JPH02255094A - コレステロール吸着物質およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明はコレステロール吸着物質およびその製造方法に
関し、更に詳しくはマンノース、グルコス、ガラクトー
ス、アラビノースおよびウロン酸からなる酸性多糖であ
って、抗変異原性、マイトジェン活性等の生理活性を有
するコレステロル吸着活性物質および、ロードコツカス
に属する微生物を用いるその製造方法に関する。

［従来の技術］ コレステロールは卵・肉・魚・我等広範囲の動物性食品
に含まれる物質でこれらの食品を摂食することにより消
化吸収されてヒトの体内では血液、筋肉、皮膚、脳、神
経系、結合組織等に広く分布することとなる。コレステ
ロールは一方では生体組織たとえば細胞膜、血漿リポタ
ンパク質、ミニリン等の構成成分として、またステロイ
ドホルモンの前駆体として必須な有用物質である反面、
食餌性コレステロールの過剰摂取が家族性高コレスチロ
ール血症や心筋梗塞、脳梗塞等の動脈硬化性疾患の原因
となることは周知のことである。これらの疾患は食習慣
の相異から欧米にくらべるとわが国の方が少ないとされ
ていたが、近年わが国の食生活の欧米化に伴いこれら疾
患の増加傾向か国民保健上の重大問題となってきている
。

人体内でのコレステロール低下剤の研究は数多くたとえ
ば遠藤らによるコレステロール合成阻害剤　ＭＬ−２３
６８（Ｊ、　　八ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、２９．１３４
６（１９７６）、特開昭５Ｌ−１５１８９Ｏｒコレステ
ロール低下剤の製造方法及び量刑を含有する飲食物」）
等がある。

これらの研究・発明は体内での生理作用による血中コレ
ステロール量の低下を目的とするものであって、薬理効
果のある物質の摂取を手段とするものであり血中コレス
テロールの適圧なコントロルのためには医薬品と同様な
健康管理体制の中で使用されるべきものである。なお最
近食品加工技術の進展に伴い、いわゆる疑似食品として
「カニアシ」　１人エイクラ」等の食品が作られるよう
になり、これらはその素材を例えば動物性素材から植物
性に切り替えることにより本来の自然食品が高コレステ
ロール食品であっても、低又は無コレステロール化する
ことは出来るようになってきた。

しかしこれらはあくまで「にせもの」であり、食文化の
向上に伴うコレステロール摂取増加とは異質の流れであ
って、低コレステロールでかつ高嗜好（いわゆるグルメ
指向）食生活の要請に応えるものではない。

一方コレスチロールは空気中で自動酸化しなり、腸内細
菌の作用をうけて様々な酸化分解物となる。

それらは、膜の内部の疎水性の破壊、酵素の不活性等に
影響を及ぼすと見出されている。その例として核毒性を
持ツ４−　Ｃｈ０１ｅＳｔｅ４１ｅ−３−Ｏｎｅ、細胞
毒性を持ツｃｈｏｌｅｓｔｅｎｅ−３β、５α、６β−
ｔｒｉｏｌ、変異原であるｃｈｏｌｅｓｔｅｎｅ−５ａ
　、６　ａ　−ｅｐｏｘｉｄｅが知られており、結腸癌
や大腸癌の一つとされている。

またコレステロール熱分解物の変巽原性も報告されてい
る。このようにコレステロールには、二面性があるか、
最近、日本人の血漿コレステロール濃度の上昇が顕著と
なり、それによる成人病の多発が懸念されている。

血漿コレステロールの降下作用を示すものに食物繊維が
あり、その具体例としてペクチンやグアカムが挙げられ
る。その作用機作は腸管内における食餌性コレステロー
ルや胆汁酸の吸収を阻害すること、及び腸肝循環してい
る中性ステロールや胆汁酸の再吸収を抑制する事による
とされている。またアスパラギン酸のような酸性多糖は
イオン交換能を有することから血中Ｎ　ａ／に比を改善
し血圧の低下に関与するとされ注目されている。この他
、微生物の産生ずる多糖、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ　ｐ
ｏｌｙｌｌｘａ　　Ｎｏ、２７１の生産する多糖（Ｇｌ
ｃ：Ｍａｎ：Ｇａｌ：ＧｃｔｌＡ＝３＋３：１　：２）
にも血清、肝臓コレステロールの上昇抑制効果が認めら
れている。菌体外産生の多糖においては、最近研究が進
められておりＬａｃｔｏ−ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈｅｌｖ
ｅｔｉｃｕｓ　ｖａｒ、ｊｕｒｔｉの産生する中性多糖
（Ｇｌｃ：Ｇａ１＝２：１）にＥｈｒｌｉｃｈｉ腹水癌
、　５ａｒｃｏｒａａ−１８０（腹水型）、及びＥＣ（
固型）に対する宿主延命効果、化学発癌剤（２Ｏ−Ｈｅ
ｔｈｖｌｃｈｏｌａｎｔｈｒｅｎｅ）による発癌の遅延
、インフルエンサウイルス、感染防御、潰瘍細胞障害性
マクロファージを誘導すると報告されている。ＰＳｅｕ
ｄＯｌｌｏｎａＳ　ｈｙｄｒｏ−ｏｅｎｏｖｏｒａから
は、抗タバコモザイクウィルス、抗癌活性を持つ多１！
　（Ｇａｌ：Ｇｌｃ：Ｍａｎ：Ｒｈａよりなる）か分離
されている。またＢ、　ｌｏｎｇｕｌＮｏ、２１由来の
酸性多糖（Ｇｌｃ、Ｇｕｌ、Ｇａ１Ｕ＾及び未確認糖）
が５ａｒｃｏｌＩａ−１８０（腹水癌）に対し、抑制効
果を示すとされている。

このような背景の中で本発明者らは、コレステロルを多
量に含む食品・飼料の低コレステロール化およびこれら
食品・飼料を摂食した場合のコレステロールの消化・吸
収を抑制する手段を提供することを目的として、先に、
「コレステロール吸着物質の製造方法」を発明出願した
（出願番号６２−３２５５１５）。この先の発明は、ロ
ードコツカスに属する微生物を用いることを特徴とする
点においては、本発明の製造方法と共通であるが、得ら
れるコレステロール吸着物質の分子量は、３０万以下の
物質を主とする製造方法であった。

［発明か解決しようとしているＢＢコ 本発明の目的は、本発明者らの先の出願発明により得ら
れたコレステロール吸着物質と同様の性質および効能を
有する物質を更に検索し、より容易な製造方法を提供す
るとともに、コレステロル吸着活性のみならず、マイト
ジェン活性等の生理活性を有する単一で組成・構造の明
らかなるコレステロール吸着物質を提供しようとするも
のである。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、ロードコツカスに属する微生物の培養液
中の分子量１００万以上の分画に、構成糖が、マンノー
ズ、グルコース、ガラクトース、アラビノースおよびウ
ロン酸からなる酸性多糖を見い出し、これを分子量的に
単一な物質として単離して、その構成糖であるマンノー
ス、グルコースがラクトース、アラビノースおよびウロ
ン酸の組成比か、およそ３６：１７　ニア：１：１２で
ある事を見い出して本発明を完成した。

本発明に用いられる微生物は、ロードコツカスに属する
微生物が用いられるが、中でもロードコツカス・ブロン
キアリス（＾ＴＣＣ２５５９２＞が、本発明のコレステ
ロール吸着物質を大量に生産する。

本発明のコレステロール吸着物質は、ロードコツカスの
培養液にコレステロールを添加・振盪しその上澄を酸性
にすることにより沈澱物として分取することが出来る。

この沈澱物は、ゲル沢過クロマトクラフィーにより分画
した後乾燥物とし、乾燥物を酢酸エチルで処理すること
によりコレステロールを除去して、コレステロールの吸
着していない酸性多糖として取り出すことが出来る。さ
らにこの酸性多糖をゲル濾過クロマトグラフィーに分画
することにより分子量的に単一な物質として単離するこ
とが出来る。

し実施例コ 以下実施例に従って本発明を具体的に説明するが、本発
明の技術的範囲をこれら実施例に限定するものでないこ
とは言うまでもない。

例−１ ０−ドコツカス・ブロンキアリス（＾ＴＣＣ２５５９２
）の保存株を表−１に示ず組成の斜面培地に１白金耳塗
抹し３７°Ｃで４８時間静置培養し、その３白金耳を表
−２に示す組成の種培養用培地２００　ｌｉｌ入り１１
容工ルレンマイヤーフラスコ２本に、各々植え継ぎ、３
７℃で４８時間ロータリーシェーカー（２，４０ｒｐｍ
で振盪培養し種菌とした。この種菌４００１を予め３０
．０容ジャーファーメンタ−中１２０℃で１５分間滅菌
し、３７℃まで冷却しておいた表−２に示す組成の培地
１７．１１に植菌し、培養温度３７℃撹拌数３３０ｒｐ
Ｉ１１、通気量０．５ｖｖｎ　、圧力０．５ｋｇ／ｃｄ
で１０日間培養した。

上記培養液１．Ｉｌから遠心分離ＩＩ　（８，０ＯＯＸ
！；１．２０分間）で菌体と不溶のままのコレステロー
ルを除去後、分離液を東洋濾紙Ｎｏ、　２で濾過した。

ｒ液を１ＮＨＣＪＩにてｐ１１３に調整し、析出した沈
澱物を遠心分離機　（８，０００ｘｇ、２０分間）で採
取し、１０　ｍＭリン酸緩衝液に溶解して凍結乾燥後、
Ｂｉｏａｅｌ　Ｉ）−１５０（日本バイオ・ラットラボ
ラトリーズ（株）社製）のカラム（２，４ｃｍφｘ６５
ａｎ）を用い１０　ｍＭリン酸緩衝液３００　ｍｌ、　
２０ｍ１　／　ｈの流速で溶出させるゲル濾過カラムク
ロマトグラフィーにて分画した。その溶出パターンは、
図−１に示す様であり、溶出画分の濁度及び着色度を示
す０Ｄ２１５ｎｎ依存の２つのピークについてコレステ
ロール含量をモノテスト（ベーリンガー・マンハイム社
製コレステロル測定試薬）を用い０Ｄ５４６ｎＩ１１を
測定したところピク１のフラクションにコレステロール
の存在か認められた６次にそのフラクションを透析、凍
結乾燥し酢酸エチル３０ｍ１で５回繰り返してコレステ
ロールを溶解除去し残った沈澱を０．１Ｍ炭酸アンモニ
ウム溶液にて溶解させた後トヨパールＩＩＷ５５Ｆ（東
洋曹達工業（株）社製）のカラム（２，４ａｎφＸ６５
ｃｍ）を用い、０．１Ｍ炭酸アンモニウム溶液２２５ｍ
１を用い２０ｍ１／ｈの流速で溶出させるゲル濾過カラ
ムクロマトグラフィーにかけたところ、図−２に示ず様
な、単一ピークを得た。得られたピーク部分を透析、凍
結乾燥し７０■のコレステロール吸着物質を得た。

表−１ 酵母エキス　　　５ｇ ８Ｎ、ＮＯ，Ｉ Ｋ　　２ｔｌＰｏ　　、０．２５ Ｎ（ｌｓＯ４・７１１２０　　　０．２５ＦｅＳＱ、　
　−７Ｈ２００，００１ 寒天　　　　　　１５ （総量１ｆＪとしＩ）１１７調整） 表−２ 酵母エキス　　　５ ＮＨ，Ｎｏ、　　　　　　Ｉ Ｋ　、　ＨＰＯ４０，２５ ＨｇＳｏ＜　・７１１２ｏ　、　　０．２５ＦｅＳＯ＜
　　７Ｈ２００，００１ コレステロール　１ （総量１．０としｐＨ７に調整） 例−２ 例−１で得られたコレステロール吸着物質５■を緩衝液
Ａ（ｐＨ８，３，０，０２５８Ｔｒｉｓ、０．１９２Ｎ
グリシン０．１％ドデシル硫酸ナトリウム　（以下５Ｏ
３））　１０ｃｎｌに溶解し、この溶液１０μ（をＳＤ
Ｓスラブゲル電気泳動装置（ゲルサイズ１３ｃｍ　Ｘ　
１３ｃｍ　Ｘ　０．１　ａｍ　）にて、緩衝液へを用い
、１００Ｖ　１５ｔｎ＾で１時間展開した結果、単一ス
ポットが得られ分子量的に単一な物質を単離したことを
確認した。

例−３ 例−１で得られたコレステロール吸着物質３０■を水３
ｍ１に溶解し、トヨパール６５Ｆ（東洋曹達工業（株）
社製）カラム（２，４ａｎφｘ７０ｃｍ）で、展開剤０
．１Ｍ重炭酸アンモニウム溶液１２５ｍ１を２０ｍ１／
ｈで溶出させ、図−３に示すようなゲルが過クロマトグ
ラムが得られ素通り画分にコレステロール吸着物質か認
められたことから分子量は、１００万以上と推定した。

例−４ 例−１で得られたコレステロール吸着物質１０μｇを含
む試料を、０゜１Ｎ硫酸で８０℃、１時間加熱した後そ
の試料液０．２ｍｌを共栓試験管にとり、これにメタ過
ヨウ素酸ナトリウム０．２８を９１リン酸に溶かした試
薬０．１　ｍｌ加えて充分混ぜたのち室温で２０分間放
置した。次に亜ヒ酸ナトリウムを０．５Ｈ硫酸ナトリウ
ムに１０％溶かした試薬１ｍｌを加えて黄褐色の色がな
くなるまで激しく振り混ぜた。

つぎに２−チオバルビッール酸を０．５８硫酸ナトリウ
ムに０．６％溶かした試薬３ｍｌを加え激しく振り混ぜ
たのち、沸騰水浴中で正確に１５分間加熱し流水で５分
間冷やした。シクロへキサノン４［ｎｌを加えて激しく
振り混ぜたのち、軽く遠心分離した。シクロヘキサノン
層を分取し、５４９ｒ＋ｎ＋の吸光度を測定した結果、
シアル酸の存在は認められなかった。

更に、水冷した硫酸（０，０２５ＨｂｏｒａＸ）　５　
ｍｌを試験管にとり、例−１で得られたコレステロール
吸着物質２００Ｊｌをその上に静かに加えた。室温以上
の温度にならないように水冷しながら混和した。

キャップをして沸騰湯浴中に１０分間保った。水冷して
室温とし、カルバゾール液０．２ｍｌを加えて混和、沸
騰湯浴中に１５分間保ち発色させた。室温まで水冷して
５３０ｎｌで、比色定量した結果、コレステロール吸着
物質中のウロン酸含量は、１６％であった。

例−５ 例−１で得られたコレステロール吸着物質２■を２６Ｎ
硫酸１．５ｍｌに溶かし１６時間放置し、蒸溜水１７．
５ｍｌを加え沸騰水浴上で５時間還流加熱しな。

これを室温まで冷却し、水酸化バリウムで中和後、桐山
ロート用Ｐ紙Ｎｏ４にて減圧濾過した。この炉液にミオ
イノシトール溶液（９５，８ｍｌ　／１０　ｍｌ　）　
Ｏ１１５ｍｌ加え、過剰の水素化ホウ素ナトリウムを添
加し１６時間放置後、酢酸１ｍｌを加え減圧乾固した。

これに１０％酢酸含有メタノール２０ｍ１を加えて減圧
乾固を行い更にこの操作を３回施した後、メタノール５
ｍｌを加え減圧乾固を５回繰り返し、ＤＯＷＥＸ　５０
■−×８でイオン交換し、再び減圧乾固を５回繰り返し
完全に脱水した。

これに酢酸エチル、無水トリフルオロ酢酸０．５＋ｎｌ
ずつ加え、ドライヤーで５分間加熱して１時間室温に放
置後、１μｐを日立０２３型ガスクロマトグラフイー（
シングルカラムＦＩＤ付）を用い、カラムは、０Ｖ１０
５　２％ｏｎ　Ｕｎｉｐｏｒｅ　ＨＰ、カラム温度は分
析温度１３０℃一定、再生温度２３０℃で分析した。

その結果マンノース：グルコース：ガラクトス：アラビ
ノースの組成比がおよそ３６：１７：７：１であった。

例−６ 例−１で得られたコレステロール吸着物質１６ｎ＋ｇを
０２０１０１１に溶かし、核磁気共鳴分析装置ＪＥＯＬ
　ＪＮＨ−ＦＸ２００本電子（株）社製）で測定した結
果は、図−４に示すようである。アノマー水素を示すケ
ミカル・シフトが５ｐｐｎに数個出ていることより、多
種のグリコシド結合の存在が示唆された。

例−７ コレステロール１００■を２２５℃で１２時間加熱後６
倍容量のエタノールを加え、６．０ＯＯＸ（＋で２０分
間遠心分離し″（得た沈澱４０■を、例−１で得られた
吸着物質０．１．２ｒａｔｒの水溶液２０ｍ１に添加し
、３７°Ｃで２４時振盪後、３，０ＯＯｒｐ和で２０分
間遠心分離し、沈澱を得た。これらの沈澱から酢酸エチ
ル５ｍｌで未吸着コレステロール酸化物を３回繰り返し
抽出・除去した後、乾固した。これら乾燥物を２５％Ｔ
ｖｒｅｅｎ８０／アセトン１ｍｌに溶かし滅菌水４ｍｌ
を加えた後、これらの溶液を０．３ｍｌずツＴｏｐ　Ａ
ｇａｒに混和しＡｍａｓＴｅＳｔを行った。

その結果、例−１で得られたコレステロール吸着物質０
■のコロニー数を１００％とすると、１■、２■の場合
それぞれ６４％、３２％でありコロニーの減少がみられ
た。

上記の変異原であるコレステロール酸化物に対しても、
例−１で得られたコレステロール吸着物質に吸着活性が
確認された。

例−８ マウスの腹腔内に、例−１で得られたコレステロール吸
着物質（０，９■／ｍ１）を０．５ｍｌ注射し４日間放
置後、ハサミでマウスの首を切断して血液を洗い流した
。表−３に示したＲＰ旧　（０，℃）を６　ｍｌ腹腔内
に注入後、よくマツサージし溶液を回収した。この溶液
を１１０００ｒｐ　、１０分間遠心後、上清を除去しＲ
Ｐ旧（０℃）を５ｍｌ加えパスツールピペットで＠濁す
ることを２回繰り返し行った。表３に示したＦＯＲ−Ｒ
Ｒ旧の１０％液で１５０万ｃｅｌｌｓ／ｍｌとし、２０
０μｊずつ９６穴プレートに分注して、３７℃、５％Ｃ
Ｏ□濃度で４８時間培養して牌臓細胞を分取し、９６穴
Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｗｉｔｈ　Ｆｌａｔ　
Ｂｏｔｔｏｎ　ｗｅｌｌｓ（Ｃ０ＡＳＴ＾Ｒ社製）に各
式に５０万Ｃｅ１ｌｓずつ分注した。この際、表−３に
示したようなＦＯＲ−ＲＰ旧の５％液を用い、容量は各
ｗｅｌｌ当り０．２０ｍ１であった。

このプレートを３７℃、５％ＣＯ２濃度で４８時間培養
後、［３Ｈ］チミジン溶液１０μＪ　　（０，５μＣａ
）を入れ、さらに１６時間同条件下で培養した。その後
ＬＡＢＯＨＡＳｌｌ　　（ラボサイエンス社製）で水を
用いフィルター（ＬＨ−１０１−１０）に叶Ａを回収し
た。フィルターを乾燥後、ミニバイアルに入れ、シンチ
ラント（ＰＯＰＯＰ　０．１０ｇ、　ＤＰＯ４ｇ／　）
ｂエア１１）を３ｍｌ加え、１分間をＬＳＣ−７５１（
アロカ社製）でカウントした。その結果は図−５に示し
たようで、例１で得られたコレステロール吸着物質の注
入量に伴って細胞増殖の増加が見られたことから、この
物質はマイトジェンであると認められた。

表−３ ＰＨＩ ＲＰ旧　１６４０　　培地（日永製薬）１，０％ＮａＣ
０１０，２５％ Ｌ　ｇｌｕｔａｎ＋ｉｎｅ　　　　　　　０．０２５％
ｔｌｅｐｅｓ　　　　　　　　　　　　　　０．５７　
　％Ｐｅｎ１ｃｉｌｉｎｅ　Ｇ　　　　　　　１０万ｕ
旧ｔ／Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎｅ　　　　　　　　　　
　　５０　　ｍｌ力価／上記ＲＰＮＩにＦｅ２　（牛胎
児血清）を混和したものをＦｅ２−ＲＰＭＩ培地とした ［発明の効果］ 本発明のコレステロール吸着物質は、コレステロールを
吸着することにより食品からコレステロール取をコント
ロールすることを可能とするものである。またコレステ
ロール酸化物のような細胞毒、変異原性を有する物質も
吸着するので生理活性物質としての効果が期待される。

すなわち、本発明のコレステロール吸着物質は実施例の
、例−７に見られるように変異原性を有するコレステロ
ール酸化物に対しても吸着活性を示し、その効果として
ａｌｎｅｓ　Ｔｅ５ｔにおいて抗変異原性活性が認めら
れた。また、例−８に示されるようにマウスの牌臓細胞
を用いたテストで明らかなマイトジェン活性を示した。

以」Ｌのように本発明は、食餌におけるけるコレステロ
ール摂取のコントロール及びマイトジェン活性に見られ
る生理活性を有する新規な物質その製造方法を提供する
ものである。

【図面の簡単な説明】 図−１は、例−１のＢｉｏｇｅｌ　Ｐ−１５０によるゲ
ルか過クロマトクラフィーの図である。実線は２１５ｎ
ｎの吸光度、破線は、モノテストによるコレステロル定
量時の５４６ｒ＋ｎ＋の吸光度を表わした。 図−２は、例−１のトヨパール１ｌＬ５５Ｆ、図−３は
、例−３のトヨパール６５−Ｆによるゲル濾過クロマト
グラフィーの図である。縦軸はフェノール硫酸法による
糖の定藍時の４９０ｒ＋ｍにおける吸光度である。 図−４は、例−６のプロトン核磁気共鳴スペクトルの図
である。図−５は、例−８のマイトジェン活性の図であ
る。 手続補正書 自 発 平成１年９月二〇日

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の性状を有することを特徴とするコレステロー
   ル吸着物質。 ［１］構成糖が　マンノース、グルコース、ガラクトー
   ス、アラビノースおよびウロン酸からなる酸性多糖であ
   ること。 ［２］ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が１０
   ０万以上であること。 ［３］マンノース：グルコース：ガラクトース：アラビ
   ノースの組成比が、およそ３６：１７：７：１であるこ
   と。 ［４］硫酸カルバゾール法によるウロン酸の組成比が１
   ０％以上２０％以下であること。 ［５］構成糖の結合が、複数の形式のグリコシド結合か
   ら成っていること。
2. （２）ロードコッカスに属する微生物を用いることを特
   徴とする請求項（１）のコレステロール吸着物質の製造
   方法。