JP5555765B2 - 固形組織内の検体の光音響検出法及び検出システム - Google Patents

Description

本発明の分野は、固形組織内での検体検出法及び組織解析システムである。本発明の好ましい用途は、インタクトなまま切除されたセンチネルリンパ節での黒色腫微小転移巣の生体外検出であり、本発明の好ましいシステムは、抽出したリンパ節において黒色腫微小転移巣の存在と位置との両方を検出できる光音響システムである。

センチネルリンパ節は、がん性腫瘍からリンパ系を介して移動してきた転移がん細胞が最初にたどり着くリンパ節群に由来するリンパ節である。センチネルリンパ節のマッピングは、センチネルリンパ節の典型的には染料注入による検出、及び、生検で転移がん細胞の有無を決定するための該センチネルリンパ節の切除を含む。リンパ節マッピング法は、皮膚黒色腫及びその他のがんの位置が特異的なリンパ節分布パターンを有しており、１つ以上のリンパ節があるリンパ節流域内の転移性疾患にまず関与するという理解に基づいている。もしこれらの最初のリンパ節又はセンチネルリンパ節が関与していないのであれば、流域全体は腫瘍がないはずである。この種の処置が、センチネルリンパ節マッピングにより検出することのできる２種のがん、悪性黒色腫及び乳がん、の診断及び治療に現在使用されている。転移性疾患の検出と監視は、これらのがん及び他の形態のがんの治療において正の臨床転帰を得るために不可欠である。所属リンパ節の状態を知ることは、予後診断のみならず、治療法を決定するためにも重要である。

黒色腫は、皮膚がんの最も致命的な形態であり、全てのがん型の中で最も速い増殖率を有している。米国では、黒色腫を発症する生涯リスクは、５５人中に１人であり、世界の他の国々では、その割合はさらに高い。黒色腫の早期の外科的切除が最善の治療手段である。一方、転移性疾患の検出と監視も、正の臨床転帰を得るために不可欠である。

センチネルリンパ節マッピング技術の弱点は、抽出したセンチネルリンパ節が転移がん細胞を有しているか否かを決定するために生検を用いる点にある。このことは、センチネルリンパ節が僅かな数の微小転移巣細胞のみを有している可能性のある初期段階において、特に当てはまる。こうした細胞は、リンパ節のほんの僅かを占めるに過ぎないので、生検でリンパ節から切片を作成する場合には、検出が困難である。典型的な生検では、８から１０の切片を採取するのみであるため、こうした微小転移巣細胞を検出できる可能性は極めて僅かである。リンパ節を部分的に検査するだけでは、高い偽陰性率が予期され得る。リンパ節が切除されると、典型的には、６から１０個の約６μｍの厚さの切片が採取され、転移がんの検査に用いられる。そのため、１ｃｍ長の典型的なリンパ節では、リンパ節のほんの僅かな部分（時として１％未満）のみが検査に供される。非現実的ではあるが、たとえ切片の数を大きく増やしたとしても、それでもまだ、微小転移巣細胞の検出は、大きく運に左右されるだろう。黒色腫マーカーの免疫組織化学的染色は感度をさらに高めるものの、それでもまだ、相応の割合の生検で、たとえ最良の手法を用いた場合でも、偽陰性が検出される可能性が高い。数々の研究によれば、センチネルリンパ節の偽陰性率は１０％を超えることが判明している。非特許文献１及び非特許文献２を参照のこと。

センチネルリンパ節及び転移がんの検出を改善するためにさまざまな努力がなされてきた。例えば、センチネルリンパ節の生検で黒色腫前駆細胞を検出するため逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴーＰＣＲ）が用いられてきた。しかし、臨床検査におけるＲＴ−ＰＣＲの有用性は明らかではない。非特許文献３を参照のこと。Ｗａｎｇ等は、センチネルリンパ節で黒色腫や乳がんを検出するために超音波変調光学的断層撮影法を使用することを提唱している。しかし、この技術は、微小転移巣を検出できない可能性が高い（非特許文献４）。また、関連する生体内の技術ではセンチネルリンパ節の位置の特定が行われる。Ｗａｎｇ等は、生体内でセンチネルリンパ節の位置を特定するために非侵襲的光音響同定システムを介した非侵襲的な技術を使用することを提唱している。しかし、この技術は、メチレンブルーを注入した後にセンチネルリンパ節に集積したメチレンブルーを検出することにより、生体内のセンチネルリンパ節の位置を同定するものである。非特許文献５を参照のこと。Ｗａｎｇ等の方法では、原発性腫瘍を切除した後の組織にメチレンブルーを注入しセンチネルリンパ節を同定する。この染料は、腫瘍を吸い込み且つセンチネルリンパ節（Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ；ＳＬＮ）につながるリンパ管により吸い上げられる。この青色染料は光音響の対象として用いられ、この染料を検出することで腋窩を切り進まずとも細針吸引を用いて生検を得ることが可能となる。この技術は、潜在的には、ＳＬＮ検査の侵襲性を減少し得る。染料検出感度を試験するために、生体外の検査が行われた。この技術は、生体内でＳＬＮを見つけるために外因性の染料を用いるため、抽出したリンパ節での微小転移巣の位置の特定には適合しない。また、この染料はＳＬＮを非選択的に着色する。さらに、センチネルリンパ節での転移がんの検出するために超音波を用いる別の試みでも、６１％もの偽陽性率が示された（非特許文献６）。

Ｊａｎｓｅｎ，Ｌ．，Ｎｉｅｗｅｇ，Ｏ．，Ｐｅｔｅｒｓｅ，Ｊ．，Ｈｏｅｆｎａｇｅｌ，Ｃ，Ｏｌｍｏｓ，Ｒ．，Ｋｒｏｏｎ，Ｂ．，"Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ Ｂｉｏｐｓｙ ｆｏｒ Ｓｔａｇｉｎｇ Ｍｅｌａｎｏｍａ"，Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．，２０００年，第８７巻，４８４−４８９頁 Ｙｕ，Ｌ．，Ｆｌｏｔｔｅ，Ｔ．，Ｔａｎａｂｅ，Ｋ．，Ｇａｄｄ，Ｍ．，Ｃｏｓｉｍｉ，Ａ．，Ｓｏｂｅｒ，Ａ．，Ｍｉｈｍ，Ｍ．，Ｊｒ．，Ｄｕｎｃａｎ，Ｌ．，"Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｍｅｔａｓｔａｓｅｓｉｎ Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅｓ"，Ｃａｎｃｅｒ，１９９９年，第８６巻，６１７−６２７頁 Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ，Ａ．，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓ，Ｅ．，"Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｎｏｄｅ Ｂｉｏｐｓｙ ｉｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ"，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．，２００１年，第４３８号，９９−１０６頁 Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，"Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｅｘ ｖｉｖｏ Ｕｓｉｎｇ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ−Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ"，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．，２００８年，第１３巻 Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｂｌｕｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎ ａ Ｒａｔ Ｍｏｄｅｌ"，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ，２００８年９／１０月，第１３巻，第５号，０５４０３３頁 Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｓｃａｎ ｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｂｅｆｏｒｅ Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｎｏｄｅ Ｂｉｏｐｓｙ ｉｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｐａｔｉｅｎｔｓ"，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，第８３巻，８０−８４頁

生体外でインタクトなリンパ節などの固形組織内の検体を検出するために好ましいシステムは、完全にインタクトなリンパ節などの固形組織に向けてパルス状レーザービームを発生するために配置されたレーザーを含む。このリンパ節内で生じた光音響信号を検出するために、音響検知器、好ましくは、少なくとも３つの音響検知器が、ＸＹＺ座標系などで三次元空間を測るために異なる位置に配置されている。少なくとも１つのコンピューターが音響検知器からの信号を受け取る。コンピューターは、信号及び信号のタイミングから、検体の有無、好ましくは、検体の位置を決定する。

生体外でリンパ節内の検体を検出するための好ましい方法は、抽出したリンパ節をパルス状レーザービームに被曝させることを含む。このとき、音響信号が検知される。音響信号は、リンパ節内の検体の有無を確認するため解析される。好ましくは、三次元空間を測る複数の検知器から複数の光音響信号が検知され、検体の位置も決定される。

固形組織内の検体を検出するための光音響検出システムの好ましい実施形態を示す模式図。 図１に係る３つの検知器を用いた実験系における健康なイヌのリンパ節から得られた光音響応答のプロット図。 図１に係る３つの検知器を用いた実験系における健康なイヌのリンパ節から得られた光音響応答のプロット図。 図１に係る３つの検知器を用いた実験系における健康なイヌのリンパ節から得られた光音響応答のプロット図。 図１に係る３つの検知器を用いた実験系における健康なイヌのリンパ節にメラニン細胞を注入した後の光音響応答を示すプロット図。 図１に係る３つの検知器を用いた実験系における健康なイヌのリンパ節にメラニン細胞を注入した後の光音響応答を示すプロット図。 図１に係る３つの検知器を用いた実験系における健康なイヌのリンパ節にメラニン細胞を注入した後の光音響応答を示すプロット図。 図１に係る３つの検知器を用いた実験系におけるブタリンパ節検査の信号強度のプロット図。

本発明は、センチネルリンパ節などの抽出した固形組織内の検体の光音響検出のための方法及びシステムを提供する。本発明の方法及びシステムでは、リンパ節内の微小検体の検出及び位置の特定が可能となる。光吸収体である任意の検体を固形組織内で検出することができる。しかし、本発明の方法及びシステムは、リンパ節内の微小転移巣の存在及び位置を検出するために特に有用である。本発明の方法及びシステムでは、例えば、従来のセンチネルリンパ節生検の代替又は補助として、抽出したセンチネルリンパ節内の微小転移巣の有無を検出し、三次元空間における位置を特定することができる。

生体外でインタクトなリンパ節などの固形組織内の検体を検出するために好ましいシステムは、完全にインタクトなリンパ節などの固形組織に向けてパルス状レーザービームを発生するために配置されたレーザーを含む。このリンパ節内で生じた光音響信号を検出するために、音響検知器、好ましくは、少なくとも３つの音響検知器が、ＸＹＺ座標系などで三次元空間を測るために異なる位置に配置されている。少なくとも１つのコンピューターが音響検知器からの信号を受け取る。コンピューターは、信号及び信号のタイミングから、検体の有無、好ましくは、検体の位置を決定する。

生体外でリンパ節内の検体を検出するための方法は、抽出したリンパ節をパルス状レーザービームに被曝させることを含む。このとき、音響信号が検知される。音響信号は、リンパ節内の検体の有無を確認するため解析される。好ましくは、三次元空間を測る複数の検知器から複数の光音響信号が検出され、検体の位置も決定される。本発明の好ましい方法及びシステムでは、抽出したリンパ節を音響媒体中に配置し、その後、音響媒体からの光音響応答を検知する。好ましい音響媒体は脱イオン水である。音響媒体として、ゲル、及び、油、例えば、ミネラルオイルを用いてもよい。空気も同様に音響媒体ではあるものの、液体、ゲル、及び、油などの媒体が好ましい。別の実施形態では、リンパ節は空気中に（ピンや他の支持手段により）つるされ、そして、光音響変換器がリンパ節そのものに、好ましくは、音響調節ゲルを用いて、物理的に接触している。

本発明の好ましい実施形態のシステム及び方法では、抽出したリンパ節の黒色腫微小転移巣を検出する。この場合、検体は微小転移巣そのものである。これらの本発明の好ましい方法及びシステムでは、黒色腫特有の光吸収特性を用いてＳＬＮを切除した後転移がんを見つける。黒色腫細胞の光吸収特性が検出に必要な光音響応答を生成するために用いられる。これにより、黒色腫微小転移の検出のための極めて強力な技術が提供される。

別の好ましい実施形態では、他種のがん細胞を検出することができる。乳がん又は他種のがん細胞を、別の実施形態では、検出することができる。この場合、外因性の吸収体が導入される。外因性の吸収体は、対象のがん細胞に特異的に誘引されるものである。外因性の吸収体の例としては、がん細胞に対する既知の抗原（ある種の乳がんではＨＥＲ−２、また、エストロゲン陽性乳がん細胞ではエストロゲン受容体など）に官能化されるナノ粒子などが挙げられる。こうしたナノ粒子は、金、銀、又は、他種のナノ粒子であってもよい。また、官能化される量子ドット又はマイクロスフィアを用いてもよい。対象のがん細胞を特異的に染色する組織化学的染料を、がん細胞を特異的に対象とし吸収体として機能し得る別種の外因性受容器として用いることもできる。

以下、本発明の好ましい実施形態について、図面を参照しながら説明する。図面は模式図を含むかもしれないが、これら模式図の意味するところは、当業者であれば周知技術と以下の記載を参考に理解できるだろう。強調のため図面では特徴が誇張されているかもしれないし、また、特徴は縮尺通りではないかもしれない。以下では実験系について論ずるが、当業者であればこれら実験系及び試験結果からより上位概念化された本発明の特徴を理解できるだろう。

図１は、生体外でインタクトなリンパ節などの固形組織内の検体を検出するための例示的システム１０を示す。インタクトなリンパ節１２又はインタクトなリンパ節の要部の形態の固形組織が、試料保持器１６内に収容された音響媒体１４内に所定のサンプルボリューム位置で配置されている。試料保持器は、外部の機械的振動を隔離することができるスタンド１８によりつるされている。ただし、通常であれば、検知信号が数十メガヘルツの範囲であるため、振動は計測結果に影響を与えないだろう。

インタクトなリンパ節１２内で生じた音響信号を検知するため、音響検知器２０ａ，２０ｂ及び２０ｃがＸＹＺ座標系内の３箇所の異なる位置に配置されている。この好ましいシステムは、検体の有無と位置との両方の決定を可能とするために独立した信号を発生するよう３つの検知器２０ａ，２０ｂ，２０ｃを有しているが、光吸収性の検体の有無を検出するのであれば１つの信号検知器のみで十分である。好ましい音響検知器は圧電検知器である。圧電式以外の検知器としては、例えば、試料内又はリンパ節を囲むキャリア流体内の光学的振動を測定する検出器などが挙げられる。

光音響信号はレーザー２２により発生されたパルス状レーザービームにより誘起される。レーザーのビームは、光ファイバー２３を介して伝達され、そして、リンパ節１２を向くようレンズ２４によりコリメートされてもよい。コリメーションは好ましいが必須ではない。コリメーションは、望ましい高レーザー強度（ｌａｓｅｒ ｆｌｕｅｎｃｅ）を維持するための役には立つものの、光ファイバーから十分に収束されたビームが提供されるため不可欠ではない。ある実施形態では、レンズ２４はリンパ節１２の全体を網羅するビームを形成する。別の実施形態では、レンズ２４は、リンパ節１２全体を『イメージング』するようなパターンで走査される細く収束されたビームを形成する。細く収束されたビームを走査する場合、リンパ節１２及びリンパ節１２に存在する微小転移巣を通過する光子の伝播が増加する。しかし、いずれの実施形態でも、効果的に、ＸＹＺ座標系などの三次元空間におけるリンパ節１２内の微小転移巣の位置を特定することができる。走査することで、レーザー光が微小転移巣に近接するリンパ節の不透明な媒質内に進入することが可能となり、光音響応答が増加する。走査型マイクロモーター２５は、コリメーションレンズ２４を動かすことで、試料リンパ節１２とレーザービームとの間の相対的移動を生じることができる。該走査型マイクロモーター２５は、コンピューター２８により制御してもよい。全リンパ節１２を走査パターンで照射するためにファイバーレンズが走査されるが、リンパ節を平行移動させたりレーザービームを操縦するなど他の方法で走査を実行してもよい。レーザー２２に付随させた光検知器をコンピューター２８及び波形検知器２６をトリガーするために用いてもよい。微小転移巣は、波形分析器２６により検知されコンピューター２８により解析される異なる音波により明らかとなる。例えばＸＹＺ座標系などで三次元空間を測るよう特徴的な位置に配置されている３つの検知器２０ａ，２０ｂ及び２０ｃを用いて、コンピューター２８は検知器２０ａ，２０ｂ及び２０ｃのそれぞれが受け取った音波のタイミングによりリンパ節１２内の微小転移巣の位置を決定することができる。３つの検知器２０ａ，２０ｂ及び２０ｃは直交するべきだが、同一直線上に配置されるのでなければ、検体の位置を決定するために逆投影法を用いてもよい。特に、検知器２０ａ，２０ｂ及び２０ｃの向きにより決定される３つのベクトルが三次元空間を測る限り、逆投影の計算を行うことで十分な情報を得ることができるだろう。検知器とリンパ節との間の距離は、多くの場合、重要ではないが、距離を長くし過ぎると装置が大きくなるため結合流体の不要な粘弾性減衰を招く虞がある。普通、検知器２０ａ，２０ｂ及び２０ｃとリンパ節１２との間の距離は約１ｃｍ以下であることが好ましい。

コンピューター２８は、検知器２０ａ，２０ｂ及び２０ｃの位置と、リンパ節及び該リンパ節を囲む音響媒体１４内を信号が移動する速度とを知っており、これにより、リンパ節内の黒色腫の位置を決定することが可能となる。コンピューター２８は、検体に関する位置情報の自動的な走査及び出力又は蓄積を実行することができる。出力又は蓄積された情報は、例えば、リンパ節を三次元にマップし検体の位置を示すようなマップの形態をとってもよい。こうした光音響情報は、検体の位置のマップ、例えば、検出された黒色腫のマップを用意するために用いられてもよい。この情報は、リンパ節内の黒色腫の位置を示すために、例えばカメラ又は他種の光学的検知器２９による標準的な撮像などにより得られたリンパ節の画像に重ね合わせてもよい。

３つより多くの検知器を用いてもよく、例を挙げれば、５個，７個，１０個，さらには、１２個などがありうる。リンパ節に対する検知器の相対的位置、及び、信号がそれぞれの検知器により検出される相対的時間を知ることは有用である。第１及び第２の検知器での信号の受信の間に相対的な差を定められるように、全ての検知器を共通の時間的尺度上に配置してもよい。普通、検知器の数を多くすると、黒色腫の位置を推定する際の精度が高くなる。しかし、また、検知器の数を多くすると、複雑さや費用も嵩むようになる虞がある。また、多くの用途では、黒色腫の位置を推定する際の精度は、３個，４個，５個，６個，又は、７個より多くの検知器を必要とするほど高くはないかもしれない。

試料保持器１６は、液性の音響媒体１４を収容するよう構成された検査室であり得、また、さまざまな形状を有し得る。音響媒体１４は、それ自身が吸収体として機能しないよう、用いられるレーザー波長に対して透明であるべきである。多くのレーザー波長について適切な媒体の例として、食塩水が挙げられる。好ましくは、音響媒体は、検査対象の組織と実質的に同一の音響インピーダンスを有する。試料保持器は、透明であってもよいし、又は、レーザービームを受け入れるための透明部を有してもよい。リンパ節は、検知器の検出結果が該リンパ節の位置と相関し得るように、試料保持器内の既知の位置に配置されるべきである。好ましい実施形態では、用いられるレーザー波長に対して透明なピン３２又は他種の要素を、リンパ節を挿すために又は保持するために、用いることができる。ピンは、リンパ節を所定の位置に保持することに加えて、三次元空間上の位置基準を設けることができる。試料保持器１６は、好ましくは、この検査室に対するリンパ節の相対的位置を知るための他の目印を含む。三次元空間での既知の位置（例えば、Ｘ、Ｙ及びＺ軸）を定めるために、試料保持器内の座標系のマーキングは有用であり得る。こうしたマーキングは、リンパ節を後で精密に切り分けるために、既知の位置に対するリンパ節内の検出検体の推定位置の座標を獲得できるので有用であり得る。試料保持器の座標系に対する検知器２０ａ，２０ｂ及び２０ｃの相対位置は、コンピューター２８に提供される。本システムは、好ましくは、リンパ節１２及び目印を撮像するカメラ又は他の形態の光学的検知器２９を含む。この画像を用いることで、コンピューターは、光音響信号から生成された検体位置のマップと組み合わせることができるようなリンパ節の三次元マップを生成することができる。別の実施形態では、本システムは、リンパ節１２を光音響的に撮像するためにレーザー２２とは異なる波長を用いることができる。例えば、用いられる波長はリンパ節内の水分を吸収される対象とすることができるだろう。この場合、音響媒体は水であってはならず、適切なゲル又は油を用いることができるだろう。

リンパ節の位置を測る目印として働き得るマーキングの例としては、リンパ節を配置する際の相対位置の基準となり得、且つ、三次元のＸＹＺ座標系及び位置を定めるために有用であり得るような第１及び第２の平面に沿って配置されたグリッド又は他の基準のマーキング又は指標要素が挙げられる。指標要素の他の例としては、ピン、支柱、若しくは、試料保持器の床面から垂直に伸びた他の構造的要素、マーキングを付された垂直の壁面若しくは隆起部、側壁から試料保持器内に水平に伸びる支柱若しくはピン、又は、リンパ節を配置する際の試料保持器内での三次元の相対位置の基準となり得るような他の物理的指標要素などが挙げられる。レーザー光を吸収しないため、ナイロンピンが一例として挙げられる。光を吸収しない素材、例を挙げればポリマーなど、からなる他の保持要素を用いることもできる。ピン３２のそれぞれが座標を定めてもよいし、又は、検知器２０ａ，２０ｂ，２０ｃがＸ，Ｙ及びＺ座標をなすように複数のピン３２が用いられてもよい。

検知器２０ａ，２０ｂ，２０ｃは、試料保持器の側壁、床面、天上に沿って配置されてもよく、また、そうでなければ、流体の圧力波を検出するために、キャリア流体と流体接触して配置されてもよい。また、光線の偏向を介して光音響的事象を検出する他種の検知器を用いてもよい。このとき、流体接触は不要である。これらは、検査資料保持器の外側に配置してもよい。

あるシステムは、黒色腫の推定位置でリンパ節を精密に切り分けるための第２のステーションを含んでもよい。これは、リンパ節を高度に精密に切り分けることがリンパ節内の黒色腫の特定の位置でのみ可能であった先行技術に対して、顕著に有利である。これにより、労力及び費用の著しい節約が達成される。

図１に係る実験系を構築し試験を行った。以下に論ずる実験は本発明の好ましいシステム及び方法のさらなる特徴を明らかにするものであるが、当業者であれば、本発明に基づく商業的システムを、性能、小型性、及び、従来の最適化などの利点を得るために特別に加工した部品を用いて構築できることを理解するだろう。実験及び好ましい実施形態は黒色腫の検出に向けられているが、当業者であれば、光電子エネルギーの吸収体である他のリンパ節及び他の検体も本発明の方法及びシステムにより解析できることを理解するだろう。

（実験系及びデータ）
本実験では、僅か５００個程度の黒色腫細胞を有するリンパ節からの光音響応答を正確に検出し、リンパ節の三次元空間内におけるリンパ節内でのこれら細胞の位置を決定することができるようにするため、複数の検知器により情報を獲得した。正常なリンパ節は応答を示さなかった。このように、本発明の検出方法及びシステムは、完全にインタクトなリンパ節内の微小転移巣の存在を検出するために用いることができる。また、リンパ節のさらなる組織学的観察の指針として用いることもでき、これにより、センチネルリンパ節生検の精度は向上する。今回の観察では偽陽性又は偽陰性の結果は観察されなかった。

大部分の黒色腫は全く黒色で、メラニン欠乏黒色腫の推計は５％未満又は１．８〜８．１％であった。なお、後者の値は、部分的に色素を有する黒色腫を含むものである。このように、黒色腫の極めて大部分は、光音響発生及び検出に活用できる天然の光吸収体を含んでいる。光音響効果は、光子の光エネルギーが機械的撹乱に変換され音波が生じる際に起きる。

（実験に用いた検出システム）
周波数三倍化ＱスイッチＮｄ：ＹＡＧレーザー（Ｖｉｂｒａｎｔ３５５ＩＩ、Ｏｐｏｔｅｋ製、米国カルフォルニア州カールズバッド）を光学パラメーター式発振器をパンプするために用いた。このシステムは、４１０−２４００ｎｍの波長範囲を有していた。実験では、このシステムを、５３２ｎｍの波長に設定し、図１に示すようにリンパ節を照射するため、直径６００μｍの光ファイバーを用いて焦点を合わせた。レーザーエネルギーは４−６ｍＪの範囲であり、レーザーパルス持続時間は５ｎ秒であった。レーザーシステムの繰り返し率は１０Ｈｚであった。リンパ節内で生じた光音響信号は、ポリフッ化ビニリデン（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＶＤＦ）のフィルム（Ｋｅｔｅｃｈ社、米国ニューメキシコ州アルバカーキ）から作られた３つの圧電音響検知器により受信された。この信号は、レーザー出力を監視する光ダイオード（ＤＥＴＩＯＡ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ製、米国ニュージャージー州ニュートン）によりトリガーされたオシロスコープ（ＴＤＳ０２４、Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ製、米国オレゴン州ウィルソンヴィル）に送信された。光ファイバーは、リンパ節上約１ｃｍに配置された。音響検知器は、リンパ節に対して直角に、各検知器のリンパ節表面から最も近い所での位置が１−３ｍｍの間となるよう、配置された。光音響波の時間と組織内での音速（約１．５ｍｍ／μｓ）との積を求めることにより、それぞれの波形から、より正確な位置を推定することができる。変換器は、約１０ｃｍ長の半剛体の同軸ケーブル（Ｍｉｃｏｒ−ｃｏａｘ製、米国ペンシルベニア州ポットタウン）のセグメントから作られた。ＰＶＤＦと同軸ケーブルとから音響検知器を作成する手順は、Ｊ．Ｖｉａｔｏｒ等，“Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ａ Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ Ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ Ｐｏｒｔ Ｗｉｎｅ Ｓｔａｉｎ Ｄｅｐｔｈ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ”，２００２年，第３０巻，１４１−１４８頁に記載されている。本実験では、外部導体の直径は３．６ｍｍ、内部導体の直径は０．９ｍｍであり、両導体は誘電体により絶縁された。２５μｍ厚のＰＶＤＦフィルムは同軸ケーブルの露出研磨面に取り付けられた。

＜リンパ節の準備及び試験＞
イヌのリンパ節を、該リンパ節の周囲の結合組織及びその他の組織から分離し、その後、リンパ節内部又は周囲の血液を取り除くため脱イオン水中に一晩浸けた。このリンパ節はライマメの形状をしており約１ｃｍの長さであった。リンパ節全体を音響媒体内に配置した。音響媒体は脱イオン水槽であった。これにより、検知器までの音波伝達が保証された。５３２ｎｍの波長を直径６００μｍの光ファイバーを通してリンパ節の上面に向けた。検知信号は３５０ＭＨｚの計装用増幅器（ＳＲ４４５、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ製、米国カリフォルニア州サニーベール）を用いて５倍に増幅され、その後、平均を１２８回取った。１０Ｈｚのレーザー繰り返し率で、１２８回の平均をとるのに１２．８秒かかった。

＜大きな黒色腫塊を注入したイヌリンパ節＞
本システムの黒色腫を検出する能力を試験するため、リンパ節に黒色腫細胞を注入した。ヒト悪性黒色腫細胞系列ＨＳ９３６を培養したものを黒色腫細胞源として用いた。黒色腫がペレットを形成するまで、高濃度黒色腫懸濁液を遠心機にかけた。上澄みを取り除き、高濃度の黒色腫をピペットにより吸い上げた。黒色腫細胞の総数は約１ｘ１０^６であった。この細胞塊の直径は約１ｍｍであった。リンパ節に照射したレーザースポットの直径は約１．５ｍｍであった。レーザービームをリンパ節全体に照射するよう走査した。１．５ｍｍのスポットはリンパ節のより広い区域に拡散するが、リンパ節全体に照射するためにレーザービームの走査を用いた。微小転移巣を模倣するため、リンパ節の側面に小さな切開部を設け、黒色腫をピペットを用いてその切開部に注入した。黒色腫を移植しない対照リンパ節においても、切開部の形成を含む試験を繰り返した。

＜小さな黒色腫塊を注入したブタリンパ節＞
かなり少ない数の黒色腫細胞から球体を形成した。上述した遠心からこの手順は異なる。具体的には、黒色腫細胞はアクリルアミド溶液内に懸濁物として集められた。このアクリルアミド溶液は、過硫酸アンモニウム及びテトラメチルエチレンジアミン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ；ＴＥＭＥＤ）（共に米国ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製）を用いて、直径約１ｍｍの球体に凝固された。浮遊細胞を含有する重合開始前のアクリルアミド溶液をミネラルオイル中に滴下すると、過硫酸アンモニウム及びＴＥＭＥＤにより１分以内に硬化し、球体が形成された。この技術により形成された球体のそれぞれは、約５００個の黒色腫細胞を含有しており、健康なブタのリンパ節に移植された。健康なブタ由来のリンパ節はイヌのリンパ節と同程度の大きさと形状であった。『陽性』のリンパ節にそれぞれ黒色腫細胞を移植した。

測定では、検知信号をより高倍率で増幅した（１２５倍）。光ファイバーは、リンパ節の上約１ｍｍに配置され、直径約６００μｍのスポットが形成された。このようにして、ブタのリンパ節表面でのレーザー強度はイヌのリンパ節表面での強度の約６倍となった。

＜結果と考察＞
図２Ａ−２Ｃは、イヌリンパ節への照射後黒色腫細胞の注入前に得られた３つの検知器のそれぞれからの光音響波形を示す。図２Ｄ−２Ｆは、黒色腫細胞の注入後の検知器のそれぞれからの波形を示す。１μ秒以内に生じる最初の波形はレーザーからの電気的ノイズによるものである。黒色腫細胞を添加していないリンパ節では、図２Ａ−２Ｃから分かるように、光音響信号は見られない。信号は、約１００μＶのベースラインのノイズ値の平坦な直線を示すのみである。黒色腫細胞が存在するリンパ節では、図２Ｄ−２Ｆから分かるように、かなりの光音響信号が見られる。検出器１では、図２Ｄから分かるように、約０．５ｍＶのピーク振幅のピークを有する約９μ秒の信号が生じた。検出器２では、図２Ｅから分かるように、約０．４ｍＶの振幅で約４．５μ秒の信号が生じた。検出器３では、図２Ｆから分かるように、約０．６ｍＶの振幅で約４．２μ秒の信号が生じた。検出器３からの波長は音波回折のため逆転している。しかし、検出のために必要なのは波の存在のみであり、また、位置の決定に必要なのは波のタイミングのみであって、波の形状は問題とならない。

ブタのリンパ節からの信号強度を図３に示す。それぞれのリンパ節の信号は８回の測定の平均である。黒色腫を移植しなかった対照リンパ節は、図３に示した対照波形と同様の信号を示した。ブタのリンパ節からの結果は、ナノ秒の持続期間のレーザー光を照射された際に、少数の黒色腫細胞が光音響信号を発生することを明確に示した。ブタのリンパ節には、約５００個の黒色腫細胞があった。こうした微小転移巣の直径は、細胞の平均直径を約２０μｍとしたとき、約１００−２００μｍであった。こうした数の細胞が、染色切片を顕微鏡で観察して初めて見つかるような微小塊を構成する。このような微小転移巣は、１ｃｍ長のリンパ節の組織切片上では容易に見過ごされてしまう可能性がある。強く明瞭な信号は、より少ない数の細胞でも検出可能であることを示している。

（正確な位置特定のための光音響逆投影法）
リンパ節内の微小転移巣の特定の位置を決定するための技術の１つとして、光音響逆投影法が挙げられる。この方法は、組織学的検査の指針として用いることが可能であり、これにより、偽陽性の画面を減らすことができる。逆投影法による再構築を用いることで、転移がんの位置を特定しリンパ節内のその位置を決定することができ、これにより、組織学的検査のために検出確率が最も高い組織切片を選択することが可能となる。逆投影法は、異なる位置を用いて信号を三角測量するのと類似した数学的方法である。さらに、フィルター処理及びノイズ除去処理を行なってもよい。適切な逆投影法は、『Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ Ｏｐｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ』，Ｊ．Ａｃｏｕｓｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．，２００２年１０月，第１１２巻，第４号，１５３６−１５４４頁に開示されている。

（検出感度の最適化）
本実験では、偽陽性率は観察されなかった。しかし、実際的には、リンパ節のリンスが不完全であるため、リンパ節内に血液が残存している可能性があった。血液の寄与による不要な光音響応答を避けるために、レーザー波長を、赤色、例えば、６３０ｎｍに変更してもよく、これにより、脱酸素化ヘモグロビン由来の光音響応答は約８分の１に、酸素化ヘモグロビン由来の応答は約５０分の１未満に減少する。一方、メラニン由来の応答は約２分の１程度にしか減少しないだろう。このようにして、ノイズを制限しつつ、感度は改善される。

別の選択肢として、２つの波長を用い、この２つの波長の相対感度を解析することが考えられる。例えば、５３２ｎｍ及び６３０ｎｍの波長への応答を取得し、光音響波をヘモグロビン又はメラニン由来のものに分類することができる。凝固した血液と未変性のヘモグロビンとを熱的に区別するために、統計的分類法が用いられてきた。Ｖｉａｔｏｒ等，“Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉａｂｌｅ ａｎｄ Ｔｈｅｒｍａｌｌｙ Ｃｏａｇｕｌａｔｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｔｗｏ− Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｂｕｒｎ Ｉｎｊｕｒｙ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ”，Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，２００７年，第５２巻，１８１５−１８２９頁を参照のこと。血液とメラニンとを区別するために、同様に、２つの波長の使用を用いてもよい。メラニンが単純な吸収スペクトルを示すのに対して、ヘモグロビンは特徴的な吸収スペクトルを示すため、このような分類が可能となる。

上記の実験では、イヌのリンパ節と比較してブタリンパ節の実験条件では検出が増幅されることが示された。両実験条件には、増幅倍率が５倍に対して１２５倍であった点、及び、組織表面に光ファイバーをより近接して配置することでレーザー強度が増加していた点で差があった。さらに、ブタリンパ節用に作られた検知器は、音波への感度が数倍高かった。ブタ用の検知器は、基本構成こそイヌ用の検知器と同様であったものの、より感度良く構築された。こうした改善の結果、感度はおよそ３桁も増加した。

信号対ノイズ比を増加するために、ウェーブレットノイズ除去及び検出中の走査を用いてもよい。適切なノイズ除去法及び走査法は、Ｖｉａｔｏｒ等，“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｗａｖｅｌｅｔ Ｄｅｎｏｉｓｉｎｇ ｏｆ Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ Ｓｉｇｎａｌｓ ｆｏｒ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｃｅｌｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｕｒｎ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ”，Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，２００８年５月２１日，Ｎ２２７−Ｎ２３６頁に記載されている。

本願発明の具体的な実施形態を示し記載してきたが、当業者であれば、他の変形例、置換例、及び、代替例が容易であることを理解するだろう。こうした変形例、置換例、及び、代替例は、添付の請求項に定められた本発明の精神と範囲を超えずになすことができる。本発明のさまざまな特徴が添付の請求項において規定する。

（関連出願の相互参照）
本願は、合衆国法典第３５巻第１１９条に基づき、２００９年４月２０日に出願の米国特許仮出願第６１／１７０，８８０号の優先権を主張する。

Claims (13)

1. 生体外での解析のために摘出した固形組織内の黒色腫細胞を直接検出する方法であって、
   前記固形組織（１２）は、外因的に添加された光吸収体により変性されていないインタクトなリンパ節又は該リンパ節の要部を含み、
   前記固形組織を所定の位置に配置する工程、
   前記固形組織をわずかにしか吸収されずに通過し、前記固形組織内に収容された検体に少なくとも部分的に吸収されるように選択された光のパルス状波長を、前記外因的に添加された光吸収体の非存在下で前記固形組織に照射する工程、
   光音響波形を得るためにある期間の間、前記照射工程により発生した光音響応答を音響学的に検知する工程、
   前記光音響波形においてメラニンの吸収スペクトルを解析する工程、及び、
   前記光音響波形がメラニンによる吸収を示す場合、検出した応答ピークを前記検体の存在に起因させる工程、
   からなる方法。
2. 前記配置工程は、前記固形組織を音響媒体（１４）中の所定の位置に配置することを含み、及び、
   前記音響学的検知工程は、前記音響媒体を介して前記光音響応答を検知することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記音響媒体は脱イオン水、油又はゲルからなる、請求項２に記載の方法。
4. 前記解析工程は、検出した応答ピークのタイミングに基づいて、検出した任意の検体の位置を決定することを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記音響学的検知工程は、複数の特徴的光音響応答を獲得することを含み、及び、
   前記解析工程は、検出した任意の検体の位置を決定することに加えて、前記検体の有無を決定する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記照射工程は、前記固形組織の全体を覆うようなレーザービーム及び／又は走査を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記音響学的検知工程は、前記固形組織内の前記検体の位置を推定するために、同一直線上にない異なる位置に配置されている複数の音響検知器（２０ａ，２０ｂ，２０ｃ）を備え、該各検知器からの検出時間及び該各検知器の相対的位置を用い検知することを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
8. 外因的に添加された光吸収体により変性されていないインタクトなリンパ節又は該リンパ節の要部を含む固形組織（１２）を所定のボリュームでその内部に保持するよう構成されている試料保持器（１６）、
   パルス状レーザービームを発生することのできるレーザー（２２）、
   前記パルス状レーザービームを前記固形組織内に向けるための光フォーカサー（２３，２４）、
   固形組織内に収容された検体の光音響応答を検出するために配置されている音響検知器（２０ａ）、及び、
   前記光音響応答を解析し且つ前記光音響応答に基づいて前記固形組織内の黒色腫細胞の有無を決定するためのコンピューターであって、前記光音響応答の波形においてメラニンの吸収スペクトルを解析し、且つ、前記光音響応答の波形がメラニンによる吸収を示す場合、検出した応答ピークを前記検体の存在に起因させるコンピューター（２８）を備える、生体外での解析のために摘出した固形組織内の黒色腫細胞を検出するためのシステム。
9. 前記音響検知器は、同一直線上に配置されていない少なくとも３つの音響検知器（２０ａ，２０ｂ，２０ｃ）を含み、及び、
   前記コンピューターは、前記少なくとも３つの音響検知器から独立した信号を受け取り、且つ、前記独立した信号を用いて、該信号及び該信号のタイミングから黒色腫細胞の有無及び位置を決定する、請求項８に記載のシステム。
10. 前記音響検知器は、三次元空間を測るように配置されている少なくとも３つの音響検知器（２０ａ，２０ｂ，２０ｃ）を含み、及び、
    前記コンピューターは、前記少なくとも３つの音響検知器から独立した信号を受け取り、且つ、前記独立した信号を用いて、該信号及び該信号のタイミングから黒色腫細胞の有無及び位置を決定する、請求項８又は９に記載のシステム。
11. 前記試料保持器は、三次元座標系を定める指標要素を備え、
    前記固形組織は、前記三次元座標系内の既知の位置に配置され、
    前記少なくとも３つの検知器は、定められた前記三次元座標系に対して既知の位置に配置される、請求項８から１０のいずれか１項に記載のシステム。
12. 前記音響検知器は、誘電体により絶縁され、且つ、薄い音響学的に感度の高いフィルムにより覆われた露出研磨面で終始する複数の同軸導体を含む、請求項８から１１のいずれか１項に記載のシステム。
13. 前記音響学的に感度の高いフィルムは、ポリフッ化ビニリデンからなる、請求項１２に記載のシステム。

Images