JP5559476B2 - 生体物質及びその使用 - Google Patents
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Description
(i)光増感剤を提供する工程と、
(ii)担体分子を提供する工程と、
(iii)第1及び第2の極性非プロトン性溶媒並びに水性緩衝液の存在下で、光増感剤及び担体分子を接合する工程と
を含む、担体分子にカップリングした光増感剤を含む化合物を作製する方法を提供する。
(iv)光増感剤の機能を調節することのできる調節剤を担体分子にカップリングする工程をさらに含む。
(v)化合物を医薬として許容される担体と混合して製剤を形成する工程をさらに含む。
(a)担体分子がScFvで、光増感剤がピロフェオホルビドaである。
(b)担体分子がScFvで、光増感剤がベンゾポルフィリン誘導体一酸(ベルテポルフィン、Visudyne(登録商標))である。
(c)担体分子がScFvで、光増感剤がパラジウム-バクテリオフェオホルビド(TOOKAD(登録商標))である。
(d)担体分子がScFvで、光増感剤がクロリンe6のモノ-l-アスパルチル誘導体である。
(e)担体分子がScFvで、光増感剤がメタ-テトラヒドロキシフェニルクロリン(Foscan(登録商標))である。
(f)担体分子がScFvで、光増感剤がスズエチオプルプリン(ロスタポルフィン)である。
「抗体フラグメント」という用語は、抗体、抗体フラグメント、または抗体誘導体の任意の1つを意味すると解釈するものとする。野生型抗体(すなわち、4本のポリペプチド鎖を含む分子);合成抗体;組換え抗体;あるいはこれらに限定されないが免疫グロブリン軽鎖及び/もしくは重鎖可変領域並びに/または定常領域のファージディスプレイにより産生された単鎖修飾抗体分子、あるいは当業者には公知である免疫アッセイフォーマットにおいて抗原に結合することができる他の免疫相互作用分子などの抗体ハイブリッドを包含することを意図している。
本発明の特定の好ましい態様を実施する実施例を、下記の図に関連してこれから説明する。
すべての化学物質は、記述がない限りSigma-Aldrich UKから購入した。PPaはFrontier Scientific、UKからのもの、C6.5 scFvはProf.Marks(University of California、San Francisco、USA)から譲渡され、MFE-23scFvはDr Chester(Royal Free Hospital、University College London、UK)から譲渡され、HuBC-1 scFvはAntisoma Research Ltd(London、UK)から譲渡された。分子生物学試薬及び細菌はStratageneからのもの、ヒト細胞系はECACC、UKから、クロマトグラフィー充填剤はAmersham Biosciences、UKから、マウスはHarlan、UKから、光源はPhototherapeutics、UK及びHigh Powered Devices、New Jersey、USAからであった。
1.選択され特徴がはっきりした、抗癌scFv、例えばc6.5(抗Her2)をPCR増幅し、NcoI/NotIフラグメントとして細菌発現ベクター(例えば、pET20b、Novagen)にクローニングし、pETC6.5 scFvを作製した(図3)。
2.塩化カルシウム法により、ベクターpETc6.5 scFvを大腸菌BL21(DE3)(Novagen)に形質転換し(Sambrookら、1990)、アンピシリン100mg/mlを含有する2TY寒天プレート上に播いた(Sambrookら、1990)。単一のコロニー形質転換体を採取し、アンピシリンを含有する新鮮な2TY寒天プレート上に再び筋状に並べた。
3.単一のコロニーを採取し、振盪培養器(250rpm)中でアンピシリン100mg/mlを含有する2TY培地5ml中、8〜16時間30℃で増殖させた。次いでこの培養物を使用して、アンピシリン100mg/mlを含有する2TY培地500mlの培養物を接種し、さらに3〜16時間同様の条件下で増殖させた。
4.培養上清を収集し、30KDaカットオフ膜を有するAmicon限外濾過攪拌セルを使用して、10mlの最終容量に濃縮した。あるいは、細菌ペリプラズムを、10mlの容量でスクロース浸透圧ショック法を使用して調製することができる。
5.濃縮上清またはペリプラズム抽出物を、0.5MのNaCl及び2mMのMgCl2を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)5Lに対し16時間透析した。次いでこれを銅(II)またはニッケル(IΙ)を充填したキレートセファロースカラム(Amersham-Pharmacia Biotech)に加え、例えば[14]に記載されているように、金属固定化アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によって精製した。組み換えタンパク質は、40〜150mMのイミダゾールでイミダゾール勾配によって溶出した(図4)。
6.溶出した融合タンパク質を、PBS中で平衡化したsuperdex-75カラム(Amersham-Pharmacia Biotech)で、ゲル濾過によりさらに精製する。得られたタンパク質を、c6.5 scFvと称する。
1.乾燥DCM/THF(9:1)の混合物中のピロフェオホルビドa(50mg、0.094mmol)の光から保護された溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(12.9mg、0.11mmol)、続いてジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(23.2mg、0.11mmol)を加えた。
2.12時間攪拌した後、沈降したジシクロヘキシル尿素を濾過し、溶媒を除去した。粗生成物を、少量のクロロホルム中に入れ、ヘキサンを加えることにより沈殿させた。沈澱物を回収し、ヘキサンでよく洗浄し、得られた粗生成物を、カラムクロマトグラフィーによって、酢酸エチル中の2%ヘキサンで溶出するシリカゲル上で精製した(Rf0.66)。
3.単離した生成物をDCM/ヘキサンから再結晶させ、純粋なピロフェオホルビドaスクシンイミジルエステル(1)を70%の収率で得た。MS(FAB+)631(M+、100%)。
4.C6.5 scFvのストック溶液(500μg/ml)を室温で解凍し、200μlをPBS 706μlに加えた。アセトニトリル(60μl)を溶液に加えた。この溶液を冷却するまで氷上で攪拌した。
1.次いで、100%DMSO中で作製したピロフェオホルビドaスクシンイミジルエステルを、1.58mMのストック溶液からC6.5 scFvへ、連続して攪拌しながら加えた(34μl)(16当量のPPaを得た)。30分攪拌しながら、混合物を暗中、氷上に置き、その後溶液を透析管中に入れ、暗中4℃でPBS 5Lに対して一晩透析した。
2.接合体の各試料を石英キュベット中に入れ、PBSを含有するブランクに対して吸光度プロファイルを行った(図6)。410nmでの吸光度を測定し、PPaの検量線と比較することによってPSの濃度(g/ml)を決定した。
3.例えば、カップリング反応中に見出されるPPaの濃度が0.0000159g/mlの場合、0.0000159g/ml中のPPaの分子数は1.4×1016であった。100μg/ml中のC6の分子数は、2×1015であった。従って、PPa:C6.5の比は8:1であった。
1.MFE-23のストック溶液(500μg/ml)を室温で解凍し、200μlをPBS 706μlに加えた。アセトニトリル(60μl)を溶液に加えた。この溶液を冷却するまで氷上で攪拌した。
2.次いで、ピロフェオホルビドaスクシンイミジルエステルを、DMSO 1.58mMのストック溶液からMFE-23に、連続して攪拌しながら加えた(34μl)(16当量のPPaを得た)。30分攪拌しながら、混合物を暗中、氷上に置き、その後溶液を透析管中に入れ、暗中4℃でPBS 5Lに対し一晩透析した。
3.接合体の各試料を石英キュベット中に入れ、PBSを含有するブランクに対して吸光度プロファイルを行った(図7)。410nmの吸光度値を測定し、PPaの検量線と比較することによってPSの濃度(g/ml)を決定した。例えば、カップリング反応中に見出されるPPaの濃度が0.0000129g/mlの場合、0.0000129g/mlのPPaの分子数は1.4×1016であった。100μg/ml中のMFEの分子数は2×1015であった。従ってPPa:MFE-23の比は6:1であった。
1.光から保護されたPB1の安息香酸誘導体(20mg、0.01136mmol)の無水THF溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(2mg、0.017mmol)、次いでジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(3.5mg、0.017mmol)を加えた。12時間攪拌した後、沈殿したジシクロヘキシル尿素を濾過し、溶媒を除去した。得られた粗生成物を、カラムクロマトグラフィーによってTHF(Rf0.79)で溶出するシリカゲル上で精製し、所望の化合物(2)を濃緑色の固体として65%の収率で得た。MS(FAB+)1860(M+2、80%)。
1.C6.5ストック溶液(500μg/ml)を室温で解凍し、200μlをPBS 706μlに加えた。アセトニトリル(60μl)を溶液に加えた。この溶液を冷却するまで氷上で攪拌した。
2.次いで100%DMSO中で作製したPB1([94]を参照されたい)を、1.58mMのストック溶液からC6.5に、連続して攪拌しながら加えた(34μl)(16当量のPB1を得た)。30分攪拌しながら、混合物を暗中、氷上に置き、その後溶液を透析管中に入れ、暗中4℃でPBS 5Lに対して一晩透析した。
3.接合体の分析。接合体の各試料を石英キュベット中に入れ、PBSを含有するブランクに対して吸光度プロファイルを行った。460nmの吸光度値を測定し、PB1の検量線と比較することによってPSの濃度(g/ml)を決定した。
1.MFE-23ストック溶液(500μg/ml)を室温で解凍し、200μlをPBS 690.8μlに加えた。アセトニトリル(60μl)を溶液に加えた。
2.溶液を攪拌し、DMSOに溶解したベンゾイルスクシンイミジルエステル(安息香酸をN-ヒドロキシスクシンイミド及びDCCと乾燥ジクロロメタン中で反応させることにより調製)0.491μMの溶液15.2μlを加えた(16当量の安息香酸を得た)。溶液を室温で30分間攪拌し、次いで連続して攪拌しながらフラスコを氷上で冷却した。
3.次いで、1.58mMのストック溶液から100%DMSO中で作製したピロフェオホルビドaスクシンイミジルエステルを加えた(34μl)(16当量のPPaを得た)。30分攪拌しながら、混合物を暗中、氷上に置き、その後溶液を透析管中に入れ、暗中4℃でPBS 5Lに対して一晩透析した。
4.接合体の各試料を石英キュベット中に入れ、PBSを含有するブランクに対して吸光度プロファイルを行った(図7)。410nmでの吸光度を測定し、PPaの検量線と比較することによってPSの濃度(g/ml)を決定した。例えば、カップリング反応中に見出されるPPaの濃度が0.0000129g/mlの場合、0.0000129g/ml中のPPaの分子数は1.4×1016であった。100μg/ml中のMFEの分子数は2×1015であった。従ってPPa:MFE-23の比は6:1であった。
1.乾燥DCM/THF(9:1)の混合物中のピロフェオホルビドa(50mg、0.094mmol)の光から保護された溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(12.9mg、0.11mmol)、次いでジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(23.2mg、0.11mmol)を加えた。
2.12時間攪拌した後、沈殿したジシクロヘキシル尿素を濾過し、溶媒を除去した。粗生成物を、少量のクロロホルム中に入れ、ヘキサンを加えることにより沈殿させた。沈澱物を回収し、ヘキサンでよく洗浄し、得られた粗生成物を、酢酸エチル中の2%ヘキサンで溶出するシリカゲル上でカラムクロマトグラフィーによって精製した(Rf0.66)。
3.単離した生成物をDCM/ヘキサンから再結晶させ、純粋なピロフェオホルビドaスクシンイミジルエステル(1)を70%の収率で得た。MS(FAB+)631(M+、100%)。
4.HuBC-1 scFvのストック溶液(500μg/ml)を室温で解凍し、200μlをPBS 706μlに加えた。アセトニトリル(60μl)を溶液に加えた。この溶液を冷却するまで氷上で攪拌した。
5.次いで、100%DMSO中で作製したピロフェオホルビドaスクシンイミジルエステルを、1.58mMのストック溶液からHuBC-1 scFvに、連続して攪拌しながら加えた(34μl)(16当量のPPaを得た)。30分攪拌しながら、混合物を暗中、氷上に置き、その後溶液を透析管中に入れ、暗中4℃でPBS 5Lに対して一晩透析した。
6.接合体の各試料を石英キュベット中に入れ、PBSを含有するブランクに対して吸光度プロファイルを行った(図9)。410nmでの吸光度を測定し、PPaの検量線と比較することによってPSの濃度(g/ml)を決定した。
7.410nmの低い吸光度ピークは、PPAカップリングの程度を決定することが可能でなかったことを意味する。
1.光から保護されたクロリンe6(0.00184mmol)の無水DMF溶液に、等モル量のN-ヒドロキシスクシンイミド及びジシクロヘキシルカルボジイミドの両方を加え、混合物を12時間アルゴン下で攪拌した。
2.得られた混合物を氷水中で短時間冷却し、次いで濾過し、ジシクロヘキシル尿素副生成物を除去し、乾燥するまで蒸発させて、クロリンe6スクシンイミジルエステルを濃緑色の固体として得た。
3.C6.5 scFvのストック溶液(500μg/ml)を室温で解凍し、200μlをPBS 706μlに加えた。アセトニトリル(60μl)を溶液に加えた。この溶液を冷却するまで氷上で攪拌した。
4.次いで100%DMSO中で作製したクロリンe6スクシンイミジルエステルを、1.58mMのストック溶液からC6.5 scFvへ、連続して攪拌しながら加えた(34μl)(16当量のCe6を得た)。30分攪拌しながら、混合物を暗中、氷上に置き、その後溶液を透析管中に入れ、暗中4℃でPBS 5Lに対して一晩透析した。
5.接合体の各試料を石英キュベット中に入れ、PBSを含有するブランクに対して吸光度プロファイルを行った(図10)。410nmの吸光度を測定し、Ce6の検量線と比較することによってPSの濃度(g/ml)を決定した。
6.例えば、カップリング反応中に見出されるCe6の濃度が0.000034g/mlである場合は、0.000034g/ml中のCe6の分子数は3.43×1016であった。100μg/mlのC6の分子数は2×1015であった。従ってCe6:C6.5の比は9:1であった。
1.PPaのヒドラジド誘導体の調製。ピロフェオホルビドaのプロピオン酸側鎖を、標準文献による手順によって塩化アシルに変換した(DCM中の塩化オキサリル)。酸クロリドを粘着性の緑色の残渣として得て、さらなる精製をせずに使用した。
2.酸クロリドの無水DCM溶液を、無水DCM中の過剰の98%ヒドラジンに1滴ずつ加え、反応をTLCによりモニターし、1時間未満で終了した。過剰な溶媒及び試薬を蒸発させ、残渣をクロマトグラフィーにより精製した。次いで、PPaヒドラジドのストック溶液をDMSO中で作製した。
3.scFv、例えばC6.5を、下記のように糖鎖を持つように操作した。部位特異的突然変異誘発を使用して、scFvの表面にわたってN-結合型グリコシル化部位を、リジン残基スペーシングですでに説明した概念に従って、すべて十分に離間した位置で組み込んだ。このクローンを、グリコシル化を行うことのできる宿主細胞のために適切な発現ベクター(例えば、ピキアパストリス酵母中で発現するためのpPICベクター)中に入れた。
4.scFvを発現させ、メーカーの指示に従ってNTA-ニッケルクロマトグラフィーを使用して精製した。
5.誘導体化されたPPaを、グリコシル化scfv上のアルデヒド残基にカップリングさせた。アルデヒド残基へのカップリングは、ヒドラゾン結合の形成と共に緩衝化した環境において迅速に進行する。
1.接合体の段階希釈(半減濃度)をPBS中で行い、蛍光を410nmの励起波長及び680nmの放射波長で測定した。
2.これらをPBS中の遊離PPaと比較した。c6.5 scFv-PPa(図11)及びMFE scFv-PPA(+/-安息香酸)の例を示す(図12)。
1.抗CEA scFv-PPa分子のin vitroでの結合特性を、ELISA(Lane、1990)により、または開示された方法Lipschultzら「Experimental Design For Analysis of Complex Kinetics Using Surface Plasmon Resonance」Methods(2000)20、3180を使用してBIACore表面プラズモン共鳴により行い、非修飾scFvと比較した。scFv-PPa/BAの細胞結合もまた、共焦点蛍光顕微鏡検査法であるFluorescently Activated Cell Sorting(FACS)によって決定することができる非修飾タンパク質と比較することができる。
2.一例として、96ウェルELISAプレートを、PBS中の癌胎児性抗原(CEA)1μg/mlでコーティングし、一晩4℃でインキュベートした。翌日、プレートをPBS-0.1%tween中で3回、及びPBSで3回洗浄した。
3.次いで、ELISAプレートを、ブロッキング緩衝液(PBS-0.1%tween中の10%Marvel(登録商標))中で60分間37℃にてインキュベートした。
4.ブロッキング緩衝液をウェルから除去し、100〜1.9×104μg/mlからのMFEの半減希釈を得るようにブロッキング緩衝液中で希釈した50μlの接合体または非接合体化MFEを、各ウェルに加えた。プレートを上記のようにインキュベートし、ウェルを上記のように洗浄した。
5.一次抗体(50μl、ウサギ抗MFE、1:40000にブロッキング緩衝液中で希釈)を、各ウェルに加えた。プレートを上記のようにインキュベートし洗浄した。
6.二次抗体(50μl、抗ウサギ・ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体、1:10000にブロッキング緩衝液中で希釈)を各ウェルに加えた。プレートを上記のようにインキュベートし洗浄した。BMブルー(50μl)を各ウェルに加え、青色が発色するまで暗中室温でインキュベートした。
7.0.5Mの塩酸50μlを加えることにより反応を止めた。次いで、試料を460nmで読み取った(図13)。
1.in vitro細胞毒性を下記のように測定した。標的細胞(この実施例では、LoVo及びLS17T)を、75cm2フラスコ中で、37℃、5%CO2、10%ウシ胎児血清及び5mMのペニシリン/ストレプトマイシンを添加した培地(DMEM)中に保持した。SkoV3細胞には、使用した培地は、15%FBS、5mMのペニシリン/ストレプトマイシンを添加したMcCoy5A培地であった。
2.70〜80%集密的となると、細胞をPBS中で洗浄し、トリプシン5mlを加えた。フラスコを、37℃、5%CO2で、15分間、または細胞がフラスコから離れるまでインキュベートした。次いで、細胞を50mlのFalconチューブ中に入れ、DMEMまたはマッコイ培地15mlを加えることによってトリプシン不活性化した。
3.細胞(20μl)をチューブから取り出し、計数のために血球計算器に入れた。残りの細胞を、室温で10分間1800g収集し、DMEMまたはマッコイ培地1ml中でペレットを穏やかに再懸濁させた。細胞を完全に再懸濁させ、DMEMまたはマッコイ培地のさらなる19mlを加えた。細胞をDMEMまたはマッコイ培地中で結果的に希釈し、2×106細胞/mlとした。次いで、細胞(50μl)を96ウェルプレートの各ウェルに加え、37℃及び5%CO2で一晩インキュベートした。
4.下記の手順を抑えた照明下で行った。翌日、接合体をPBS中で希釈し、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml及び0.78μg/mlと等しいC6.5濃度を得た。細胞を一度PBSで洗浄し、接合体50μlを4通りウェルに加えた。対照ウェル(接合体を加えたが光に曝さないウェル、及び接合体を加えず光にも曝さないウェル)もまた含めた。レーザー光のみでは細胞生存率に影響を及ぼさないことが従前の実験から確認されたため、光源、または光のエネルギー線量が変化しない限り「光のみ」の対照は含めない。
5.細胞を、接合体または遊離PS(濃度は様々である)中で30分間37℃、5%CO2でインキュベートし、次いでPBSで3回洗浄した。PBS(50μl)を各ウェルに加え、4通り作製したウェルをレーザー光に2分間曝した(エネルギー線量=4.2J、エネルギー密度=1.4J/cm2)。
6.PBSを各ウェルから除去し、DMEMまたはマッコイ培地100μlを加えた。プレートを箔で緩く包んだが、周辺光が入らないように適切に覆った。次いで、プレートを上記のように48時間インキュベートし、その後細胞殺滅アッセイを行った。
7.細胞殺滅アッセイを、Cytotox-96キットを使用して(Promegaプロトコルに従って)行った。細胞をPBSで3回洗浄し、細胞溶解剤50μlを加えた。プレートを、37℃で暗中60分間インキュベートした。この後、基質溶液50μlを加えた(これは細胞中の乳酸デヒドロゲナーゼの量を示す)。これを室温で30分間インキュベートし、次いで停止液(0.5Mの酢酸)50μlを加えた。細胞懸濁液をウェルから除去し、未使用のマイクロタイタープレート中に置いた。次いで、吸光度をマイクロタイタープレートリーダー中で490nmにて測定した。
8.細胞殺滅を決定し、対照に対する割合で表した(図14)。
1.in vitroでの細胞毒性を下記のように測定した。標的細胞(この実施例において、LoVo、LS17TまたはSkov3)を、75cm2フラスコ中、10%ウシ胎児血清及び5mMのペニシリン/ストレプトマイシンを添加した培地(DMEM)中で、37℃、5%CO2に維持した。SkoV3細胞のために使用した培地は、15%FBS、5mMのペニシリン/ストレプトマイシンを添加したマッコイ5A培地であった。
2.70〜80%集密的となると、細胞をPBS中で洗浄し、トリプシン5mlを加えた。フラスコを、37℃、5%CO2で15分間または細胞がフラスコから離れるまでインキュベートした。次いで、細胞を50mlのFalconチューブに入れ、DMEMまたはマッコイ培地15mlを加えることによってトリプシンを不活性化した。
3.細胞(20μl)をチューブから取り出し、計数のために血球計算器に入れた。残りの細胞を、10分間室温で1800g収集し、ペレットをDMEMまたはマッコイ培地1ml中で穏やかに再懸濁させた。細胞を完全に再懸濁させ、さらにDMEMまたはマッコイ培地19mlを加えた。細胞をDMEMまたはマッコイ培地中で希釈し、結果的に2×106細胞/mlを得た。次いで、細胞(50μl)を96ウェルプレートの各ウェルに加え、一晩37℃及び5%CO2でインキュベートした。
4.下記の手順を抑えた照明下で行った。翌日、接合体をPBS中で希釈し、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml及び0.78μg/mlと等しいMFE濃度を得た。細胞を一度PBSで洗浄し、接合体50μlを4通りウェルに加えた。対照ウェル(接合体を加えたが光に曝さないウェル、及び接合体を加えず光にも曝さないウェル)もまた含めた。レーザー光のみでは細胞生存率に影響を及ぼさないことが従前の実験から確認されたため、光源、または光のエネルギー線量が変化しない限り「光のみ」の対照は含めない。
5.細胞を、接合体または遊離PS(濃度は様々である)中で30分間37℃、5%CO2でインキュベートし、次いでPBSで3回洗浄した。PBS(50μl)を各ウェルに加え、4通り作製したウェルをレーザー光に2分間曝した(エネルギー線量=4.2J、エネルギー密度=1.4J/cm2)。
6.PBSを各ウェルから除去し、DMEM100μlを加えた。プレートを箔で緩く包んだが、周辺光が入らないように適切に覆った。次いで、プレートを上記のように48時間インキュベートし、その後細胞殺滅アッセイを行った。
7.細胞殺滅アッセイを、Cytotox-96キットを(Promegaプロトコルに従って)使用して行った。細胞をPBSで3回洗浄し、細胞溶解剤50μlを加えた。プレートを、60分間37℃で暗中インキュベートした。この後、基質溶液50μlを加えた(これは細胞中の乳酸デヒドロゲナーゼの量を示す)。これを室温で30分間インキュベートし、次いで停止液(0.5Mの酢酸)50μlを加えた。細胞懸濁液をウェルから除去し、未使用のマイクロタイタープレート中に置いた。次いで、吸光度をマイクロタイタープレートリーダー中で490nmにて測定した。
8.細胞殺滅を決定し、対照に対する割合で表した(図15)。
1.in vivoでの腫瘍根絶を下記のように決定することができる。約1×107SKOV-3細胞を、ヌードBALB/Cマウスの側腹部にs.c.注射し、腫瘍を4〜6週間定着させた。
2.10〜50μgの125-ヨウ素放射性標識した(Iodogen法、Pierce Chemical Co.を使用)scFv-PPaを、腫瘍担持マウスの尾静脈にi.v.注射し、1〜48時間にわたり腫瘍に集積させた。
3.分析した各時点からの3匹以上のマウスの群を終末麻酔の下で処分し、解剖し、腫瘍、血液及び様々な臓器をscFv-PPa取込みについて分析した。PPa単独及びscFvでの対照実験を行う。
4.一例として、c6.5-PPaの腫瘍ターゲティングを、scFv及びPPa単独と比較して図16に示す。親水性scFvに接着した後は、疎水性光感受性物質の血液循環時間は減少が見られた(図17)。
1.in vivo腫瘍根絶を下記のように示すことができる。約1×107SKOV-3細胞を、ヌードBALB/Cマウスの側腹部にs.c.注射し、腫瘍を4〜6週間定着させる。
2.50〜200μgのscFv-PPaを、腫瘍担持マウスの尾静脈にi.v.注射し、12〜24時間にわたり腫瘍に集積させる。
3.腫瘍:正常臓器比が高い時(5:1以上、例えば16時間)に、光を2.4W/cm2で腫瘍に照射する。
4.カリパーを使用して腫瘍の大きさを測定し、生理食塩水のみで処置したマウスと比較する。腫瘍をPDT誘発ネクローシスについて観察した(図18)。
1.実際には非常に乏しい光物理的性質(蛍光、一重項酸素生成及びin vitroの光細胞毒性など)を示すことが示されてきたscFvを、一次構造及び三次構造レベルで分析する。これは、光感受性物質へのカップリングまたは三次元構造の検査のために良好なものであると知られているscFvへのアミノ酸アラインメントによって行うことができる。
2.活性化した光感受性物質とのカップリングに使用される残基、例えばリジン残基を同定する。
3.一次配列において、または三次元モデル(または実際の構造)から位相的に互いに隣接したものを、部位特異的突然変異誘発によって操作する。変更は、最適に離間したリジン残基の導入、他に近すぎるリジンの除去、または不用なリジンと他の同様ではあるが(アルギニンまたはグルタミンなどの)接合が可能でない残基との置換の場合がある。
4.この実施例において、抗フィブロネクチンscFv HuBC-1をc6.5に整列させ、リジン位置を同定した。リジン位置がむしろc6.5に見出されるものに近いものに変更された(図19)、6つの変化が同定された(図10)。
5.同定された各々の可能性のある変更(この実施例では全部で6)は、抗体遺伝子中の単一の変異として抗体フラグメントにおいて生じる。Stratagene Quick Change(登録商標)システムを使用して突然変異誘発を行った。
6.抗体特性のいずれかが突然変異誘発によって変化または破壊されているかどうかを確かめるために、(4)からの各変異抗体を試験する。宿主細胞(例えば、大腸菌)中の抗体タンパク質の発現、精製、(ELISA及びBIACore表面プラズモン共鳴による)抗原結合性、(ELISA、FACS及び免疫顕微鏡観察による)細胞結合、安定性アッセイ(温度、尿素が誘発するアンフォールディング及び血清安定性)をすべて行う。
7.抗体の安定性及び機能を有意に変化させない変異を保持し、有害な変異を捨てる。
8.すべての変異を、1つの抗体遺伝子に組み合わせ最適化した光感受性物質カップリングのための新たに配置されたリジン残基を有するタンパク質を形成する。
9.この抗体を実施例1〜11におけるように使用して、抗体-光感受性物質接合体を作製する。
1.特徴がはっきりした抗微生物抗体を、実施例1(上記)で記載したものと同じ技術を使用してクローニングし、発現させ、精製する。
2.実施例2〜5(上記)に記載したように、光感受性物質を接着させる。
3.抗菌の細胞殺滅。初めに、多数の細菌種に対する多数の光感受性物質接合体を選別する迅速な方法を行った。細菌の一晩培養物を遠心分離により収集し、PBS中に再懸濁させた。細菌培養物(1ml)を寒天プレートに広げ、30分間乾燥させた。
4.この後、光感受性物質5μlを広げた細菌の上に置き、レーザーダイオードからの光に2分間曝した(35mW、675nm)(エネルギー密度=1.4J/cm2)。プレートを一晩37℃でインキュベートした。
5.翌日、光感受性物質接合体及び光を施用した場所以外は、プレート上に細菌の菌叢が増殖しているはずである。細菌増殖がここで起こっていることが見出された場合は、対応する光感受性物質接合体はさらに調査しなかった。成功したことが見出されたそれらの光感受性物質接合体/細菌の組合せを、下記のようにさらに分析した([93、94]からの改良した方法)。
6.細菌の一晩培養物を収集し、PBS中で再懸濁させた。細菌の一定分量(100μl)を採取し、24ウェルプレートのウェルに加えた。次いで、連続希釈した光感受性物質接合体l00μlを、3通り各ウェルに加えた。特定の時間(通常1〜30分間)懸濁液を攪拌し、その後細菌を遠心分離により収集し、PBSまたは0.15MのNaClで4回洗浄した。細菌ペレットをPBSまたは0.15MのNaCl中で再懸濁させ、24ウェルプレートに入れた。次いで、ウェルをレーザーダイオードからの光に曝した(エネルギー密度=1.4J/cm2)。すべての懸濁液を各ウェルから取り出し、2TYブロス中で連続希釈した。一定分量(25μl)を各希釈物から取り出し、寒天プレートの半分に置いた。次いで、懸濁液を寒天プレートの半分に広げて、プレートを一晩37℃でインキュベートした。
7.翌日、プレート上にあるコロニーの数を数えた(すなわち、20〜200コロニーを有するプレート)。次いで、光感受性物質がないまたは光による処理をしない懸濁液からのコロニーと比較して、細菌の細胞生存を計算した。
1.円形のカバーガラスをエタノール中で洗浄し、PBS中でそそいだ。次いで、カバーガラスを12ウェル組織培養プレート中に置いた。
2.SKOV3細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄した。細胞ペレットをマッコイ培地中で再懸濁させ、細胞をカバーガラス上に2×105細胞/mlで播いた。細胞を、一晩37℃及び5%CO2でインキュベートした。
3.接着細胞が付いたカバーガラスを、PBS中で注意深くそそぎ、C6-PPaまたはPBSをウェルに加えた。細胞を、37℃及び5%CO2で30分間インキュベートし、その後それらをPBSで注意深くそそいだ。
4.細胞を、4%パラホルムアルデヒド2ml中で60分間室温にてインキュベートすることによって、カバーガラス上に付けた。この後、カバーガラスをPBSで洗浄し、セルを横にしてスライドガラス上に反転させた。次いで、マニキュア液を使用してカバーガラスの端を密封した。
5.次いで、Leicaレーザー走査共焦点顕微鏡を使用して、励起光源としてAr+レーザー(418nm)を使用して蛍光イメージングを行った。画像を図20及び24に、放出スペクトルを、図21及び24に示す。
Fl及びGP6(抗ヒト胎盤アルカリホスファターゼ)及びD1.3(31)を、pHEN2で発現させた。すべてのscFvの発現及び精製は、C6.5のための上記と同様であった。
ピロフェオホルビド-aスクシンイミジルエステルを、下記のようにscFvへのカップリングのために合成した。光から保護した乾燥DCM/THF(9:1)の混合物中のピロフェオホルビド-a(50mg、0.094mmol)の溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(12.9mg、0.11mmol)、続いてジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(23.2mg、0.11mmol)を加えた。
100%DMSO及びPBS/1.9%DMSO中の遊離PPaの吸光度プロファイルを図22Aに示す。両方とも、400nm付近で特徴的なピーク(Soretピーク)、500〜630nmでより小さいピーク、及び670nmでQ帯を示す。図22Bは、PPaにカップリングしたC6.5 scFvのプロファイルを示す。ピークは鋭さを残し、遊離PPaのピークと同様である。PPaの濃度を決定するために670nmでの吸光度を使用して、PPa:scFv比を計算するために使用し、これは11.92±1(5つの別個のカップリング反応の平均)であった。これによって、少量(30%)の非共有結合を補正した後、効率的な比である約8:1が出る。MFE scFvに接着した場合のPPaのプロファイルを図22Cに示す。
Scherrerら(1986)J.Org.Chem.51:1094〜1100に記載されているように、ベルテポルフィンを得た。
1.ベルテポルフィンスクシンイミジルエステル(図27、化合物「b」)を、PPaで説明したように調製した。光から保護されたベルテポルフィン(6mg)の乾燥THF(5ml)溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(3mg)、続いてジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、6mg)を加えた。
2.反応混合物を12時間室温で窒素下攪拌し、この時点ですべての出発物質が消費された。
3.溶媒を蒸発させ、粗生成物をカラムクロマトグラフィーによってシリカゲル上で精製し、DCM中の溶液として充填し、酢酸エチル(Rf0.74)で溶出し、75%の収率で純粋なベルテポルフィンスクシンイミジルエステルを得た。MS(FAB+)832(M+)。
4.C6.5 scFvのストック溶液(500μg/ml)を室温で解凍し、200μlをPBS 706μlに加えた。アセトニトリル(60μl)を溶液に加えた。この溶液を冷却するまで氷上で攪拌した。
1.次いで、100%DMSO中で作製したベルテポルフィン(Visudyne(登録商標))スクシンイミジルエステルを、1.58mMのストック溶液からC6.5 scFvへ、連続して攪拌しながら加えた(34μl)(16当量のベルテポルフィン(Visudyne(登録商標))を得た)。30分攪拌しながら、混合物を暗中、氷上に置き、その後溶液を透析管中に入れ、暗中4℃でPBS 5Lに対して一晩透析した。
2.接合体の各試料を石英キュベット中に入れ、PBSを含有するブランクに対して吸光度プロファイルを行った。410nmの吸光度を測定し、ベルテポルフィン(Visudyne(登録商標))の検量線と比較することによって、PSの濃度(g/ml)を決定した。
1.MFE-23のストック溶液(500μg/ml)を室温で解凍し、200μlをPBS 706μlに加えた。アセトニトリル(60μl)を溶液に加えた。溶液を冷却するまで氷上で攪拌した。
2.次いで、ベルテポルフィン(Visudyne(登録商標))スクシンイミジルエステルを、DMSO 1.58mMのストック溶液からMFE-23へ、連続して攪拌しながら加えた(34μl)(16当量のベルテポルフィン(Visudyne(登録商標))を得た)。30分攪拌しながら、混合物を暗中、氷上に置き、その後溶液を透析管中に入れ、PBS 5Lに対して4℃で暗中一晩透析した。
3.接合体の各試料を石英キュベット中に入れ、PBSを含有するブランクに対して吸光度プロファイルを行った。410nmの吸光度を測定し、ベルテポルフィン(Visudyne(登録商標))の検量線と比較することによって、PSの濃度(g/ml)を決定した。従ってベルテポルフィン(Visudyne(登録商標)):MFE-23の比は、8:1〜10:1であった。
1.接合体の段階希釈(半減濃度)を、PBS中で行い、吸光度を690nmの励起波長及び680nmの放射波長で測定した。
2.これらをPBS中の遊離ベルテポルフィン(Visudyne(登録商標))と比較した(図28)。
1.in vitroでの細胞毒性を下記のように測定した。標的細胞(この実施例において、SKOV3細胞を抗原陽性細胞として使用し、KB細胞を抗原陰性細胞として使用した)を、75cm2フラスコ中、10%ウシ胎児血清及び5mMのペニシリン/ストレプトマイシンを添加した培地(DMEM)中で、37℃、5%CO2に維持した。SKOV3細胞のために使用した培地は、15%FBS、5mMのペニシリン/ストレプトマイシンを添加したマッコイ5A培地であった。
2.70〜80%集密的となると、細胞をPBS中で洗浄し、トリプシン5mlを加えた。フラスコを、37℃、5%CO2で15分間または細胞がフラスコから離れるまでインキュベートした。次いで、細胞を50mlのFalconチューブに入れ、DMEMまたはマッコイ培地15mlを加えることによってトリプシンを不活性化した。
3.細胞(20μl)をチューブから取り出し、計数のために血球計算器に入れた。残りの細胞を、10分間室温で1800g収集し、ペレットをDMEMまたはマッコイ培地1ml中で穏やかに再懸濁させた。細胞を完全に再懸濁させ、さらにDMEMまたはマッコイ培地19mlを加えた。細胞をDMEMまたはマッコイ培地中で希釈し、結果的に2×106細胞/mlを得た。次いで、細胞(50μl)を96ウェルプレートの各ウェルに加え、一晩37℃及び5%CO2でインキュベートした。
4.下記の手順を抑えた照明下で行った。翌日、接合体をPBS中で希釈し、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml及び0.78μg/mlと等しいC6.5濃度を得た。細胞を一度PBSで洗浄し、接合体50μlを4通りウェルに加えた。対照ウェル(接合体を加えたが、光に曝していないウェル、及び接合体を加えず、光にも曝していないウェル)もまた含めた。レーザー光のみでは細胞生存率に影響を及ぼさないことが従前の実験から確認されたため、光源、または光のエネルギー線量が変わらない限りは「光のみ」の対照は含めない。
6.細胞を、接合体または遊離PS(濃度は様々である)中で30分間37℃、5%CO2でインキュベートし、次いでPBSで3回洗浄した。PBS(50μl)を各ウェルに加え、4通り作製したウェルをレーザー光に2分間曝した(エネルギー線量=4.2J、エネルギー密度=1.4J/cm2)。
7.PBSを各ウェルから除去し、DMEMまたはマッコイ培地100μlを加えた。プレートを箔で緩く包んだが、周辺光が入らないように適切に覆った。次いで、プレートを上記のように48時間インキュベートし、その後細胞殺滅アッセイを行った。
8.細胞殺滅アッセイを、Cytotox-96キットを使用して(Promegaプロトコルに従って)行った。細胞をPBSで3回洗浄し、細胞溶解剤50μlを加えた。プレートを、37℃で暗中60分間インキュベートした。この後、基質溶液50μlを加えた(これは細胞中の乳酸デヒドロゲナーゼの量を示す)。これを室温で30分間インキュベートし、次いで停止液(0.5Mの酢酸)50μlを加えた。細胞懸濁液をウェルから除去し、未使用のマイクロタイタープレート中に置いた。次いで、吸光度をマイクロタイタープレートリーダー中で690nmにて測定した。
9.細胞殺滅を決定し、対照に対する割合で表した(図29)。
SKOV3細胞上のC6.5-ベルテポルフィン(Visudyne(登録商標))接合体=2.2μM
KB細胞上のC6.5-ベルテポルフィン(Visudyne(登録商標))接合体=28.1μM
SKOV3細胞上のベルテポルフィン(Visudyne(登録商標))=15.3μM
KB細胞上のベルテポルフィン(Visudyne(登録商標))=10μM
本発明のさらなる態様は、医薬もしくは動物用医薬として許容されるアジュバント、希釈剤または担体と混合した、本発明の第1の態様による化合物を含む製剤を提供する。
Claims (39)
- 担体分子にカップリングした光増感剤を含む化合物の作製方法であって、前記化合物が少なくとも3:1の比率の光増感剤と担体分子とを含み、且つ以下の工程:
(i)光増感剤を提供する工程であって、前記光増感剤が、ヘマトポルフィリン、天然ポルフィリン、天然クロリン、天然バクテリオクロリン、フェオホルビド、ピロフェオホルビドa、フォトクロル、クロリン、クロリンe6、モノ-l-アスパルチルクロリンe6、ジ-l-アスパルチルクロリンe6、スズ(IV)クロリンe6、天然バクテリオクロロフィルパラジウム、バクテリオフェオホルビドパラジウム、合成クロリン、合成バクテリオクロリン、メタ-テトラヒドロキシフェニルクロリン及びバクテリオクロリン、ベンゾポルフィリン、モノベンゾポルフィリン、ベルテポルフィン、フタロシアニン、スルホン化アルミニウムフタロシアニン(ジスルホン化及びテトラスルホン化)、スルホン化アルミニウムナフタロシアニン、プルプリン、プルプリン-18、オクタエチルプルプリンスズ及びオクタエチルプルプリン亜鉛、スズエチオプルプリン、ベルジン、ポルフィセン、合成ポルフィリン、合成クロリン、合成バクテリオクロリン、無金属メソ-トリエチニルポルフィリン、メタル化メソ-トリエチニルポルフィリン、コア修飾ポルフィリン、拡張ポルフィリン(テキサフィリン)、モテキサフィンルテチウム、モテキサフィンガドリニウム、フェノチアジニウム、メチレンブルー、トルイジンブルー、シアニン、メロシアニン-540、アクリジン色素、BODIPY色素、アザ-BODIPY、ヒペリシン、ハロゲン化スクアライン色素、ハロゲン化キサンテン色素、エオシン、及びローズベンガルからなる群から選択される、工程と、
(ii)担体分子を提供する工程であって、前記担体分子がヒト化されているScFvまたはヒトのScFvである、工程と、
(iii)第1及び第2の極性非プロトン性溶媒、並びに水性緩衝液の存在下で、前記光増感剤と前記担体分子とを接合する工程であって、前記第1及び第2の極性非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、HMPA、ジオキサン、スルホラン、及びN-メチルピロリドンからなる群から選択され、且つ、前記第1の非プロトン性溶媒と第2の非プロトン性溶媒との比が1〜49%:49〜1%である、工程と
を含む、担体分子にカップリングした光増感剤を含む化合物の作製方法。 - 前記光増感剤及び前記担体分子の機能特性及び物理的特性がカップリング後に変化しない、請求項1に記載の方法。
- 前記第1及び第2の非プロトン性溶媒がDMSO、DMF、及びアセトニトリルからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記第1及び第2の非プロトン性溶媒がDMSO及びアセトニトリルである、請求項3に記載の方法。
- 前記水性緩衝液、第1及び第2の非プロトン性溶媒の比が92%PBS:2%DMSO:6%アセトニトリルである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記光増感剤と前記担体分子とを接合する工程が0℃〜5℃の温度で行われる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記光増感剤と前記担体分子とを接合する工程が30分間行われる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記光増感剤が単官能の光感受性物質である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(iii)の後に行われる、
(iv)前記光増感剤の機能を調節することのできる調節剤を前記担体分子にカップリングする工程をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。 - 前記調節剤が、安息香酸、アジド基を含有する安息香酸、4-アジドテトラフルオロフェニル安息香酸、アジド部分を有する芳香族基を含有する安息香酸、アジド部分を有するヘテロ芳香族基を含有する安息香酸、ビタミンE類似体、トロロックス、ブチルヒドロキシルトルエン、没食子酸プロピル、デオキシコール酸、及びウルソデオキシコール酸からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記芳香族基またはヘテロ芳香族基が、ポリフルオロベンゼン、ナフタリン、ナフトキノン、アントラセン、アントラキノン、フェナントレン、テトラセン、ナフタセンジオン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、インドール、イソインドール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピラジン、ベンズイミダゾール、ベンゾフラン、ジベンゾフラン、カルバゾール、アクリジン、アクリドン、及びフェナントリジン、キサンチン、キサントン、フラボン、クマリン、並びにそれらのスルフェナートからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 工程(iii)または(iv)の後に行われる、
(v)前記化合物を医薬として許容される担体と混合して製剤を形成する工程をさらに含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。 - 前記担体分子にカップリングしている光増感剤の間の距離が3.5オングストローム〜25オングストロームである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体分子にカップリングしている光増感剤の間の距離が20〜25オングストロームである、請求項13に記載の方法。
- 工程(v)の前に、
(vi)視覚化剤を前記担体分子、光増感剤、またはそれらの接合体とカップリングする工程をさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。 - 前記視覚化剤が蛍光色素または発光色素である、請求項15に記載の方法。
- 請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法によって得られる、前記担体分子のアミノ酸残基において前記担体分子にカップリングしている光増感剤を含む化合物であって、前記担体分子がヒト化されているScFvまたはヒトのScFvであり;前記光増感剤が、2個のアミノ酸だけ隔たって(3.5〜7.5オングストローム)、または3個のアミノ酸だけ隔たって(9〜12オングストローム)、または4個のアミノ酸だけ隔たって(10〜15オングストローム)、または5個のアミノ酸だけ隔たって(15〜20オングストローム)、または6個のアミノ酸だけ隔たって(20〜25オングストローム)前記担体分子のアミノ酸残基にカップリングしており、前記アミノ酸残基が、リジン、システイン、チロシン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、及びアルギニンからなる群から選択される、化合物。
- 3:1の最小カップリング比で担体分子のアミノ酸残基で担体分子にカップリングした光増感剤を含み、前記担体分子が選択的に標的細胞に結合する化合物であって、前記担体分子がヒト化されているScFvまたはヒトのScFvであり;前記光増感剤が2個のアミノ酸だけ隔たって(3.5〜7.5オングストローム)、または3個のアミノ酸だけ隔たって(9〜12オングストローム)、または4個のアミノ酸だけ隔たって(10〜15オングストローム)、または5個のアミノ酸だけ隔たって(15〜20オングストローム)、または6個のアミノ酸だけ隔たって(20〜25オングストローム)前記担体分子のアミノ酸残基にカップリングしており、前記アミノ酸残基が、リジン、システイン、チロシン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、及びアルギニンからなる群から選択される、化合物。
- 非カップリング形態である場合の特性と比較して、カップリング形態において前記光増感剤及び前記担体分子の機能特性及び物理的特性が変化しない、請求項17または18に記載の化合物。
- 前記光増感剤が単官能の光感受性物質である、請求項17〜19のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記光増感剤が、ヘマトポルフィリン、天然ポルフィリン、天然クロリン、天然バクテリオクロリン、フェオホルビド、ピロフェオホルビドa、フォトクロル、クロリン、クロリンe6、モノ-l-アスパルチルクロリンe6、ジ-l-アスパルチルクロリンe6、スズ(IV)クロリンe6、天然バクテリオクロロフィルパラジウム、バクテリオフェオホルビドパラジウム、合成クロリン、合成バクテリオクロリン、メタ-テトラヒドロキシフェニルクロリン及びバクテリオクロリン、ベンゾポルフィリン、モノベンゾポルフィリン、ベルテポルフィン、フタロシアニン、スルホン化アルミニウムフタロシアニン(ジスルホン化及びテトラスルホン化)、スルホン化アルミニウムナフタロシアニン、プルプリン、プルプリン-18、オクタエチルプルプリンスズ及びオクタエチルプルプリン亜鉛、スズエチオプルプリン、ベルジン、ポルフィセン、合成ポルフィリン、合成クロリン、合成バクテリオクロリン、無金属メソ-トリエチニルポルフィリン、メタル化メソ-トリエチニルポルフィリン、コア修飾ポルフィリン、拡張ポルフィリン(テキサフィリン)、モテキサフィンルテチウム、モテキサフィンガドリニウム、フェノチアジニウム、メチレンブルー、トルイジンブルー、シアニン、メロシアニン-540、アクリジン色素、BODIPY色素、アザ-BODIPY、ヒペリシン、ハロゲン化スクアライン色素、ハロゲン化キサンテン色素、エオシン、及びローズベンガルからなる群から選択される少なくとも1種類である、請求項20に記載の化合物。
- 前記担体分子にカップリングしている光増感剤の間の距離が6個のアミノ酸だけ隔たって(20〜25オングストローム)いる、請求項17〜21のいずれか一項に記載の化合物。
- 一重項酸素及び活性酸素種の収率を高めるための、前記光増感剤の機能を調節することができる調節剤をさらに含む、請求項17〜22のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記調節剤が、安息香酸、アジド基を含有する安息香酸、4-アジドテトラフルオロフェニル安息香酸、アジド部分を有する芳香族基を含有する安息香酸、アジド部分を有するヘテロ芳香族基を含有する安息香酸、ビタミンE類似体、トロロックス、ブチルヒドロキシルトルエン、没食子酸プロピル、デオキシコール酸、及びウルソデオキシコール酸からなる群から選択される、請求項23に記載の化合物。
- 前記芳香族基またはヘテロ芳香族基が、ポリフルオロベンゼン、ナフタリン、ナフトキノン、アントラセン、アントラキノン、フェナントレン、テトラセン、ナフタセンジオン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、インドール、イソインドール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピラジン、ベンズイミダゾール、ベンゾフラン、ジベンゾフラン、カルバゾール、アクリジン、アクリドン、及びフェナントリジン、キサンチン、キサントン、フラボン、クマリン、並びにそれらのスルフェナートからなる群から選択される、請求項24に記載の化合物。
- 視覚化剤をさらに含み、光力学的療法(PDT)の調節を可能にするための、請求項17〜25のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記視覚化剤が蛍光色素または発光色素である、請求項26に記載の化合物。
- 前記担体分子がヒト化されているScFvまたはヒトのScFvであり、前記光増感剤がピロフェオホルビドaである、請求項17〜27のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記担体分子がヒト化されているScFvまたはヒトのScFvであり、前記光増感剤がベンゾポルフィリン誘導体一酸(ベルテポルフィン)である、請求項17〜27のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記担体分子がヒト化されているScFvまたはヒトのScFvであり、前記光増感剤がパラジウム-バクテリオフェオホルビドである、請求項17〜27のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記担体分子がヒト化されているScFvまたはヒトのScFvであり、前記光増感剤がモノ-l-アスパルチルクロリンe6である、請求項17〜27のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記担体分子がヒト化されているScFvまたはヒトのScFvであり、前記光増感剤がメタ-テトラヒドロキシフェニルクロリンである、請求項17〜27のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記担体分子がヒト化されているScFvまたはヒトのScFvであり、前記光増感剤がスズエチオプルプリン(ロスタポルフィン)である、請求項17〜27のいずれか一項に記載の化合物。
- 標的細胞の破壊を必要とする疾患の診断のための医薬の製造における、請求項17〜33のいずれか一項に記載の化合物の使用。
- 標的細胞の破壊を必要とする疾患の治療及び/または予防のための医薬の製造における、請求項17〜33のいずれか一項に記載の化合物の使用。
- 治療される前記疾患が、癌、加齢性黄斑変性症、免疫障害、心血管疾患、並びにウイルス、細菌または真菌性感染を含めた微生物感染、BSEなどのプリオン病、及び歯肉炎などの口腔/歯の疾患からなる群から選択される、請求項34または35に記載の使用。
- 治療される前記疾患が、大腸、肺、乳房、頭頸部、前立腺、皮膚、胃/胃腸、膀胱の癌、及びバレット食道などの前癌性病変である、請求項36に記載の使用。
- 前記医薬が、露光前に前記化合物を患者に投与するための医薬である、請求項34〜37のいずれか一項に記載の使用。
- 請求項17〜33のいずれか一項に記載の化合物、及び医薬として許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物。
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