KR20230000934A

KR20230000934A - 커큐민 유도체와 TGF-β 수용체 억제제의 병용투여를 통한 비알코올성 지방간염 치료 방법

Info

Publication number: KR20230000934A
Application number: KR1020220010145A
Authority: KR
Inventors: 정춘희; 이은수; 하경봉; 이동건; 박나원; 조수호
Original assignee: 연세대학교 원주산학협력단
Priority date: 2021-06-24
Filing date: 2022-01-24
Publication date: 2023-01-03
Also published as: EP4248957A1; US20230364069A1; WO2022270760A1; WO2022270760A8; EP4248957A8; CA3217764A1

Abstract

본 발명은 커큐민 유도체 및 TGF-β 수용체 억제제를 유효성분으로 포함하는 지방간염 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물, 의약외품, 식품 조성물에 관한 것으로. 상기 조성물은 TGF-β 수용체 억제제가 간 조직의 섬유화를 억제하고, 커큐민 유도체는 섬유화 억제 과정에서 증가한 간세포의 지방생성을 억제하여 기존의 커큐민 유도체 또는 TGF-β 수용체 억제제를 단독 투여했을 때보다 뛰어난 지방간염의 예방 및 치료 효과를 나타내는바, 지방간염을 포함한 대사성 간질환 예방, 개선 또는 치료를 위한 약학 조성물, 의약외품, 식품 조성물로 사용될 수 있다.

Description

커큐민 유도체와 TGF-β 수용체 억제제의 병용투여를 통한 비알코올성 지방간염 치료 방법{Methods for treating non-alcoholic steatohepatitis by concomitant administering curcumin derivatives and TGF-β receptor inhibitor}

본 발명은 커큐민 유도체(Curcumin derivatives) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 TGF-β(전환성장인자 베타, Transforming Growth Factor beta) 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 대사성 간질환 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물, 의약외품 및 식품 조성물에 관한 것이다.

지방간 질환에는 알코올에 의해 형성되는 지방간 질환과 대사 조절장애의 결과로 생기는 지방간(hepatic steatosis), 지방간염(steatohepatitis) 또는 간 섬유증(liver fibrosis)과 같은 대사성 간질환(metabolic liver disease)이 포함된다.

비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD)은 전술한 대사성 간질환의 일종으로서, 알코올 섭취와 관련이 없는, 간에서의 지방 축적에 의해 발생되는 질환이다. 비알코올성 지방간 질환은 간세포에 지방의 과도한 축적만 있는 단순 지방증(simple steatosis), 간세포 괴사와 염증 및 섬유화를 동반하는 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis; NASH) 등을 포함하는 일련의 질환군을 의미한다.

비알코올성 지방간염(NASH)은 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)의 악화 과정에서 발생되는 질환이다. 먼저, 파괴된 간세포 파편이 쿠퍼(Kupffer) 세포 및 대식세포(macrophage)에 의해 탐식 되는 곳에서 염증성 사이토카인이 분비된다. 상기 분비된 사이토카인은 간유동벽(hepatic sinusoid) 내피세포와 간세포 사이에서 혈류를 조절하는 간성상세포(hepatic stellate cell)를 활성화시켜 콜라겐을 비롯한 결합조직 성분을 합성하고 분비하여 섬유화를 발생시킨다. 이러한 과정이 진행되면 단순히 지방화한 간세포를 갖는 지방증(steatosis)이 아닌 벌룬 현상(ballooning), 염증(inflammation), 또는 섬유화(fibrosis)를 발생시키는 중대한 병변인 비알코올성 지방간염(NASH)으로 진행하게 된다.

한편, 커큐민(Curcumin, Diferuloylmethane)은 동인도산의 생강과(Zingiberaceae)에 속하는 식물인 울금(Curcuma longa Linn)의 뿌리에서 추출되어 인도 음식에 널리 사용되어 온 폴리페놀(Polyphenol) 성분의 노란색 향신료로 심황(Turmeric)의 커큐미노이드(Curcuminoid)이다. 식품첨가물에서는 노란색 색소로 사용되며 향신료로 이용되고 있다. 세포 생리학에서 커큐민의 역할은 다양하며 염증 관련 단백질들, 세포 신호 물질, 전사 인자 등을 포함하는 많은 세포 구성요소와 관련된다.

또한, TGF-β(Transforming growth factor-β)는 간성상세포(Hepatic Stellate Cells, HSCs)를 근섬유아세포로 전환분화시켜 간에서 섬유화를 진행시키는 역할을 하는 사이토카인이기 때문에 만성적인 간 질환에서 TGF-β 신호를 차단하는 것은 간 섬유화 치료에 이상적인 방법으로 알려져 있다. TGF-β 수용체 억제제인 EW-7197은 매우 강력하고, 선택적이며 경구투여할 수 있는, TGF-β 수용체 AKL4(Activin receptor-like kinase 4) 또는 AKL5(Activin receptor-like kinase 5)의 억제제이다. 상기 EW-7197은 기존 연구에서 사염화탄소(tetrachloride, CCL4) 투여, 담관결찰(bile duct ligation)에 의한 간섬유화 모델에서 간 손상을 억제할 뿐만 아니라 UUO(unilateral ureteral obstruction)에 의한 신장 섬유화 및 블레오마이신(bleomycin, BLM)으로 폐 섬유화를 유도한 모델에서도 TGF-β/Smad 및 ROS 시그널을 조절하여 조직 섬유화를 억제하는 효과가 있음이 밝혀졌다.

하지만, TGF-β 수용체 억제제는 간 섬유화를 억제하는 과정에서 간의 지방생성을 촉진하는 부작용이 있어 비알콜성 지방간염 치료를 위한 보다 효과적인 치료방법이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 대사성 간질환, 특히, 비알코올성 지방간염에 더욱 효과적인 치료방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 커큐민 유도체 및 TGF-β 수용체 억제제를 병용투여함으로써 간 섬유화 억제와 동시에 간에서의 지방 축적을 억제하는 효과를 나타낼 수 있다는 점을 새로이 밝혔고, 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허 제10-1927399호

기존의 TGF-β(Transforming growth factor-β) 수용체 억제제는 항섬유증 효과가 있지만 조직 섬유화를 억제하는 과정에서 간세포에서의 지방생성을 증가시키는 문제점이 있었다.

본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는 대사성 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는 대사성 간질환 예방 또는 치료용 의약외품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는 대사성 간질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는 제제를 복합, 혼합 또는 병용적으로 포함하는 대사성 간질환 치료용 복합, 혼합 또는 병용제 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는, 대사성 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 커큐민 유도체는 디메톡시커큐민 (demethoxycurcumin), 비스디메톡시커큐민 (bisdemethoxycurcumin), 5-하이드록시-1-(4-하이드록시-3-메톡시-페닐)-7-(4-니트로-페닐)-헵타-1,4,6-트리엔-3-온 (5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-7-(4-nitro-phenyl)-hepta-1,4,6-trien-3-one), N-{3-[(2E)-3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)프로프-2-에노일]페닐}-2-메틸프로판아미드 (N-{3-[(2E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)prop-2-enoyl]phenyl}-2-methylpropanamide), 4,4'-(3,5-피리딘에딜디-2,1-에티네딜)비스(2-메톡시페놀) (4,4'-(3,5-Pyridinediyldi-2,1-ethynediyl)bis(2-methoxyphenol)), 2,6-디클로로-N-{3-[(2E)-3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-2-프로페노일]페닐}벤즈아마이드) (2,6-Dichloro-N-{3-[(2E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenoyl]phenyl}benzamide), 디하이드로진제론 (dehydrozingerone, DHZ), 4-(3,4-디메톡시페닐)-3-부텐-2-온 (4-(3,4-Dimethoxyphenyl)-3-buten-2-one) 및 1-(4-클로로페닐)-3-페닐-1,3-프로판디온 (1-(4-Chlorophenyl)-3-phenyl-1,3-propanedione)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나 이로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 조성물은 TGF-β 수용체 AKL4(Activin receptor-like kinase 4) 또는 AKL5(Activin receptor-like kinase 5)를 억제할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 TGF-β 수용체 억제제는 N-(2-플루오로페닐)-5-(6-메틸-2-피리디닐)-4-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘-6-일-1H-이미다졸-2-메탄아민 (N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a] pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine; EW-7197)이다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 커큐민 유도체와 TGF-β 수용체 억제제의 몰비율은 1:15 내지 15:1이다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 대사성 간질환은 지방간, 간섬유증 및 지방간염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나 이로 한정되는 것은 아니다.

구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 지방간염은 비알코올성 지방간염이다.

또한, 본 발명은 상기 대사성 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함하는 경구용 약학 제제를 제공한다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 경구용 약학 제제는 정제, 과립제, 환제, 산제, 캡슐제 및 액제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는, 대사성 간질환 예방 또는 치료용 의약외품을 제공한다.

또한, 본 발명은 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는, 대사성 간질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는 제제를 복합, 혼합 또는 병용적으로 포함하는 대사성 간질환 치료용 복합, 혼합 또는 병용제 키트를 제공한다.

본 발명의 커큐민 유도체(Curcumin derivatives) 및 TGF-β(Transforming growth factor-β) 수용체 억제제를 병용, 배합 또는 순차 투여하였을 때, TGF-β 수용체 억제제를 단독 투여할 때 나타나는 부작용인 간에서의 지방축적 증가를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 따라서, 상기 커큐민 유도체 및 TGF-β 수용체 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 대사성 간질환의 예방, 개선 또는 치료를 목적으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 마우스 간세포주에서 섬유화 유도를 위한 TGF-β와 각종 커큐민 유도체들을 농도별로 처리시 세포생존에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 2는 TGF-β에 의해 섬유화를 유도한 마우스 간세포주에서 EW-7197 처리시 간섬유화 억제 효과를 섬유화 마커의 단백질 발현을 통해 확인한 도이다.
도 3은 TGF-β에 의해 섬유화를 유도한 인간 간선상세포주에서 EW-7197 처리시 간섬유화 억제 효과를 섬유화 마커의 단백질 발현을 통해 확인한 도이다.
도 4는 마우스 간세포주에 불포화 지방산인 올레산 처리를 통해 지방이 생성되게 하고 커큐민 또는 커큐민 유도체를 처리하여 커큐민 또는 커큐민 유도체의 지방감소 효과를 확인한 도이다.
도 5는 도 4에서 양성염색된 지방의 영역을 수치화 하여 나타낸 도이다.
도 6은 마우스 간세포주에 불포화 지방산인 올레산 처리를 통해 지방이 생성되게 하고 커큐민 유도체 또는 EW-7197를 처리한 후 지방 합성과 분해를 확인한 도이다.
도 7은 마우스 간세포주에 불포화 지방산인 올레산 처리를 통해 지방이 생성되게 하고 커큐민 유도체 또는 EW-7197를 처리한 후 지방 합성과 분해를 지방 축적 인자 및 지방 대사 조절 인자의 단백질 발현을 통해 확인한 도이다.
도 8은 마우스 간세포주에서 EW-7197과 커큐민5-8 병용처리시 상승효과를 나타낸 도로서, TGF-β에 의해 섬유화를 유도한 간세포에 EW-7197과 커큐민5-8 병용처리시 상피간엽전환 억제 효과, 간세포 내 지방생성 억제 효과 및 간섬유화 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 9는 도 8에서 양성염색된 지방의 영역을 수치화 하여 나타낸 도이다.
도 10은 도 8에서 양성염색된 a-SMA의 영역을 수치화 하여 나타낸 도이다.
도 11은 마우스 간세포주에서 EW-7197과 커큐민5-8 병용처리시 상승효과를 나타낸 도로서, TGF-β에 의해 섬유화를 유도한 간세포주에 EW-7197과 커큐민5-8 병용처리시 간섬유화 억제 효과를 섬유화 마커의 단백질 발현을 통해 확인한 도이다.
도 12는 인간 간성상세포주에서 EW-7197과 커큐민5-8 병용처리시 상승효과를 나타낸 도로서, TGF-β에 의해 섬유화를 유도한 간성상세포주에 EW-7197과 커큐민5-8 병용처리시 간섬유화 억제 효과를 섬유화 마커의 단백질 발현을 통해 확인한 도이다.
도 13은 마우스 간세포주에서 10 μM 또는 0.5 μM EW-7197과 커큐민5-8 병용처리시 상승효과를 나타낸 도로서, TGF-β에 의해 섬유화를 유도한 간세포에 EW-7197과 커큐민5-8 병용처리시 간세포 내 지방생성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 14는 도 13에서 10 μM EW-7197 처리군의 양성염색된 지방의 영역을 수치화 하여 나타낸 도이다.
도 15는 도 13에서 0.5 μM EW-7197 처리군의 양성염색된 지방의 영역을 수치화 하여 나타낸 도이다.
도 16은 마우스 간세포주에서 EW-7197과 커큐민5-8, 디하이드로진제론(DHZ), 디하이드로진제론103(DHZ103) 또는 디하이드로진제론176(DHZ176) 병용처리시 상승효과를 나타낸 도로서, TGF-β에 의해 섬유화를 유도한 간세포에 EW-7197과 커큐민5-8, DHZ, DHZ103 또는 DHZ176 병용처리시 상피간엽전환 억제 효과, 간세포 내 지방생성 억제 효과 및 간섬유화 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 17은 도 16에서 양성염색된 지방의 영역을 수치화 하여 나타낸 도이다.
도 18은 도 16에서 양성염색된 a-SMA의 영역을 수치화 하여 나타낸 도이다.
도 19는 MCD(methionine-choline deficient diet) 사료로 지방간염을 유도한 동물모델에서 고농도 EW-7197(40 mg/kg)과 커큐민5-8을 병용처리시 생리학적 변화를 나타낸 도이다.
도 20은 도 19의 동물모델에서 고농도 EW-7197(40 mg/kg)과 커큐민5-8을 병용처리시 간 조직 내 지방축적과 조직의 섬유화를 억제하는 효과를 나타낸 도로서, H&E(Hematoxylin & Eosin), 피크로시리우스 레드(Picrosirius red), 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 염색을 통해 간 조직의 지방방울 및 섬유화 수준을 나타낸 도이다.
도 21은 도 20에서 양성염색된 피크로시리우스 레드 및 메이슨 트리크롬 영역을 수치화 하여 나타낸 도이다.
도 22는 도 20에서 H&E 염색된 간 조직을 NAS(NAFLD acitivity score) 시스템으로 평가하여 나타낸 도이다.
도 23은 도 19의 동물모델에서 고농도 EW-7197(40 mg/kg)과 커큐민5-8을 병용처리시 간 조직 내 지방축적 억제 효과를 지방 대사 조절 인자 및 이와 관련된 신호 인자의 단백질 발현을 통해 확인한 도이다.
도 24는 도 19의 동물모델에서 고농도 EW-7197(40 mg/kg)과 커큐민5-8을 병용처리시 간 조직의 섬유화 억제 효과를 섬유화 마커의 단백질 발현을 통해 확인한 도이다.
도 25는 MCD 사료로 지방간염을 유도한 동물모델에서 저농도 EW-7197(5 mg/kg)과 커큐민5-8을 병용처리시 생리학적 변화를 나타낸 도이다.
도 26은 도 25의 동물모델에서 저농도 EW-7197(5 mg/kg)과 커큐민5-8을 병용처리시 간 조직 내 지방축적과 조직의 섬유화를 억제하는 효과를 나타낸 도로서, H&E(Hematoxylin & Eosin), 피크로시리우스 레드(Picrosirius red), 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 염색을 통해 간 조직의 지방방울 및 섬유화 수준을 나타낸 도이다.
도 27은 도 26에서 양성염색된 피크로시리우스 레드 및 메이슨 트리크롬 영역을 수치화 하여 나타낸 도이다.
도 28은 도 26에서 H&E 염색된 간 조직을 NAS(NAFLD acitivity score) 시스템으로 평가하여 나타낸 도이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서에서 "약학적으로 허용가능한"이란 포함된 성분이 생물체를 상당히 자극하지 않고, 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.

본 명세서에서 "약학적으로 허용가능한 염"이란 바람직한 생물활성을 보유한 염으로서, 무기산염(염산, 황산, 인산, 질산), 유기산염(아세트산, 옥살산, 말레산, 푸마르산, 숙신산, 벤조산, 아스코르브산, 타닌산, 파모산, 알긴산, 트리에틸아민, 사이클로헥실아민, 피리딘), 알칼리금속염(나트륨염, 칼륨염), 알칼리토금속염(칼슘염), 암모늄염 또는 이들의 부가 염 형태 등을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "예방"은 본 발명의 조성물의 체내 투입으로 특정 질환(예를 들어, 대사성 간질환)의 증상을 억제시키거나 진행을 억제시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 "치료"는 본 발명의 조성물의 체내 투입으로 특정 질환(예를 들어, 대사성 간질환)의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명은 커큐민 유도체(Curcumin derivatives) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β(Transforming growth factor-β) 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는, 대사성 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 커큐민은 울금(Curcuma longa Linn)의 뿌리에서 주로 추출되는 폴리페놀(polyphenol)을 의미한다.

본 발명에서, 커큐민 유도체(Curcumin derivatives)는 상기 폴리페놀의 일종인 커큐민의 화학구조 일부가 삭제, 부가, 변경된 화합물을 의미한다. 커큐민 유도체는 예를 들면, 디메톡시커큐민 (demethoxycurcumin), 비스디메톡시커큐민 (bisdemethoxycurcumin), 5-하이드록시-1-(4-하이드록시-3-메톡시-페닐)-7-(4-니트로-페닐)-헵타-1,4,6-트리엔-3-온 (5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-7-(4-nitro-phenyl)-hepta-1,4,6-trien-3-one), N-{3-[(2E)-3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)프로프-2-에노일]페닐}-2-메틸프로판아미드 (N-{3-[(2E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)prop-2-enoyl]phenyl}-2-methylpropanamide), 4,4'-(3,5-피리딘에딜디-2,1-에티네딜)비스(2-메톡시페놀) (4,4'-(3,5-Pyridinediyldi-2,1-ethynediyl)bis(2-methoxyphenol)), 2,6-디클로로-N-{3-[(2E)-3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-2-프로페노일]페닐}벤즈아마이드) (2,6-Dichloro-N-{3-[(2E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenoyl]phenyl}benzamide), 디하이드로진제론 (dehydrozingerone, DHZ), 4-(3,4-디메톡시페닐)-3-부텐-2-온 (4-(3,4-Dimethoxyphenyl)-3-buten-2-one), 1-(4-클로로페닐)-3-페닐-1,3-프로판디온 (1-(4-Chlorophenyl)-3-phenyl-1,3-propanedione) 등을 포함한다.

본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 커큐민 유도체는 N-{3-[(2E)-3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)프로프-2-에노일]페닐}-2-메틸프로판아미드 (N-{3-[(2E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)prop-2-enoyl]phenyl}-2-methylpropanamide)로, 하기 [화학식 1]의 구조를 갖는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 커큐민 유도체는 커큐민5-8(curcumin5-8, CUR5-8)을 지칭한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명의 커큐민 유도체는 4,4'-(3,5-피리딘에딜디-2,1-에티네딜)비스(2-메톡시페놀) (4,4'-(3,5-Pyridinediyldi-2,1-ethynediyl)bis(2-methoxyphenol))로, 하기 [화학식 2]의 구조를 갖는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 커큐민 유도체는 커큐민4-8(curcumin4-8, CUR4-8)을 지칭한다.

[화학식 2]

또한, 본 발명의 커큐민 유도체는 2,6-디클로로-N-{3-[(2E)-3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-2-프로페노일]페닐}벤즈아마이드) (2,6-Dichloro-N-{3-[(2E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenoyl]phenyl}benzamide)로, 하기 [화학식 3]의 구조를 갖는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 커큐민 유도체는 커큐민5-14(curcumin5-14, CUR5-14)을 지칭한다.

[화학식 3]

또한, 본 발명의 커큐민 유도체는 디하이드로진제론 (Dehydrozingerone; DHZ))으로, 하기 [화학식 4]의 구조를 갖는 것일 수 있다.

[화학식 4]

또한, 본 발명의 커큐민 유도체는 4-(3,4-디메톡시페닐)-3-부텐-2-온 (4-(3,4-Dimethoxyphenyl)-3-buten-2-one)으로 하기 [화학식 5]의 구조를 갖는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 커큐민 유도체는 디하이드로진제론103(Dehydrozingerone103; DHZ103)을 지칭한다.

[화학식 5]

또한, 본 발명의 커큐민 유도체는 1-(4-클로로페닐)-3-페닐-1,3-프로판디온 (1-(4-Chlorophenyl)-3-phenyl-1,3-propanedione)으로 하기 [화학식 6]의 구조를 갖는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 커큐민 유도체는 디하이드로진제론176(Dehydrozingerone176, DHZ176)을 지칭한다.

[화학식 6]

본 발명의 상기 커큐민 유도체는 간세포에서 TGF-β 수용체 억제제에 의한 지방생성을 억제하는 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 상기 커큐민 유도체는 공지의 방법에 따라 합성하여 사용할 수 있고, 상업적으로 판매되는 것을 구입하여(일 예로, Sigma 등에서 입수 가능) 사용할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 TGF-β 수용체 억제제는 N-(2-플루오로페닐)-5-(6-메틸-2-피리디닐)-4-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘-6-일-1H-이미다졸-2-메탄아민 (N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a] pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine)으로 하기 [화학식 7]의 구조를 갖는 것 일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 TGF-β 수용체 억제제는 EW-7197을 지칭한다.

[화학식 7]

본 발명에서, 상기 EW-7197은 경구투여가 가능하고, CCL4 투여 및 담관 결찰(bile duct ligation)에 의한 간섬유화 모델에서 간손상을 억제할 수 있으며, 한쪽 요관폐쇄(unilateral ureteral obtruction, UUO)에 의한 신장 섬유화 모델 및 블레오마이신(bleomycin)에 의한 폐섬유화 모델에서 조직 섬유화를 억제할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 약학 조성물은 TGF-β 수용체 AKL4 또는 AKL5를 억제할 수 있다.

본 발명의 상기 TGF-β 수용체 억제제는 공지의 방법에 따라 합성하여 사용할 수 있고, 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 커큐민 유도체와 TGF-β 수용체 억제제의 몰비율은 1:15 내지 15:1, 1:14 내지 14:1, 1:13 내지 13:1, 1:12 내지 12:1, 1:11 내지 11:1, 또는 1:10 내지 10:1일 수 있다.

보다 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 커큐민 유도체는 커큐민5-8, 디하이드로진제론, 디하이드로진제론103 또는 디하이드로진제론176이고, TGF-β 수용체 억제제는 EW-7197일 수 있다.

본 발명에서 대사성 간질환은 지방간, 지방간염 및 간 섬유증으로 구성된 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 대사성 간질환은 지방간염일 수 있으며, 더욱 구체적으로 비알코올성 지방간염일 수 있다. 본 발명에서 비알코올성 지방간염은 간세포의 지방화, 괴사, 염증 및 섬유화를 동반할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 유효성분 뿐만 아니라 기존에 지방간 질환 치료 효과, 간 질환 치료 효과, 간 보호 효과, 간 기능 개선 효과 등이 있는 것으로 인정된 물질, 일예로 지방간 질환 치료제, 간세포 보호용 물질, 간 질환 치료제 또는 간 기능 개선제 등으로 사용되는 물질을 더 포함하거나, 상기 물질과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물이 종래 지방간 예방 또는 치료제와 함께 사용되는 경우, 동시 또는 순차적으로 투여될 수 있고, 그 횟수 및 순서의 영향을 받지 않는다.

본 발명의 약학 조성물 내 상기 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 상기 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;의 함량은 0.001 중량% 내지 99.999 중량%, 0.01 중량% 내지 99.99 중량%, 0.1 중량% 내지 99.9 중량% 또는 1 중량% 내지 90 중량% 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고 투여 개체, 사용태양, 사용방법, 제제의 형태 등에 따라 본 발명의 상기 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 상기 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 함량이 적절히 조절하여 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제와 병용하여 사용될 수 있고, 상기 제제와 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.3 mg 내지 80 mg을 매일 또는 격일로 투여하거나 1일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 복강 내, 피하, 피내, 또는 국소에 적용) 할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres), 또는 나노 구형입자와 같은 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 사용하여 운반될 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 서로 연결 또는 담체 중에 포함될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내로/ 내에서 운반될 수 있다. 이 외에도, 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화 될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되고, 이러한 고형 제제는 적어도 하나 이상의 부형제(전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴) 및 윤활제(마그네슘 스티레이트 탈크) 등을 섞어 제조할 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 포함되고, 이러한 액상 제제는 적어도 하나 이상의 희석제(물, 리퀴드 파라핀), 부형제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 섞어 제조할 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함되고, 상기 비수용성용제 및 현탁용제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으며, 상기 좌제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 대사성 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 경구용 약학 제제일 수 있다. 구체적으로 상기 경구용 약학 제제는 정제, 과립제, 환제, 산제, 캡슐제 및 액제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 경구 투여를 위한 제제는 예를 들어 정제, 과립제, 환제, 산제, 캡슐제 또는 액제와 같은 투여량 단위 형태 및 앰플로 존재할 수 있다. 이들은 그 자체로 공지된 방법, 예를 들어 통상적인 혼합, 입상화, 당제, 조제, 용해 또는 동결건조 방법에 의해 제조된다.

본 발명은 또한, 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는, 대사성 간질환 예방 또는 치료용 의약외품을 제공한다.

본 발명의 상기 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 대사성 간질환에 대해서는 상기 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는 대사성 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 내용과 동일하므로 상기 내용을 원용하고, 이하에서는 의약외품의 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로 사람이나 동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품일 수 있다.

상기 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 소독 청결제, 세정제, 주방용 세정제, 청소용 세정제, 치약, 가글제, 물티슈, 세제, 비누, 핸드 워시, 헤어세정제, 헤어 유연제, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 및 필터 충전제, 비타민 제제, 미네랄 제제, 자양강장변질제, 건위소화제, 정장제 등 의약품에서 전환된 내복용제 등으로 구성된 군에서 선택되는 제형으로 제조할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 상기 의약외품은 의약품에서 전환된 내복용제일 수 있다.

본 발명은 또한, 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는 대사성 간질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 대사성 간질환에 대해서는 상기 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는 대사성 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 내용과 동일하므로 상기 내용을 원용하고, 이하에서는 식품 조성물의 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.

상기 식품 조성물은 기능성 식품 또는 건강기능식품 일 수 있고, 대사성 간질환 개선 또는 예방과 이에 추가로 간 보호 및 간 기능 개선을 위한 건강기능성 식품 조성물 일 수 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 일 예로 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미할 수 있고, 통상적으로 식품, 식품첨가제, 건강기능식품 및 음료를 모두 포함한다.

본 발명의 상기 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 상기 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품은 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스낵류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임 식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 수프 등)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

본 발명에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분을 포함하는 것에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디로시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g 또는 5 g 내지 12 g 이다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 주스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.

상기 외의 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 식품 조성물 100 중량부 당 0 중량부 내지 200,000 중량부 범위에서 선택될 수 있다.

본 발명에서 기능성 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병 방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.

상기 기능성 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명 식품 조성물의 유효성분을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g 또는 5 g 내지 12 g일 수 있다.

또한, 상기 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는 대사성 간질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물에 있어서, 상기 유효성분의 함량은 전체 식품 중량의 0.0001 중량% 내지 99.99 중량% 또는 0.001 중량% 내지 99.9% 중량% 또는 0.01 중량% 내지 90 중량% 또는 0.1 중량% 내지 50 중량%로 포함할 수 있으며, 음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.0002 g 내지 5 g 또는 0.03 g 내지 1 g의 비율로 포함할 수 있다.

또한, 상기 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는 대사성 간질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물의 섭취량은 섭취하고자 하는 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 일 예로, 본 발명의 식품 조성물은 유효성분을 기준으로 1일 0.0001 g/kg(유효성분의 양/체중) 내지 12 g/kg(유효성분의 양/체중) 또는 0.01 g/kg 내지 9 g/kg으로 투여될 수 있다. 투여방법은 하루에 한 번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수 있으며 투여횟수 및 투여방법은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초콜릿, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위를 이로 한정하는 것을 의도하지 않는다.

<실시예 1> 세포 실험

<실시예 1-1> 세포 배양

쥐 간세포인 AML12 및 인간 간성상세포(hepatic stellate cell)인 LX-2 세포를 사용하여 세포 실험을 수행하였다.

AML12 세포는 간세포(hepatocyte)나 전립선상피세포(prostate eopthelial cell)의 배양에 사용되는, DMEM 배지와 Ham's F-12가 50:50으로 섞인 F-12 media(Corning, USA, Arizona)에 인슐린(insulin; ITS) 5 ml, 덱사메타손(dexamethasone) 40 ng/ml, 1 % 페니실린 스트렙토마이신(penicillin streptomycin; anti-anti) 및 10 % 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)를 첨가하여 만든 배양액에서 배양하였다.

LX-2 세포는 고 포도당이 포함된 DMEM 배지 (4500 mg/L D-glucose, L-glutamine, 110 mg/L sodium pyruvate, sodium bicarbonate) 에 1 % 페니실린 스트렙토마이신(penicillin streptomycin; anti-anti) 및 10 % 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)를 첨가하여 만든 배양액에서 배양하였다.

<실시예 1-2> 커큐민 유도체의 세포 독성 확인

세포 독성을 확인하기 위해 상기 실시예 1-1의 세포에 TGF-β 2 ng/ml를 처리한 후, 커큐민(CUR), 커큐민5-8(CUR5-8), 커큐민4-8(CUR4-8), 커큐민5-14(CUR5-14) 각각을 0.1, 1, 3 및 5 μM로 동일한 시간동안 처리하였다. 이후, 5 % CO₂, 37℃ 인큐베이터에서 배양한 세포에 생존한 세포를 염색할 수 있는 테트라졸륨(tetrazolium) 염색약을 통해 염색한 후 (MTT) 분광광도계(sepctrophotometer) 를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

<실시예 1-3> TGF-β 수용체 억제제 투여 후 간세포의 섬유화 확인

간세포에 TGF-β로 섬유화를 유도하고, TGF-β 수용체 억제제를 투여한 후, 섬유화를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-1의 세포에 TGF-β 2 ng/ml를 투여한 후, 10 μM EW-7197(EW)를 투여 또는 비투여하고 24시간 동안 배양하였다. 대조군(Con)은 TGF-β 및 시료를 모두 처리하지 않았다. 이후, 세포를 회수하고, 세포에서 섬유화 마커로 α-SMA, 콜라겐 Ⅰ(Col1), p-SMAD2, p-SMAD3 단백질 발현을 웨스턴 블럿팅으로 확인하였다. 이를 위해, 회수한 세포를 RIPA 완충액(Thermo, MA, USA)에서 프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제(Roche, IN, USA)로 용해한 후 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션 하였다. 용해물을 4℃에서 13,000 rpm으로 20분 동안 원심분리한 후, 불용성 물질을 제거하였다. BCA 분석(Pierce Biotechnology)으로 단백질 농도를 측정하였다. 동량의 세포 용해물을 전기영동을 위해 SDS-PAGE 겔에 로딩하고, PVDF 멤브레인(polyvinylidene difluoride, Immobilon-P, Merck KGaA, Darmstadt, Germany)으로 옮겼다. 그 다음, 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 1X TBST의 5%(w/v) 스킴밀크로 블로킹 하였다. 블로킹 후 멤브레인에 1차 항체로 항-β-액틴 항체(1:2000; Santa Cruz), 항-α-SMA 항체(1:1000; Santa Cruz), 항-콜라겐 Ⅰ 항체(1:1000; Santa Cruz), 항-p-SMAD2 항체(1:1000; Cell signaling), 항-p-SMAD3 항체(1:1000; Cell signaling) 각각을 처리하고 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 그 후, 1X TBST로 여러 번 세척한 후 멤브레인을 실온(RT)에서 1시간 동안 블로킹 완충액에서 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합 이차 항체(항-마우스, 토끼 또는 염소, 1:2000; Cell signaling)와 함께 인큐베이션 하였다. 그 다음, 멤브레인을 세척하고, 제조사의 절차에 따라 Pico Enhanced Peroxidase Detection (EPD) Western reagent (Elpis Biotechnology)와 함께 간단히 인큐베이션 하고 이미지 분석기(ImageQuant™ LAS 500, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden)로 정량화 하였다. 내부 대조군으로 β-액틴을 사용하였다. 단백질 강도의 농도 측정은 Image J(National Institutes of Health)를 사용하여 정량화 하였다.

<실시예 1-4> 커큐민 유도체 투여 후 지방의 합성과 분해 확인

간세포에 올레산으로 지방 축적을 유도하고, 커큐민 유도체를 투여한 후, 지방의 합성과 분해를 확인하였다.

구체적으로, 올레산의 경우 0.2 % 소혈청 알부민(Bovine serum albumin, BSA)에 500 μM 농도로 녹여 상기 실시예 1-1의 세포에 24시간 동안 배양하여 처리하고, 1 μM 커큐민(Cur), 1 μM 커큐민5-8(Cur5-8), 1 μM 커큐민4-8(Cur4-8), 1 μM 커큐민5-14(Cur5-14)를 동일한 시간동안 처리하였다. 이후, 5 % CO₂, 37℃ 인큐베이터에서 배양한 세포에 BODIPY-지방산(BODIPY-Fatty acid) 용액(Sigma, 1 mg/mL의 스톡 DMSO 용액을 PBS 1X로 희석하여, 최종 농도 0.2 ㎍/mL를 얻었다.)을 투여하고 1시간 동안 배양하였다. PBS 1X로 세척 후, 염색된 세포를 관찰하였다.

또한, 상기 실시예 1-1의 세포에 상기에 기재된 방법과 동일한 방법으로 올레산을 처리하고, 1 μM 커큐민(Cur), 1 μM 커큐민5-8(Cur5-8), 10 μM EW-7197(EW)를 처리한 후 상기와 동일한 방법으로 BODIPY-지방산 염색을 수행하였다. 또한, 시료를 처리한 후 세포를 회수하고, 회수한 세포에서 지방 축적 유도 인자로 adipophilin 및 지방 대사 조절 인자로 SREBP1C 단백질 발현을 웨스턴 블럿팅으로 확인하였다. 이를 위해 회수한 세포를 이용하여 상기 <실시예 1-3>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. 이때 1차 항체로 항-β-액틴 항체, 항-adipophilin 항체 및 항-SREBP1C 항체를 이용하였다.

<실시예 1-5> 커큐민 유도체 및 TGF-β 수용체 억제제 병용투여 후 간세포의 섬유화 및 지방 합성과 분해 확인

간세포에 TGF-β로 섬유화를 유도하고, 커큐민 유도체 및 TGF-β 수용체 억제제를 병용투여한 후, 섬유화 및 지방 합성과 분해를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-1의 세포에 TGF-β 2 ng/ml를 투여한 후, 비히클(Veh), 1 μM 커큐민(Cur), 1 μM 커큐민5-8(Cur5-8), 0.5 μM EW-7197(EW0.5), 10 μM EW-7197(EW 또는 EW10), 1 μM 커큐민 및 0.5 μM EW-7197(EW0.5+Cur), 1 μM 커큐민 및 10 μM EW-7197(EW+Cur 또는 EW10+Cur), 1 μM 커큐민5-8 및 0.5 μM EW-7197(EW0.5+Cur5-8), 1 μM 커큐민5-8 및 10 μM EW-7197(EW+Cur5-8 또는 EW10+Cur5-8) 투여군으로 나누어 시료를 각각 투여하고 24시간 동안 배양하였다. 대조군(Con)은 TGF-β 및 시료를 모두 처리하지 않았다. 이후, 5 % CO₂, 37℃ 인큐베이터에서 배양한 세포를 현미경 관찰을 통해 상피간엽전환 여부를 확인하였고, BODIPY-지방산(BODIPY-Fatty acid) 용액(Sigma, 1 mg/mL의 스톡 DMSO 용액을 PBS 1X로 희석하여, 최종 농도 0.2 ㎍/mL를 얻었다.)을 투여하고 1시간 동안 배양하였다. PBS 1X로 세척 후, 염색된 세포를 관찰하였다.

또한, 간세포의 섬유화 정도를 확인하기 위하여, 상기 24시간 동안 배양한 세포를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정 후, α-SMA(SantaCruz, Dallas, Texas, USA), alexafluor 488 (Cell Signaling, Danvers, Massachusetts USA) 항체와 DAPI (abcam Cambridge, MA, USA) 를 사용하여 염색하였다. 마운팅(mounting) 용액(Fisher Scientific, Hampton, Rockingham, USA)으로 마운팅하고 제작이 완료된 샘플은 공초점 현미경을 이용하여 염색사진을 촬영하고, 염색된 사진에서 발색의 정도를 image J 프로그램으로 분석하였다.

또한, 간세포의 섬유화 정도를 확인하기 위하여, 상기 24시간 동안 배양한 세포를 회수하여 상기 <실시예 1-3>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 섬유화 마커로 α-SMA, 콜라겐 Ⅰ(Col1), p-SMAD2, p-SMAD3 단백질 발현을 웨스턴 블럿팅으로 확인하였다.

<실시예 1-6> 디하이드로진제론 유도체 및 TGF-β 수용체 억제제 병용투여 후 간세포의 섬유화 및 지방 합성과 분해 확인

간세포에 TGF-β로 섬유화를 유도하고, 커큐민 유도체로 디하이드로진제론 또는 이의 유도체 및 TGF-β 수용체 억제제를 병용투여한 후, 섬유화 및 지방 합성과 분해를 확인하였다. 또한, 상기 실시예 1-4의 커큐민 유도체 Cur5-8 및 TGF-β 수용체 억제제를 병용투여한 후, 섬유화 및 지방 합성과 분해를 재차 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-1의 세포에 TGF-β 2 ng/ml를 투여한 후, 비히클(Veh), 10 μM EW-7197(EW), 1 μM 커큐민 및 10 μM EW-7197(EW+Cur), 1 μM 커큐민5-8 및 10 μM EW-7197(EW+Cur5-8), 10 μM 디하이드로진제론(DHZ) 및 10 μM EW-7197(EW+DHZ), 10 μM 디하이드로진제론103(DHZ103) 및 10 μM EW-7197(EW+Z103), 10 μM 디하이드로진제론176(DHZ176) 및 10 μM EW-7197(EW+Z176) 투여군으로 나누어 시료를 각각 투여하고 24시간 동안 배양하였다. 대조군(Con)은 TGF-β 및 시료를 모두 처리하지 않았다. 이후, 5 % CO₂, 37℃ 인큐베이터에서 배양한 세포를 현미경 관찰을 통해 상피간엽전환 여부를 확인하였고, BODIPY-지방산(BODIPY-Fatty acid) 용액(Sigma, 1 mg/mL의 스톡 DMSO 용액을 PBS 1X로 희석하여, 최종 농도 0.2 ㎍/mL를 얻었다.)을 투여하고 1시간 동안 배양하였다. PBS 1X로 세척 후, 염색된 세포를 관찰하였다.

<실시예 2> 동물 실험

<실시예 2-1> 지방간염 동물 모델 제작, 및 커큐민 유도체 및 고농도 TGF-β 수용체 억제제 병용투여

8주령 수컷 20~25 g의 C57BL/6 쥐를 대한 바이오링크(충북)에서 구매하였다. 쥐는 실온 (25 ± 2℃), 60 ± 5 % 습도 및 12시간 명/암 주기 하에 일주일 동안 적응기간을 거쳤다. 쥐에게 일반 사료(Research Diets, RD)를 급여하였고, 물은 자유롭게 마시도록 하였다. 이후 쥐들을 급여하는 사료나 투여하는 약물에 따라 무작위로 5개의 그룹으로 나누었으며, 5개 그룹은 일반 사료를 급여하는 그룹(Con), MCD 사료(methionine-choline deficient diet)를 급여하는 그룹(MCD), MCD 사료에 커큐민5-8(사료 1 kg당 커큐민5-8 1 g)을 배합하여 급여하는 그룹(MCD+Cur5-8), MCD 사료를 급여하고 EW-7197을 경구투여하는 그룹(MCD+EW), 및 MCD 사료에 커큐민5-8을 배합한 사료를 급여하고 EW-7197을 함께 경구투여하는 그룹(MCD+EW+Cur5-8)이다(n=10).

EW-7197은 40 mg/kg으로 2일에 한 번씩 경구투여 방식으로 위에 직접적으로 투여하였다. 실험기간 동안 매주 몸무게를 측정하였고, 6주 후 간 조직을 적출하여 -80℃에서 보관하였다. 모든 실험은 연세대학교 원주 의과대학 동물실험 윤리 위원회의 승인을 받아 수행하였다(YWC-200907-1).

<실시예 2-2> 지방간염 동물 모델 제작, 및 커큐민 유도체 및 저농도 TGF-β 수용체 억제제 병용투여

상기 <실시예 2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 지방간염 동물 모델을 제작하고, 커큐민 유도체 및 EW-7197를 병용투여하되, EW-7197의 투여 농도를 5 mg/kg으로 하였다.

<실시예 2-3> 지방간염 동물 모델의 생리학적 변화 확인

커큐민 유도체(Cur5-8)와 TGF-β 수용체 억제제(EW-7197)의 병용 투여시 생리학적 변화를 확인하기 위해, 간 무게, 혈청 내 TG, TC, AST, ALT, γ-GT 농도를 측정하였다. 또한, 간 조직에서 섬유화 마커로 hydroxyprolin 발현을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 2-1 및 2-2에서 적출한 간 조직의 무게를 보관 전 측정하였다.

또한, 실시예 2-1 및 2-2에서 실험종료 후 채혈하고 혈청 내 TG, TC, AST, ALT, γ-GT 농도를 측정하였다. 혈당, 중성지방, 콜레스테롤, AST, ALT 농도 측정을 위해 Asan 사의 ELISA kti를 구매하여 측정하였다. 간 γ-GT의 경우 Sigma 사의 Mak089, hydroxyproline의 경우 Cell Biolabs 사의 STA-675 ELISA kit를 이용하여 측정하였다.

아울러, 상기 실시예 2-1 및 2-2에서 적출한 간 조직에서 hydroxyprolin 발현을 확인하였다.

<실시예 2-4> 지방간염 동물 모델의 간 조직 병변 관찰

커큐민 유도체(Cur5-8)와 TGF-β 수용체 억제제(EW-7197)의 병용 투여시 간 조직 내의 지방축적 및 간 조직의 섬유화 억제 효과를 확인하기 위해 간 조직 염색을 수행하였다.

상기 실시예 2-1 및 2-2에서 적출한 간 조직을 10 % 포름알데히드(Formaldehyde)로 고정시킨 다음 12시간 이상 흐르는 물에서 포름알데히드를 세척한 후 60 % 에탄올(Ethanol)에서 1 시간, 70% 에탄올에서 1시간, 100% 에탄올에서 1시간 간격으로 수세하였다. 그리고 자일렌(Xylene)에 1시간씩 3회의 투명과정과 파라핀에 1시간씩 2회의 침투과정을 실시하였다. 그 후 파라핀 블록을 약 4 ㎛ 두께로 잘라 절편을 얻었다. 절편은 탈파라핀화 한 후 헤마톡실린(Hematoxylin) 및 에오신(Eosin)으로 염색(H&E 염색)하고, 간 조직의 혈관 및 지질방울 등을 확인하였다.

상기 방법으로 간 조직 절편을 얻어 피크로시리우스 레드(Picrosirius red) 및 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 염색법을 통해 염색한 후, 400배의 배율을 가진 카메라가 달린 현미경(Pulnix, Sunnyvale, CA, USA)을 통해 혈관 주변 조직의 섬유화를 확인하였다.

또한, H&E 염색된 간 절편을 NAS(NAFLD acitivity score) 시스템으로 평가하였다. 이 시스템은 지방증의 정도 (0-3), 소엽의 염증 (0-3), 그리고 간세포의 팽창 (0-2)을 고려하였다. 이 점수의 합인 NAS 점수는 3점 미만은 정상, 5점 이상은 비알콜성 지방간염(NASH)으로 점수를 매겨 NAFLD의 심각성을 나타낸다.

<실시예 2-5> 지방간염 동물 모델의 간 조직 내 섬유화 및 지방 합성과 분해 확인

커큐민 유도체(Cur5-8)와 TGF-β 수용체 억제제(EW-7197)의 병용 투여시 간 조직 내의 지방축적 및 간 조직의 섬유화 억제 효과를 확인하기 위해 간 조직 내 섬유화 마커 및 지방 대사 조절 인자 및 이와 관련된 신호 인자의 발현을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 2-1에서 적출한 간 조직을 이용하여 상기 <실시예 1-3>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. 이때 간 조직 내 섬유화 마커로 α-SMA, Col1, Fibronectin, p-SMAD2, p-SMAD3 단백질 발현을 확인하기 위해, 1차 항체로 항-β-액틴 항체, 항-α-SMA 항체, 항-Col1 항체, 항-Fibronectin 항체, 항-p-SMAD2 항체, 항-p-SMAD3 항체를 사용하였다. 또한, 지방 대사 조절 인자 및 이와 관련된 신호 인자로 Rock1, p-AMPK, AMPK, SREBP1C 단백질 발현을 확인하기 위해, 1차 항체로 항-β-액틴 항체, 항-Rock1 항체, 항-p-AMPK 항체, 항-AMPK 항체, 항-SREBP1C 항체를 사용하였다.

<실시예 3> 통계분석

모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시되었다. 통계분석에는 일원 분산분석 및 다중 비교를 위한 Tukey의 사후 검정이 포함되었으며, SPSS Statistics 소프트웨어(version 20.0; IBM Corp, Armonk, NY, USA)를 사용하여 수행되었다. 통계적 유의성은 P＜0.05로 설정되었다.

<실험예 1> 마우스 간세포주 또는 인간 간선상세포주에서 커큐민 유도체 및 TGF-β 수용체 억제제의 병용투여 효과 확인

<실험예 1-1> 마우스 간세포주에서 TGF-β에 의한 섬유화 유도 시 커큐민 유도체가 세포에 미치는 영향 확인

상기 실시예 1-2에 기재된 방법으로 커큐민(CUR) 및 커큐민 유도체들(CUR5-8, CUR4-8, CUR5-14) 각각을 농도별로 TGF-β와 병용투여시 생존한 세포를 측정하였다.

그 결과, 도 1에서 나타낸 바와 같이, 0.1 μM, 1 μM 농도에서 가장 세포의 생존률이 높았고, 0.1 μM을 제외한 농도의 CUR4-8 처리군에서는 세포독성이 높게 나타남을 확인하였다.

<실험예 1-2> 마우스 간세포주 또는 인간 간선상세포주에서 TGF-β에 의한 섬유화 유도 시 TGF-β 수용체 억제제가 섬유화에 미치는 영향 확인

상기 실시예 1-3에 기재된 방법으로 TGF-β로 섬유화를 유도하고, TGF-β 수용체 억제제(EW-7197)를 처리한 후 섬유화 마커로 α-SMA, Col1, p-SMAD2, p-SMAD3 단백질 발현을 웨스턴 블럿팅으로 확인하였다.

그 결과, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, TGF-β에 의해 증가된 α-SMA, Col1, p-SMAD2, p-SMAD3 단백질 발현이 EW-7197 투여에 의해 억제되는 것을 확인하였다. 이를 통해 EW-7197 투여로 간섬유화가 억제되는 것을 알 수 있다.

<실험예 1-3> 마우스 간세포주에서 올레산에 의한 지방축적 유도 시 커큐민 유도체 또는 TGF-β 수용체 억제제가 지방 합성에 미치는 영향 확인

상기 실시예 1-4에 기재된 방법으로 올레산을 마우스 간세포주에 처리하고 이와 동시에 커큐민(Cur) 및 커큐민 유도체들(Cur5-8, Cur4-8, Cur5-14) 각각을 24시간 동안 처리한 후 BODIPY 염색법을 이용하여 지방을 염색하였다.

그 결과, 도 4 및 도 5에서 나타낸 바와 같이, 커큐민 유도체가 올레산에 의해 증가된 지방을 줄이며, 특히 Cur5-8이 가장 효과적으로 줄여주는 것을 확인하였다.

또한, 상기 실시예 1-4에 기재된 방법으로 올레산을 마우스 간세포주에 처리하고 이와 동시에 커큐민(Cur), 커큐민 유도체(Cur5-8), TGF-β 수용체 억제제(EW-7197) 각각을 24시간 동안 처리한 후 BODIPY 염색법을 이용하여 지방을 염색하였고, 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.

그 결과, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 커큐민 유도체(Cur5-8)가 올레산에 의해 증가된 지방을 줄이는 반면, TGF-β 수용체 억제제(EW-7197)는 올레산에 의한 지방 증가를 촉진하는 것을 확인하였다.

<실험예 1-4> 마우스 간세포주 또는 인간 간선상세포주에서 커큐민 유도체 및 TGF-β 수용체 억제제의 지방 축적 및 섬유화 억제 효과 확인

커큐민 유도체(Cur5-8)와 TGF-β 수용체 억제제(EW-7197)를 병용투여시 TGF-β에 의한 섬유화를 억제하고, 그로 인한 지방축적도 억제하는 상승효과를 확인하기 위하여 상기 실시예 1-5에 기재된 방법으로 세포 실험을 통해 간세포의 상피간엽전환 여부를 확인하고, BODIPY 염색 및 α-SMA 염색을 수행하였다. 또한, α-SMA, 콜라겐 Ⅰp-SMAD2, p-SMAD3 단백질 발현을 웨스턴 블럿팅으로 확인하였다.

그 결과, 도 8 내지 도 12에 나타낸 바와 같이, 간세포에 TGF-β 2 ng/ml를 24시간 동안 처리시 상피간엽전환으로 인해 간세포의 형태가 변화되고 α-SMA 염색 결과 간섬유화가 유도되는 것을 확인하였다(Veh군, 초록색). 커큐민 투여군(Cur) 및 커큐민 유도체 투여군(Cur5-8)도 TGF-β에 의한 상피간엽전환이 억제되지 않고 간섬유화가 유도되는 것을 확인하였다. EW-7197 투여군(EW)은 상피간엽전환 및 간섬유화가 억제되나, BODIPY 염색 결과 세포 내 지방이 축적되는 현상이 나타남을 확인하였다(빨간색). 반면, 커큐민 및 EW-7197 병용투여군(EW+Cur) 또는 커큐민 유도체 및 EW-7197 병용투여군(EW+Cur5-8)은 상피간엽전환 및 간섬유화가 억제되고, EW-7197에 의한 세포 내 지방생성도 억제되는 것을 확인하였다. 특히, EW+Cur 군보다 EW+Cur5-8 군에서 더 효과적으로 세포 내 지방생성을 억제하는 것을 확인하였다.

또한, 도 13 내지 도 15에 나타낸 바와 같이, 고농도(10 μM) EW-7197를 투여한 경우와 저농도(0.5 μM) EW-7197 투여한 경우 모두 커큐민 또는 커큐민 유도체를 병용 투여하였을 때 세포 내 지방생성이 억제되고 커큐민 유도체 병용투여군에서 더 효과적으로 세포 내 지방생성을 억제하는 것을 확인하였다.

<실험예 1-5> 마우스 간세포주에서 디하이드로진제론 유도체 및 TGF-β 수용체 억제제의 지방 축적 및 섬유화 억제 효과 확인

커큐민 유도체로 디하이드로진제론(DHZ) 또는 이의 유도체(DHZ103, DHZ176)와 TGF-β 수용체 억제제(EW-7197)를 병용투여시 TGF-β에 의한 섬유화를 억제하고, 그로 인한 지방축적도 억제하는 상승효과를 확인하기 위하여 실시예 1-6에 기재된 방법으로 세포 실험을 통해 간세포의 상피간엽전환 여부를 확인하고, BODIPY 염색 및 α-SMA 염색을 수행하였다.

그 결과, 도 16 내지 도 18에 나타낸 바와 같이, 간세포주에 TGF-β 2 ng/ml를 24시간 동안 처리시 상피간엽전환으로 인해 간세포의 형태가 변화되고 α-SMA 염색 결과 간섬유화가 유도되는 것을 확인하였다(Veh군, 초록색). 또한, EW-7197 투여군(EW)은 상피간엽전환 및 간섬유화가 억제되나, BODIPY 염색 결과 세포 내 지방이 축적되는 현상이 나타남을 확인하였다(빨간색). 반면, 커큐민 및 EW-7197 병용투여군(EW+Cur), Cur5-8 및 EW-7197 병용투여군(EW+Cur5-8)과 함께 디하이드로진제론 또는 이의 유도체 및 EW-7197 병용투여군(EW+DHZ, EW+Z103 및 EW+Z176)에서도 상피간엽전환 및 간섬유화가 억제되고, EW-7197에 의한 세포 내 지방생성도 억제되는 것을 확인하였다. 특히, EW+Cur 군보다 EW+DHZ, EW+Z103 및 EW+Z176 군에서 더 효과적으로 세포 내 지방생성을 억제하는 것을 확인하였다.

<실험예 2> 지방간염을 유도한 동물모델에서 커큐민 유도체 및 TGF-β 수용체 억제제의 간 섬유화 및 지방축적 억제 효과 확인

<실험예 2-1> 지방간염을 유도한 동물모델에서 커큐민 유도체 및 고농도 TGF-β 수용체 억제제의 간 섬유화 및 지방축적 억제 효과 확인

커큐민 유도체(Cur5-8)와 고농도 TGF-β 수용체 억제제(EW-7197)의 병용투여시 간 조직 섬유화 억제 및 간 조직 내 지방 축적 억제 효과를 확인하기 위해 상기 실시예 2-1에 기재된 방법으로 지방간염을 유도한 동물모델을 제작하고 커큐민 유도체(Cur5-8)와 고농도 TGF-β 수용체 억제제(40 mg/kg EW-7197)를 병용투여하였다. 이후 실시예 2-3에 기재된 방법으로 생리학적 변화를 확인하였고, 실시예 2-4에 기재된 방법으로 간 조직 병변을 관찰하였으며, 실시예 2-5에 기재된 방법으로 간 조직 내 섬유화 및 지방 합성과 분해를 확인하였다.

Group	BW ^a (g)	Liver weight/ *Body weight100(g)**	TG ^b (mg/dL)	TC ^c (mg/dL)	AST ^d (IU/L)	ALT ^e (IU/L)
Con ^f	27.5±1.87	4.9±0.27	76.8±11.3	124.1±8.91	40.4±7.16	36.6±2.38
MCD ^g	14.8±0.71^*	4.3±0.36^*	31.5±7.78^*	14.3±4.05^*	175.0±19.39^*	164.7±18.43^*
MCD+Cur5-8	15.6±0.74^*#	4.4±0.35^*	42.4±8.51^*	29.3±8.25^*	119.9±3.80	88.9±6.39^#
MCD+EW	15.2±0.83^*	4.2±0.39^*	30.8±4.54^*	18.5±3.13^*	91.2±13.84^#	68.4±4.17^#
MCD+EW+ Cur5-8	15.3±0.52^*#	4.5±0.37	38.6±5.63^*	20.7±2.28^*	89.4±11.87^#	86.1±10.54^#
BW^a, Body weight; TG^b, serum triglycerides; TC^c,serum total cholesterol; AST^d,aspartate transaminase; ALT^e,alanine transaminase; Con^f, regular diet; MCD^g, Methionine choline deficient diet

그 결과, 표 1 및 도 19 내지 도 24에 나타낸 바와 같이, C57BL/6 마우스에 MCD 먹이를 사료로 공급하는 경우 간 조직의 섬유화 병변이 발생하는 것을 확인하였다. MCD+Cur5-8 투여군은 간 조직의 섬유화가 개선되지 않았으나, MCD+EW 군 및 MCD+EW+Cur5-8 군에서는 간 조직의 섬유화가 억제되는 것을 확인하였다.

또한, C57BL/6 마우스에 MCD 먹이를 사료를 공급하는 경우 간 조직 내에 지방이 축적되는 것을 확인하였다. MCD+EW 군은 간 조직 내 지방축적이 억제되지 않았으나, MCD+Cur5-8 군과 MCD+EW+Cur5-8 군은 간 조직 내 지방축적이 감소하는 것을 확인하였다.

이로 인해 MCD+EW 군 및 MCD+Cur5-8 군에 비해 MCD+EW+Cur5-8 군에서 현저히 우수한 비알콜성 지방간염 개선 효과가 나타나는 것을 확인하였다.

<실험예 2-2> 지방간염을 유도한 동물모델에서 커큐민 유도체 및 저농도 TGF-β 수용체 억제제의 간 섬유화 및 지방축적 억제 효과 확인

커큐민 유도체(Cur5-8)와 저농도 TGF-β 수용체 억제제(EW-7197)의 병용투여시 간 조직 섬유화 억제 및 간 조직 내 지방 축적 억제 효과를 확인하기 위해 상기 실시예 2-2에 기재된 방법으로 지방간염을 유도한 동물모델을 제작하고 커큐민 유도체(Cur5-8)와 고농도 TGF-β 수용체 억제제(5 mg/kg EW-7197)를 병용투여하였다. 이후 실시예 2-3에 기재된 방법으로 생리학적 변화를 확인하였고, 실시예 2-4에 기재된 방법으로 간 조직 병변을 관찰하였으며, 실시예 2-5에 기재된 방법으로 간 조직 내 섬유화 및 지방 합성과 분해를 확인하였다.

Group	BW (g)	Liver weight/ *Body weight100(g)**	TG (mg/dL)	TC (mg/dL)	AST (IU/L)	ALT (IU/L)
MCD	14.9±0.44	4.2±0.13	52.4±11.66	8.6±1.01	168.9±28.37	113.0±18.73
MCD+EW 5	14.0±0.17	4.1±0.09	28.3±4.84	9.5±2.37	159.6±26.73	96.1±17.96
MCD+EW 5+Cur5-8	14.7±0.29	4.7±0.17^#	41.3±12.76	9.8±0.85	91.3±22.34^#	52.4±11.86^#

그 결과, 표 2 및 도 25 내지 도 28에 나타낸 바와 같이, 저농도 TGF-β 수용체 억제제를 병용투여한 경우에도 상기 <실험예 2-1>과 유사하게 간 조직의 섬유화가 억제되고, 지방축적이 감소하는 것을 확인하였다.

이로 인해 MCD+EW 군에 비해 MCD+EW+Cur5-8 군에서 현저히 우수한 비알콜성 지방간염 개선 효과가 나타나는 것을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에서 간세포에 TGF-β로 자극을 준 후 커큐민 유도체, 예컨대 커큐민5-8, 디하이드로진제론 또는 이의 유도체, 및 TGF-β 수용체 억제제, 예컨대 EW-7197 병용투여에 의한 변화를 확인하였다. 그 결과, TGF-β에 의한 세포 변형이 EW-7197에 의해 억제되었으며, 이때 증가하는 지방생성이 커큐민 유도체에 의해 억제되어, 이들을 병용 투여한 경우 각각을 단독으로 투여한 경우와 비교해서 지방간염 예방, 개선, 치료 효과가 현저히 우수한 것으로 나타나는바, 상기 커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 대사성 간질환 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는, 대사성 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 커큐민 유도체는 디메톡시커큐민 (demethoxycurcumin), 비스디메톡시커큐민 (bisdemethoxycurcumin), 5-하이드록시-1-(4-하이드록시-3-메톡시-페닐)-7-(4-니트로-페닐)-헵타-1,4,6-트리엔-3-온 (5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-7-(4-nitro-phenyl)-hepta-1,4,6-trien-3-one), N-{3-[(2E)-3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)프로프-2-에노일]페닐}-2-메틸프로판아미드 (N-{3-[(2E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)prop-2-enoyl]phenyl}-2-methylpropanamide), 4,4'-(3,5-피리딘에딜디-2,1-에티네딜)비스(2-메톡시페놀) (4,4'-(3,5-Pyridinediyldi-2,1-ethynediyl)bis(2-methoxyphenol)), 2,6-디클로로-N-{3-[(2E)-3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-2-프로페노일]페닐}벤즈아마이드) (2,6-Dichloro-N-{3-[(2E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenoyl]phenyl}benzamide), 디하이드로진제론 (dehydrozingerone, DHZ), 4-(3,4-디메톡시페닐)-3-부텐-2-온 (4-(3,4-Dimethoxyphenyl)-3-buten-2-one) 및 1-(4-클로로페닐)-3-페닐-1,3-프로판디온 (1-(4-Chlorophenyl)-3-phenyl-1,3-propanedione)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 1종 이상인, 대사성 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 TGF-β 수용체 AKL4(Activin receptor-like kinase 4) 또는 AKL5(Activin receptor-like kinase 5)를 억제하는, 대사성 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 TGF-β 수용체 억제제는 N-(2-플루오로페닐)-5-(6-메틸-2-피리디닐)-4-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘-6-일-1H-이미다졸-2-메탄아민, (N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine; EW-7197)인, 대사성 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 커큐민 유도체와 TGF-β 수용체 억제제의 몰비율은 1:15 내지 15:1인, 대사성 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 대사성 간질환은 지방간, 간섬유증 및 지방간염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 1종 이상인, 대사성 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 6항에 있어서,
상기 지방간염은 비알코올성 지방간염인, 대사성 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대사성 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 경구용 약학 제제에 포함되는 것인, 대사성 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 8항에 있어서,
상기 경구용 약학 제제는 정제, 과립제, 환제, 산제, 캠슐제 및 액제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상으로 제형화되는 것인, 대사성 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는, 대사성 간질환 예방 또는 치료용 의약외품.
제10항에 있어서,
상기 커큐민 유도체는 디메톡시커큐민 (demethoxycurcumin), 비스디메톡시커큐민 (bisdemethoxycurcumin), 5-하이드록시-1-(4-하이드록시-3-메톡시-페닐)-7-(4-니트로-페닐)-헵타-1,4,6-트리엔-3-온 (5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-7-(4-nitro-phenyl)-hepta-1,4,6-trien-3-one), N-{3-[(2E)-3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)프로프-2-에노일]페닐}-2-메틸프로판아미드 (N-{3-[(2E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)prop-2-enoyl]phenyl}-2-methylpropanamide), 4,4'-(3,5-피리딘에딜디-2,1-에티네딜)비스(2-메톡시페놀) (4,4'-(3,5-Pyridinediyldi-2,1-ethynediyl)bis(2-methoxyphenol)), 2,6-디클로로-N-{3-[(2E)-3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-2-프로페노일]페닐}벤즈아마이드) (2,6-Dichloro-N-{3-[(2E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenoyl]phenyl}benzamide), 디하이드로진제론 (dehydrozingerone, DHZ), 4-(3,4-디메톡시페닐)-3-부텐-2-온 (4-(3,4-Dimethoxyphenyl)-3-buten-2-one) 및 1-(4-클로로페닐)-3-페닐-1,3-프로판디온 (1-(4-Chlorophenyl)-3-phenyl-1,3-propanedione)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 1종 이상이고,
상기 TGF-β 수용체 억제제는 N-(2-플루오로페닐)-5-(6-메틸-2-피리디닐)-4-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘-6-일-1H-이미다졸-2-메탄아민 (N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine; EW-7197)인, 대사성 간질환 예방 또는 치료용 의약외품.
커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는, 대사성 간질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제12항에 있어서,
상기 커큐민 유도체는 디메톡시커큐민 (demethoxycurcumin), 비스디메톡시커큐민 (bisdemethoxycurcumin), 5-하이드록시-1-(4-하이드록시-3-메톡시-페닐)-7-(4-니트로-페닐)-헵타-1,4,6-트리엔-3-온 (5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-7-(4-nitro-phenyl)-hepta-1,4,6-trien-3-one), N-{3-[(2E)-3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)프로프-2-에노일]페닐}-2-메틸프로판아미드 (N-{3-[(2E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)prop-2-enoyl]phenyl}-2-methylpropanamide), 4,4'-(3,5-피리딘에딜디-2,1-에티네딜)비스(2-메톡시페놀) (4,4'-(3,5-Pyridinediyldi-2,1-ethynediyl)bis(2-methoxyphenol)), 2,6-디클로로-N-{3-[(2E)-3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-2-프로페노일]페닐}벤즈아마이드) (2,6-Dichloro-N-{3-[(2E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenoyl]phenyl}benzamide), 디하이드로진제론 (dehydrozingerone, DHZ), 4-(3,4-디메톡시페닐)-3-부텐-2-온 (4-(3,4-Dimethoxyphenyl)-3-buten-2-one) 및 1-(4-클로로페닐)-3-페닐-1,3-프로판디온 (1-(4-Chlorophenyl)-3-phenyl-1,3-propanedione)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 1종 이상이고,
상기 TGF-β 수용체 억제제는 N-(2-플루오로페닐)-5-(6-메틸-2-피리디닐)-4-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘-6-일-1H-이미다졸-2-메탄아민, (N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine; EW-7197)인, 대사성 간질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
커큐민 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 TGF-β 수용체 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는 제제를 복합, 혼합 또는 병용적으로 포함하는, 대사성 간질환 치료용 복합, 혼합 또는 병용제 키트.
제14항에 있어서,
상기 커큐민 유도체는 디메톡시커큐민 (demethoxycurcumin), 비스디메톡시커큐민 (bisdemethoxycurcumin), 5-하이드록시-1-(4-하이드록시-3-메톡시-페닐)-7-(4-니트로-페닐)-헵타-1,4,6-트리엔-3-온 (5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-7-(4-nitro-phenyl)-hepta-1,4,6-trien-3-one), N-{3-[(2E)-3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)프로프-2-에노일]페닐}-2-메틸프로판아미드 (N-{3-[(2E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)prop-2-enoyl]phenyl}-2-methylpropanamide), 4,4'-(3,5-피리딘에딜디-2,1-에티네딜)비스(2-메톡시페놀) (4,4'-(3,5-Pyridinediyldi-2,1-ethynediyl)bis(2-methoxyphenol)), 2,6-디클로로-N-{3-[(2E)-3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-2-프로페노일]페닐}벤즈아마이드) (2,6-Dichloro-N-{3-[(2E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenoyl]phenyl}benzamide), 디하이드로진제론 (dehydrozingerone, DHZ), 4-(3,4-디메톡시페닐)-3-부텐-2-온 (4-(3,4-Dimethoxyphenyl)-3-buten-2-one) 및 1-(4-클로로페닐)-3-페닐-1,3-프로판디온 (1-(4-Chlorophenyl)-3-phenyl-1,3-propanedione)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 1종 이상이고,
상기 TGF-β 수용체 억제제는 N-(2-플루오로페닐)-5-(6-메틸-2-피리디닐)-4-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘-6-일-1H-이미다졸-2-메탄아민 (N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine; EW-7197)인, 대사성 간질환 치료용 복합, 혼합 또는 병용제 키트.