明，对CL和OXY为1:1和1:10比例时的组合，观察到协同效应。另一方面，CL和OXY为1:3的组合仅提供简单的加和效果，而无协同效应。
这些结果表明β3-AR激动剂CL和抗毒蕈碱剂OXY之间的协同效应依赖于组合中特定的组合比例。
实施例 6
包含β 3-AR 激动剂和抗毒蕈碱剂的组合的组合物
包含β3-AR激动剂和抗毒蕈碱剂的示例性组合的组合物如表8所示：
表8. β3-AR激动剂和抗毒蕈碱剂的组合的组合物
Figure 663150DEST_PATH_IMAGE098
注：表8中的重量百分数(wt%)是基于组合的组合物的总重量。
在一个实施方案中，所述β3-AR激动剂选自表3中所列的化合物。在另一个实施方案中，抗毒蕈碱剂选自托特罗定、非索罗定、奥昔布宁、索非那新、丙哌维林、曲司铵、咪达那新和TD6301。
在一个实施方案中，上述组合的组合物为控释(CR)制剂。在另一个实施方案中，所述组合的组合物为用于口服给药的胶囊剂。
实施例 7
包含 CR 抗毒蕈碱剂和 IR β 3-AR 激动剂的组合的组合物
包含在控释(CR)部分的抗毒蕈碱剂和在立即释放(CR)部分的β3-AR激动剂的示例性组合的组合物如表9所示：
表9. β3-AR激动剂和抗毒蕈碱剂的组合的组合物
Figure 612520DEST_PATH_IMAGE099
注：表9中的重量百分数(wt%)是基于组合的组合物的各个部分的总重量。
在一个实施方案中，所述β3-AR激动剂选自表3中所列的化合物。在另一个实施方案中，抗毒蕈碱剂选自托特罗定、非索罗定、奥昔布宁、索非那新、丙哌维林、曲司铵、咪达那新和TD6301。
在一个实施方案中，上述组合物为用于口服给药的胶囊剂。
实施例 8
组合治疗对恒河猴膀胱容量的影响
材料和方法
使用重量在5.3-6.2 kg(4-7岁)的成年雌性恒河猴(猕猴)。实验对象成对或单独安置，给予12-h光照/12-h黑暗周期(7:00AM开始光照)。它们的饮食由2050Teklad(Harlan Laboratories，Indianapolis, IN)和新鲜水果或蔬菜组成。水可自由获得。所有动物由兽医和看护者每天观察是否有不健康迹象。实验对象重复使用，并有>13天的休息期。用肌内注射舒泰(Telazol，3-5 mg/kg)或氯胺酮(10-20 mg/kg)，继之用注射泵(552222, Harvard Apparatus, Holliston, MA)以静脉内恒速输入氯胺酮(0.2-0.8 mg/kg/分钟)。动物以仰卧姿势放置，将三腔气囊导尿管(7.4 Fr, Cook Medical, Bloomington, IN)插入膀胱并用1 mL水使气囊膨胀以保证导尿管的顶端在膀胱底部。将导尿管连接到输液泵(Gemini PC-2TX, ALARIS Medical Systems, San Diego, CA)上用于膀胱填充和压力传感器用于膀胱内压力监测。利用多通道数据采集系统(Power lab, AD Instruments, Biopac systems, Colorado Springs, CO)在20 Hz的采样频率下连续记录膀胱内压力。在通过超声检测(Logiq e vet, GE Medical Systems, Waukesha, WI, Fig. 1 A)确认膀胱排空后，以15 mL/分钟将生理盐水输入膀胱内。当观察到压力急剧上升表现出排尿反射时，停止膀胱内输液并用60 ml注射器将膀胱手动排空。当两个膀胱测压基线读数后，使用上升剂量模型将药物静脉内给药三次，并在每次给药后10分钟进行膀胱测压。每次膀胱测压均测量膀胱容量并计算相对于基线容量的%变化。在此使用，术语“基线容量”或“基线”是指由两次前剂量（pre-dose）测量得到的平均膀胱容量。
利用不同剂量的托特罗定(“TOL”)、达非那新(“DAR”)或化合物14(“Cpd 14”)的单-治疗以及不同剂量的TOL：Cpd14和DAR：Cpd 14的组合治疗，并利用表10所示的剂量比例在恒河猴上测试。
表10. 单-治疗和组合治疗的剂量和剂量比例
利用上述单-治疗和组合治疗，恒河猴的膀胱容量结果总结于表11中。报告的结果是由4-6只动物得到相对于基线的%变化的平均值。
表11. 在恒河猴上利用单-治疗和组合治疗的膀胱容量结果
Figure 311672DEST_PATH_IMAGE101
由表11可见，相比每个单-治疗，测试的化合物14和托特罗定的所有组合显示出更大的膀胱容量。需要指明的是，在化合物14为最低剂量(0.003mg/kg)时，该组合的协同效应要大得多。具体而言，相比于每个单-治疗时的分别的4.1%和8.6%来说，Cpd14：TOL为0.003mg/kg：0.01 mg/kg的组合显示出膀胱容量增大28.2%。类似地，相比于每个单-治疗时的分别的4.1%和16.8%来说，Cpd14：TOL为0.003mg/kg：0.03 mg/kg的组合显示出膀胱容量增大35.5%。
对于化合物14和达非那新的组合治疗，高剂量的达非那新(0.03, 0.1 mg/kg)的组合显示出更优良的膀胱容量效应。
在实验的组合中，非选择性毒蕈碱拮抗剂托特罗定在与化合物14的组合中清楚地表现出改善的效果，而选择性M3拮抗剂达非那新与化合物14的组合的额外效果仅限于在较高剂量。这些结果表明当与β3-AR激动剂组合时，抗毒蕈碱剂对M2和M3二者的拮抗作用对提高效果可能是重要的。
尽管已参照其某些具体实施方案描述和例证了本发明，但本领域技术人员会认识到，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下对其作出各种变动、修改和取代。例如，由于被治疗的哺乳动物对任何适应征、对上述本发明中所用的活性剂的响应性的变化，不同于上文阐述的具体剂量的有效剂量是适用的。同样地，所观察到的具体药理学响应可随或依赖于所选的具体活性化合物或是否存在药物载体以及所用制剂的类型而变，根据本发明的目的和实践预计到此类预期变动或差异的结果。因此，意在通过下列权利要求的范围规定本发明，且此类权利要求在合理的程度内尽可能宽地解释。

Claims (20)

1.治疗膀胱过动症的方法，其中所述方法包括给予需要该治疗的患者：
β3-AR激动剂，
抗毒蕈碱剂，和
可选的选择性M2 拮抗剂；
其中所述β3-AR激动剂选自：
Figure 993221DEST_PATH_IMAGE001
Figure 848045DEST_PATH_IMAGE002
Figure 627782DEST_PATH_IMAGE003
。
2.权利要求1所述的方法，其中所述抗毒蕈碱剂具有小于40的M2/M3比值。
3.权利要求2所述的方法，其中所述抗毒蕈碱剂具有小于20的M2/M3比值。
4.权利要求2所述的方法，其中所述抗毒蕈碱剂选自：托特罗定、非索罗定、奥昔布宁、索非那新、丙哌维林、曲司铵、咪达那新和TD6301。
5.权利要求4所述的方法，其中所述抗毒蕈碱剂为托特罗定或奥昔布宁。
6.权利要求1所述的方法，其中所述β3-AR激动剂选自：
Figure 960675DEST_PATH_IMAGE004
。
7.权利要求6所述的方法，其中所述β3-AR激动剂和抗毒蕈碱剂以300:1至1:10的重量比给予患者。
8.权利要求6所述的方法，其中所述抗毒蕈碱剂为托特罗定，且其中所述β3-AR激动剂和托特罗定以300:1至1:1的重量比给予患者。
9.权利要求1所述的方法，其中所述方法包括给予患者：
β3-AR激动剂，
抗毒蕈碱剂，和
选择性M2 拮抗剂。
10.权利要求9所述的方法，其中所述抗毒蕈碱剂具有大于40的M2/M3比值。
11.权利要求10所述的方法，其中所述抗毒蕈碱剂为达非那新且所述选择性M2 拮抗剂为美索托明。
12.治疗膀胱过动症的方法，其中所述方法包括给予需要该治疗的患者：
CL316243，和
奥昔布宁；
其中CL316243和奥昔布宁以1:1或1:10的重量比给予患者。
13.权利要求1所述的方法，其中所述β3-AR激动剂、抗毒蕈碱剂和可选的选择性M2拮抗剂以同时、分别或顺序的方式给药。
14.权利要求1所述的方法，其中所述β3-AR激动剂、抗毒蕈碱剂和可选的选择性M2拮抗剂以口服方式给药。
15.药物组合物，包括：
β3-AR激动剂，
抗毒蕈碱剂，和
可选的选择性M2拮抗剂；
其中所述β3-AR激动剂选自：
Figure 775047DEST_PATH_IMAGE005
。
16.权利要求15所述的药物组合物，其中所述组合物包括：
β3-AR激动剂，和
抗毒蕈碱剂；且
其中所述抗毒蕈碱剂具有小于40的M2/M3比值。
17.权利要求16所述的药物组合物，其中所述抗毒蕈碱剂选自：托特罗定、奥昔布宁、非索罗定、索非那新、丙哌维林和曲司铵。
18.权利要求15所述的药物组合物，其中所述组合物包括：
β3-AR激动剂，
抗毒蕈碱剂，和
选择性的M2 拮抗剂；
其中所述抗毒蕈碱剂为达非那新，且
其中所述选择性M2 拮抗剂为美索托明。
19.权利要求15所述的药物组合物，其中所述组合物为口服给药的片剂或胶囊剂。
20.权利要求15所述的药物组合物，其中所述组合物提供抗毒蕈碱剂的控制释放。
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