TWI736084B - 以免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的用途，及該以免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法 - Google Patents

Abstract

一種以一免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的用途，係應用於製備治療肝癌的藥物，其中，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子係投予一所需個體，以使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子標靶至位於該所需個體的一患部的一肝癌細胞，續以波長為540nm的光，對該所需個體的患部進行一光照處理15分鐘，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子產生自由基，並使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子阻斷細胞程序性死亡受體1及細胞程序性死亡配體1的專一性結合。

Description

以免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒 子的用途，及該以免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法

本發明係關於一種以一免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的用途，尤其是一種以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子用以製備治療肝癌的藥物的用途。本發明另關於該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法。

癌症免疫療法(cancer immunotherapy)係指藉由人為刺激免疫系統，提高免疫系統對抗癌症的能力，以治療癌症的方法。舉例而言，細胞程序性死亡受體1(programmed cell-death protein 1，簡稱PD-1)及細胞程序性死亡配體1(programmed cell-death ligand 1，簡稱PD-L1)的專一性結合可以抑制與T細胞的活化有關的免疫檢查點途徑(immune checkpoint pathway)，因此對PD-1及/或PD-L1具有專一性的抗體藥物(例如，Nivolumab、Pembrolizumab等)即能夠作為免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitor，簡稱ICI)，可以阻斷癌症細胞的自我保護機制，使一自然殺手細胞(natural killer cell，簡稱NK細胞)不再受到免疫檢查點的調控，能夠恢復對抗癌症細胞的能力。

然而，癌症免疫療法相關的副作用可能會影響正常的組織，例如會造成皮疹(rash)或搔癢(itching)等皮膚症狀(skin symptom)，或造成腹瀉(idarrhoea)、嚴重腹痛(severe abdominal pain)等腸胃道症狀(gastrointestinal symptom)，甚至可能造成疲勞(fatigue)、體重減輕(weight loss)、噁心/嘔吐(nausea/vomiting)、口渴或食慾過盛(excessive thirst or appetite)、頻尿(frequent urination)等內分泌症狀(endocrine symptom)，及呼吸急促(shorness of breath)、咳嗽(cough)等呼吸道症狀(respiratory symptom)。

又，光動力療法(photodynamic therapy，簡稱PDT)則是涉及光與光敏劑(photosensitizer)的光療法(phototherapy)，藉由一光照處理來激活該光敏劑，以產生能夠誘發光毒性(phototoxicity)的自由基(free radical)，進而殺死標靶細胞(target cell)，卻又不會損傷鄰近的健康組織。

然而，長期暴露在光源的過程中，容易使患者的皮膚組織對光變得敏感，並容易發生紅斑(erythema)、疼痛(pain)、燒傷(burn)、水腫(edema)、搔癢(itching)、脫屑(desquamation)或形成膿皰(pustular formation)，因此容易降低患者的長期滿意度(long-term patient satisfaction)。

綜上所述，無論是癌症免疫療法或光動力療法各有其優缺點，若是能夠開發同時能夠誘發免疫系統，且能夠搭配該光照處理以誘發光毒性的光免疫療法(photoimmunotherapy，簡稱PIT)藥物，必能夠降低藥物的使用量，進而減少各種副作用發生的可能性，提升患者的生活品質。

為解決上述問題，本發明的目的是提供一種以一免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的用途，係用以製備治療肝癌的藥物者。

本發明的次一目的是提供一種以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法，係用以製備獲得可以應用於光免疫療法的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子者。

本發明的再一目的是提供一種以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法，係能夠製備獲得容易分離純化的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子者。

本發明的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的用途，係可以應用於製備治療肝癌的藥物；其中，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子係投予一所需個體，以使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子標靶至位於該所需個體的一患部的一肝癌細胞，續以波長為540nm的光，對該所需個體的患部進行一光照處理15分鐘，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子產生自由基，並使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子阻斷細胞程序性死亡受體1及細胞程序性死亡配體1的專一性結合；其中，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子係以包含以下步驟的製備方法所製備獲得：混合數個功能性單體、一模版胜肽、一光敏劑及一溶劑，使該數個功能性單體於該溶劑中進行聚合時，將該模版胜肽及該光敏劑包覆其中，共同形成一分子拓印聚合物；及移除位於該分子拓印聚合物的表面的模版胜肽，以獲得該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動 及免疫複合奈米粒子的表面具有對應該模版胜肽的數個辨識孔位；其中，各該功能性單體為聚乙烯乙烯醇，該光敏劑為部花青素，且該模版胜肽為由如SEQ ID NO：4或8所示之胺基酸序列所組成。

據此，由於該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的表面具有能夠辨識PD-L1蛋白質的辨識孔位，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子能夠辨識該肝癌細胞上的PD-L1蛋白質，當該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子投予該所需個體時，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子即可以標靶至位於該所需個體的患部的肝癌細胞；再者，由於該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子包含該光敏劑，當對該所需個體的患部進行該光照處理時，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子中的光敏劑即會受到該光照處理而激活，於該所需個體的患部處產生能夠誘發光毒性的自由基；並且，由於該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子可以阻斷該肝癌細胞的自我保護機制(即，PD-1蛋白質及PD-L1蛋白質的專一性結合)，使該所需個體體內的一自然殺手細胞不再受到免疫檢查點的調控，而能夠恢復該自然殺手細胞對抗該肝癌細胞的活性，進而在經過體循環之後，能夠於該所需個體的全身啟動免疫機制，為本發明之功效。並且，藉由該模版胜肽為由如SEQ ID NO：4或8所示之胺基酸序列所組成，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子具有較佳的標靶至該肝癌細胞，以及阻斷PD-1蛋白質及PD-L1蛋白質的專一性結合的能力；再且，藉由各該功能性單體可以為聚乙烯乙烯醇，使該數個功能性單體能夠聚合形成穩定的結構，並使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子具有良好的生物相容性，進而避免在將該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈 米粒子投予該生物體時，使該生物體發生不良的反應；此外，藉由該光敏劑可以為部花青素，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子在受到波長為540nm之光，進行該光照處理時，可以有效地產生能夠誘發光毒性的自由基。

本發明的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的用途，其中，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子係能夠以口服投予、靜脈注射、肌肉注射、腹膜內注射的方式投予該所需個體。如此，藉由投予途徑的調整，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子能夠有效地進入該所需個體的體內。

本發明的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的用途，其中，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子係能夠以每週每公斤之該所需個體投予0.001~1000毫克的劑量投予。如此，藉由投予劑量的調整，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子能夠有效地發揮其生物活性，促進該肝癌細胞的死亡。

本發明的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法，包含：混合數個功能性單體、一模版胜肽、一光敏劑及一溶劑，使該該數個功能性單體於該溶劑中進行聚合時，將該模版胜肽及該光敏劑包覆其中，共同形成一分子拓印聚合物；及移除位於該分子拓印聚合物的表面的模版胜肽，以獲得該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的表面具有對應該模版胜肽的數個辨識孔位；其中，各該功能性單體為聚乙烯乙烯醇，該光敏劑為部花青素，且該模版胜肽可以為由如SEQ ID NO：4或8所示之胺基酸序列所組成。

據此，本發明的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫 複合奈米粒子的製備方法，可以獲得表面具有能夠辨識PD-L1蛋白質的辨識孔位之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子能夠辨識該肝癌細胞上的PD-L1蛋白質，因此當該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子投予該所需個體時，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子即可以標靶至位於該所需個體的患部的肝癌細胞；再者，由於該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子包含該光敏劑，當對該所需個體的患部進行該光照處理時，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子中的光敏劑即會受到該光照處理而激活，於該所需個體的患部處產生能夠誘發光毒性的自由基；並且，由於該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子可以阻斷該肝癌細胞的自我保護機制(即，PD-1蛋白質及PD-L1蛋白質的專一性結合)，使該所需個體體內的自然殺手細胞不再受到免疫檢查點的調控，而能夠恢復該自然殺手細胞對抗該肝癌細胞的活性，進而在經過體循環之後，能夠於該所需個體的全身啟動免疫機制，為本發明之功效。並且，藉由該模版胜肽為由如SEQ ID NO：4或8所示之胺基酸序列所組成，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子具有較佳的標靶至該肝癌細胞，以及阻斷PD-1蛋白質及PD-L1蛋白質的專一性結合的能力；再且，藉由各該功能性單體可以為聚乙烯乙烯醇，使該數個功能性單體能夠聚合形成穩定的結構，並使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子具有良好的生物相容性，進而避免在將該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子投予該生物體時，使該生物體發生不良的反應；此外，藉由該光敏劑可以為部花青素，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子在受到波長為540nm之光，進行該光照處理時，可以有效地產 生能夠誘發光毒性的自由基。

本發明的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法，其中，各該功能性單體可以為乙烯莫耳百分比為5~50mol%的聚乙烯乙烯醇。如此，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子具有較佳的拓印效果。

本發明的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法，其中，該溶劑可以為水。如此，可以降低該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備成本。

本發明的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法，其中，使該數個功能性單體進行聚合時，可以同時將該模版胜肽及一磁性顆粒包覆其中，以共同形成該分子拓印聚合物。如此，工者能夠藉由施以外界磁場分離純化該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子(例如，利用磁石進行吸附)，達成提升該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子在進行分離純化時的便利性之功效。

本發明的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法，其中，該磁性顆粒的磁化率大於±0.1emu/g。如此，可以降低該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備成本。

〔第1a圖〕試驗(A)中，第A1-1~A1-3組奈米粒子的平均粒徑的柱狀圖。

〔第1b圖〕試驗(A)中，第A1-0~A1-3組奈米粒子的粒徑分布圖。

〔第1c圖〕試驗(A)中，第A2-1~A2-3組奈米粒子的平均粒徑的柱狀圖。

〔第1d圖〕試驗(A)中，第A2-0~A2-3組奈米粒子的粒徑分布圖。

〔第2a圖〕試驗(B)中，第B1-0~B1-1組奈米粒子的模版胜肽吸附量的柱狀圖。

〔第2b圖〕試驗(B)中，第B2-0~B2-1組奈米粒子的模版胜肽吸附量的柱狀圖。

〔第3圖〕試驗(C)中，以一免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP的模版胜肽吸附量變化曲線圖。

〔第4圖〕試驗(D)中，第D0~D1組奈米粒子的模版胜肽吸附量變化曲線圖。

〔第5圖〕試驗(E)中，第E0~E1組奈米粒子的磁通量變化曲線圖。

〔第6圖〕試驗(F)中，第F1~F2組奈米粒子的比表面積柱狀圖。

〔第7圖〕試驗(G)中，第G1~G4組肝癌細胞的細胞存活率。

〔第8a圖〕試驗(H)中，於第H0組肝癌細胞中加入0、100、200、300、400、500μg/mL等不同濃度的非以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子NIP共同培養1、2、3天之後，第H0組肝癌細胞的細胞存活率。

〔第8b圖〕試驗(H)中，於第H1組肝癌細胞中加入0、100、200、300、400、500μg/mL等不同濃度的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP共同培養1、2、3天之後，第H1組肝癌細胞的細胞存活率。

〔第8c圖〕試驗(H)中，將0、100、200、300、400、500μg/mL等不同濃度的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP混合NK細胞後，續加入第H2組肝癌細胞中共同培養1、2、3天不同時間之後， 第H2組肝癌細胞的細胞存活率。

〔第8d圖〕試驗(H)中，於第H3組肝癌細胞中加入0、100、200、300、400、500μg/mL等不同濃度的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP，進行照光處理，並培養1、2、3天之後，第H3組肝癌細胞的細胞存活率。

〔第8e圖〕試驗(H)中，將0、100、200、300、400、500μg/mL等不同濃度的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP混合NK細胞後，續加入第H4組肝癌細胞中，進行照光處理，並培養共同培養1、2、3天之後，第H4組肝癌細胞的細胞存活率。

〔第9圖〕試驗(I)中，第I1-1~I1-4組肝癌細胞中，細胞凋亡途徑中的半胱天冬酶-8(caspase-8，簡稱CASP8)、半胱天冬酶-3(caspase-3，簡稱CASP3)、半胱天冬酶-9(caspase-9，簡稱CASP9)、細胞色素c(cytochrome c，簡稱CYCS)、Bcl-2相關X蛋白質(Bcl-2-associated X protein，簡稱Bax)、BH3反應域死亡促效劑(BH3 interaction-domain death agonist，簡稱Bid)及B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，簡稱Bcl2)等主要基因的相對表現量。

〔第10圖〕試驗(J)中，第J0~J2組肝癌細胞的細胞存活率。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明之一實施例的以一免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法，係藉由使數個功能性單體(functional monomer)、一模版胜肽及一光敏劑共同形成一分子拓印聚合物，續移除位於 該分子拓印聚合物的表面的模版胜肽所獲得。

詳而言之，該數個功能性單體可以進行聚合，並且於進行聚合的同時包覆該模版胜肽及該光敏劑，以形成該分子拓印聚合物，該模板胜肽可以結合於該分子拓印聚合物的表面，以於該分子拓印聚合物的表面形成有數個辨識孔位(recognition site)，各該辨識孔位係對應該模版胜肽的立體結構，因而在移除位於該分子拓印聚合物的表面的模版胜肽之後所獲得的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的表面即會露出該辨識孔位。舉例而言，該功能性單體可以為聚乙烯乙烯醇(poly(ethylene-co-vinyl alcohol)，簡稱EVAL)、甲殼素、聚(羥甲基3,4-伸乙基二氧噻吩)(poly(hydroxymethyl 3,4-ethylene dioxythiophene、聚(苯胺-共-甲酸(poly(aniline-co-metanilic acid))、聚苯硫醚(poly(p-phenylene sulfide))、聚噻吩(poly(thiophene))。於本實施例中，該功能性單體為聚乙烯乙烯醇，其乙烯莫耳百分比介於5~50mol%之間，其能夠形成穩定的結構，且具有良好的生物相容性。

為了使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子能夠標靶該免疫檢查點阻斷分子，並可以作為免疫檢查點抑制劑，本實施例中，該模版胜肽可以為PD-L1蛋白質的部分片段，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的表面具有可以辨識PD-L1蛋白質的辨識孔位，是以該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子可以辨識該肝癌細胞上的PD-L1蛋白質，進而將該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子投予一所需個體時，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子可以結合PD-L1蛋白質，進而標靶至位於該所需個體的一患部的肝癌細胞，阻斷該肝癌細胞的自我保護機制(即，PD-1蛋白質及PD-L1蛋白質的專一性結合)，使該所需個體體 內的一自然殺手細胞不再受到免疫檢查點的調控。於本發明之第一實施例中，該模版胜肽包含如SEQ ID NO：1、2或3所示之胺基酸序列，較佳可以為由如SEQ ID NO：1、2、3或4所示之胺基酸序列所組成；於本發明之第二實施例中，該模版胜肽包含如SEQ ID NO：5、6或7所示之胺基酸序列，較佳可以為由如SEQ ID NO：5、6、7或8所示之胺基酸序列所組成。

值得注意的是，該數個功能性單體在聚合的同時也可以包覆該光敏劑，使所製備獲得的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子包含該光敏劑，該光敏劑係可以受到一光照處理而激活，產生能夠誘發光毒性的自由基(free radical)，促進該肝癌細胞的死亡。舉例而言，該光敏劑可以為血紫質(hematoporphyrin)、金屬紫質(metalloporphyrin)、卟啉烯(porphycene)、去鎂葉綠素酸(pheophorbide)、尿紅質(purpurin)、二氫卟酚(chlorin)、原紫質(protoporphrin)、酞青素(phthalocyanine)等卟啉類光敏劑(porphyrin photosensitizer)或補骨脂素(psoralean)、蒽環(anthracene)、硫屬吡喃染劑(chalacogenopyrylium dye)、氮-二-甲烷重排(ADPM)、花青素(cyanine)、吩噻嗪染劑(phenothiazinium dye)等非卟啉類光敏劑(non-porphyrin photosensitizer)，於本實施例中，該光敏劑為部花青素(merocyanine 540)，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子在受到波長為540nm之光，進行該光照處理時，可以有效地產生能夠誘發光毒性的自由基。

較佳地，可以將該數個功能性單體及該模版胜肽加入一溶劑中，使該數個功能性單體於該溶劑中進行聚合的同時包覆該模版胜肽，例如可以於0~25℃之溫度下，將包含該數個功能性單體及該模版胜肽的混合物加入該溶劑中，並以磁石攪拌1~30分鐘，以利形成該分子拓印聚合物。該溶劑係可以提供良好的聚合環境，舉例而言，該溶劑可以為水、異丙酮 (isopropanol)，或者為包含水及異丙酮的混合溶劑。

又，在形成該分子拓印聚合物之後，能夠以一清洗溶液清洗該分子拓印聚合物，以露出位於該分子拓印聚合物表面的辨識孔位，即可以獲得該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子。舉例而言，該清洗溶液可以為丙酮、乙醇、甲醇、水或包含前述溶劑之混合液體。

此外，為了有助於該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的分離純化，較佳可以於使該數個功能性單體在進行聚合的同時也包覆該磁性顆粒，使所製備獲得的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子包含該磁性顆粒(即，混合該數個功能性單體、該模版胜肽、該磁性顆粒及該溶劑，即可以使該數個功能性單體於該溶劑中進行聚合時，同時包覆該磁性顆粒)。該磁性顆粒的飽和磁化率可以大於±0.1emu/g，例如可以為具有超順磁性(superparamagnetism)的四氧化三鐵(Fe₃O₄)、氧化鐵(FeO)或三氧化二鐵(Fe₂O₃)。舉例而言，係提供一含鐵離子水溶液，該含鐵離子水溶液包含莫耳數比為2：1的三價鐵離子(Fe³⁺)及二價鐵離子(Fe²⁺)，於該含鐵離子水溶液中加入一沉澱劑之後，於60~95℃之溫度下，使該三價鐵離子及該二價鐵離子共同沉澱而形成四氧化三鐵；於本實施例中，係以氯化鐵(FeCl₃)及氯化亞鐵(FeCl₂)共同配製形成該含鐵離子水溶液，該沉澱劑為一氫氧化鈉水溶液(NaOH_(aq))或一氫氧化銨水溶液(NH₄OH_(aq))，且該沉澱劑所含的氫氧基(OH^-)與該含鐵離子水溶液的三價鐵離子(Fe³⁺)的莫耳數比為4：1。

在該分子拓印聚合物同時包含該磁性顆粒及該光敏劑的狀況下，該磁性顆粒的表面較佳能夠經過修飾，例如能夠以(3-氨基丙基)三乙氧基矽烷(3-aminopropyltriethoxysilane，簡稱APTES)進行修飾，此時，使該光敏劑(例如，部花青素)得以經由(3-氨基丙基)三乙氧基矽烷的矽烷基，接載 在該磁性顆粒上。詳而言之，於本實施例中，係將四氧化三鐵(0.2~5g)混合乙醇(10~250mL，乙醇濃度為99.5%)，於其中添加(3-氨基丙基)三乙氧基矽烷(10~1000μL)混合10~90分鐘，再加熱至100~300℃進行熱處理20~120小時，得一經修飾的磁性顆粒。

將該經修飾的磁性顆粒(5~1000mg)混合部花青素(10~1000μg/mL)1~30分鐘，移除上層溶液，再進行清洗，以得一複合磁性奈米粒子。

將該複合磁性奈米粒子(2~100mg)混合聚乙烯乙烯醇溶液(10~2000μL，溶於二甲基亞碸中，濃度為0.001~2wt%)及該模版胜肽(2~500μL)，得一混合溶液，將該混合溶液滴入0~25℃之去離子水中，以磁石攪拌1~30分鐘即可以形成該分子拓印聚合物，接著以該清洗溶液清洗該分子拓印聚合物即可以獲得該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子。

經由上述方法所製備獲得的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的表面具有能夠辨識PD-L1蛋白質的辨識孔位，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子能夠辨識該肝癌細胞上的PD-L1蛋白質，因此當該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子投予該所需個體時，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子即可以標靶至位於該所需個體的患部的肝癌細胞，並能夠在該所需個體的體內阻斷該肝癌細胞的自我保護機制(即，PD-1蛋白質及PD-L1蛋白質的專一性結合)，使該所需個體體內的自然殺手細胞不再受到免疫檢查點的調控，而能夠恢復該自然殺手細胞對抗該肝癌細胞的活性。

該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒 子能夠誘發免疫系統，因而可以作為一種癌症免疫療法的活性成分，較佳係可以將該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子用於製備治療或輔助性治療肝癌的藥物。該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子可以與醫藥學上可接受之載劑或賦形劑共同形成一醫藥組合物，或是於該醫藥組合物中額外添加他種有助於促進該肝癌細胞的死亡的活性成分(例如，自然殺手細胞或T細胞)，其中，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子係可以製備成任何便於投予該所需個體的型式，如錠劑、膠囊、粉劑、粒劑或液劑等。

又，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子係能夠以各種合適之投予途徑投予該所需個體，舉例而言，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子能夠以非經腸道(parenterally)或口服(orally)的方式投予該所需個體，例如該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子則可以利用靜脈注射(intravenous injection，簡稱IV injection)、肌肉注射(intramuscular injection，簡稱IM injection)、腹膜內注射(intraperitoneal injection，簡稱IP injection)等方式投予該所需個體。

再者，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子能夠以0.001~1000毫克/公斤/週之投予劑量投予該所需個體(即，針對體重為60公斤的成人，每週的投予劑量可以為0.06毫克~60公克)；惟前述之投予劑量應對應該所需個體及途徑的不同而有所差異，於此不加以限制。

又，當該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子包含該光敏劑時，在將該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子投予該所需個體之後，更可以對該所需個體進行該光照處理 (例如，以波長為460~580nm的光，對該所需個體的患部進行該光照處理0.01~30分鐘)，使該光敏劑受到該光照處理而激活，以產生能夠誘發光毒性的自由基，而促進該肝癌細胞的死亡。

此外，由於該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子更包含該磁性顆粒，在製備獲得該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子之後，可以利用藉由施以外界磁場進行分離純化(例如，可以利用磁石進行吸附，此為本領域具有通常知識者可以理解，恕不贅述)，因此可以容易地分離純化該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子。

為優化本發明之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法，遂進行以下試驗：

(A)以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的粒徑變化

本試驗係如第1表所示，以由如SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列所組成的模版胜肽(濃度為100μg/mL)，混合包含不同乙烯莫耳百分比的聚乙烯乙烯醇及該複合磁性奈米粒子，以共同形成第一實施例的分子拓印聚合物(第A1-1組)之後，以水作為該清洗溶液清洗該分子拓印聚合物，以移除該模版胜肽而獲得第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子(簡稱EIP，第A1-2組)；接著再混合該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP與一再吸附溶液(其中含濃度為100μg/mL的模版胜肽)，使該模版胜肽可以再次吸附於該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP的表面上的辨識孔位，為便於後續說明，該辨識孔位結合有該模版胜肽的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP稱為第一實施例的再吸附粒子(第A1- 3組)。

請參照第1a圖所示，在移除該模版胜肽之前，第一實施例的分子拓印聚合物(第A1-1組)之粒徑(直徑)係隨聚乙烯乙烯醇的乙烯莫耳百分比而有所提升，分別為165.1±27.8nm(27mol%)、201.2±49.7nm(32mol%)、214.0±51.3nm(38mol%)及230.2±30.3nm(44mol%)。在移除該模版胜肽之後，第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP(第A1-2組)的粒徑比移除前為大，分別為237.7±30.4nm(27mol%)、364.5±26.9nm(32mol%)、492.9±80.8nm(38mol%)及271.6±94.9nm(44mol%)，其理由可能為親水的模版胜肽被移除後，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP較為疏水，而產生團聚的現象。又，在再次吸附之後的第一實施例的再吸附粒子(第A1-3組)的粒徑分別為183.4±47.3nm(27mol%)、120.1±23.2nm(32mol%)、124.5±23.8nm(38mol%)及199.9±50.7nm(44mol%)，顯示親水的模版胜肽可以再次被吸附於該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合 奈米粒子EIP的表面上的辨識孔位，使其親水性得以提升。

另，觀察使用乙烯莫耳百分比為27mol%的聚乙烯乙烯醇所得的第一實施例的分子拓印聚合物(第A1-1組)、第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP(第A1-2組)及第一實施例的再吸附粒子(第A1-3組)的粒徑分布變化，以及第一實施例的該經修飾的磁性顆粒(Fe₃O₄@APTES，第A1-0組)的粒徑分布變化，其結果如第1b圖所示，在移除該模版胜肽後的第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP(第A1-2組)的粒徑分布較廣，而在再次吸附之後的第一實施例的再吸附粒子(第A1-3組)的粒徑則可以變得較為均一。

本試驗另如第2表所示，以由如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列所組成的模版胜肽(濃度為100μg/mL)，混合包含不同乙烯莫耳百分比的聚乙烯乙烯醇及該複合磁性奈米粒子，以共同形成第二實施例的分子拓印聚合物(第A2-1組)之後，以水作為該清洗溶液清洗該分子拓印聚合物，以移除該模版胜肽而獲得第二實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子(簡稱RIP，第A2-2組)；接著再混合該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子RIP與該再吸附溶液(其中含濃度為100μg/mL的模版胜肽)，使該模版胜肽可以再次吸附於該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子RIP的表面上的辨識孔位，為便於後續說明，該辨識孔位結合有該模版胜肽的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子RIP稱為第二實施例的再吸附粒子(第A2-3組)。

請參照第1c圖所示，在移除該模版胜肽之前，第二實施例的分子拓印聚合物(第A2-1組)之粒徑(直徑)係隨聚乙烯乙烯醇的乙烯莫耳百分比而有所提升，分別為293.5±28.7nm(27mol%)、313.0±67.9nm(32mol%)、353.1±47.1nm(38mol%)及373.8±51.9nm(44mol%)。在移除該模版胜肽之後，第二實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子RIP(第A2-2組)的粒徑比移除前為大，分別為398.9±50.6nm(27mol%)、423.0±34.2nm(32mol%)、429.8±153.9nm(38mol%)及244.2±36.8nm(44mol%)，其理由可能為親水的模版胜肽被移除後，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子RIP較為疏水，而產生團聚的現象。又，在再次吸附之後的第二實施例的再吸附粒子(第A2-3組)的粒徑分別為173.5±14.4nm(27mol%)、323.8±69.0nm(32mol%)、249.0±60.8nm(38mol%)及163.8±47.4nm(44mol%)，顯示親水的模版胜肽可以再次被吸附於該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子RIP的表面上的辨識孔位，使其親水性得以提升。

另，觀察使用乙烯莫耳百分比為44mol%的聚乙烯乙烯醇所得的第二實施例的分子拓印聚合物(第A2-1組)、第二實施例的以該免疫檢查 點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子RIP(第A2-2組)及第二實施例的再吸附粒子(第A2-3組)的粒徑分布變化，以及第二實施例的該經修飾的磁性顆粒(Fe₃O₄@APTES，第A2-0組)的粒徑分布變化，其結果如第1d圖所示，在移除該模版胜肽後的第二實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子RIP(第A2-2組)的粒徑分布較廣，而在再次吸附之後的第二實施例的再吸附粒子(第A2-3組)的粒徑則可以變得較為均一。

(B)乙烯莫耳百分比的影響

請參照第3表所示，本試驗係將包含不同乙烯莫耳百分比的聚乙烯乙烯醇所製備獲得的第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP作為第B1-1組，以及同樣包含前述不同乙烯莫耳百分比的聚乙烯乙烯醇，惟未加入該模版胜肽所製備獲得的非以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子NIP作為第B1-0組。

量測第B1-0組的非以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子NIP所能夠吸附的模版胜肽的量，以及第B1-1組的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP所能夠吸附的模版胜肽的量，其結果如第2a圖所示，並依(式一)計算包含不同乙烯莫耳百分比的聚乙烯乙烯醇所製備獲得的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免 疫複合奈米粒子EIP的拓印效率α。

其結果顯示，乙烯莫耳百分比為27mol%、32mol%、38mol%及44mol%的聚乙烯乙烯醇所製備獲得的第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP的拓印效率分別為2(27mol%)、0.91(32mol%)、1.02(38mol%)及1.03(44mol%)，可以得知以乙烯莫耳百分比為27mol%的聚乙烯乙烯醇所製備獲得的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP的拓印效率最佳，因此後續所有試驗均以乙烯莫耳百分比為27mol%的聚乙烯乙烯醇進行。

請參照第4表所示，本試驗另將包含不同乙烯莫耳百分比的聚乙烯乙烯醇所製備獲得的第二實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子RIP作為第B2-1組，以及同樣包含前述不同乙烯莫耳百分比的聚乙烯乙烯醇，惟未加入該模版胜肽所製備獲得的非以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子NIP作為第B2-0組。

量測第B2-0組的非以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子NIP所能夠吸附的模版胜肽的量，以及第B2-1組的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子RIP所能夠吸附的模版 胜肽的量，其結果如第2b圖所示，並依(式二)計算包含不同乙烯莫耳百分比的聚乙烯乙烯醇所製備獲得的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子RIP的拓印效率α。

其結果顯示，乙烯莫耳百分比為27mol%、32mol%、38mol%及44mol%的聚乙烯乙烯醇所製備獲得的第二實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子RIP的拓印效率分別為2.05(27mol%)、0.71(32mol%)、0.85(38mol%)及4.34(44mol%)，可以得知以乙烯莫耳百分比為44mol%的聚乙烯乙烯醇所製備獲得的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子RIP的拓印效率最佳，因此後續所有試驗均以乙烯莫耳百分比為44mol%的聚乙烯乙烯醇進行。

(C)吸附時間的影響

另外測試第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP與該再吸附溶液中的模版胜肽之間的吸附時間，對第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP的吸附量所造成的影響，其結果如第3圖所示，在吸附時間為1分鐘時，第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP的吸附量即已達到最高的34.36±0.29μg/mg，而在吸附時間為5、10、30及60分鐘時，第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP的吸附量分別為34.68±1.74μg/mg(5分鐘)、35.53±0.73μg/mg(10分鐘)、36.43±0.71μg/mg(30分鐘)及37.21±0.13μg/mg(60分鐘)，惟後續所有試驗均以10分鐘的吸附時間進行。

(D)再吸附溶液的濃度的影響

請參照第5表所示，混合第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP(第D1組)與包含不同濃度的模版胜肽的再吸附溶液，於10分鐘的吸附時間後，第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP(第D1組)的吸附量如第4圖所示，在該再吸附溶液包含濃度為50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL及200μg/mL的模版胜肽時，第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP(第D1組)的吸附量分別為32.0±3.5μg/mg(50μg/mL)、41.5±4.0μg/mg(100μg/mL)、42.4±2.0μg/mg(150μg/mL)及66.1±1.2μg/mg(200μg/mL)。

又，另測試該非以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子NIP(第D0組)與包含不同濃度的模版胜肽的再吸附溶液的吸附曲線，其結果同樣如第4圖所示，在該再吸附溶液包含濃度為50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL及200μg/mL的模版胜肽時，該非以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子NIP同樣能夠吸附該再吸附溶液中的模版胜肽，其吸附量分別為15.7±1.5μg/mg(50μg/mL)、33.1±0.8μg/mg(100μg/mL)、27.7±2.1μg/mg(150μg/mL)及39.1±0.7μg/mg(200μg/mL)，其可能理由在於：用以製備獲得第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標 靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP的聚乙烯乙烯醇與該模版胜肽之間具有足以使該模版胜肽吸附於第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP的表面上的親和力，且其吸附量與該在吸附溶液中的模版胜肽的濃度有關。

此外，依上述(式一)換算第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP對包含不同濃度的模版胜肽的再吸附溶液的拓印效率，分別為2.0(50μg/mL)、1.8(100μg/mL)、1.5(150μg/mL)及1.5(200μg/mL)，顯示當該再吸附溶液中的模版胜肽的濃度為50μg/mL時，第D1組的第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP的吸附量趨於飽和，因而導致拓印效率呈負成長。

(E)以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的磁滯曲線

本試驗係如第6表所示，以超導量子干涉儀(superconducting quantum interference device，簡稱SQUID)測定該經修飾的磁性顆粒(第E0組)、第一實施例的分子拓印聚合物(第E1組，移除該模版胜肽前)及第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP(第E2組，移除該模版胜肽後)的磁滯曲線(hvsteresis curve)。

請參照第5圖所示，無論是經修飾的磁性顆粒(第E0組)、第E1組的分子拓印聚合物(第一實施例)或第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP(第E2組)都具有超順磁性。

又，經修飾的磁性顆粒(第E0組)的磁通量(magnetic flux)為55.8emg/g，第一實施例的分子拓印聚合物(第E1組)因為還包含該功能性單體(EVAL)及該模版胜肽，導致非磁性物質的比例提升，使磁通量下降至50.2emg/g，而第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP(第E2組)則是是由於移除該模版胜肽後，使磁性物質的比例再次提升，使磁通量上升到51.4emg/g。

(F)以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的比表面積

本試驗係如第7表所示，以比表面積分析儀(specific surface area and porosimetry analyzer，簡稱BET)測定第一實施例的分子拓印聚合物(第F1組，移除該模版胜肽前)及第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP(第F2組，移除該模版胜肽後)的比表面積(specific surface area)。

請參照第6圖所示，第一實施例的分子拓印聚合物(第F1組)的比表面積約為281.4±99.9m²/g，第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP(第F2組)由於表面形成的辨識孔位，使其比表面積上升為431.1±173.5mg²/g。

為證實經由本發明之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法所製備獲得的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子確實能夠有效地促進肝癌細胞的死亡，另進行以下試驗：

(G)細胞毒性

為了排除該磁性顆粒(四氧化三鐵)、該經修飾的磁性顆粒(經APTES修飾的四氧化三鐵，簡稱Fe₃O₄@APTES)及該光敏劑(部花青素)對細胞具有細胞毒性的可能性，係如第8表所示，將該磁性顆粒(第G1組)、該經修飾的磁性顆粒(第G2組)、該經修飾的磁性顆粒及該光敏劑的混合物(第G3組)，及使該數個功能性單體(EVAL)聚合並包覆該經修飾的磁性顆粒及該光敏劑(第G4組)所獲得的奈米粒子加入人類肝癌細胞株(HepG2細胞)中，測試HepG2細胞的存活率。

請參照第7圖所示，無論加入第G1~G4組的奈米粒子均不會影響HepG2細胞的細胞存活率，顯示該磁性顆粒、該經修飾的磁性顆粒及該光敏劑均不具有細胞毒性。

(H)於癌症免疫阻斷療法(cancer immunotherapy)及光動療法(photodynamic therapy，簡稱PDT)的應用

本試驗係以由如SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列所組成的模版胜肽，混合該數個功能性單體(EVAL)、該光敏劑(部花青素)及該經修飾的磁性顆粒(Fe₃O₄@APTES)，以製備獲得第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP，另混合該數個功能性單體(EVAL)、該光敏劑(部花青素)及該經修飾的磁性顆粒(Fe₃O₄@APTES)(即，未加入該模版胜肽)，以製備獲得該非以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子NIP。

接著，本試驗係如第9表所示，將該非以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子NIP加入HepG2細胞中(第H0組)，測試第H0組HepG2細胞的細胞存活率，其結果如第8a圖所示，第H0組HepG2細胞仍可以持續增生，顯示該非以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子NIP不會抑制HepG2細胞的細胞存活率。

另如第9表所示，將該第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP加入HepG2細胞中(第H1組)，測試第H1組HepG2細胞的細胞存活率，其結果如第8b圖所示，第H1組HepG2細胞雖仍可以持續增生，顯示該第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP亦不會抑制HepG2細胞的細胞存活率。

再如第9表所示，將該第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP與該自然殺手細胞共同加入HepG2細胞中(第H2組)，測試第H2組HepG2細胞的細胞存活率，其結果如第8c圖所示，第H2組HepG2細胞的細胞存活率明顯下降顯示以由如SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列所組成的模版胜肽所形成的第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP確實具有提升該自然殺手細胞對抗該肝癌細胞的活性的作用，進而有效抑制HepG2細胞的存活(即，第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP能夠應用於癌症免疫阻斷療法)。

續如第9表所示，將該第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP加入HepG2細胞中之後，以波長為540nm的光，對該HepG2細胞進行15分鐘的照光處理(第H3組)，測試第H3組HepG2細胞的細胞存活率，其結果如第8d圖所示，第H3組HepG2 細胞的細胞存活率亦明顯下降，顯示．以由如SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列所組成的模版胜肽所形成的第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP確實在照光的情況下可以有效抑制HepG2細胞的存活(即，第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP能夠應用於光動療法)。

又如第9表所示，將該第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP與該自然殺手細胞共同加入HepG2細胞中之後，以波長為540nm的光，對該HepG2細胞進行15分鐘的照光處理(第H4組)，測試第H4組HepG2細胞的細胞存活率，其結果如第8e圖所示，第H4組HepG2細胞的細胞存活率亦明顯下降，並且相較於第8c、8d圖所示的第H2、H3組HepG2細胞的細胞存活率，第H4組HepG2細胞的細胞存活率明顯較低，顯示以由如SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列所組成的模版胜肽所形成的第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP在同時應用於癌症免疫阻斷療法及光動療法時，具有較佳的效果。

(I)造成肝癌細胞死亡的分子機制

本試驗係如第10表所示，將第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP加入HepG2肝癌細胞之後，在未照光(第I1組)或照光(第I2組)的情況下，以定量即時聚合酶連鎖反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，簡稱Q-PCR)分別測試HepG2細胞的細胞凋亡途徑(apoptosis pathway)中CASP8、CASP3、CASP9、CYCS、Bax、Bid及Bcl2等主要基因的表現量，並依據未加入該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的HepG2細胞的主要基因的表現量換算其相對表現量。此外，將第一實施例的以該免疫檢查點阻斷分子為 標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP及該自然殺手細胞共同加入HepG2細胞之後，在未照光(第I3組)或照光(第I4組)的情況下測試前述主要基因的表現量，並換算其相對表現量。

請參照第9圖所示，相較於未進行照光處理的第I1組HepG2細胞，將該第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP加入HepG2細胞之後進行照光處理的第I2組HepG2細胞的CASP8、CASP3、CASP9、CYCS、Bax、Bid及Bcl2等基因的表現量均有提升，顯示該第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP係藉由促進細胞凋亡路徑的進行，進而實現癌症免疫阻斷療法。

同請參照第9圖所示，相較於未混合該自然殺手細胞的第I1組HepG2細胞，將該第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP及該自然殺手細胞共同加入的第I3組HepG2細胞的CASP3及Bid等基因的表現量亦有提升，顯示該第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP同樣藉由促進細胞凋亡路徑的進行，進而實現光動療法。

值得注意的是，請參照第9圖所示，相較於僅進行該光照處理的第I2組HepG2細胞，共同混合該自然殺手細胞之後，續進行該光照處理的 第I4組HepG2細胞的CASP8、CASP3及Bcl2等基因的表現量均有提升，而相較於僅混合該自然殺手細胞的第I3組HepG2細胞，共同混合該自然殺手細胞之後，續進行該光照處理的第I4組HepG2細胞的CASP8、CASP3、CASP9、CYCS、Bax、Bid及Bcl2等基因的表現量均有提升，顯示同時實施癌症免疫阻斷療法與光動療法具有較佳的效果。

(J)第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP及第二實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子RIP的比較

本試驗係如第11表所示，將第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP與該自然殺手細胞共同加入HepG2細胞中(第J1組)，或將第二實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子RIP與該自然殺手細胞共同加入HepG2細胞中(第J2組)之後，測試HepG2細胞的細胞存活率。本試驗另以僅加入該自然殺手細胞的HepG2細胞的細胞存活率作為第J0組。

請參照第10圖所示，無論是加入第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP或是加入第二實施例之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子RIP，都可以使HepG2細胞的存活率有所下降，其中以第一實施例之以該免疫檢查點阻斷分 子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子EIP的效果較佳。

綜上所述，由於該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的表面具有能夠辨識PD-PL蛋白質的辨識孔位，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子能夠辨識該肝癌細胞上的PD-L1蛋白質，當該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子投予該所需個體時，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子即可以標靶至位於該所需個體的患部的肝癌細胞；再者，由於該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子包含該光敏劑，當對該所需個體的患部進行該光照處理時，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子中的光敏劑即會受到該光照處理而激活，於該所需個體的患部處產生能夠誘發光毒性的自由基；並且，由於該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子可以阻斷該肝癌細胞的自我保護機制(即，PD-1蛋白質及PD-L1蛋白質的專一性結合)，使該所需個體體內的自然殺手細胞不再受到免疫檢查點的調控，而能夠恢復該自然殺手細胞對抗該肝癌細胞的活性，進而在經過體循環之後，能夠於該所需個體的全身啟動免疫機制，為本發明之功效。並且，藉由該模版胜肽為由如SEQ ID NO：4或8所示之胺基酸序列所組成，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子具有較佳的標靶至該肝癌細胞，以及阻斷PD-1蛋白質及PD-L1蛋白質的專一性結合的能力；再且，藉由各該功能性單體可以為聚乙烯乙烯醇，使該數個功能性單體能夠聚合形成穩定的結構，並使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子具有良好的生物相容性，進而避免在將該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子投予該生物體時，使該生物體發生不良的反應；此外，藉由該光敏劑可以為部花青素，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈 米粒子在受到波長為540nm之光，進行該光照處理時，可以有效地產生能夠誘發光毒性的自由基。

再者，本發明的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法，可以獲得表面具有能夠辨識PD-L1蛋白質的辨識孔位之以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子能夠辨識該肝癌細胞上的PD-L1蛋白質，因此當該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子投予該所需個體時，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子即可以標靶至位於該所需個體的患部的肝癌細胞；再者，由於該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子包含該光敏劑，當對該所需個體的患部進行該光照處理時，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子中的光敏劑即會受到該光照處理而激活，於該所需個體的患部處產生能夠誘發光毒性的自由基；並且，由於該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子可以阻斷該肝癌細胞的自我保護機制，使該所需個體體內的自然殺手細胞不再受到免疫檢查點的調控，而能夠恢復該自然殺手細胞的對抗該肝癌細胞活性，進而在經過體循環之後，能夠於該所需個體的全身啟動免疫機制，為本發明之功效。並且，藉由該模版胜肽為由如SEQ ID NO：4或8所示之胺基酸序列所組成，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子具有較佳的標靶至該肝癌細胞，以及阻斷PD-1蛋白質及PD-L1蛋白質的專一性結合的能力；再且，藉由各該功能性單體可以為聚乙烯乙烯醇，使該數個功能性單體能夠聚合形成穩定的結構，並使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子具有良好的生物相容性，進而避免在將該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子投予該生物體時，使該生物體發生不 良的反應；此外，藉由該光敏劑可以為部花青素，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子在受到波長為540nm之光，進行該光照處理時，可以有效地產生能夠誘發光毒性的自由基。

又，本發明的以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法，可以獲得包含該磁性顆粒的分子拓印聚合物，因此工者能夠藉由施以外界磁場分離純化該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子(例如，利用磁石進行吸附)，達成提升該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子在進行分離純化時的便利性之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

<110> 國立高雄大學

<120> 以免疫阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的用途，及該以免疫阻斷 分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens(人類)

<400> 1

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens(人類)

<400> 2

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens(人類)

<400> 3

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens(人類)

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens(人類)

<400> 5

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens(人類)

<400> 6

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens(人類)

<400> 7

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens(人類)

<400> 8

Claims (8)

1. 一種以一免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的用途，係應用於製備治療肝癌的藥物；其中，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子係投予一所需個體，以使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子標靶至位於該所需個體的一患部的一肝癌細胞，續以波長為540nm的光，對該所需個體的患部進行一光照處理15分鐘，使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子產生自由基，並使該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子阻斷細胞程序性死亡受體1及細胞程序性死亡配體1的專一性結合；其中，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子係以包含以下步驟的製備方法所製備獲得：混合數個功能性單體、一模版胜肽、一光敏劑及一溶劑，使該數個功能性單體於該溶劑中進行聚合時，將該模版胜肽及該光敏劑包覆其中，共同形成一分子拓印聚合物；及移除位於該分子拓印聚合物的表面的模版胜肽，以獲得該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子，該以該免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的表面具有對應該模版胜肽的數個辨識孔位；其中，各該功能性單體為聚乙烯乙烯醇，該光敏劑為部花青素，且該模版胜肽為由如SEQ ID NO：4或8所示之胺基酸序列所組成。
2. 如請求項1之以一免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的用途，其中，該以一免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子係以口服投予、靜脈注射、肌肉注射、腹膜內注射的方式投予該所需個體。
3. 如請求項1之以一免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的用途，其中，該以一免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子係以每週每公斤之該所需個體投予0.001~1000毫克的劑量投予。
4. 一種以一免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法，包含：混合數個功能性單體、一模版胜肽、一光敏劑及一溶劑，使該數個功能性單體於該溶劑中進行聚合時，將該模版胜肽及該光敏劑包覆其中，共同形成一分子拓印聚合物；及移除位於該分子拓印聚合物的表面的模版胜肽，以獲得該以一免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子，該以一免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的表面具有對應該模版胜肽的數個辨識孔位；其中，各該功能性單體為聚乙烯乙烯醇，該光敏劑為部花青素，且該模版胜肽為由如SEQ ID NO：4或8所示之胺基酸序列所組成。
5. 如請求項4之以一免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法，其中，各該功能性單體為乙烯莫耳百分比為5~50mol%的聚乙烯乙烯醇。
6. 如請求項4之以一免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法，其中，該溶劑為水。
7. 如請求項4之以一免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法，其中，使該數個功能性單體進行聚合時，同時將該模版胜肽及一磁性顆粒包覆其中，以共同形成該分子拓印聚合物。
8. 如請求項7之以一免疫檢查點阻斷分子為標靶之光動及免疫複合奈米粒子的製備方法，其中，該磁性顆粒的磁化率大於±0.1emu/g。

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