JP5632054B2

JP5632054B2 - 免疫調節機能を有する多糖を主成分とする組成物

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Publication number: JP5632054B2
Application number: JP2013164478A
Authority: JP
Inventors: 田良二高; 本玲子山; 内隆章矢; 野知典金
Original assignee: Mercian Corp
Current assignee: Mercian Corp
Priority date: 2006-04-26
Filing date: 2013-08-07
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2027-04-20
Also published as: EP2017301B1; EP2017301A1; WO2007125823A1; US7879370B2; AU2007244497B2; PL2017301T3; NZ572501A; JP2014015616A; EP2017301A4; US20090220531A1; JPWO2007125823A1; AU2007244497A1

Description

本発明は、カシス果汁に含まれる多糖画分を特定の酵素で限定的に部分分解することによって得ることができる多糖を主成分とする新規組成物に関する。さらに本発明は、この組成物を含有する、抗腫瘍作用や抗アレルギー作用のような免疫調節効果を有する免疫調節剤、さらには、この組成物を含有する飲食品に関する。この組成物は、単位量あたりの免疫調節活性が従来のカシス果汁由来の多糖類と比較して非常に高く、かつ同時に非常に低粘性であるため製品製造上の取り扱いが容易である。

国際的な食と健康に関する関心の高まりはとどまるところを知らない。その高まりは食と免疫に関する領域にも及んでいる。いうまでもなく免疫機構の異常は花粉症のようなアレルギーや感染症、癌を始めとする現代の難病の原因となっている。現代日本においては、加えて、長引く不況により、不規則な生活習慣、食事の偏り、精神的ストレスなど、免疫機構にダメージを与える要因が氾濫している。一方では、食品（成分）によって、これら難病を予防することが可能となってきている。特に、少子化・高齢化が進む我が国では、将来的に医療費が国家予算を圧迫することが容易に予想され、予防医学の概念は益々重要性をおびてきている。

ところで、免疫応答は自然免疫と獲得（適応）免疫に大別される。前者の自然免疫は我々に生まれながらに備わった免疫系であり、その生体防御機構を担う細胞性因子の代表として、好中球、マクロファージ、樹状細胞などの食細胞があげられる。これらの細胞は、補体、レクチンなどの液性因子の助けをかりて微生物のような異物を認識し、速やかに取り込み、排除を行う。さらに、自然免疫は早期の感染防御のみならず、それに引き続く早期誘導反応や後期の獲得（適応）免疫の分化、すなわち、細胞性免疫／体液性免疫のバランスを方向づける重要な役割を担っている。

細胞性免疫は、細胞障害性 T 細胞（別名キラー T 細胞）やマクロファージなどが中心となって、主にウイルス感染やそれによって引き起こされる腫瘍などの細胞内感染防御に働き、体液性免疫は、B 細胞における IgG1 および IgE 抗体のクラススイッチを制御することにより、原虫・真菌・寄生虫・マイコプラズマ・肺炎球菌・大腸菌など主に細胞外で増殖する微生物に対する感染防御に働く。

細胞性免疫／体液性免疫はシーソー・バランスに例えられ、何らかの原因（内因性・外因性）によりそのバランスが崩れ、細胞性免疫の方に傾くと、インスリン依存性糖尿病や慢性関節性リュウマチのような自己免疫疾患に陥り、逆に体液性免疫の方に傾くと、様々のアレルギー疾患や癌を発病するようになるということが最近明らかとなってきた。すなわち、免疫機能のバランスを良好な状態に保つということは、身体の恒常性維持には欠かせないことである。

免疫機構のバランスを正常な状態に調節する飲食品の素材の由来は、キノコに代表される真菌類、酵母や乳酸菌、海草やハーブなどがある（非特許文献 1〜7 参照）。これらは、調節作用という意味から総称して生体応答調節物質（Biological Response Modifier [BRM]）と呼ばれている。

本発明者らは、消費者にとってより身近で手軽、安心感のある素材の一つである果実類に着目し、カシス果汁に含まれる多糖類を主成分とする画分が in vitro でマクロファージを活性化することを新たに見出した（特許文献１参照）。続いて、in vivo でのマウス抗腫瘍試験において高い抗腫瘍効果を発揮することを見出し、本多糖画分を cassis polysaccharide（CAPS）と命名した（非特許文献 8 参照）。

Medical mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 60, 258-274 (2002)) Antitumor activity and immune response of Mekabu fucoidan extracted from Sporophyll of Undaria pinnatifida. (In Vivo, 17, 245-250 (2003)) Antitumor potential of a polysaccharide-rich substance from the fruit juice of Morinda citrifolia (Noni) on Sarcoma 180 ascites tumour in mice. (Phytother. Res., 17, 1158-1164 (2003)) A polysaccharide, extract from Grifola frondosa, induces Th-1 dominant responses in carcinoma-bearing BALB/c mice. (Jpn. J. Pharmacol., 90, 357？360 (2002)) The anti-allergic effects of lactic acid bacteria are strain dependent and mediated by effects on both Th1/Th2 cytokine expression and balance. (Int. Arch. Allergy Immunol., 135, 205-215 (2004)) In vitro and in vivo anti-allergic activity of soy sauce. (Int. J. Mol. Med., 14, 879-884 (2004)) Clinical effects of Lactobacillus acidophilus strain L-92 on perennial allergic rhinitis: a double-blind, placebo-controlled study. (J. Dairy Sci., 88, 527-533 (2005)) Immunostimulatory Effects of a Polysaccharide-Rich Substance with Antitumor Activity Isolated from Black Currant (Ribes nigrum L.). (Biosci. Biotechnol. Biochem., 69 (11), 2042-2050 (2005))

特開 2004−107660 号公報

カシスは、和名を黒房すぐり、英名で black currant と呼ばれ、主に、北アメリカやヨーロッパ、最近ではニュージーランドでも広く栽培されている。また特に、酒類・製菓業界では非常に良く知られた素材である。

しかしながら、CAPS の原料であるカシス果汁は一般的な果実の果汁と比較して高価なものであるため、実際の製品化にあたってはコスト高になること、また、カシス果汁は粘性が高く取り扱い難いことが製品化への大きな障害となっていた。

そこで本発明の目的は、CAPSに類する優れた抗腫瘍効果等を有し、かつ粘性が低く、扱いが容易な、カシス果汁に由来する新規な素材をより安価に提供することにある。

すなわち、カシス果汁に由来する新規な物質であって、CAPSより高い生理活性を有する素材を提供することで、より安価に優れた生理活性を有する素材を提供することを本発明は目的とする。

さらに、本発明は、上記の優れた生理活性を有する新規な素材を利用した安価で安全な飲食品、特に健康飲食品を提供することを目的とする。

発明の開示
本発明者らは、上記課題を解決するため、種々検討した結果、CAPS の限定的かつ部分的な酵素分解によって生じる平均分子量が約10,000〜40,000を示す物質がCAPSより高い免疫調節効果を示すこと、および同時に粘性がCAPSより低下することを新たに発見し、これらを利用することで、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、以下のとおりである。
[１]下記（１）〜（３）の性質を有する多糖を主成分とする組成物。
（１）平均分子量が10,000〜40,000の範囲であり、
（２）中性糖としてラムノース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、キシロースおよびグルコースを含有し、
（３）分子量 1,000 以上の画分における（２）に記載の中性糖のモル比が 18：3：19：30：1：29 である。
[２]前記多糖が下記（４）の性質を有する[1]記載の組成物。
（４）水および 0〜20%（v/v）のエタノール水溶液に易溶である。
[３]前記多糖の平均分子量が約20,000である[1]または[2]記載の組成物。
[４]中性糖としてラムノース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、キシロースおよびグルコースのみを含有する[1]〜[3]のいずれかに記載の組成物。
[５]タンパク質とポリフェノール化合物をさらに含有する[1]〜[4]のいずれかに記載の組成物。
[６]カシス果汁またはカシス果汁から単離した多糖含有画分をβ−ガラクトシダーゼで部分消化することで得られる[1]〜[5]のいずれかに記載の組成物。
[７]カシス果汁またはカシス果汁から単離した多糖含有画分を、多糖の平均分子量が10,000〜40,000の範囲となるまでβ−ガラクトシダーゼで部分消化して多糖を主成分とする組成物を得る、多糖を主成分とする組成物の製造方法。
[８]多糖を主成分とする組成物が、[1]〜[5]のいずれかに記載の組成物である[7]に記載の製造方法。
[９][1]〜[6]のいずれかに記載の組成物、または[7]または[8]に記載の製造方法で得られる組成物を含有する免疫調節剤。
[１０]抗腫瘍作用および／または抗アレルギー作用を有する[9]に記載の免疫調節剤。
[１１]花粉症抑制作用を有する[9]または[10]に記載の免疫調節剤。
[１２][1]〜[6]のいずれかに記載の組成物、または[7]または[8]に記載の製造方法で得られる組成物を含有する飲料または食品。

本発明によれば、単離した CAPS やカシス果汁そのものから、単位量あたりの免疫調節効果がより高く、しかもより低粘性であり、最終製品製造工程での取り扱いが容易である多糖を主要成分とする新規組成物を提供することができる。この組成物は、従来の CAPS と比較してより高い免疫調節作用を示す。さらにこの組成物を有効成分とする抗腫瘍作用および抗アレルギー作用のような免疫調節効果を発揮する免疫調節剤および健康飲食品を提供することもできる。特に、この組成物を有効成分とする花粉症抑制作用を有する免疫調節剤および健康飲食品を提供することもできる。また本発明の組成物は、日常的に食されているカシス果汁からの調製物であるため、長期の連用においても人体に何等の悪影響は与えないものである。

さらに本発明によれば、カシス果汁そのものを直接的に酵素処理し、上記組成物を製造する方法も提供でき、この方法で得られるジュースの粘度は処理前後で非常に低下し製品製造工程でのジュースの取り扱いを容易できるという利点もある。

[多糖を主成分とする組成物およびその製造方法]
本発明の多糖を主成分とする組成物は、カシス果汁より単離した CAPS あるいはカシス果汁そのものを限定的かつ部分的に酵素分解することで得られる。

初めに、カシス果汁より単離した CAPS を用いての多糖含有組成の調製法について説明する。
カシス果汁からのCAPS調製は、特開 2004−107660 号公報（特許文献１）や非特許文献 8 に記載の方法に従って行うことができる。簡潔には、カシス果汁（カシス・ピューレの遠心上清）を陽イオン交換樹脂および陰イオン交換樹脂に通液することで各種のイオン性物質を除去する。次いで、C-18 逆相カラムに通液してポリフェノール化合物を除去する。得られた素通り画分を純水にて透析、凍結乾燥することで CAPS を得ることができる。

CAPSを限定的かつ部分的に分解するには、CAPSにβ−ガラクトシダーゼを添加する。β−ガラクトシダーゼの添加量は、反応液中の CAPS 濃度、pH、反応温度、反応時間、およびβ−ガラクトシダーゼの起源や精製度等を考慮して適宜決定できる。添加量が少なすぎると反応に時間がかかりすぎることがあり、場合によっては、途中で酵素が失活してしまって目的とする分子量をもった分解産物が得られないことがある。逆に多すぎると、反応が急速に進みすぎて適切な時点で反応を止めることが困難になり、また、製品製造におけるコスト・アップを招く場合がある。このようなことを考慮して、β−ガラクトシダーゼの添加量(範囲)は、β−ガラクトシダーゼが精製度合いの高い標品（試薬グレード）である場合は、例えば、0.01%〜1% (w/v)、好ましくは0.05%〜0.5% (w/v) 程度であることが適切である。また、β−ガラクトシダーゼの精製度合いが標品には劣る、例えば食品加工用酵素の場合は、例えば、0.2%〜2% (w/v) 程度であることが適切である。但し、上記β−ガラクトシダーゼの添加量(範囲)は、あくまでも例示であり、上記条件を考慮して適宜決定できる。

使用するβ−ガラクトシダーゼはアスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）由来のものが最も望ましい。但し、β−ガラクトシダーゼであれば、他の由来の物も同様に使用できる。他の由来のβ−ガラクトシダーゼの例としては、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、サッカロマイセス・フラギリス（Saccharomyces fragilis）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等由来のβ−ガラクトシダーゼが利用可能である。

酵素処理においては、分子量が約 1,000 以下の低分子の糖類（単糖〜オリゴ糖）側のピークは考慮せず、多糖側（MW>1,000）のピークが平均分子量約 10,000〜40,000の範囲にあるときに酵素反応を止めて、目的とする多糖を含有する組成物を得る。この際、例えば、反応を開始してから経時的に反応液の一部をサンプリングし、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によるゲルろ過で分析しながら反応停止の時期をモニタリングすることができる。なお、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）の検出器に示差屈折検出器を用い、基本的に、糖（単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）のみを検出する。酵素反応は、酵素の至適温度付近で(例えば、約50℃)で行うことができる。酵素反応の停止は、生成する多糖の熱安定性が高いので、酵素の失活を数分間、例えば 5〜10 分間煮沸することで行うこともできる。

酵素の失活後、必要に応じて精製して、多糖を主成分とする本発明の組成物を得ることができる。精製方法には特に制限されないが、例えば、煮沸により生じる少量の不溶沈殿物を、例えば遠心することで除去することがでる。さらに、不溶沈殿物を除去した後に、例えば分画分子量 1,000 の限外ろ過に供することで分子量 1,000 以下の低分子（単糖〜オリゴ糖）を除去することもできる。また、必要であれば、凍結乾燥することで乾燥物として多糖を主成分とする本発明の組成物を得ることもできる。

精製して最終的に得られた本発明の多糖(以下、本多糖ということがある)を主成分とする組成物に含まれる多糖の物理化学的性質は以下の（１）〜（４）に示す通りである。
（１）分子量：
平均分子量は約10,000〜40,000、好ましくは、約15,000〜25,000、より好ましくは約20,000である。平均分子量は、HPLC によるゲルろ過分析による。
（２）糖組成：
塩酸加水分解後、HPLC で中性糖組成を調べたところ、ラムノース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、キシロース、グルコースのみから構成されている。
（３）分子量 1,000 以上の画分におけるこれら中性糖ラムノース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、キシロースおよびグルコースのモル比が約18：3：19：30：1：29である。なお、分子量 1,000 以下の単糖〜オリゴ糖には in vitro でのアッセイ系において生理活性（TNF-α のようなサイトカイン誘導活性）はみられない。
（４）溶解性：
水および 0〜20%（v/v）エタノール水溶液に容易である。

さらに、本発明の組成物に含まれる多糖は、さらに以下の（５）および（６）の物理化学的性質も有することができる。
（５）熱安定性：
100℃、10 分間の加熱処理を行った結果、本多糖の生理活性（マクロファージからのサイトカイン誘導活性）は失活しなかった。
（６）呈色反応：
本多糖は、フェノール硫酸法およびカルバゾール硫酸法による呈色反応が陽性であった。

さらに、上記多糖を主成分として含む本発明の組成物は、以下の（７）〜（９）の物理化学的性質も有することができる。
（７）赤外線吸収スペクトル：
精製・凍結乾燥した本多糖（MW>1,000）の赤外線吸収スペクトルのチャートを図１に示す。1,000 cm^-1付近で最大吸収が見られた。
（８）吸収スペクトル：
本多糖（80 μg/ml の濃度で純水に溶解）の吸収スペクトルのチャートを図２に示す。194 nm に最大吸収が見られた。
（９）物質の色：
本多糖を純水で透析後に凍結乾燥したところ、淡い褐色であった。

精製して得られる本発明の多糖を主成分とする組成物に含まれる多糖の含有量は、例えば、50〜95質量%の範囲、好ましくは60〜95質量%の範囲、より好ましくは80〜95質量%の範囲である。

さらに、本発明の組成物は、多糖以外にタンパク質とポリフェノール化合物をさらに含有する。タンパク質とポリフェノール化合物の含有量は、それぞれ0〜5質量%の範囲および5〜45質量%の範囲である。

次に、カシス果汁から直接的に、上記多糖を主成分とする組成物を調製する方法について説明する。
使用するカシス果汁は、カシス果実組成物をすべて含有するピューレでも、遠心操作などの前処理によって主には果皮や種などに由来する不溶成分を予め除去した、いわゆる果汁であっても良い。

使用する酵素は、前記と同様にアスペルギラス・オリザエ(Aspergillus oryzae)由来のβ−ガラクトシダーゼが最も望ましい。但し、前記と同様にその他のβ−ガラクトシダーゼも使用することはできる。β−ガラクトシダーゼの添加量は、前記CAPSの限定的かつ部分的分解の場合と同様の点を考慮して適宜決定できる。例えば、β−ガラクトシダーゼが精製度合いの高い標品（試薬グレード）である場合は、例えば、0.01%〜1% (w/v)、好ましくは0.05%〜0.5% (w/v) 程度が適切である。また、β−ガラクトシダーゼの精製度合いが標品には劣る、例えば食品加工用酵素の場合は、0.2%〜2% (w/v) 程度であることが適切である。

カシスの風味を損なわないためには、酵素処理・失活・殺菌条件はできるだけ穏和な条件下での反応が望ましい。例えば酵素処理は生理的条件に近い 40 ℃ 前後で反応させることができる。カシス果汁の pH が約2.9 と非常に低いため、反応温度は、単離あるいは部分精製したCAPSの酵素分解に比べて、低い温度で行うことが好ましい。酵素反応を開始してから経時的に反応液の一部をサンプリングし、検出器に示差屈折検出器を用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によるゲルろ過で分析しながら反応停止の時期を決定することができる。分子量が約 1,000 以下の低分子の糖類（単糖〜オリゴ糖）側のピークは考慮せず、多糖側（MW>1,000）のピークが平均分子量約 20,000 を示した時点で失活操作により反応を止める。カシスの pH は 2.9 と非常に低いため、70 ℃ 前後で数分間保持するだけで酵素は失活する。この操作は殺菌も兼ねることができる。

以上の操作により、カシス果汁から、上記多糖を主成分とする組成物を得ることができる。この酵素処理によって、カシス果汁の粘性は酵素処理前後で、分解の程度にもよるが、約 1/5 にまで低下する。従って、生成物は非常に取り扱いやすい物性を有するようになる。

カシス果汁から得られる本発明の多糖を主成分とする組成物に含まれる多糖の含有量は 50〜95質量%の範囲である。

さらに、カシス果汁から得られる本発明の組成物は、多糖以外にタンパク質とポリフェノール化合物をさらに含有する。タンパク質とポリフェノール化合物の含有量は、それぞれ0〜5質量%の範囲および5〜45質量%の範囲である。

[免疫調節剤および飲食品]
本発明は、上記本発明の多糖を主成分とする組成物を含有する免疫調節剤および飲食品も包含する。カシスの果実に含まれる多糖類（主成分： CAPS）より新たに生成した多糖成分を含有する組成物は、抗腫瘍作用、抗アレルギー作用等をともなう免疫調節効果を発揮する。特に本発明の上記組成物は、花粉症抑制作用を有し、免疫調節剤として使用できる。本発明の上記組成物が、ヒトスギ花粉症諸症状の抑制作用を有することは、後述の実施例で具体的に示されている。

上記免疫調節剤は、カシス果汁由来の多糖(CAPS)を含有する組成物に、各種素材を混合したものを、噴霧乾燥法または凍結乾燥法により水分を除去し、得られた乾燥粉末を賦形剤と物理的に混合し、造粒して、粉末または顆粒状の組成物を調製することができる。上記各種素材としては、例えば、甘味料、着色料、保存安定剤、酸化防止剤、酸味料、香料、苦味料、香辛料、調味料等を用いることができる。また、賦形剤としては、例えば、乳糖、結晶セルロース、澱粉（デキストリン）、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル等を用いることができる。

本発明の免疫調節剤は、一般には、経口投与され、投与量は患者の症状、年齢、体重等に基づいて医師の処方に従って決定される。投与量の一般的な範囲は、例えば、０．１ｇ〜１００ｇである。投与は1回または複数回に分けて行うことができる。

さらに、上記本発明の多糖を主成分とする組成物を含有する飲食品も、免疫力を調節するために用いられることができる。

本発明の上記飲食品は、免疫力を調節するために用いられ、「免疫力を調節するために用いられる旨の表示」を付した飲食品であることもできる。ここで、「表示」とは、例えば、飲食品の容器や取扱い説明書における表示のみならず、紙媒体上及びウエブ上に掲載された飲食品についての広告文や音声による広告等も包含する。

また、「表示を付した飲食品」とは、飲食品の容器や取扱い説明書に表示を付した飲食品のみならず、容器や取扱い説明書に表示を付していなくても、この飲食品の紙媒体上及びウエブ上に掲載されたこの飲食品についての広告文や音声による広告等により、同様の表示をしている場合も含む。表示には、例えば、「虚弱体質の人に」、「滋養強壮に」、「体質改善に」、「風邪をひきやすい人に」、「季節に敏感な人に」、「春先に敏感な人に」、「肌が敏感な人に」、「受験の時期に」、「体調維持に」など、免疫力を調節する効果を謳ったものが含まれる。

本発明の飲食品は、上記の免疫調節効果を有する本発明の組成物を定法に従って飲食品に配合したものであり、それを摂取する対象は、ヒトに限定するものでなく、イヌ、ネコをはじめとするペットやあらゆる動物にも適応される。すなわち、本発明において、飲食品には動物用の飼料も包含する。

本発明の飲食品としては、上記の免疫力改善・強化等を含む免疫調節を目的として、カシスの果実から調製した有効成分を混合して調製される。食品の形態としては、固形食品、クリーム状などの半流動食品、ゲル状食品、飲料等のあらゆる形態が可能である。または、粉状、顆粒状、カプセル状、タブレット状、液状等の形態でも良い。

カシスの果実から調製した有効成分とともに飲食品に配合される各種成分は、特に制限はなく、通常使用される各種成分がいずれも使用可能である。このような成分としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、ラクトース、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、アミノ酸類、色素、香料、保存料等が挙げられる。

本発明にかかる食品の具体例としては、清涼飲料、ジュース、ジャム、菓子類、乳製品等が挙げられる。カシスの果実から調製した有効成分の含有量は、0.01〜100 mg/gの範囲が適当であるが、この範囲よりも多量に配合しても問題はない。

次に実施例を記載して本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１：単離した CAPS からの本発明の組成物の調製
CAPS の単離は基本的には特許文献１と非特許文献 8 に従って行った。以下、調製法を簡潔に記す。カシス・ピューレを遠心して得られるカシス果汁を陽イオン交換樹脂（アンバーライト IR 120B H AG [オルガノ社製]）と陰イオン交換樹脂（IRA 410 OH AG [オルガノ社製]）を等量ずつ詰めた混床カラムに流速 SV 4 で通液し、素通り画分を回収した。得られた画分を、Sep-Pak C18 Vac 35 ml（ミリポア社製）に通液することでポリフェノール化合物を固相樹脂に吸着させ、非吸着画分を回収した。得られた画分を 4 ℃ にて、脱イオン水で透析した。その後、凍結乾燥することで CAPS を得た。なお、特許文献１では、CAPSをエタノール沈殿で多糖Aと多糖Bに分画しているが、本発明でCAPSと称しているのは、多糖Aと多糖Bの混合物である。

このようにして得た CAPS を 4 mg/ml（フェノール硫酸法にて測定）となるよう phosphate-buffered saline（PBS；リン酸緩衝生理食塩水 [pH7.4]，ディフコ社製）に溶解した。1 N 塩酸にて pH 5.5 に調整、これに β−ガラクトシダーゼ（シグマ社製，Aspergillus oryzae 由来）を 0.1 w/v % (8 units/ml) となるよう添加、50 ℃ にてインキュベート、経時的にサンプリング、10 分間煮沸することで酵素を失活させた。各サンプルの遠心上清を HPLC によるゲルろ過分析に供し、多糖画分（MW>1,000）の平均分子量が約 20,000 である本発明の多糖を含有する組成物のサンプルを同定した。

分析カラムは Shodex OHpak SB-804（排除限界： MW 1,000,000）、平衡化バッファーには PBS を使用し、分析時の流速は 1 ml/min、検出器には示差屈折検出器（RID）を用いた。なお、分子量マーカーには T-2000（MW 2,000,000），T-500（MW 473,000），T-70（MW 67,200），T-40（MW 43,000），T-10（MW 10,000）[以上、ファルマシア社製]，マルトヘキサオース（MW 991）スクロース（MW 342），グルコース（MW 180）を使用した。

また、このとき得られた多糖（平均分子量約 20,000）の一部を分画分子量 1,000 の限外ろ過に供し、分子量 1,000 以下の低分子（単糖〜オリゴ糖）を除去・洗浄後、中性糖の組成分析を行った。

さらに、本多糖を 4 mg/ml となるよう PBS に溶解、添加するエタノール濃度を変化させることで活性画分の挙動を調べた。すなわち、エタノールを種々の濃度となるよう添加、遠心（15,000 rpm，10 分間）により上清画分と沈殿画分に分離し、沈殿画分には元の容量となるよう PBSを加え懸濁した。上清画分は遠心エバポレーターでエタノールを蒸発させた後、同様に元の容量となるよう PBS を添加した。各エタノール濃度における上清画分と沈殿画分の TNF-α（主にマクロファージから放出されるサイトカインの一種）誘導活性を測定した。また同時に、それぞれの画分を HPLC によるゲルろ過分析に供した。

TNF-α 誘導活性の測定法は以下の通りである。アッセイにはマウス・マクロファージ様セルライン RAW 264 を使用（1×10⁵ cells/ml, 100 μl，37 ℃，5 % CO₂下で培養）した。培養液にそれぞれの画分が 40 倍希釈となるよう添加し、一夜培養後の上清中に存在する TNF-α を、ELISA 定量キット(Quantikine mouse TNF-α，R&D システムズ社製)を用い、添付されたマニュアルに従って測定した。

0（未消化；予め失活させた酵素を規定量添加後さらに 10 分間煮沸処理），3，8，35 時間後の分析サンプルのクロマトグラムを検量線とともに図３に示す。35 時間後のサンプルは酵素によって完全消化されたものである。3，8，35 時間後の生成多糖の平均分子量はそれぞれ 55,000、19,000、2400 であった。すなわち、8 時間消化のサンプル中に多糖が生成されていた。この多糖を含む生成物から分子量 1,000 以下の低分子（単糖〜オリゴ糖）を除去して得られた画分は、中性糖としてラムノース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、キシロース、グルコースのみから構成されており、構成モル比は 18：3：19：30：1：29であった。

エタノール水溶液中における活性画分の挙動を図４に示す。エタノール濃度が 30% 以上になると上清中に存在するTNF-α 誘導活性は急激に減少していった。エタノール濃度が 40% 以上になると、上清中に存在する活性はほぼ消失した。HPLC 分析の結果、エタノール濃度が 70% 以上になると上清中に存在する多糖類はほぼ検出されなくなったが、活性が完全に沈殿画分に移行したというわけではなかった。

実施例２：カシス・ピューレ（ジュース）からの本発明の組成物の調製
カシス・ピューレ（SVZ 社製）を様々の酵素濃度と温度の下でインキュベートした。酵素はスミラクト L （β−ガラクトシダーゼ主体の食品用酵素剤、Aspergillus oryzae 由来、新日本化学工業社製）を使用した。経時的に少量をサンプリング、10 分間煮沸することで酵素を失活させた。遠心（15,000 rpm, 10 分間）上清を HPLC によるゲルろ過分析と粘度測定に供した。ゲルろ過での分析条件は実施例１と同様である。なお、粘度計は VISCOMATE（model VM-1G-L，山一電機社製）を使用した。

結果を表に示す。Aspergillus oryzae 由来のβ−ガラクトシダーゼの至適温度は一般的には 55 ℃ 付近と言われているが、カシス（pH 2.9）に関しては 40 ℃ 前後での反応が最適であることが明らかとなった。このことにより、穏和な条件下でカシスの風味を損なうことなく、ピューレ中に本多糖を生成することが可能となった。また、本酵素製剤（10,000 U/g）は、1% (w/v) 程度での使用が実用的であることが示唆された。これらの条件下で4〜6 時間反応を行うと、ピューレに含まれる CAPS の平均分子量は約 20,000 前後にまで減少した。すなわち本多糖の生成を意味した。さらに、粘性は約1/5 にまで低下したことで非常に扱いやすい物性となった。

例として、1% (w/v)，40 ℃ で 6 時間反応させた場合と、未処理ピューレのゲルろ過クロマトグラムを図５に示す。

ところで、カシス・ピューレの低い pH にも関わらず、例えば、1% (w/v)、40℃の条件下で反応させた場合、24 時間後にはピューレ中の CAPS は、平均分子量6,600まで分解されていた。したがって、次に本酵素の失活条件を検討することとした。

0.9% (w/v)、42 ℃、5 時間の反応条件でカシス・ピューレを処理後、少量をサンプリング、10 分間煮沸、遠心上清を回収し「反応 5 時間後サンプル」とした。同時に別にサンプリング、少量ずつ 4 等分し、それぞれ 42（陽性対照）、70、75、80℃のウオーターバス中で10 分間インキュベートした。その後、上記4等分したそれぞれのサンプルを再び 42℃のウオーターバスに戻し、さらに19 時間インキュベートした（反応開始からトータルで 24 時間）。その後、煮沸、遠心し、上清を分析に供した。

HPLC によるゲルろ過分析の結果、カシス・ピューレ中では、少なくとも70℃以上であれば、10分間保温することで、酵素活性を問題の無いレベルにまで失活させることができることが明らかとなった。なお、この失活操作は殺菌も兼ねることが可能であった。

実施例２の結果、非常に温和な酵素反応条件、なおかつ比較的温和な失活・殺菌条件によって風味を損なうことなく、ピューレから本発明の多糖を主成分とする組成物を得ることが可能となった。

実施例３：サイトカイン誘導活性の測定
実施例1と同様の方法で得たCAPSを3 mg/ml（フェノール硫酸法での測定値）となるよう 50mM 酢酸ナトリウム（pH 5.5）に溶解した。これにスミラクト Lを 4 mg/ml となるよう添加し、50℃ で 1 時間反応させた。100℃、3分煮沸することで酵素を失活させ、遠心（12000 rpm, 3 min）し、上清を得た。得られた上清に含まれる多糖の平均分子量は約30,000〜31,000と推定される。

上記上清をマウス腹腔マクロファージ培養液に 50 倍希釈となるよう添加した。腹腔マクロファージの調製は定法に従った。具体的には、チオグリコレート培地を ICR マウスに腹腔内注射し、4 日後に腹腔マクロファージを回収し、最終的に 96 穴プレートに 1×10⁶ cells/ml となるよう分注して下記試験に用いた。

一夜培養後のマクロファージ培養液中に存在する TNF-α を、ELISA 定量キット(Quantikine mouse TNF-α，R&D システムズ社製)を用い、添付されたマニュアルに従って測定した。

結果を図６に示す。CAPS をβ−ガラクトシダーゼで処理して得られる本発明の組成物は、in vitro においては、CAPSに比べて10 倍近く高いサイトカイン誘導活性を有することが分かる。

実施例４：マウスを用いた抗腫瘍活性の測定
実施例１で得られた本発明の多糖を主成分とする組成物、平均分子量が異なる数種類の CAPS 分解産物の in vivo での抗腫瘍活性を比較した。

実験動物は、日本エスエルシー社より4 週齢で購入した雌性 ICR 系マウス（SPF）を8 日間予備飼育して実験に供した。マウスは予備飼育期間および実験期間を通して室温 24±3 ℃、相対湿度55±15% のSPF動物飼育室（照明時間 8〜18時、換気回数 18 回/時）で飼育した。マウスは5 匹/ケージとし、給水ビンにて滅菌蒸留水を、またマウス用給餌器にて固形飼料（MF、オリエンタル酵母）をそれぞれ自由に与えた。また、マウスの個体識別は色素（ピクリン酸溶液）塗布法を用いた。

マウスに移植する腫瘍細胞としては、Ehrlich 腫瘍細胞株を ICR 系マウスで継代維持（腹水型）したものを使用した。腹水型で継代維持したマウスの腹水を採取した後、滅菌生理食塩液で希釈し 8×10⁶細胞/ml濃度の腫瘍細胞浮遊液を作製した。この細胞浮遊液の 0.25 ml をマウスの鼠径部皮下に移植した（2×10⁶細胞/マウス）。なお、腫瘍細胞移植日を day 0 とした。

以下、投与サンプルの調製と投与量について記す。
実施例１で得られた本多糖の他、平均分子量が異なる数種類の CAPS 分解産物と未消化の CAPS を PBS にてそれぞれ 500 倍に希釈（多糖濃度：各 8 μg/ml）したものを投与サンプルとした。また、コントロール群には PBS を投与した。投与方法は強制経口投与（10 ml/kg）とした。

以下、投与スケジュールについて記す。
腫瘍細胞を移植した日を day 0とし、投与（1 群 10 匹）は day −6から day 14 まで毎日一回強制経口投与を行った。最終日（day 14）にマウスを解剖して腫瘍を摘出した後、重量を電子天秤にて測定した。

摘出腫瘍の重量を測定した結果を図７に示す。平均分子量が約 20,000 である本多糖のみが有意差をもって腫瘍の増殖を抑制する効果を示した。その前後での抗腫瘍活性は低かった。

実施例５：マウス抗アレルギー試験
実施例１で得られた本多糖を主成分とする組成物の抗アレルギー作用について測定した。なお、試験系としては卵白アルブミンで誘発したマウス・アレルギーモデルを使用した。

実験動物は、日本チャールスリバー社より6 週齢で購入した BALB/c 系雄性マウス (SPF) 93匹を 1 日予備飼育して実験に供した。マウスは予備飼育期間および実験期間を通して室温 24±3 ℃、相対湿度 55±15% の SPF バリア飼育室（照明時間 7〜19 時、換気回数 18 回/時）で飼育した。マウスは 5 匹/ケージとし、滅菌蒸留水を給水瓶にて、またマウス用固形飼料（MF、オリエンタル酵母工業）を給餌器にて、それぞれ自由に与えた。なお、マウスの個体識別はピクリン酸を被毛に塗布した。

以下、投与サンプルの調製と投与量について記す。
投与サンプルの調製は実施例１に記載した方法に従った。本実施例で用いた投与サンプルの平均分子量は、それぞれ MW 59,000，MW 24,000，MM 3,500 であった。未消化 CAPS も含め、投与サンプルは、部分分解反応液をそれぞれ 10 倍に希釈（多糖濃度： 400 μg/ml）したものを投与サンプルとした。投与方法は強制経口投与（10 ml/kg）とした。なお、陽性対照としてシクロフォスファミド（30 mg/kg，3 mg/ml，0.5% CMC 懸濁）を用いた。

以下、投与スケジュールについて記す。
上記投与サンプルを day 15から day 21（初回免疫日を day 0 とする）の毎日、マウス用経口ゾンデを用いて強制経口投与した。投与容量はマウスの体重 10 g当り 0.1 mlとした。

以下、感作抗原の調製について記す。
感作抗原として卵白アルブミン（OVA，生化学工業社製）を使用した。１次免疫用として OVA を適当量秤量し生理食塩液に溶解させて66 μg/ml の溶液を作製した。この OVA 溶液 10 mlと水酸化アルミニウムゲル（Al(OH)₃，13 mg/ml，シグマ社製 A8222）10 mlを氷冷下で充分に混合し、OVA およびAl(OH)₃濃度としてそれぞれ 33 μg/ml および 6.5 mg/ml の懸濁液を作製した。また、2 次免疫用として OVA を適当量秤量し生理食塩液に溶解して 25 mg/ml の溶液を作製した。

以下、アレルギーの誘発方法について記す。
1 次免疫用抗原の 0.3 mlを day 0 および day 4 の 2 回、6 週齢のマウスに腹腔内投与した。また、2 次免疫用抗原液を遠心管に入れマウスの鼻を 3 秒間浸漬することにより経鼻感作を行った。経鼻感作は day 9〜13 の間、 1 日 3 回実施した。

以下、群構成について記す。
day 14 に採血の血漿 OVA 特異的 IgE レベルの値が群間に差がないようにして表２に示すとおりの群を構成した。1 群あたりの動物数は、1 群 6〜12 匹（OVA-IgE の測定結果による）とした。

以下、検査項目について記す。
体重は day 0、day 7、day 14 および day 22 に体重計にて測定した。一般症状は day 0 よりday 22 まで、毎日観察した。血漿の分析は day 0、day 14、day 18 および day 22 に眼静脈から採血した血液の遠心後の血漿をそれぞれ用いて、OVA 特異的 IgE レベルの測定を行った。

以下、OVA 特異的 IgE の定量法について記す。
OVA のビオチン化：
OVA(生化学工業社製)のビオチン化は、Immunoprobe Biotinylation Kit(Sigma-Aldrich社製, BK-101)を用いて行った。
方法は、使用書に従った。

ELISAによるマウス血漿中の OVA 特異的 IgE 抗体の検出:
OVA-IgE のタイターを測定するために以下のような ELISA による検出系を確立した。
Goat anti-mouse IgE 抗体(ベッチル社製)をPBSで10μg/mlに希釈してマイクロプレート(ヌンク社製)に100μl/wellずつ添加し、4℃で一晩静置した。IgE抗体をコートしたマイクロプレートをPBSで3回洗浄後、0.5％Casein-PBS溶液を200μl/well添加して室温で3時間静置し、ブロッキングを行った。さらに3回PBSで、マイクロプレートを洗浄し、0.5％Casein-PBSで20倍に希釈したマウス血漿サンプルを各ウェルに100μl添加して4℃、一晩静置して反応させた。PBSで4回洗浄した後、Caseinで希釈した(10μg/ml)ビオチン化OVAを各ウェルに添加し、室温で2時間反応した。PBSで5回洗浄した後、Caseinで希釈した(0.5μg/ml)Streptavidin-Peroxidaseシグマ社製, S-5512)を100μl添加して室温で1時間静置した。さらに0.1％ Tween-PBSで5回洗浄して発色液(ABTS Peroxidase Substrate System, カペル社製)を100μl添加した。室温で1から3時間静置してマイクロプレートリーダーで波長405nmおよび波長492nmにおける吸光度を測定し、前者の値から後者の値を引いた値を求めた。OVA特異的IgE値は、血漿中OVA特異的IgE値が高値を示した個体の血漿を−80℃で保存し、それをポジティブコントロールとし希釈系列をつくり検量線を引き、それに対する相対活性で表した。

最終日（day 22）に採血した血液（血漿）中の OVA 特異的 IgE レベルの測定結果を図８に示す。平均分子量が約20,000 の CAPS 分解産物、すなわち、本多糖のみが IgE 上昇を抑制する傾向を示した。

次に、体重の推移を図９に示す。強力な免疫抑制剤の一種であるシクロフォスファミドの投与は副作用としてマウスの体重減少を引き起こしたが、本多糖は何ら影響を及ぼさなかった。これらの結果から、本多糖の高い安全性も明らかとなった。

実施例６：ヒト花粉症介入試験
本発明のカシス果汁由来の多糖を主成分とする組成物のヒトスギ花粉症諸症状の抑制効果並びに安全性について検討した。
試験は被験品群に対してプラセボ群を対照とした二重盲験群間比較試験であり、以下にその試験方法を記した。

スギ花粉特異的 IgE (FEIA法)が陽性者で、過去2年間の通年性アレルギー鼻炎の重症度が軽症〜重症の症状を有する20〜65歳の男女28名に対して、スギ花粉飛散約4週間前から飛散開始後4週間の計8週間、実施例の被験品6個（カシス果汁由来の多糖として約 360mg）とプラセボ6個を毎日摂取させた。

ここで、スギ花粉の飛散量は、2月下旬より増加し始め、第5週から第6週目（2006年3月8日〜3月14日）でピークにさしかかる。試験品摂取前、摂取4週後と8週後に試験責任医師による問診、所見（下鼻甲介粘膜の腫脹）と採血を行った。また、試験品摂取開始前及び終了後に日本アレルギー性鼻炎標準調査票を用いた自覚症状に関するQOL調査を実施した。採血時に総蛋白、アルブミン、アルカリフォスファターゼ(ALP)、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ(GOT)、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(GPT)、乳酸脱水素酵素(LDH)、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ(γ-GTP)、コリンエルテラーゼ、総ビリルビン(T-BIL)、直接ビリルビン(D-BIL)、間接ビルビリン(I-BIL)、クレアチンフォスフォキナーゼ(CPK)、総コレステロール、中性脂肪、尿素窒素、クレアチン、尿酸、特異的 IgE 抗体（抗原：スギ）の各項目について検査した。

以下、被験品の製造方法を示す。
実施例２に示したように、カシス・ピューレに酵素処理（スミラクトL 10,000 U/gを終濃度で0.9% [w/v]添加し、42℃にて 5 時間反応）を施した後、70℃にて 10分間酵素を失活させた。次いで、遠心により上清を回収し、得られた本発明の多糖(CAPS)を主成分とする上清にデキストリンを添加し、凍結乾燥を行った。さらに、この乾燥物（デキストリン含有量49.2% [w/w] ）を粉砕し、粉末香料カシスミクロン M-10759（高砂香料工業製）を0.6% [w/w]となるように添加して混合し、打錠末を得た。この打錠末を用いて打錠を行い、１粒あたり2gのチュアブルタブレットを得た。

被験品と外観の区別のできないプラセボの製造方法を以下に示した。
デキストリン 800g、グラニュー粉糖 108g、無水クエン酸 50g、サンレッドNo.5 36g（三栄源エフ・エフ・アイ製）、カシスミクロン（高砂香料工業製） 6g を添加して混合し、打錠末を得た。この打錠末を用いて打錠を行い、１粒あたり2gのチュアブルタブレットを得た。

被験品群とプラセボ群それぞれ 14 名、計 28 名の被験者を組み入れ、安全性評価には全症例を対象とした。

一方、有効性評価に関しては、試験品摂取前のIgE抗体検査（RAST値）によるクラス1〜5 の被験者から、被験品群で試験品の未完食が全摂取日数の10%に達した摂取率違反と評価に影響を及ぼす可能性がある薬剤を連用した併用薬違反の計4例を本試験からの逸脱とした。また、プラセボ群では中止、摂取率違反と併用薬違反の計4例を本試験からの逸脱とし解析対象から除外し、最終的に被験品群 10 例とプラセボ群 9 例で解析を行った。

有効性の評価の結果を以下に示した。
１）医師所見（下鼻甲介粘膜の腫脹）
試験品摂取前、4週後と8週後に下鼻甲介粘膜の腫脹の程度をスコア化し、被験品群とプラセボ群について、時期ごとに平均値±標準偏差を算出した。各群内で、試験品摂取前、4週後と8週後の時期ごとにスコアの変化を比較したところ、プラセボ群では有意にスコアの悪化を認めた（p<0.05）のに比し、被験品群での変化は有意ではなかった（図10）。また、試験品摂取前に対する8週後の変化を被験品群とプラセボ群について群間比較したところ、有意差はないものの（被験品群 vs プラセボ群、p=0.0572）、プラセボ群に比し被験品群で低く、被験品の摂取により症状が抑制される傾向が認められた。

２）特異的 IgE 抗体検査（抗原：スギ）
試験品摂取前、4週後と8週後に特異的 IgE 抗体価を測定し、被験品群とプラセボ群で抗体価の平均値を比較したところ、試験品摂取前、4週後と8週後の抗体価は、被験品群及びプラセボ群に差は認められなかった。

３）QOL調査（日本アレルギー性鼻炎標準調査票）
試験品摂取開始前及び終了後に実施したQOL調査において、被験品群とプラセボ群での鼻・眼に関する項目について、それぞれの程度をスコア化し、時期ごとに平均値±標準偏差を算出し、群間あるいは群内で比較した。被験品群とプラセボ群における試験品摂取開始前及び終了後の各項目のスコアを時期ごとに群間比較したところ、8週後の「目のかゆみ」において両群間に有意差が認められ(p<0.05)、被験品群での症状低減が認められた。被験品群とプラセボ群における試験品摂取前に対する8週後のスコアの変化を群間比較したところ、「くしゃみ」と「涙目」において被験品群の変化はプラセボ群に比し小さい傾向が認められ(p=0.0809、p=0.0563)、「目のかゆみ」においては有意に低下していた(p<0.05)(図11)。以上の結果より、プラセボ群では被験品群より花粉による「くしゃみ」、「目のかゆみ」、「涙目」の悪化を自覚していた。

安全性の評価
本試験においては、被験品に起因すると考えられる副作用及び臨床検査値の異常変動は認められず、安全性に問題はないものと考えられた。

本発明のカシス果汁由来の多糖(CAPS)を主成分とする組成物は、スギ花粉症の主症状である「目のかゆみ」を改善または予防する効果があるとともに、鼻症状の下鼻甲介粘膜の腫脹と「くしゃみ」や目症状の「涙目」では改善する傾向が認められた。よって、アレルギー症状を有するスギ花粉症の諸症状の緩和に対して効果が期待できることが示唆された。さらに、副作用は認められないことより安心して長期間摂取することができる。

本発明のカシス果汁に含まれる多糖画分を特定の酵素で限定的に部分分解することによって得ることができる多糖を主成分とする本発明の新規組成物は、飲食品及び医薬品の分野で有用である。

本発明の組成物の赤外線吸収スペクトルを示す。本発明の組成物の吸収スペクトルを示す。本発明の組成物に含まれる多糖のゲルろ過クロマトグラムを検量線図とともに示す。本発明の組成物に含まれる多糖のエタノール水溶液中での活性の挙動を示す。実施例２における酵素処理前後のカシス・ピューレのゲルろ過クロマトグラムを示す。実施例３におけるサイトカイン誘導活性の測定結果を示す。実施例４における本発明の組成物のマウス抗腫瘍作用を示す。実施例５における本発明の組成物の抗アレルギー効果を示す。実施例５における抗アレルギー試験において本発明の組成物を投与したマウスの体重推移を示す。実施例６における花粉症ヒト介入試験において試験食品摂取前後の医師鼻腔腫脹所見スコアの変動を示す。実施例６における花粉症ヒト介入試験において試験食品摂取前後の各症状に関するQOLスコアの変動を示す。

Claims

カシス果汁またはカシス果汁から単離した多糖含有画分をβ−ガラクトシダーゼで部分消化することで得られる平均分子量10,000〜40,000の多糖を含有する、免疫調節活性を有するカシス由来の多糖含有組成物。
サイトカイン誘導活性を有する、請求項１に記載の組成物。
前記多糖が、中性糖としてラムノース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、キシロースおよびグルコースを含有する、請求項１または２に記載の組成物。
タンパク質とポリフェノール化合物をさらに含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
カシス果汁またはカシス果汁から単離した多糖含有画分を、多糖の平均分子量が10,000〜40,000の範囲となるまでβ−ガラクトシダーゼで部分消化することを含んでなる、カシス由来の多糖含有組成物の製造方法。
多糖含有組成物が請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物である、請求項５に記載の製造方法。
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物を含有する、免疫調節剤。
抗腫瘍作用および／または抗アレルギー作用を有する、請求項７に記載の免疫調節剤。
花粉症抑制作用を有する、請求項７または８に記載の免疫調節剤。
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物を含有する、飲料または食品。