CZ303355B6

CZ303355B6 - Zpusob inaktivace patogenních prionu, fotosenzitizátor pro inaktivaci patogenních prionu a použití fotosenzitizátoru pro inaktivaci patogenních prionu

Info

Publication number: CZ303355B6
Application number: CZ20110009A
Authority: CZ
Inventors: Rakušan@Jan; Karásková@Marie; Holada@Karel; Janoušková@Olga
Original assignee: Centrum organické chemie s.r.o.; Univerzita Karlova V Praze
Priority date: 2011-01-06
Filing date: 2011-01-06
Publication date: 2012-08-08
Also published as: CZ20119A3

Abstract

Zpusob in vitro inaktivace patogenních prionu podle vynálezu zahrnuje ošetrení organického substrátu alespon jedním fotosenzitizátorem za soucasného pusobení svetla a diatomického kyslíku. Ve výhodném provedení vynálezu fotosenzitizátor tvorí alespon jedna látka ze skupiny derivátu fenothiazinu, porfyrinu, chlorinu, aminolevulové kyseliny, fenazinu, cyaninu, ftalocyaninu, naftalocyaninu. Reaktivní formy kyslíku vznikající interakcí fotosenzitizátoru se svetlem jsou generovány bezprostredne na fotosenzitizátorem vybarveném prionu a mají možnost na nej úcinne pusobit. Fotosenzitizátor je s výhodou tvoren látkou ze skupiny ftalocyaninu, pricemž základní strukturu fotosenzitizátoru tvorí sulfo skupiny nebo karboxy skupiny, nebo sulfamidické skupiny na ftalocyaninovém (porfyrinovém) skeletu, protože tyto skupiny zajištují interakci s patogenními priony. Zpusob a fotosenzitátor podle vynálezu lze s výhodou použít pro inaktivaci patogenních prionu na organických substrátech, v jakémkoli prostredí, a také ve forme dezinfekcního prostredku ve zdravotnických a jiných zarízeních.

Description

Způsob inaktivace patogenních prionů, fotosenzitizátor pro inaktivaci patogenních prionů a použití fotosenzitizátoru pro inaktivaci patogenních prionů

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu inaktivace patogenních prionů, dále se týká látek, tzv. fotosenzitizátoru a dále použití těchto fotosenzitizátorů pro inaktivaci patogenních prionů.

Dosavadní stav techniky

Prion, označovaný jako infekční bílkovina, je název pro vadnou formu takzvané nepatogenní buněčné prionové bílkoviny, která se běžně vyskytuje v mnoha typech buněk savců, především v neuronech. Infekční, vadná forma prionové bílkoviny má, na rozdíl od nepatogenní prionové bílkoviny, odlišné prostorové uspořádání molekuly. Důsledkem této konformační změny je schopnost navazovat se na zdravou formu prionové bílkoviny a konvertovat ji na její vadnou, patogenní formu. Hromadění těchto prionů v nervové tkáni ve svém důsledku vede ke vzniku smrtelných neurogenerativních onemocnění savců, tzv. prionových chorob. Dalším důsledkem konformační změny nepatogenní prionové bílkoviny na její patogenní formuje mimořádná odolnost prionů vůči běžným desinfekčním prostředkům a různým fyzikálním vlivům, jako jsou vysoké teploty a tlak. Na základě dosud známých poznatků lze priony spolehlivě likvidovat pouze v alkalickém vodném prostředí za vysoké teploty a tlaku. Podmínky, při kterých jsou běžně prováděny sterilizace chirurgických nástrojů a zdravotního materiálu ke spolehlivé likvidaci pato25 genních prionů nestačí. Uvedené skutečnosti dokumentují závažný zdravotnický a současně i právní problém, spočívající v obtížně realizovatelné sterilizaci chirurgických nástrojů či jiného zdravotnického materiálu, které mohou být potenciálně kontaminovány patogenními priony a ty mohou být následně transportovány do jinak zdravého lidského organizmu buď krevní cesto chirurgickými nástroji, či neinvazivní cestou např. přes sliznice jiným zdravotnickým materiálem apod. a být tak příčinou smrtelného onemocnění. Proto jsou nyní ve světě intensivně hledány možnosti jak účinné prevence, tak terapie těchto chorob.

V současné době je využíván proces fotodynamické inaktivace mikroorganismů, nebo nádorových buněk. Účinek fotoinaktivace je závislý jednak na fotosenzitivní látce, dále na světle vhod35 né vlnové délky a přítomnosti diatomického kyslíku. Je známa celá řada fotoaktivních substancí přírodních nebo syntetických, které způsobují foto inaktivaci určitých mikroorganismů. Mezi tyto substance se řadí obvykle aromatické sloučeniny, často známé jako barviva - deriváty fenothiazininu, porfiriny, chloriny, aminolevulová kyselina, fenaziny, cyaniny, ftalocyaniny, naftalocyaniny. Tyto látky jsou používány k fotodynamické inaktivaci grampozitivních a gramnega40 tivních bakterií jako hlavních cílových mikroorganismů. Jejich účinek je mimo jiné podmíněn i vhodnou molekulovou strukturou daného fotosenzitizátoru, která umožňuje jeho potřebnou fixaci na příslušnou bakterii.

Vhodnými fotosenzitizátory pro uvedenou fotodynamickou metodu mohou například být vodo45 rozpustné ftalocyaninové deriváty, popisované v americkém patentu US 4 318 883. Tento dokument popisuje obecně způsob boje proti mikroorganismům v nebo na organických nebo anorganických substrátech a způsob ochrany těchto substrátů proti napadení mikroorganismy sloučeninami ftalocyaninů rozpustnými ve vodě, za přítomnosti kyslíku a vody a při současném ozařování viditelným a/nebo infračerveným světlem.

⁵⁰

Úkolem vynálezu je vytvoření takového způsobu inaktivace patogenních prionů, který by odstraňoval nevýhody dosud známých postupů jejich likvidace v alkalickém prostředí za vysoké teploty a tlaku a umožňoval by likvidaci prionů v podstatě v neutrálním prostředí při běžné teplotě.

T

Podstata vynálezu

Tento úkol je vyřešen využitím způsobu inaktivace patogenních prionů, fotosenzítizátorem pro inaktivaci patogenních prionů a použitím fotosenzitizátoru pro inaktivaci patogenních prionů podle tohoto vynálezu.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že způsobu inaktivace patogenních prionů zahrnuje ošetření organického substrátu alespoň jedním fotosenzitizárorem za současného působení světla a diato10 mického kyslíku. Fotosenzitizátor je funkcionální barvivo se schopností produkovat reaktivní formy kyslíku, zejména singletní kyslík, interakcí se světlem a diatomickým kyslíkem. Vysoce reaktivní formy kyslíku jsou generované při běžné teplotě a tlaku interakcí vhodného fotosenzitizátoru, diatomického kyslíku a světla. Řešení podle vynálezu lze tedy snadno použít v jakémkoli prostředí, protože nedochází k žádným nežádoucím vedlejším účinkům. Tyto reaktivní formy kyslíku jsou schopny kvantitativně likvidovat patogenní priony i na zdravotnickém materiálu, přístrojích apod., takže je možné způsob podle vynálezu využít i ve formě dezinfekčního prostředku ve zdravotnických a jiných zařízeních.

Ve výhodném provedení vynálezu fotosenzitizátor tvoří alespoň jedna látka ze skupiny derivátů fenothiazinu, porfyrinů, chlorinů, aminotevulové kyseliny, fenazinů, cyaninů, ftalocyaninů, naftalocyaninů. Základní předpoklad pro fotodynamickou inaktivaci prionů je ten, že fotosenzitizátor musí být substantivní k patogennímu prionů a musí jej v podstatě vybarvovat. Reaktivní formy kyslíku vznikající interakcí ftalocyaninového fotosenzitizátoru se světlem jsou generovány bezprostředně na fotosenzítizátorem vybarveném prionů a mají možnost na něj účinně působit.

Je výhodné, že fotosenzitizátor je tvořen látkou ze skupiny ftalocyaninů, přičemž základní strukturu fotosenzitizátoru tvoří sulfoskupiny, karboxy skupiny, nebo sulfamidické skupiny na ftalocyaninovém (porfyrinovém) skeletu, protože tyto skupiny zajišťují interakci s patogenními priony. Fotosenzitizátor lze s výhodou použít pro inaktivaci patogenních prionů na organických nebo anorganických substrátech a pro ochranu těchto substrátů před napadením patogenními priony.

Dále je výhodné, že fotosenzitizátor obsahující sulfo skupiny či karboxy skupiny se aplikuje ve formě sodné, draselné, litné nebo amonné soli. Tyto soli jsou rozpustné ve vodě a zajistí dostatečnou substantivitu k patogenním prionům.

Je také výhodné, že fotosenzitizátor obsahující sulfamidické skupiny se aplikuje ve formě solí kyseliny chlorovodíkové, octové, ascorbové, mléčné, citrónové nebo ve formě směsi těchto solí.

Výhodou řešení podle vynálezu je, že tento způsob s použitím fotosenzitizátorů podle vynálezu lze použít pro likvidaci patogenních prionů při běžné laboratorní teplotě, v neutrálním prostředí a nevyžaduje složitá technická zařízení pracující s vysoce alkalickým prostředím za současného použití vysoké teploty a tlaku. To je důležité zejména vzhledem ke skutečnosti, že všechny dosud ve světě známé prionové choroby jsou smrtelné a v současné době neléčitelné.

Příklady provedení vynálezu

Rozumí se, že dále popsané a zobrazené konkrétní příklady uskutečnění vynálezu jsou představovány pro ilustraci, nikoli jako omezení příkladů provedení vynálezu na uvedené případy.

Odborníci znalí stavu techniky najdou nebo budou schopni zjistit za použití rutinního experimentování větší či menší počet ekvivalentů ke specifickým uskutečněním vynálezu, která jsou zde speciálně popsána. 1 tyto ekvivalenty budou zahrnuty v rozsahu následujících patentových nároků.

-2CZ 303355 B6

Vynález blíže objasňují následující příklady inaktivace patogenních prionů fotodynamickým způsobem, spočívajícím v synergickém působení vybraných ftalocyaninových fotosenzitizátorů a světla, v aerobním prostředí, na materiál prokazatelně kontaminovaný patogenními priony.

Příklad 1

K ověření fotodynamické inaktivace patogenních prionů byl jako zdroj prionů použit homogenát mozku myši v konečném stádiu prionové infekce po inokulaci laboratorním kmenem patogenních io prionů „scrapie“ RML. Mozek myši obsahuje v tomto případě 10⁸-10⁹ infekčních dávek v 1 g tkáně. Homogenáty mozku v 10 a 0,1% koncentraci v isotonickém fosfátovém pufru o pH 7,4 byly upraveny přídavky vodného roztoku ftalocyaninového fotosenzitizátorů, sodné soli disulfonovaného hydroxyhlinitého ftalocyaninu (HO)A1 FTC(SO₃Na)₂ tak, aby výsledné koncentrace této látky v uvedených homogenátech byly 5 pg/ml a 20 μg/ml. Fotosenzitizátorem upravené homogenáty byly následně inkubovány při pokojové teplotě po dobu 10, 30 a 60 minut Inkubace probíhaly v definovaných podmínkách, v laminámím boxu, za osvitu zajišťovaném standardní zářivkou (1200 Lx) ze vzdálenosti (60 cm). Po skončené inkubaci byly homogenáty vždy přidány ke kultuře buněk katecholaminoergní neuronální linie (CAD 5), která se rutinně využívá pro testování infektivity prionů. Buňky byly kultivovány po dobu 10 dnů a přítomnost prionů stanovena metodou buněčného blotu (Bosque JP, Prusiner SB: Cultured cell sublines highly susceptible to prion infection. J. Virol. 2000, 74,4377-4386).

Experiment byl prováděn pro každou koncentraci homogenátu (1% a 0,1 %) a každou koncentraci fotosenzitizátorů (5pg/ml a 20 pg/ml) vždy v duplikátech a třikrát opakován. Tímto způsobem bylo tedy pro každou sledovanou variantu provedeno šest identických experimentů. Ve všech těchto případech vedla inkubace mozkového homogenátu s 20 pg/ml (HO)A1 FTC(SO₃Na)₂ již po 30 minutách osvitu ke kompletnímu vymizení infekce buněk patogenními priony. Výrazné snížení infekce bylo pozorováno také při použití nižší koncentrace fotosenzitizátorů (5 pg/ml), avšak v tomto případě nebyla eliminace kompletní.

Příklad 2

Stejný jako příklad 1, s tím rozdílem, že obdobného positivního výsledku bylo dosaženo, když místo sodné soli disulfonováného ftalocyaninu hydroxyhlinitého byla jako fotosenzitizátor použita směs sodných solí mono, di tri a tetra sulfonovaných hydroxyhlinitých ftalocyaninu (HO)A1 FTC(SO₃Na)^

Příklad 3

Stejný jako příklad 1, stím rozdílem, že obdobného, positivního výsledku bylo dosaženo, když místo sodné soli disulfonovaného ftalocyaninu hydroxyhlinitého byla jako fotosenzitizátor použity směsi sodných, draselných či litných či amonných solí mono, di tri a tetra sulfonovaných hydroxyhlinitých ftalocyaninů (HO)AI FTC(SO₃Na)i_4.

Příklad 4

Stejný jako příklad 1, s tím rozdílem, že obdobného, positivního výsledku bylo dosaženo, když místo sodné soli disulfonovaného ftalocyaninu hydroxyhlinitého byla jako fotosenzitizátor použita sodná sůl disulfonovaného zinečnatého ftalocyaninu ZnFTC(SO₃Na)₂.

Příklad 5

Stejný jako příklad 1, s tím rozdílem, že obdobného, positivního výsledku bylo dosaženo, když místo sodné soli disulfonovaného ftalocyaninu hydroxyhlinitého byla použita jako fotosenzitizátor směs sodných solí mono, di tri a tetra sulfonovaných zinečnatých ftalocyaninu ZnFTC(SO₃Na)^.

Příklad 6

Stejný jako příklad 1, s tím rozdílem, že obdobného, positivního výsledku bylo dosaženo, když místo sodné soli disulfonovaného ftalocyaninu hydroxyhlinitého byly jako fotosenzitizátor použity směsi sodných, draselných či lithných či amonných solí mono, di tri a tetra sulfonovaných zinečnatých ftalocyaninů ZnFTC(SO₃Na)i^.

Příklad 7

Stejný jako příklad 1, stím rozdílem, že obdobných, positivních výsledků bylo dosaženo, když místo sodné soli disulfonovaného ftalocyaninu hydroxyhlinitého byl jako fotosenzitizátor použit zinečnatý sulfonamidický ftalocyanin,

ZnFTC(SO₃H)₀_,[SO₂ NHCH₂CH₂ CH₂N(C₂H₅)2]i-3 ve formě vodorozpustné soli, hydrochloridu, sulfátu, acetátu, askorbátu, citrátu či laktátu.

Průmyslová využitelnost

Řešení podle vynálezu lze použít pro fotodynamickou inaktivaci patogenních prionů, zejména pří dezinfekci ve zdravotnických a jiných zařízeních, kde hrozí kontaminace patogenními priony.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Způsob inaktivace patogenních prionů „in vitro“ v nebo na organických substrátech tvořených kapalinami nebo pevnými látkami obsahujícími složky organického původu nebo kontaminovanými složkami organického původu, zejména v nebo na živočišných tkáních a buňkách, tělesných a buněčných sekretech a biologických tekutinách a produktech připravených z těchto složek a pro ochranu těchto substrátů před kontaminací patogenními priony, vyznačující se tím, že zahrnuje ošetření substrátu alespoň jedním fotosenzitizátorem za současného působení světla a diatomického kyslíku, přičemž fotosenzitizátorem je funkcionální barvivo se schopností produkovat reaktivní formy kyslíku, zejména singletní kyslík, interakcí se světlem a diatomickým kyslíkem.

2. Způsob inaktivace patogenních prionů podle nároku 1, vyznačující se tím, že fotosenzitizátor tvoří alespoň jedna látka ze skupiny derivátů fenothiazinu, porfyrinů, chlorinů, aminolevulové kyseliny, fenazinů, cyaninů, ftalocyaninů, naftalocyaninů,

3. Způsob inaktivace patogenních prionů podle nároku 2, vyznačující se tím, že fotosenzitizátor je tvořen látkou ze skupiny ftalocyaninů, přičemž základní strukturu fotosenziti-4CZ 303355 Β6 zátoru tvoří sulfo skupiny, karboxy skupiny, nebo sulfonamidické skupiny obsahující terciální dusík na ftalocyaninovém resp. porfyrinovém skeletu.

4. Způsob inaktivace patogenních prionů podle nároku 3, vyznačující se tím, že fotosenzitizátor obsahující sulfo skupiny nebo karboxy skupiny se aplikuje ve formě sodné, draselné, litné nebo amonné soli.

5. Způsob inaktivace patogenních prionů podle nároku 3, vyznačující se tím, že fotosenzitizátor na fázi ftalocyaninu, obsahující sulfonamidické skupiny, se aplikuje ve formě soli kyseliny chlorovodíkové, octové, askorbové, mléčné, citrónové, nebo ve formě směsi uvedených solí, vytvořené protonací terciálního dusíku v sulfonamidické skupině některou z následujících kyselin: chlorovodíková, sírová, octová, citrónová, askorbová či mléčná, dle obecného vzorce:

MeFTC(SO₃H)₀_i[SO₂NHCH₂CH₂CH₂NH⁺(C₂H₅)₂]₁_₃kde X' představuje anion některé z výše uvedených kyselin a Me představuje Al(OH), Zn.

6. Použití fotosenzitizátoru tvořeného alespoň jednou látkou ze skupiny derivátů fenothiazinu, porfyrinů, chlorinů, aminolevulové kyseliny, fenazinů, cyaninů, ftalocyaninů, naftalocyaninů pro inaktivací patogenních prionů v nebo na organických substrátech a pro ochranu těchto substrátů před kontaminací priony způsobem podle nároku 1, ošetřením substrátu fotosenzitizátorem za současného působení světla a diatomického kyslíku, přičemž fotosenzitizátor produkuje reaktivní formy kyslíku, zejména singletní kyslík, interakcí se světlem a diatomickým kyslíkem.

7. Použití fotosenzitizátoru tvořeného látkou ze skupiny ftalocyaninů, jehož základní strukturu molekuly tvoří sulfo skupiny, karboxy skupiny nebo sulfonamidické skupiny obsahující terciální dusík na ftalocyaninovém resp. porfyrinovém skeletu, pro inaktivací patogenních prionů v nebo na organických substrátech a pro ochranu těchto substrátů před kontaminací patogenními priony způsobem podle nároku 1, ošetřením substrátu fotosenzitizátorem za současného působení světla a diatomického kyslíku, přičemž fotosenzitizátor produkuje reaktivní formy kyslíku, zejména singletní kyslík, interakcí se světlem a diatomickým kyslíkem.

8. Použití ftalocyaninového fotosenzitizátoru obsahujícího sulfo skupiny a karboxy skupiny, aplikovaného ve formě sodné, draselné, litné nebo amonné soli pro inaktivací patogenních prionů v nebo na organických substrátech a pro ochranu těchto substrátů před kontaminací patogenními priony, způsobem podle nároku 1, ošetřením substrátu fotosenzitizátorem za současného působení světla a diatomického kyslíku, přičemž fotosenzitizátor produkuje reaktivní formy kyslíku, zejména singletní kyslík, interakcí se světlem a diatomickým kyslíkem.

9. Použití ftalocyaninového fotosenzitizátoru obsahujícího sulfonamidické skupiny, aplikovaného ve formě soli kyseliny chlorovodíkové, octové, askorbové, mléčné, citrónové, nebo ve formě směsi uvedeých solí, pro inaktivací patogenních prionů v nebo na organických substrátech a pro ochranu těchto substrátů před kontaminací patogenními priony, způsobem podle nároku 1, ošetřením substrátu fotosenzitizátorem za současného působení světla a diatomického kyslíku, přičemž fotosenzitizátor produkuje reaktivní formy kyslíku, zejména singletní kyslík, interakcí se světlem a diatomickým kyslíkem.