JP5635932B2 - プロセシンググルコシダーゼ阻害剤 - Google Patents
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Description
[3] 糖タンパク質のN型糖鎖プロセシング阻害剤として使用する、[1]又は[2]に記載のプロセシンググルコシダーゼ阻害剤。
[4] 糖タンパク質が、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連蛋白TRP1、又はチロシナーゼ関連蛋白TRP2である、[3]に記載のプロセシンググルコシダーゼ阻害剤。
[5] チロシナーゼ成熟阻害剤として使用する、[1]から[4]の何れか1項に記載のプロセシンググルコシダーゼ阻害剤。
本発明によればさらに、糖タンパク質のN型糖鎖プロセシング阻害剤の製造のための、式(1)で表される化合物の使用が提供される。
本発明によればさらに、チロシナーゼ成熟阻害剤の製造のための、式(1)で表される化合物の使用が提供される。
本発明によればさらに、式(1)で表される化合物を投与対象者に投与することを含む、糖タンパク質のN型糖鎖プロセシングを阻害する方法が提供される。
本発明によればさらに、式(1)で表される化合物を投与対象者に投与することを含む、チロシナーゼ成熟を阻害する方法が提供される。
本発明のプロセシンググルコシダーゼ阻害剤、糖タンパク質のN型糖鎖プロセシング阻害剤、並びにチロシナーゼ成熟阻害剤(以下、これらを総称して、本発明の阻害剤とも称する)は、下記式(1)で表される化合物を有効成分として含有する。
サラシア属植物の抽出物1kgを酢酸エチル/メタノールで分液し、メタノール画分を減圧下で濃縮し、アミドカラムによる分取クロマトにより成分を分取し、サラシノールを500mg得た。得られたサラシノールは、NMR及びMS等を測定し、文献値と比較することにより同定した。分取クロマトの条件を下記に示す。
カラム:TOSOH TSK−GEL Amlde80 10μ1 φ21.5x30cm
流速:15mL /min
移動相:90%アセトニトリル(v/v)(0.1%酢酸)
検出:Negative ESI 333
ヒト細胞で新たに作り出されるポリペプチドは、3つのアームに分岐し、14個の糖からなる構造をもつ糖鎖によって修飾されていることが多い(図3)。1つのアームの末端には3個のグルコースがあり、その末端側の2個のグルコースは、2種類の糖鎖プロセッシング酵素により順番に切断される。
粗酵素液の調製には、以下のバッファーを用いた。
Buffer A : 0.1 M MES (pH7.0) / 0.15 M NaCl / 5 mM DTT / 0.1 mM PMSF
Buffer B : 0.1 M MES (pH7.0) / 0.15 M NaCl / 5 mM DTT / 1% Triton X-100
100 mmディッシュで培養したHepG2細胞をセルスクレイパーで回収し,Buffer A 400 μLを加えてホモジナイズし,900 X g,4℃で10分間遠心した.次に,上清を8,000 × g,4℃で20 分間遠心し、上清をさらに105,000 × g,4℃で1時間遠心し,沈殿画分を100 uLのbuffer B で溶解したものを粗酵素液とした。
マウス小腸(湿重量4.0g)を氷上のシャーレ内で細かく裁断し、16mL のbuffer A を加えホモジナイズした。その後、上記(1)と同様に遠心分離操作を行った後、300 μLのBuffer B で溶解して粗酵素液を得た。
反応液は以下の組成で構成した。
基質のGlc3Man9GlcNAc2 (G3M9)および Glc1Man9GlcNAc2(GM9)は、PA化(ピリジルアミノ化)により蛍光標識した。
溶出・分離条件
カラム:Shodex Asahipak NH-2P-50 4E サイズ250mm x 4.6mm .
移動相A :97%アセトニトリル/0.3%酢酸アンモニウム(pH7.0)
移動相B :10%アセトニトリル/0.3%酢酸アンモニウム(pH7.0)
条件:0分 A 70%, B 30%, 20分間でA 35%, B 65%に変化させるグラジエント濃度勾配で溶出
流速:0.8 mL/min
カラム温度:42 ℃
結果を図4に示す。図4は、反応系に存在するPA化オリゴ糖鎖(基質、生成物を含む)をクロマトグラムの相対面積比から算出したものである。
図4aは、HepG2細胞由来グルコシダーゼI活性を測定したものである。サラシノールなしの場合は、生成物G2M9の割合が9.5%であるのに対し、サラシノールを添加した系では、G2M9の割合は0%に抑制された。図4bは、グルコシダーゼII活性を測定したものである。サラシノールなしの場合は、生成物M9の割合が51.8%であるのに対し、サラシノールを添加した系では、G2M9の割合は0%に抑制された。
Asn結合型糖鎖(N型糖鎖)の生合成過程では、N-アセチルグルコサミン、マンノース、およびグルコース からなる前駆体が脂質キャリアー中間体の上に合成され、まず小胞体(ER)で糖タンパク質の特定の配列(Asn-X-SerまたはThr)に転移される(図3)。この時点で、付加されている糖鎖はマンノース残基を多く含む構造を取っている。ここからプロセシング(グルコース残基と特定のマンノース残基の切断)を受け、最終的には末端にシアル酸が付加された複合型糖鎖を形成されることが一般的に知られている。
ヒト正常メラノサイト(NHEM(NB)Moderately、クラボウ社)を、Medium 254 (クラボウ社)に増殖添加剤HMGS(クラボウ社)を加えた培地を用いて12000cells/cm2の密度で播種し、24時間前培養した。前培養後、72h毎に各種濃度に調製したサラシノールを含有する培地に交換し、6日間培養を行った。
培養後、トリプシン-EDTA処理によって細胞を回収し、細胞破砕液(1% Triton X-100、プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche Applied Science社)含有 0.2M リン酸バッファー(pH6.8))を添加し、ボルテックス処理後、氷上にて1h静置した。その後、700×g、10分間遠心を行い、回収した上清を細胞タンパク溶解液とした。タンパク定量は、Protein Quantification Kit(DOJINDO)を用いて行った。
エンドグリコシダーゼH(Endo-H)による糖鎖切断処理は、ENDO-H(New England Biolabs社)を用いて行った。タンパク量1mg/mLに調整したヒト正常メラノサイト細胞タンパク溶解液10μLに、Glycoprotein Denaturing Buffer (5% SDS、0.4M DTT)1μLを加え、95℃で5分間加熱した。次にReaction Buffer(50 mM クエン酸バッファー(pH5.5))2μL、50UエンドグリコシダーゼHを加え、純水で総量20μLにメスアップし、37℃で18時間酵素反応を行った。
糖鎖切断処理を行わなかったタンパク溶解液は常法に従い、SDSサンプルバッファーを加えて加熱処理した。
細胞タンパク溶解液を常法に従ってSDS-PAGEによって分離し、PVDF膜に転写した。PVDF膜を5%スキムミルクでブロッキングし、PBS-Tにて洗浄後、一次抗体にヤギ抗チロシナーゼ抗体(Santa Cruz Biotechnology社)、二次抗体にHRP標識抗ヤギ抗体(Santa Cruz Biotechnology社)を用い、ECL検出システム(GEヘルスケア社)によって検出した。
結果を図5に示す。
図5は、サラシノールを培地に添加したヒト正常メラノサイト由来チロシナーゼの糖鎖消化試験の結果である。チロシナーゼの糖鎖は全てN結合型であることから、N-グリコシダーゼF(PNGaseF)とエンドグリコシダーゼH(Endo H)による脱糖鎖処理が有効である。
同様の糖鎖消化実験を他の糖タンパクに対しても行った。具体的には、チロシナーゼファミリータンパクであるTRP1、TRP2を用いた。実験操作は実施例2と同様にして行った。ウェスタンブロッティングは、一次抗体にヤギ抗TRP1抗体、ヤギ抗TRP2抗体(共にSanta Cruz Biotechnology社)、二次抗体にHRP標識抗ヤギ抗体(Santa Cruz Biotechnology社)を用い、ECL検出システム(GEヘルスケア社)によって検出した。
TRP1の結果を図6、TRP2の結果を図7に示す。
図6では、脱糖鎖無処理群において、TRP1は70〜75kD付近に検出されるが、PNGaseF処理では、N結合型糖鎖が全て切断されるため、TRP1はポリペプチド鎖長から推測される60kD付近に検出される。一方、Endo-H処理において、サラシノールを添加しない場合のTRP1タンパクは、Endo-H耐性型(70kD付近)として検出される。
サラシノールはN結合型糖タンパク質において、ハイマンノース型糖鎖から複合型糖鎖へプロセシングされる過程を阻害することがわかった。そこで糖鎖プロセシング阻害がタンパク質の機能に及ぼす影響を調べた。糖タンパクとしては、チロシナーゼに着目し、電気泳動後、DOPA染色により活性型チロシナーゼを検出した。
ヒト正常メラノサイト(NHEM(NB)Moderately、クラボウ社)を、Medium 254 (クラボウ社)に増殖添加剤HMGS(クラボウ社)を加えた培地を用いて12000cells/cm2の密度で播種し、24時間前培養した。前培養後、72h毎に各種濃度に調製したサラシノールを含有する培地に交換し、6日間培養を行った。
培養後、トリプシン-EDTA処理によって細胞を回収し、細胞破砕液(1% Triton X-100、プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche Applied Science社)含有 0.2M リン酸バッファー(pH6.8))を添加し、ボルテックス処理後、氷上にて1h静置した。その後、700×g、10分間遠心を行い、回収した上清を細胞タンパク溶解液とした。タンパク定量は、Protein Quantification Kit(DOJINDO)を用いて行った。
細胞タンパク溶解液に還元剤不含のサンプルバッファーを添加し、加熱処理をせずにSDS-PAGEによって分離した。電気泳動後、ゲルを0.2M リン酸緩衝液(pH6.8)中で10分間振盪させた。次に5mM L−DOPA含有0.2M リン酸緩衝液(pH6.8)に浸し、37℃で30分間ゆっくりと振盪し、DOPAを基質としたチロシナーゼ活性をゲル内で検出した。
結果を図8に示す。図8Aは、DOPA染色、図8Bは、実施例2と同様の手順で実施したチロシナーゼのウェスタンブロッティングの結果である。
図8Aにおいて、DOPA染色で細胞内のチロシナーゼ活性を可視化したところ、サラシノールは濃度依存的に細胞内のチロシナーゼ活性を減少させた。また、この活性減少は、図8Bにおいてチロシナーゼの低分子量シフトとして観測される糖鎖プロセシング阻害と相関していた。このことから、サラシノールは糖鎖プロセシングを阻害することで、チロシナーゼタンパクの未熟化を引き起こすことがわかった。
乳液の処方例として、以下の処方を調製した。
(成分) (%)
サラシノール 1.0
スクワラン 8.0
ホホバ油 7.0
パラアミノ安息香酸グリセリル 1.0
リン酸アスコルビルマグネシウム 0.5
セチルアルコール 1.5
グリセリンモノステアレート 2.0
ポリオキシエチレンセチルエーテル 3.0
ポリオキシエチレンソオルビタンモノオレート 2.0
1,3−ブチレングリコール 1.0
グリセリン 2.0
1,2-ペンタンジオール 3.0
香料 適量
精製水 残量
クリームの処方例として、以下の処方を調製した。
(成分) (%)
サラシノール 0.5
セトステアリルアルコール 3.0
グリセリン脂肪酸エステル 2.0
モノオレイン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン 1.0
モノステアリン酸ソルビタン 1.0
N−ステアロイル−N−メチルタウリンナトリウム 0.5
ワセリン 5.0
ジメチルポリシロキサン(25℃での粘度は100mPa・s) 3.0
トリ−2−エチルヘキサン酸グリセリル 20.0
アスタキサンチン 0.05
エラグ酸 0.05
乳酸 1.0
ジプロピレングリコール 10.0
アルブチン 3.0
クエン酸ナトリウム 0.5
リン酸アスコルビルマグネシウム 0.1
酸化チタン 0.1
香料 適量
エデト酸2ナトリウム 0.03
パラオキシ安息香酸エチル 0.05
精製水 残量
Claims (6)
- プロセシンググルコシダーゼが、小胞体におけるグルコシダーゼIまたはグルコシダーゼIIである、請求項1に記載のプロセシンググルコシダーゼ阻害剤。
- チロシナーゼ成熟阻害剤として使用する、請求項1又は2に記載のプロセシンググルコシダーゼ阻害剤。
- 医薬部外品又は化粧品として使用される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のプロセシンググルコシダーゼ阻害剤。
- 医薬部外品又は化粧品として使用される、請求項5に記載のチロシナーゼ成熟阻害剤。
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