JP2009142597A - メラニン分布可視化方法及びその装置 - Google Patents
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
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Abstract
【解決手段】生体組織の所定深度に対してレーザー光を平面的に走査させて照射し該組織からの自家蛍光を受光する装置を用い、生体組織に存在するメラニンの自家蛍光の減衰曲線を2次減衰曲線に近似して、蛍光寿命に係る係数τ1及びτ2と、蛍光寿命に対する振幅に係る係数A1及びA2を決定してメラニン分布を可視化する方法であって、A1/A2比に12〜33の閾値を設け、当該閾値を超える蛍光をメラニンに起因する蛍光と判別することを特徴とする、生体組織のメラニン分布可視化方法。
【選択図】図1
Description
当該蛍光顕微鏡は、発色団(Chromophore)として生体内の自家蛍光物質を利用するものであり、NAD(P)H、フラビン類(Flavines)、エラスチン(Elastin)、コラーゲン(Collagen)、メラニン(Melanin)、リポスチン(Lipofuscin)等の生体物質の蛍光寿命が測定できることが報告されている(非特許文献7)。
例えば、Teuchnerらは合成メラニンの蛍光特性を減衰曲線を用いて詳細に調べ(非特許文献8)、自家蛍光の減衰曲線を3つの指数係数(exponential curve)でフィッティングすると、τ1=0.20ns(A1/(A1+A2+A3)=0.56)、τ2=1.5ns(A2/(A1+A2+A3)=0.32)、τ3=5.8ns(A2/(A1+A2+A3)=0.11)であるとの報告がなされている。ここでτ1、τ2、τ3は3つの蛍光寿命、A1、A2、A3はそれら蛍光寿命に対応する振幅を示す。
このため、本来であれば、生体組織中のメラニンの蛍光減衰曲線を求めるためには、レーザパワーに対して細心の注意を払いつつ測定すると同時に、測定後、精度の高いフォンタナマッソン染色法など従来法によるメラニン分布との対比が必要であるが、従来、このような測定や対比はなされていない。従って、信頼性の高い生体メラニン判別法は未だ確立されていないと考えられた。
そこで、本発明者らは、後述したように、生体2光子励起顕微鏡を用いて、メラニンを含む生体サンプルを対象として、意図的にレーザパワーを上げ蛍光強度を明るく変化させて組織変性となった部分を測定したところ、τ1=0.13ns、τ2=0.5ns、A1/A2は10程度の測定値が得られ、この測定値はKonigらの毛髪における報告値(非特許文献10)とほぼ同じであった。つまり、Konigらは変性した組織を観察した可能性が高いことを見出した。
1)生体組織の所定深度に対してレーザー光を平面的に走査させて照射し該組織からの自家蛍光を受光する装置を用い、生体組織に存在するメラニンの自家蛍光の減衰曲線を2次減衰曲線に近似して、蛍光寿命に係る係数τ1及びτ2と、蛍光寿命に対する振幅に係る係数A1及びA2を決定してメラニン分布を可視化する方法であって、A1/A2比に12〜33の閾値を設け、当該閾値を超える蛍光をメラニンに起因する蛍光と判別することを特徴とする、生体組織のメラニン分布可視化方法。
強いエネルギーの励起光を生体組織に照射すると突然、生体組織からの蛍光強度が強くなる場合があり、輝度の明るく変化した部分の蛍光特性(寿命)はメラニン蛍光と区別がつかない場合があることから(試験例2参照)、励起レーザーパワーは、最小限に抑えることが好ましく、20mW以下に制限するのが好ましい。
また、励起レーザーパワーはメラニンの密度の高い抜去毛球部のFLIM(Fluorescence Life Time Imaging)をとる場合1mW以下、直接レーザーに暴露される皮膚表面近傍で8mW以下、メラニンの比較的多い露光部表皮基底層で10mW以下が望ましい。
検出の際の波長は、できるだけ多くのフォトンを検出するために、フィルター等により制限しないほうが良いが、生体組織に存在するメラニン以外の物質からメラニンの自家蛍光と誤認されやすい光が発生するおそれがある場合には、この誤認されやすい光を除くため、ビームスプリッター9とフォトカウンター14との間にバンドパスフィルターのようなフィルター13を設置することが好ましい。
例えば、生体組織中にコラーゲンが存在する可能性がある場合には、生体組織においてコラーゲン分子から生体第2高調波発生光(SHG光)が発生し、このSHG光はメラニンの自家蛍光と誤認されるおそれがあることから、このSHG光を除くためバンドパスフィルター(450±40nm)をフィルター13として設置することが好ましい。
後記実施例に示すように、メラニンの蛍光特性は、τ1成分がτ2成分より短く(τ1の平均が120±19ps、τ2の平均1100±401ps)、A1/A2比が大きい(14〜33(平均:24±7)という特徴を有する(表1)。また、正常な組織において、メラニン以外の生体成分からA1/A2>12の蛍光特性は観察されない。
また、閾値(A1/A2)を20に設定すれば、3D培養皮膚組織切片において、そのイメージング画像は、メラニン顆粒の染色法として知られているフォンタナマッソン染色による染色像と一致した。
よって、メラニンからの蛍光の閾値として、12〜33を設定することができ、係る閾値を超える蛍光をメラニンに起因する蛍光と判断し、生体皮膚、毛髪、細胞等の生体組織に対して、メラニン分布のインビボでの可視化が可能となる。
表1からの各試料のメラニン蛍光寿命から求めたτ1=97ps〜162ps及びτ2=503ps〜1598psを下記式のごとく、τ1、τ2を固定値にすると、より少ないピークフォトン数で曲線近似が可能でありる。
また、判別する生体組織の部位としては、メラニンが組織内に存在する部位であればよく、例えば、皮膚、毛髪、毛包、培養細胞等が挙げられる。
2)A1/A2比の値が上述の所定の閾値を超えるか否かを判断する(ステップ2:YES/NO)。
3)A1/A2比が上述の所定の閾値を越える場合には、メラニンに起因する蛍光と判別する(ステップ2:YES,ステップ3)。一方、A1/A2比が所定の閾値を超えない場合には、メラニン以外の物質に起因する蛍光と判別する(ステップ2:No,ステップ4)。
この記憶部には、例えば、CD、DVD及びハードディスク等の磁気的、光学的記録媒体又は半導体メモリで構成される不揮発性の記憶媒体が備えられている。
この記憶部には、メラニンの分布の判別及びレーザー光を走査した範囲におけるメラニン分布の2次元又は3次元画像生成並びに装置全体の動作に係る各種機能を実現するためのプログラムと、当該プログラムの実行に使用されるデータとを記憶しており、当該プログラムはCPUによって実行される。
なお、この記憶部には、蛍光寿命に係る係数τ1及びτ2と、蛍光寿命に対する振幅に係る係数A1及びA2を算出し、算出されたパラメータに基づき2次元又は3次元画像生成できるソフトウェア、たとえばSPCImage2.8(Becker & Hickl GmbH)を格納していてもよい。
(1)生体2光子励起蛍光顕微鏡
生体組織中にメラニンを多く含むと思われる以下のサンプルa)〜d)のヒト皮膚、ヒト皮膚由来、ヒト毛球のヒト由来サンプル4種、メラニンが存在しない3D培養皮膚のサンプルe)について、生きたままの試料の蛍光寿命を生体2光子励起蛍光顕微鏡(DermaInspect JENLAB GMBH, Jena, Germany)を用いて測定した。
サンプル:
a)3D培養皮膚(MEL-300(Mat Tek Corporation アジア人種由来メラノサイト含)
b)培養メラノサイト(黒人由来 入手先 クラボウ)
c)人前腕しみ部表皮メラニンキャップ(日本人健康男性前腕部)
d)抜去毛の毛根部(日本人健康男性頭部より抜去)
e)3D培養皮膚(EPI-200(Mat Tek Corporation メラノサイト無)入手先 クラボウ)
各試料から得られたデータに基づき、ソフトウェアSPCImage2.8(Becker & Hickl GmbH)により、自家蛍光減衰曲線を二次減衰曲線にフィッティングして蛍光寿命を構成する4つのパラメータのτ1、A1、τ2、A2を求めた。
3D培養皮膚(MEL-300(Mat Tek Corporation アジア人種由来))の10μm厚の凍結組織切片を作成し、蛍光寿命イメージングを取得後、定法に従いフォンタナマッソン染色((月間)MEDICAL TECHNOLOGY 別冊 染色法のすべて P54 医歯薬出版株式会社発行(1988))を行い比較した。染色試薬として、フォンタナマッソン染色用フォンタナアンモニア銀(武藤化学株式会社)を使用した。
表1に示すように、生体2光子励起蛍光顕微鏡により求められた各試料のτ1成分は97psから162ps(平均120ps)、τ2成分は503psから1598ps(平均1100ps)であり、各試料により異なった。
このことから、τ1やA1/A2を指標とした場合、精度よく、信頼性の高いメラニンの判別方法の確立及びそれを基にしたメラニンの可視化の可能性が示された。
更に、今回求められたτ1やA1/A2について検討をした。
今回求められたτ1は、従来の報告(Ehlers A, Riemann I, Stark M, Konig K.,Microsc Res Tech. 2007 Feb;70(2):154-61)をほぼ再現した値と考えられる。
しかし、従来A1/A2=9(A1/(A1+A2)=0.90)あるいはA1/A2>4(A1/(A1+A2)>0.80)( Ehlers A, Riemann I, Stark M, Konig K., Microsc Res Tech. 2007 Feb;70(2):154-61))と報告されているが、今回求められたA1/A2はより大きく14<A1/A2<33であった。
この理由として、従来の報告では、励起レーザーによる皮膚変性の可能性が考えられた。さらに、以下の試験例2を行い、更にメラニンの判別方法について検討を行った。
メラニンの自家蛍光と区別すべき生体光信号とメラニンのイメージングの最適化について以下のとおり検討を行った。
(1)生体組織においてコラーゲン分子から特異的に生体第2高調波発生光(SHG光)が発生する場合があるので、この点について本装置について検討を行った。
SHG光は、物質の構造非中心対称性に起因する非線形光学現象の1つで、蛍光現象とは異なるものである(T. Yasui, Y. Tohno, and T. Araki, Appl. Opt., Vol. 43, pp. 2861-2867 (2004).; T. Yasui, Y. Tohno, and T. Araki, J. Biomed. Opt., Vol. 9, No. 2, pp. 259-264 (2004).)。
本装置では、励起波長800nm付近でコラーゲン由来のSHG強度が最も高まる。励起波長800nmの場合、波長400nmのSHG光が蛍光寿命の短い蛍光(メラニン)として誤って検出されるおそれがある。また、メラニン分布と組織、細胞の形態を同時に観察するために、NAD(P)H由来の蛍光(蛍光波長450nm〜470nm)も検出することが望ましい。そこで、SHG光(400nm)を排除し、かつ、NAD(P)H由来の蛍光(蛍光波長のピークが450nm)が検出可能である、バンドパスフィルター(450±40nm)をフォトンカウンター検出器前に設置した。
図3中の矢印が変化した部分である。皮膚表面近く(角層)をレーザーパワー10mWで走査中にこの現象が起きた。輝度の明るく変化した部分の蛍光特性(寿命)を調べると、τ1=134ps(A1=0.91)、τ2=1588ps(A2=0.09)、A1/A2=10程度であり、この輝点のτ1はメラニン蛍光のτ1とほぼ同じであった。
このように、意図的にレーザパワーを上げ蛍光強度を明るく変化させた部分では、τ1=0.13ns、τ2=0.5ns、A1/A2は10程度であり、Konigらの毛髪における報告値(非特許文献10)とほぼ同じである。長期間強いエネルギーを照射すると生体組織が組織変性されるため、Konigらの報告は変性した組織を観察した可能性が高い。
一般に、表皮基底層で作られたメラニンは角化に伴い分解され、正常部位の角層からはごく微量、あるいは検出されないと考えられ、出現した輝点はメラニンではない。よって、この現象が起きた場合τ1を指標としたメラニンイメージングはできないことは明らかである。
しかし、メラニンからの蛍光の閾値として、A1/A2=12〜33を設定すれば、この輝点とメラニン蛍光を分離することが可能である。
このようなサンプルの変化を避けるためには、励起パワーはメラニンの密度の高い抜去毛球部のFLIM(Fluorescence Life Time Imaging)をとる場合1mW以下、直接レーザーに暴露される皮膚表面近傍で8mW以下、メラニンの比較的多い露光部表皮基底層で10mWが望ましい。
図4に実験的に皮膚細胞に障害を与えた例を示した。皮膚に微細な針電極を刺した上で電流を流した(電圧9V)。針電極の穴(図5中のX印)付近のケラチノサイトのFLIMを取得した結果、τ1=143ps(A1=0.92)、τ2=1818ps(A2=0.08)、A1/A2=11であった(図5矢印)。
先に述べた強いレーザーを照射した場合と異なり、蛍光強度は低下するが、τ1はメラニンの自家蛍光とほぼ同じレベルに変化した。よって、このような現象が起きた場合もτ1を指標としたメラニンイメージングはできないことを明らかにした。
メラニンからの蛍光の閾値として、A1/A2=12〜33を設定すれば、電流により傷害を受けたケラチノサイトとメラニンを分離することが可能であった。
表1からの各試料のメラニン蛍光寿命から求めたτ1=120ps(平均値)及びτ2=1100ps(平均値)を上記式(2)のように二次減衰曲線に固定し、これに自家蛍光の減衰曲線をカーブフィッティングし、A1/A2比を求め、A1/A2に閾値を設けてメラニンを判別し、この結果をメラニン分布のイメージングする手法が最適であると考えた。更にτ1、τ2を固定値にすると、より少ないピークフォトン数でカーブフィッティングが可能であることが示唆された。
従来法でメラニンの判別の精度及び信頼性の高いフォンタナマッソン染色法との比較による、本発明のメラニンイメージングの妥当性の検討を行った。
図5に、3D培養皮膚10μm厚凍結切片のフォンタナマッソン染色像(黒褐色顆粒がメラニン顆粒)と、上記本発明のメラニン判別方法(閾値20)によるイメージング画像を示した。メラニンとして判別されたデータを青の色調とし、それ以外と判別されたデータを黄〜こげ茶の色調とした。
イメージング画像中の青い部分の位置と信頼性の高いフォンタナマッソン染色により黒く染色されたメラニン顆粒の位置が一致した。このとき、青い部分はA1/A2>20の領域であり、A1/A2比とその閾値に基づくメラニンイメージングの妥当性が示された。
また、メラニンからの蛍光の閾値として、A1/A2=12〜33を設定すれば、生体皮膚、毛髪、細胞など幅広い対象に対して、信頼性の高いメラニン分布のin vivoイメージングが可能であった。
以上のことより、本願発明のメラニンの判別方法によれば、生体組織を傷つけず、簡便に、生体組織中のメラニンを精度よく信頼性の高い判別することができた。
2 フェムトセカンドレーザー光源
9 ビームスプリッッター
11 対物レンズ
12 サンプル固定器
13 フィルター
14 フォトカウンター
Claims (7)
- 生体組織の所定深度に対してレーザー光を平面的に走査させて照射し該組織からの自家蛍光を受光する装置を用い、生体組織に存在するメラニンの自家蛍光の減衰曲線を2次減衰曲線に近似して、蛍光寿命に係る係数τ1及びτ2と、蛍光寿命に対する振幅に係る係数A1及びA2を決定してメラニン分布を可視化する方法であって、A1/A2比に12〜33の閾値を設け、当該閾値を超える蛍光をメラニンに起因する蛍光と判別することを特徴とする、生体組織のメラニン分布可視化方法。
- 蛍光寿命τ1を97ps〜162ps、τ2を503ps〜1598psに固定したうえで、A1及びA2を決定し、A1/A2比を算出する請求項1記載の方法。
- メラニンに起因する蛍光として判別されたデータと、メラニン以外の物質に起因する蛍光として判別されたデータとを、それぞれ異なる色調にて可視化する請求項1又は2記載の方法。
- 生体組織の所定深度に対してレーザー光を平面的に走査させて照射し該組織からの自家蛍光を受光する装置を用い、生体組織に存在するメラニンの自家蛍光の減衰曲線を2次減衰曲線に近似して、蛍光寿命に係る係数τ1及びτ2と、蛍光寿命に対する振幅に係る係数A1及びA2を決定してメラニン分布を可視化する生体組織のメラニン分布を可視化する装置であって、A1/A2比に12〜33の閾値を設け、当該閾値を超える蛍光をメラニンに起因する蛍光と判別する解析手段を具備することを特徴とする、メラニン分布可視化装置。
- 生体組織の所定深度に対してレーザー光を平面的に走査させて照射し生体組織からの自家蛍光を受光する装置が、生体2光子励起蛍光顕微鏡装置である請求項4記載の装置。
- 蛍光寿命τ1を97ps〜162ps、τ2を503ps〜1598psに固定したうえで、A1及びA2を決定し、A1/A2比を算出する請求項4又は5記載の装置。
- メラニンに起因する蛍光として判別されたデータと、メラニン以外の物質に起因する蛍光として判別されたデータとを、それぞれ異なる色調にて可視化する請求項4〜6の何れか1項記載の装置。
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