KR20230084943A - 락토바실러스 사케이 ny518 균주를 이용하여 제조된 올리고당을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 - Google Patents
락토바실러스 사케이 ny518 균주를 이용하여 제조된 올리고당을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) NY518 균주를 이용하여 제조된 올리고당을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것으로서, 상기 올리고당은 피부의 주름 또는 염증을 개선하는 효과를 나타내므로, 이를 효과적으로 피부 상태의 개선 용도로 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) NY518 균주를 이용하여 제조된 올리고당을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 락토바실러스 사케이 NY518 균주의 배양액을 유자청을 기질로 하여 배양함으로써 하여 생성된 올리고당을 함유하는 배양물을 제공함으로써 피부의 주름 또는 염증을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 기술에 관한 것이다.
건강한 삶에 대한 욕구가 높아지면서 설탕 섭취를 줄이려는 사회적 분위기가 확산되는 가운데, 당도는 높지만 칼로리가 낮은 대체 감미료인 올리고당 시장이 급속히 커지고 있다. 시장조사기관인 링크아즈텍에 따르면 올리고당 시장은 2008년 106억 원 규모에 불과했지만, 2011년에는 222억 원으로 성장한 것으로 나타났다.
포도당과 과당, 갈락토스 등의 단당류가 많게는 10개까지 결합된 올리고당은 최근 들어 감미료 수준을 벗어나 저칼로리, 비피더스균 증식인자 등의 생리적 기능을 갖춘 다양한 제품으로 발전하였다. 건강을 생각해 당류 섭취를 줄이는 추세지만 일상 생활에서 일정량의 당류 섭취가 필수적인 만큼, 올리고당이 설탕이나 물엿, 조청 등을 대체하는 품목으로 자리잡고 있다.
올리고당은 글루코스, 프락토스 같은 단당류가 일반적으로 2 내지 8개 결합한 탄수화물로서 감미를 가지는 수용성 물질로 식물체에 소량씩 널리 분포되어 있으며, 설탕, 말토스 또는 이들의 혼합물에 특이한 당 전이효소를 작용시켜 여러 가지 종류의 올리고당이 생성되는데, 락토당, 갈락토당, 글루코당(이소말토) 등이 생성된다. 이들의 감미도의 강도는 설탕을 1로 보았을 때 대두올리고당(0.7), 이소말토올리고당(0.5), 갈락토올리고당(0.4), 프락토올리고당(0.3) 순이다.
한편, 글루코올리고당은 트랜스글리코시다아제 효소를 사용하고, 말토스를 기질로 하여 이소말토올리고당을 생성하며 주로 α-1,6-글루코시드 결합(glucosidic linkage)을 가지고 있는 글루코실사카라이드(glucosylsaccharide)를 말하며 이소말토오스, 판노스(panose), 이소말토트리오스 등을 주성분으로 한다.
전분 생성효소의 일종인 글루칸수크라아제는 설탕을 기질로 하여 주로 설탕의 글루코스를 α-1,3 과 α-1,6- 글루코시드 결합을 가지고 있는 글루코실사카라이드로 판노스, 이소말토오스, 이소말토판노스, 이소말토트리오스, 이소말토테트리오스, 이소말토판토스 등을 주성분으로 한다. 이러한 이소말토 올리고당들은 효모로 발효되지 않는 비발효성 당으로 청주, 굴, 간장 등에 존재한다.
이러한 글루코올리고당은 비슷한 기능을 가지는 식이섬유와는 물성이 크게 다르고 고분자 물질이 아니므로 식품에 첨가하여도 물성과 조직감이 크게 달라지지 않는 장점이 있고, 설탕보다 낮은 감미도, 비발효성, 보습성, 난흡습성, 침투성, 청량감, 변색방지, 감칠맛 보강, 수분활성 저하작용 등의 특성이 있어 음료수, 과자, 캬라멜, 초콜렛, 쿠키, 빵, 아이스크림, 쨈, 젤리, 요구르트, 케이크, 건강식품에 주로 이용되고 있다.
유자는 수분이 25% 미만을 차지하고 당분이 10-11%, 단백질이 0.5% 내외를 차지하며, 식이섬유는 함량이 높아 변비 및 정장작용이 뛰어난 과일이다. 유자 식이섬유는 셀룰로오스, 리그닌, 헤미-셀룰로오스, 펙틴 등으로 이루어져 있고, 특히 수용성 식이섬유인 펙틴함량이 30% 이상으로 구성되어 있다. 섬유소 구성성분은 셀룰로오스(글루코오스 결합), 펙틴(갈락쿠론산 결합), 헤미셀룰로오스(아라비노 자일란 골격을 기초로 자일로오스, 아라비노스, 만노스, 글루코스, 갈락토스 구성), 리그닌(페놀성 구조) 등으로 구성되어 있다.
한편, 이소말토올리고당과 같은 글루코올리고당은 생리적으로 여러 가지 유효한 특성을 지닌다. 장내의 비피도박테리아(Bifidobacteria)를 증식시켜 정장작용을 촉진하며, 장내 pH를 저하시켜 유해균의 증식을 억제하는데 이소말토올리고당을 장기간 토끼에 투여한 경우 생체 면역계에 중심적인 역할을 담당하는 T 임파구, B 임파구의 수가 증가하고, 장내에 비피더스균 및 유산균의 수가 현저히 증가하고 유해균인 클로스트리듐(Clostridium)은 감소한다고 보고된 바 있다.
현재 유자 가공에 관한 연구는 주로 유자껍질을 이용해 설탕과 1:1로 혼합해 만든 유자차(유자청) 등의 형태의 단순가공이 주를 이루며, 수출이나 내수시장에서는 설탕섭취에 대한 성인병 증가로 인해 고함유 설탕을 함유한 유차차 가공제품에 대해 해결책을 고민해왔다. 한편, 한국등록특허 제0479752호에는 보리 유래 올리고당의 제조방법이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제10-1136108호에는 배즙 유래 올리고당의 제조방법이 개시되어 있으나, 아직까지 유자를 이용해 만든 올리고당이나, 특히 장건강에 효과가 알려진 유산균인 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 유래 효소를 적용시켜 만든 유자올리고당의 피부 보호 효과에 대해 보고된 바는 없다.
이에 본 발명자들은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) NY518 균주 배양액을 이용하여 유자올리고당을 생성하고, 이로부터 피부의 주름 또는 염증을 개선하는 효과가 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 수탁번호 KCTC 13680BP로 기탁된 락토바실러스 사케이 NY518 균주 또는 이의 배양액을 기질 존재하에서 배양하여 제조된 배양물을 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 수탁번호 KCTC 13680BP로 기탁된 락토바실러스 사케이 NY518 균주 또는 이의 배양액을 기질 존재하에서 배양하여 제조된 배양물을 포함하는 피부 주름 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수탁번호 KCTC 13680BP로 기탁된 락토바실러스 사케이 NY518 균주 또는 이의 배양액을 기질 존재하에서 배양하여 제조된 배양물을 포함하는 피부 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수탁번호 KCTC 13680BP로 기탁된 락토바실러스 사케이 NY518 균주 또는 이의 배양액을 기질 존재하에서 배양하여 제조된 배양물을 포함하는 피부 염증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 사케이 NY518 균주 또는 이의 배양액을 배양하여 제조된 배양물의 피부 주름 또는 염증 개선 용도에 관한 것이다.
본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) NY518 균주를 이용하여 제조된 올리고당을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 유자올리고당은 피부의 주름 또는 염증을 개선하는 효과를 나타낸다.
본 발명자들은 이에 락토바실러스 사케이 NY518 균주의 배양액에 의해 생성된 올리고당이 콜라겐 생성능을 증가시키고, 염증유발물질의 생성을 감소시키며, 피부 유해균의 생장을 억제하는 것을 확인하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 수탁번호 KCTC 13680BP로 기탁된 락토바실러스 사케이 NY518 균주 또는 이의 배양액을 기질 존재하에서 배양하여 제조된 배양물을 포함하는 피부 주름 예방, 개선 또는 치료용 조성물이다.
상기 조성물은 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물인 것일 수 있다. 상기 피부 주름은 광노화, 연령, 얼굴 표정, 수분 부족, 또는 이들의 조합에 의하여 유도되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 기질은 과실 추출물인 것일 수 있고, 바람직하게는 밀감, 오렌지, 레몬, 자몽, 유자, 및 라임으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과실로부터 유래한 추출물로서, 착즙액, 파쇄액, 농축액, 절임 및 청으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 과실 추출물의 농도는 5 내지 75%(v/w)일 것일 수 있고, 바람직하게는 10 내지 75%(v/w), 25 내지 75%(v/w), 50 내지 75%(v/w), 5 내지 50%(v/w), 10 내지 50%(v/w) 또는 25 내지 50%(v/w), 예를 들어, 50%(v/w)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양액은 균주로부터 생성된 효소를 포함하고 있으며, 본 명세서상에서는 효소를 포함하는 균주 배양액의 상등액을 올리고당 제조에 이용하였다. 예를 들어, 본 명세서의 실시예에서 NY 효소라 함은 락토바실러스 사케이 NY518 균주 배양액의 상등액을 의미한다.
본 발명에 있어서 상기 배양액의 농도는 1 내지 20%(v/v)인 것일 수 있고, 바람직하게는 5 내지 20%(v/v), 7.5 내지 20%(v/v), 10 내지 20%(v/v), 1 내지 10%(v/v), 5 내지 10%(v/v) 또는 7.5 내지 10%(v/v), 예를 들어, 10%(v/v)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 배양은 1 내지 75시간 동안 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 3 내지 75시간, 6 내지 75시간, 9 내지 75시간, 15 내지 75시간, 18 내지 75시간, 21 내지 75시간, 24 내지 75시간, 34 내지 75시간 또는 48 내지 75시간, 예를 들어, 48 내지 72시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물은 피부 주름 예방 또는 치료용 약제학적 조성물인 것일 수 있다. 상기 피부 주름은 광노화, 연령, 얼굴 표정, 수분 부족, 또는 이들의 조합에 의하여 유도되는 것일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 수탁번호 KCTC 13680BP로 기탁된 락토바실러스 사케이 NY518 균주 또는 이의 배양액을 기질 존재하에서 배양하여 제조된 배양물의 약제학적 유효량 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 배양물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 100 내지 400 mg/kg이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 수탁번호 KCTC 13680BP로 기탁된 락토바실러스 사케이 NY518 균주 또는 이의 배양액을 기질 존재하에서 배양하여 제조된 배양물을 포함하는 피부 염증 예방, 개선 또는 치료용 조성물이다.
상기 조성물은 피부 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 피부 염증의 예방 또는 개선은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermis), 및 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acne)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 피부 유해균에 대한 항균 작용에 의하여 달성되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 기질은 과실 추출물인 것일 수 있고, 바람직하게는 밀감, 오렌지, 레몬, 자몽, 유자, 및 라임으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과실로부터 유래한 추출물로서, 착즙액, 파쇄액, 농축액, 절임 및 청으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 과실 추출물의 농도는 5 내지 75%(v/w)일 것일 수 있고, 바람직하게는 10 내지 75%(v/w), 25 내지 75%(v/w), 50 내지 75%(v/w), 5 내지 50%(v/w), 10 내지 50%(v/w) 또는 25 내지 50%(v/w), 예를 들어, 50%(v/w)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양액은 균주로부터 생성된 효소를 포함하고 있으며, 본 명세서상에서는 효소를 포함하는 균주 배양액의 상등액을 올리고당 제조에 이용하였다. 예를 들어, 본 명세서의 실시예에서 NY 효소라 함은 락토바실러스 사케이 NY518 균주 배양액의 상등액을 의미한다.
본 발명에 있어서 상기 배양액의 농도는 1 내지 20%(v/v)인 것일 수 있고, 바람직하게는 5 내지 20%(v/v), 7.5 내지 20%(v/v), 10 내지 20%(v/v), 1 내지 10%(v/v), 5 내지 10%(v/v) 또는 7.5 내지 10%(v/v), 예를 들어, 10%(v/v)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 배양은 1 내지 75시간 동안 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 3 내지 75시간, 6 내지 75시간, 9 내지 75시간, 15 내지 75시간, 18 내지 75시간, 21 내지 75시간, 24 내지 75시간, 34 내지 75시간 또는 48 내지 75시간, 예를 들어, 48 내지 72시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물은 피부 염증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물인 것일 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) NY518 균주를 이용하여 제조된 올리고당을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것으로서, 상기 올리고당은 피부의 주름 또는 염증을 개선하는 효과를 나타내므로, 이를 효과적으로 피부 상태의 개선 용도로 이용할 수 있다.
도 1a는 글루코올리고당의 생성을 위한 최적 기질 농도를 탐색한 결과 사진이다.
도 1b는 글루코올리고당의 생성을 위한 최적 효소 농도를 탐색한 결과 사진이다.
도 1c는 글루코올리고당의 생성을 위한 최적 반응 시간을 탐색한 결과 사진이다.
도 2a는 유자올리고당의 생성을 위한 최적 기질 농도를 탐색한 결과 사진이다.
도 2b는 유자올리고당의 생성을 위한 최적 효소 농도를 탐색한 결과 사진이다.
도 2c는 유자올리고당의 생성을 위한 최적 반응 시간을 탐색한 결과 사진이다.
도 3a는 설탕 또는 유자청의 기질 농도별 올리고당 생성조건 TLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 설탕 또는 유자청의 효소 농도별 올리고당 생성조건 TLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 설탕 또는 유자청의 반응 시간별 올리고당 생성조건 TLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 설탕올리고당 및 유자올리고당을 TLC 분석한 결과 사진이다.
도 4b는 설탕올리고당을 2D(Two dimentional)-TLC 분석한 결과 사진이다.
도 4c는 유자올리고당을 2D-TLC 분석한 결과 사진이다.
도 5는 올리고당의 조성비 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 유자청과 유자올리고당의 기능성분을 분석한 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography; HPLC) 결과 사진이다.
도 7은 유자청 또는 유자올리고당의 유익균 생장 촉진효과를 확인한 그래프이다.
도 8a는 유자청 또는 유자올리고당의 대식세포에 대한 세포독성 평가 결과를 확인한 그래프이다.
도 8b는 유자청 또는 유자올리고당의 대식세포에 대한 NO 생성 억제 결과를 확인한 그래프이다.
도 9a는 유자청 또는 유자올리고당의 섬유아세포에 대한 세포독성 평가 결과를 확인한 그래프이다.
도 9b는 유자청 또는 유자올리고당의 섬유아세포에 대한 콜라겐 생성 효과를 확인항 그래프이다.
도 1b는 글루코올리고당의 생성을 위한 최적 효소 농도를 탐색한 결과 사진이다.
도 1c는 글루코올리고당의 생성을 위한 최적 반응 시간을 탐색한 결과 사진이다.
도 2a는 유자올리고당의 생성을 위한 최적 기질 농도를 탐색한 결과 사진이다.
도 2b는 유자올리고당의 생성을 위한 최적 효소 농도를 탐색한 결과 사진이다.
도 2c는 유자올리고당의 생성을 위한 최적 반응 시간을 탐색한 결과 사진이다.
도 3a는 설탕 또는 유자청의 기질 농도별 올리고당 생성조건 TLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 설탕 또는 유자청의 효소 농도별 올리고당 생성조건 TLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 설탕 또는 유자청의 반응 시간별 올리고당 생성조건 TLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 설탕올리고당 및 유자올리고당을 TLC 분석한 결과 사진이다.
도 4b는 설탕올리고당을 2D(Two dimentional)-TLC 분석한 결과 사진이다.
도 4c는 유자올리고당을 2D-TLC 분석한 결과 사진이다.
도 5는 올리고당의 조성비 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 유자청과 유자올리고당의 기능성분을 분석한 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography; HPLC) 결과 사진이다.
도 7은 유자청 또는 유자올리고당의 유익균 생장 촉진효과를 확인한 그래프이다.
도 8a는 유자청 또는 유자올리고당의 대식세포에 대한 세포독성 평가 결과를 확인한 그래프이다.
도 8b는 유자청 또는 유자올리고당의 대식세포에 대한 NO 생성 억제 결과를 확인한 그래프이다.
도 9a는 유자청 또는 유자올리고당의 섬유아세포에 대한 세포독성 평가 결과를 확인한 그래프이다.
도 9b는 유자청 또는 유자올리고당의 섬유아세포에 대한 콜라겐 생성 효과를 확인항 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실험에서 얻어진 결과는 SAS 프로그램(Package relwase 8.01)을 이용하여 평균+표준편차로 표시하였고, 평균값의 통계적 유의성은 p<0.05수준에서 Duncan의 다중검정법(multiple range test)에 의해 검정 하였다.
실시예 1:
Lactobacillus sakei
NY518에 의해 설탕 또는 유자청을 이용한 올리고당을 생성하는 방법.
수탁번호 KCTC 13680BP로 기탁된 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) NY518 균주로부터 설탕을 이용하여 올리고당을 생성하는 데 있어서, 반응조건은 28℃, 소듐 아세테이트 버퍼, pH 5.2에서 효소(균주 배양액의 상등액) 10%, 설탕 기질 0.5 M, 반응시간은 24시간인 것으로 수행하였다. 기질의 농도는 각각 0.0, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 및 2.5 M을 첨가하여 조사하였고 효소의 농도는 0.0, 1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 20.0, 30.0 및 40.0%, 반응 시간은 0, 1h(hour), 3h, 6h, 12h, 18h, 1D(day), 1,5D, 2D, 3D로 적용하였다. 여기서 0.1% 글루코스(glucose, G), 0.1% FS(fructose, sucrose), IMO(Isomalto series), Maltose series(MO)를 의미하였다.
올리고당 생성효율은 최적 기질 조건에서는 설탕소비량을 기준으로, 효소함량과 반응시간에 있어서는 설탕이 소비되어 남은 함량을 기준으로 조사하였다. 기질로 사용된 유자청은 제조 후 6개월 동안 숙성시킨 유자청의 상등액을 사용하였다. 유자청은 유자 50% 및 설탕 50%을 혼합한 후 4℃에서 6개월 이상 보관 후 사용되었다.
도 1a 내지 1c에서 확인할 수 있듯이, 올리고당 생성시 설탕을 기질로 사용한 경우, 최적 조건은 설탕 0.5 내지 1.0 M, 효소농도는 10%, 반응시간은 18 내지 24시간이 최적인 것으로 나타났다.
도 2a 내지 2c에서 확인할 수 있듯이, 유자청을 기질로 사용한 경우, 최적 조건은 유자청 50%(v/w), 효소 농도는 10%, 반응 시간은 48시간 이상일 시 올리고당이 잘 생성되었다.
이와 같이 도출된 최적 조건을 적용하여 설탕 또는 유자청으로부터의 올리고당 생성 조건을 기질 농도별, 효소 농도별, 반응 시간별로 TLC 분석하여 도 3a 내지 3c로 나타내었다.
실시예 2:
Lactobacillus sakei NY
518에 의해 생성된 올리고당의 정량 및 정성분석
설탕 또는 유자청을 이용하여 제조된 올리고당의 물리적 특성을 조사하였다.
시료의 색도는 투명한 플라스틱 원통용기(35x10 mm)에 담아 분광측색계 (Minolta, CM-2500D, Tokyo, Japan)를 사용하여 CIE 체계인 L＊,a＊,b＊를 각각 3개씩 준비하여 3회 반복 측정하였으며 평균치(mean)와 표준편차(SD)로 나타내었다.
시료의 점도 측정을 위해 회전식점도계(LVDV II,Brookfield Engineering Laboratories, Middleboro, MA, USA)를 사용하여 겉보기 점도를 측정하였다.
| 올리고당 | pH | 총산도 | 당도 | 색도 | 점도 | |||
| (%) | (Brix) | L | a | b | △E | (cp) | ||
| 설탕 | 5.37 | 0.08 | 63.5 | 68.04 | -0.62 | 4.55 | 26.67 | 28 |
| 유자청 | 3.82 | 0.76 | 34.5 | 34.27 | -1.25 | 27.06 | 64.65 | 8 |
| 설탕올리고당 | 5.00 | 0.63 | 68.0 | 67.88 | -0.86 | 7.58 | 27.06 | 595 |
| 유자올리고당 | 4.47 | 1.26 | 65.0 | 36.74 | 4.16 | 36.77 | 66.69 | 568 |
올리고당은 설탕 및 유자청 대비 점도가 20배 가까이 증가하였으며 당도는 60 brix 이상, pH는 5.0 대로 유지하였다. 흥미롭게도 유자올리고당은 산도가 설탕올리고당에 비해 2배 가까이 높아 기호도가 좋을 것으로 여겨지며 식품첨가제로도 뛰어난 특성을 지니는 것으로 볼 수 있다.
올리고당 생성물을 예비(Preparartive) 실리카겔 플레이트에 점적한 후 1차 용매 85:20:50:50(v/v/v/v) 아세토니트릴/에틸아세테이트/1-프로판올/물로 2번 전개했으며 끝부분을 잘라서 황산 발색한 후 발색되지 않는 부분과 비교하였다. 각 부분의 스팟들을 회수해서 물에 담근 후 원심분리해 동결건조로 각 성분들을 얻었다.
또한, 각 성분들은 2D(Two-Dimentional) TLC를 이용하여 성분을 분석하였다. 올리고당 생성물을 예비(Preparartive) 실리카겔 플레이트에 점적한 후 1차 용매 85:20:50:50(v/v/v/v) 아세토니트릴/에틸아세테이트/1-프로판올/물로 2번 전개했으며, 다시 90도로 회전한 후 2차 용매로 20:50:15(v/v/v) 니트로메탄/1-프로판올/물로 2번 전개한 후 표준(standard) IMn(Isomaltoseries)와 Mn(Maltose series)로 비교해 성분을 분석하여 도 4a 내지 4c와 같이 나타내었다. 또한 LC/MS/MS를 통해 질량을 확인하였다.
도 5에서 확인할 수 있듯이, 생성된 올리고당의 조성은 5 내지 6 당이 10%를 차지하나 8 내지 10당까지 긴 사슬이 45 내지 50%를 구성하여 3 내지 4당이 주로 구성되는 일반 글루코당보다는 효능이 높을 것으로 예상되었다.
또한, HPLC를 이용하여 올리고당 내 기능성 성분을 조사하였다.
구체적으로, HPLC의 수행에는 Agilent 1216 infinity LC series system(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)을 사용하였다. 분석용 컬럼(column)은 ZORBAX eclipse plus C18(4.6x250mm, 5-Micron, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 사용하였다(용매조성은 A:0.1% formic acid, B:methanol-acetonitrile). 용매구배는 A:80, B:20으로 시작하여 5분 내지 10분에는 A:60, B:40, 10.1 내지 15분에는 A:50, B:50, 15.1 내지 20분에는 A:30, B:70, 20.1 내지 25분에는 A:0, B:100, 25.1 내지 30분에는 A:80, B:20로 하여 분석하였다. 용매 흐름속도는 0.5 mL/min로 하였고 컬럼의 온도는 35℃로 고정하였으며, 시료는 10 uL 주입하고, 280 nm에서 검출하였다.
| 시료명 | 나리루틴 | 나린진 | 헤스페리딘 | 네오헤스페리딘 | 전체 |
| (mg/g) | |||||
| 유자청 | 9.58±0.14a | 2.78±0.08a | 6.65±0.03a | 2.93±0.01d | 21.94 |
| 유자올리고당 | 6.49±0.04b | 1.56±0.03b | 5.00±0.05b | 1.84±0.14b | 14.88 |
표 2 및 도 6에서 확인할 수 있듯이, 유자청과 유자청을 활용하여 제조된 올리고당의 성분을 분석한 결과, 유자올리고당은 나리루틴 6.49 mg, 나린진 1.56 mg, 헤스페리딘 5.00 mg, 네오헤스페리딘 1.84 mg을 함유하였다. 유자청 대비 올리고당에서 나리루틴은 30%, 나린진, 네오헤스페리딘 등 쓴맛을 내는 성분은 45%까지 함량이 감소되었으나 올리고당 제조시 효능 성분 70%는 그대로 유지되었다.
실시예 3:
Lactobacillus sakei NY
518에 의해 생성된 올리고당의 피부 보호 효과
3-1. 항균 효과
유자청과 유자올리고당에 대한 유익균 생장 촉진 효과를 확인하고, 대표적인 피부 위해균 4종에 대해 Broth dilution assay 현탁도법을 수행하여 항균력 또한 테스트하였다.
먼저, 유익균으로서 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)을 10 mL의 MRS broth(Difco) 배지에 1% 접종하였다. 음성 대조군(Negative control)으로는 멸균된 PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.4, Life Technologies Co., Paisley, UK), 양성 대조군(positive control)으로는 탄소원인 1% 글루코스(glucose)나 설탕(sucrose)을 사용하였다.
도 7에서 확인할 수 있듯이, 유익균인 락토바실러스 플란타럼은 글루코스와 설탕에서 100% 생장함을 보였으며, 유자청은 생장이 78%까지 감소한 반면 락토바실러스 사케이 NY518 균주를 사용해 생산한 글루코올리고당과 유자올리고당은 110%, 123%의 생장 촉진 효과를 보였다.
항균 효과는 피부 기회감염균이자 아토피 유발 세균인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus, ATCC 12600)와 피부 외피 염증을 유발하는 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermis, ATCC 12288), 여드름 유발균 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acne, ATCC 11828), 백선, 무좀균인 칸디다 알비칸스(Candida albicans, ATCC 10231)를 대상으로 조사하였다.
유자청과 유자올리고당을 5, 10, 50, 100 mg/mL 농도로 첨가하고 500 μL의 세균 현탁액(105 CFU/mL)을 접종 후 37℃ 온도 조건에서 배양(110 rpm)하였다. 배양 후 총 12 내지 24시간 동안 2시간 간격으로 배양액 시료를 채취하고, UV 분광광도계(spectrophotometer, Mecasys Co. Ltd., Daejeon, Korea)를 이용해 640 nm에서 흡광도를 측정하여 생장률을 비교하거나 연속 희석법을 통해 실제 생균 수를 확인하여 생장률을 비교하였다. 시험시료와 동일한 양의 인산완충 식염수를 첨가한 실험군을 기준으로 각 균주에 대해 3회씩 반복 및 평균값을 구하여 백분율로 비교하였다.
| Staphylococcus aureus (ATCC 12600) |
Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) |
Propionibacterium acnes (ATCC 11828) |
||||
| 접종농도 (mg/mL) |
유자청 | 유자올리고당 | 유자청 | 유자올리고당 | 유자청 | 유자올리고당 |
| 5 | ND | ND | ND | ND | ND | 5.21 + 0.01 |
| 10 | ND | 9.59 + 1.72 | ND | ND | 10.16 + 1.22 | 19.41 + 0.39 |
| 50 | 10.92 + 0.39 | 40.05 + 2.22 | 2.22 + 0.31 | 20.70 + 0.47 | 21.81 + 1.93 | 31.48 + 1.77 |
| 100 | 53.82 + 1.93 | 77.08 + 1.77 | 98.82 + 1.91 | 103.49 + 1.32 | 51.81 + 2.93 | 69.48 + 4.17 |
무좀 등을 유발하는 칸디다 알비칸스는 효과가 전혀 나타나지 않았고 나머지 세가지 균에 대한 생장 억제 효과가 관찰되었다. 특히 스타필로코커스 에피더미스에서 유자청 또는 유자올리고당 100 mg/mL 처리시 항균 효과가 높았으나 저농도에서는 효과가 미비하였다. 또한 스타필로코커스 아우레우스 및 프로피오니박테리움 아크네 모두 유자올리고당 처리시 유자청 대비 1.5 내지 2.0배 가량 향균 효과가 높았으며 이들의 IC50 은 64.5 와 71.6 mg/mL로 나타났다.
3-2. 항염증 효과
대식세포(RAW 264.7)를 이용하여 세포독성을 측정하였다. 대식세포는 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양 받았으며, 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, Welgene, Daegu, Korea) 및 10% FBS(fetal bovine serum, Welgene)이 포함된 DMEM(Welgene)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
유자청과 유자올리고당의 농도별(0.004 내지 1%) 세포독성 측정과 실험에 사용될 농도 범위 결정을 위해 MTT assay를 시행하였다. 이를 위해 96 웰 플레이트(well plate)에 대식세포를 1 × 105 cells/well로 7℃, 5% CO2 및 오버나이트(overnight) 조건으로 배양한 후 유자청과 유자올리고당을 농도별로 첨가하여 24 h 처리하였다. 최종 농도가 5 mg/mL 이 되도록 MTT 용액을 넣고 37℃, 5% CO2 배양기에서 3 h 동안 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader, Spectramax Plus 384, Molecular Devices, USA)를 이용하여 570 nm 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다.
도 8a에서 확인할 수 있듯이, 유자올리고당과 유자청의 0.25% 이하 농도에서는 Raw264.7 대식세포에 대한 세포 독성은 나타나지 않았다(*p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001).
상기 세포독성 평가 결과를 토대로 Raw264.7 대식세포에서 유자올리고당이 염증 유발 인자인 NO 생성을 억제하는지 확인하기 위하여 NO 생성 억제능을 평가하였다.
LPS(Lipopolysaccharides, 1 μg/mL)는 대식세포에 대하여 염증을 유발하며 이러한 염증 유발은 iNOS의 발현에 의해 NO(nitric oxide)를 생성한다. 산화질소 생성에 대한 시료의 효과를 알아보기 위해 그리스 시약(griess reagent)을 사용하여 NO의 생성량을 측정하였다.
먼저, RAW 264.7 대식세포를 96 웰 플레이트에 1 × 105 cells/well로 배양한 후, LPS를 1 μg/mL 농도로 처리하고 시료를 0.06%, 0.12%, 0.25% 처리하여 24 h 동안 배양하였다. 각 실험군의 배양 상층액 100 μL와 그리스 시약을 동량으로 혼합하고 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 산화질소 생성량은 NaNO2(Sodium nitrite)의 농도별 표준곡선을 이용하여 검량선을 작성하여 계산하였다. iNOS의 활성을 저해하기 위한 양성 대조군으로는 COX-2 선택적 비스테로이드 항염증제인 0.02% 세레콕시브(Celecoxib, 화이자)를 사용하였다.
| mean | SD | P | effect(%) | |||
| 무처리 | - | 0.66 | 0.39 | |||
| + | 20.46 | 1.10 | *** | 0 | ||
| 세레콕시브(%) | 0.02 | + | 2.73 | 0.31 | *** | 86.64 |
| 유자청(%) | 0.06 | + | 23.41 | 0.41 | * | -14.41 |
| 0.12 | + | 21.85 | 0.31 | -6.78 | ||
| 0.25 | + | 21.20 | 0.36 | -3.63 | ||
| 유자올리고당(%) | 0.06 | + | 19.85 | 0.26 | 3.00 | |
| 0.12 | + | 17.60 | 0.91 | * | 13.96 | |
| 0.25 | + | 16.55 | 0.40 | ** | 19.09 | |
표 4 및 도 8b에서 확인할 수 있듯이, 유자올리고당 농도별 (0.06% ~ 0.25%)에 대한 NO 생성능은 모든 구간에서 농도의존적으로 NO 생성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다(*p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001). 특히, 세레콕시브 처리시 86%의 억제력을 나타냈다. 유자올리고당은 농도 의존적으로 NO 생성을 억제함을 확인하였으며, 0.06%, 0.12%, 및 0.25% 농도에서 NO 생성을 3%, 14%, 및 20% 억제하였다. 그러나 유자청은 NO 생성 억제효과가 전혀 나타나지 않았다.
3-3. 주름 생성 억제능
주름 생성 억제능을 조사하기 위해 CCD-986sk 섬유아세포에 대한 세포독성 측정과 실험에 사용될 농도 범위 결정을 위해 MTT assay를 시행하였다. 인체섬유아세포(CCD-986sk, Human fibroblast)는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양 받아 사용하였다. 인체섬유아세포는 10% FBS, 5% antibiotic-antimyotic을 첨가한 DMEM를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
세포종류별 시료 농도별(0.004 내지 1%)로 생존율 측정을 하였으며 이를 위해 96 웰 플레이트에 섬유아세포를 1×105 cells/well로 7℃, 5% CO2 및 오버나이트 조건으로 배양한 후 유자청과 유자올리고당을 농도별로 첨가하여 24 h 동안 처리하였다. 최종 농도가 5 mg/mL 이 되도록 MTT 용액을 넣고 37℃, 5% CO2 배양기에서 3 h 동안 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 570 nm 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다.
도 9a에서 확인할 수 있듯이, CCD-986sk 섬유아세포에 대한 세포독성을 측정한 결과 유자올리고당과 유자청의 0.06% 이하 농도에서는 CCD-986sk 섬유아세포에 대한 세포 생존율이 90% 이상으로 세포독성이 나타나지 않았다(*p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001).
상기 세포독성 평가 결과를 토대로 유자청 또는 유자올리고당을 처리 후 프로-콜라겐(Pro-collagen) 합성량을 조사함으로써 주름생성 억제능을 평가하였다.
CCD-986sk 세포를 배양한 후 6 웰 플레이트에 1×105 cells/well로 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 PBS 1 mL을 첨가하여 UVB(20 mJ/cm2)를 조사한 뒤, PBS를 제거하고 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 들어 있지 않은 DMEM 배지로 교체한 후 유자청과 유자올리고당을 0.01, 0.03, 0.06%로 희석하여 처리하여 48시간 동안 배양하였다.
상등액을 취하여 Soluble COLLAGEN Assay kit(Biocolor, S1000)의 프로토콜(protocol)에 따라 실험을 진행한 뒤, 마이크로플레이트 리더로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 vit-C(Ascorbic acid) 0.01%를 사용하였다.
| 무처리 | mean | SD | P | effect (%) | |
| 100 | 0 | 0 | |||
| Vit-C(%) | 0.01 | 215.2 | 14.4 | ** | 115.2 |
| 유자청(%) | 0.01 | 87.8 | 6.52 | -12.2 | |
| 0.03 | 92.7 | 2.27 | * | -7.3 | |
| 0.06 | 94.42 | 1.57 | * | -6.2 | |
| 유자올리고당(%) | 0.01 | 104.1 | 4.84 | 4.1 | |
| 0.03 | 124.9 | 4.71 | * | 24.9 | |
| 0.06 | 128 | 2.35 | ** | 28.0 |
표 5 및 도 9b에서 확인할 수 있듯이, 유자올리고당 농도별(0.01 내지 0.06%)에 대한 콜라겐 생성능은 모든 구간에서 농도의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다(*p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001). 특히, vit-C의 0.01% 처리시 215%의 프로-콜라겐 합성량이 나타났다. 유자청은 모든 농도에서 프로-콜라겐 합성량이 무처리 대비 감소한 반면, 유자올리고당은 0.01%, 0.03%, 및 0.06% 농도에서 프로-콜라겐 생성을 4.0%, 24.9%, 및 28.0% 증가시켰다는 점에서 주름 예방 효과가 있는 것으로 판단되었다.
Claims (13)
- 수탁번호 KCTC 13680BP로 기탁된 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) NY518 균주 또는 이의 배양액을 기질 존재하에서 배양하여 제조된 배양물을 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 기질은 과실 추출물인 것인, 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 과실 추출물의 농도는 5 내지 75%(v/w)인 것인, 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 배양액의 농도는 1 내지 20%(v/v)인 것인, 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 배양은 1 내지 75시간 동안 수행되는 것인, 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
- 수탁번호 KCTC 13680BP로 기탁된 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) NY518 균주 또는 이의 배양액을 기질 존재하에서 배양하여 제조된 배양물을 포함하는 피부 주름 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 수탁번호 KCTC 13680BP로 기탁된 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) NY518 균주 또는 이의 배양액을 기질 존재하에서 배양하여 제조된 배양물을 포함하는 피부 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 피부 염증의 예방 또는 개선은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermis), 및 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acne)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 피부 유해균에 대한 항균 작용에 의하여 달성되는 것인, 피부 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 기질은 과실 추출물인 것인, 피부 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 과실 추출물의 농도는 5 내지 75%(v/w)인 것인, 피부 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 배양액의 농도는 1 내지 20%(v/v)인 것인, 피부 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 배양은 1 내지 75시간 동안 수행되는 것인, 피부 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
- 수탁번호 KCTC 13680BP로 기탁된 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) NY518 균주 또는 이의 배양액을 기질 존재하에서 배양하여 제조된 배양물을 포함하는 피부 염증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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