KR102024956B1 - 생체 조직에서의 멜라닌과 같은 내생적 형광단의 특정 3d 검출, 시각화 및/또는 정량화를 위한 비침습적 방법 - Google Patents

생체 조직에서의 멜라닌과 같은 내생적 형광단의 특정 3d 검출, 시각화 및/또는 정량화를 위한 비침습적 방법 Download PDF

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Abstract

생체 조직에서의 내생적 형광단 (endogenous fluorophore) 의 검출, 정량화 및/또는 시각화를 위한 방법으로서, a) 다광자 여기 (multiphoton excitation) 이후에, 샘플에서의 형광 신호들의 시간 경과에 따른 감소에 대한 정보를 제공하는 연속적인 3 차원 또는 2 차원 이미지들의 세트를 획득하는 단계, b) 형광 신호들의 로그의 선형 회귀를 수행하여 이들 이미지들을 프로세싱함으로써, 상기 선형 회귀의 슬로프들의 샘플에서의 공간 분포를 결정하는 단계, 및 c) 이 공간 분포에 적어도 기초하여 샘플에서의 형광단의 체적 밀도 또는 표면 밀도 및/또는 존재에 대한 정보를 생성하는 단계를 포함하고, 형광단은 멜라닌인, 생체 조직에서의 내생적 형광단의 검출, 정량화 및/또는 시각화를 위한 방법.

Description

생체 조직에서의 멜라닌과 같은 내생적 형광단의 특정 3D 검출, 시각화 및/또는 정량화를 위한 비침습적 방법{NON-INVASIVE METHOD FOR SPECIFIC 3D DETECTION, VISUALIZATION AND/OR QUANTIFICATION OF AN ENDOGENOUS FLUOROPHORE SUCH AS MELANIN IN A BIOLOGICAL TISSUE}
본 발명은 생체 조직들, 특히 피부와 같은 케라틴 물질들의 관찰에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은, 특히 미용 또는 치료 처리의 작용을 평가하기 위해, 생체 조직들에서의 멜라닌의 분포, 특히 분포의 성질 및/또는 양을 결정하는 것을 목표로 한 방법에 관한 것이지만 이것에 한정되지 않는다.
생체 조직들의 컬러는 멜라닌의 3 차원 분포 및 양에 밀접하게 관련된다. 현재, 멜라닌의 분포 및 양의 특징화는, 백색광 이미징 및 조직학적 부분 상에서의 폰타나 마손 (Fontana Masson) 으로 염색된 멜라닌의 정량화에 의한 2 차원 형태로, 또는 다광자 이미징 (multiphoton imaging) 및 이미지 프로세싱 이후의 멜라닌의 3 차원 정량화에 의한 3 차원 형태로 실시될 수 있다.
다광자 현미경 검사법은 생체 조직들, 특히 고도로 산란하는 살아 있는 조직들의 깊은 관찰을 용이하게 한다. 이것은, 적외선 광이 덜 산란되고 덜 흡수되므로 적외선 광이 조직들 내로 더 양호하게 침투하고 그리고 비선형 메커니즘을 이용하여 신호를 생성하는 것이 산란 매질에 더 강한 신호 선택 기준을 도입하기 때문이다. 이러한 비선형 메커니즘은, 검출하기를 원하는 구조 또는 분자와 2 개 또는 심지어 수 개의 광자들의 동시 상호작용을 수반한다. 일반적으로, 자극적인 빔 (excitatory beam) 은 샘플에서 포커싱되고 스캐닝되며, 생성된 비선형 신호가 이미지를 획득하기 위해 검출된다. 이러한 종류의 이미징의 특이성은, 이미징이 신호의 비선형 의존성으로 인해 여기 파워 (excitation power) 를 제공하는 광학 부분 능력에 기초한다. 여기 파워 밀도는 초점에서 매우 높기 때문에, 고려 중인 비선형 효과는 제한된 초점 체적에서만 효율적으로 발생하며; 이러한 본질적인 특성은 샘플에서 획득되는 신호의 억제를 보장하고, 그리하여 마이크로미터 정도의 고유한 3 차원 분해능을 획득할 수 있게 한다. 이미징 깊이는 조직들에 따라 다양하며, 그 깊이는 사람의 피부에 대해 대략 130 내지 200 ㎛ 일 수도 있다.
또한, 내생적 신호 소스들의 사용으로 인해서, 이러한 이미징 기법은 조직 성분들의 라벨링을 요구하지 않는다. 형광 신호들은 내생적 발색단들에 의해 생성되고; 멜라닌뿐만 아니라, NAD(P)H, 플라빈들, 케라틴 및 엘라스틴이 언급될 수도 있다.
출원 FR 2 944 425 에는, 표피의 기저층들의 레벨에서의 피부에 있어서, 다른 내생적 형광단들 (endogenous fluorophores) 의 형광 강도보다 더 강한 형광 강도에 의해 고 농축 멜라닌이 반영된다는 사실에 기초하여 다광자 현미경 검사법에 의해 피부 색소침착 (skin pigmentation) 을 평가하는 방법이 개시되어 있다. 강한 강도를 갖는 픽셀들은 멜라닌에 기인한다. 그럼에도 불구하고, 이 방법은 항상 만족스럽지는 않는데, 그 이유는, 첫 번째로, 케라틴과 같이 강한 형광 강도를 또한 발현하는 다른 형광단들에 의해 방해될 수 있고, 두 번째로, 다른 내생적 형광단들의 형광 신호에 필적하는 형광 신호를 발현하는 멜라닌을 고려하지 않기 때문이다.
보다 특정적인 방법은 멜라닌의 형광 수명을 고려하는 데에 있다. 사실상, 멜라닌의 형광 수명은 멜라닌의 고유한 형광 특성들에 의존하며, 여기 체적에서의 형광단의 농도에 또는 형광의 강도에 의존하지 않는다. 멜라닌은 다른 내생적 형광단들의 형광 수명과는 상이한 2-광자 여기된 형광 수명을 갖는다. 이러한 형광 수명은, 시간 경과에 따라 형광 신호의 감소를 모니터링하는 것에 있는, M.S. Roberts 등에 의한 논설 "Non-invasive imaging of skin physiology and percutaneous penetration using fluorescence spectral and lifetime imaging with multiphoton and confocal microscopy" (유럽 약제학 및 생물 약제학 학술지의 vol. 77 (2011), pp 469-488) 에 기재된 기법인 FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging) 에 의해 획득되는 이미지들에 기초하여 추정될 수도 있다. 출원 JP2009-142597 에는, 다광자 현미경 검사법과 FLIM 을 조합하여 멜라닌을 시각화하는 방법이 기재되어 있다. 후자의 기법은, 형광 수명의 양호한 추정을 제공하기 위해서, 시간 및 공간에 있어서 형광 신호의 적분, 시간 관점에서 값싼 동작을 요구하며, 이에 따라 특히 3 차원 이미징의 맥락에서 이 기법의 응용의 가능성을 제한한다.
그리하여, 생체 조직들에서의 멜라닌의 분포의 3 차원 시각화를 위해, 신뢰성 있고 신속하고 적절한 결과들을 획득할 수 있게 하는, 구현이 용이한 민감성 비침습적 방법의 이점을 가질 필요가 있다.
본 발명의 목적은, 특정적으로 멜라닌을 검출할 수 있게 하고 그리고 생체 조직, 특히 표피에서의 멜라닌의 3 차원 분포를 특징화할 수 있게 하는, 종래기술의 방법들보다 더 간단하고 더 신속한 방법을 개발하는 것이다.
또한, 처리 동안 사용되는, 예를 들어 색소침착 방지 (anti-pigmenting), 탈색 (depigmenting) 또는 전색소침착 (pro-pigmenting) 활성제들에 기초한, 제품의 무해 또는 효능을 검증할 수 있게 할 필요가 있다.
또한, 피부 타입, 인구, 지리적 위치, 또는 그 밖의 식습관 등에 따라 멜라닌의 분포 및 양의 차이들을 객관화하기 위해, 그리고 화학선 흑자 (actinic lentigenes), 모반 (주근깨) 또는 기미 (임신 동안 때때로 나타나는 마스크) 와 같이, 특히 피부의 색소침착 장애를 특징화하기 위해, 특히 피부의 색소침착을 특징화하는 것이 유리하다.
게다가, 합성 방식으로 재현된 새로운 조직들을 개발하기 위한 조사의 맥락에서, 조직 모델, 특히 피부 모델의 타입에 따라 멜라닌의 분포 및 양의 차이들을 객관화할 필요가 있다.
본 발명은 이들 필요성들의 전부 또는 일부를 충족시키기 위한 것이다.
그리하여, 본 발명의 양태들 중 하나 양태에 따른 본 발명의 과제는, 생체 조직에서, 멜라닌과 같은 내생적 형광단 성분의 검출, 정량화 및/또는 시각화를 위한 방법이며, 이 방법은,
a) 다광자 여기 (multiphoton excitation) 이후에, 샘플에서의 형광 신호들의 시간 경과에 따른 감소에 대한 정보를 제공하는 연속적인 3 차원 또는 2 차원 이미지들의 세트를 획득하는 단계,
b) 형광 신호들의 로그의 선형 회귀를 수행하여 이들 이미지들을 프로세싱함으로써, 상기 선형 회귀의 슬로프들의 샘플에서의 공간 분포를 결정하는 단계, 및
c) 이 3 차원 공간 분포에 적어도 기초하여 샘플에서의 형광단의 양 및/또는 존재에 대한 정보를 생성하는 단계를 포함한다.
이 방법은 비침습적이고, 비치료, 미용 맥락에서 사용될 수도 있다.
이 방법은 색소침착을 평가하는 것을 가능하게 할 수도 있다.
획득된 이미지들은 3 차원 시간적 이미지들이다. 용어 "3 차원 시간적 이미지" 는 시간 경과에 따른 일련의 연속적인 3 차원 이미지들을 의미하도록 의도된다.
각각의 3 차원 이미지는, 소정 순간 및 소정 깊이에서의 샘플의 구조를 나타내는 2 차원 이미지들의 스택에 대응한다.
각각의 3 차원 또는 2 차원 이미지의 각각의 픽셀은 공간 좌표들 (x, y, z) 에 의해 정의될 수도 있으며, z 는 샘플에서의 깊이이다. 그리하여, 각각의 2 차원 이미지는, 오로지 소정 깊이 z 에서 획득이 실시된, 3 차원 이미지의 특정한 경우에 대응한다.
3 차원 이미지들의 픽셀들은 다양한 순간들에서 취해진 이미지들의 동일한 공간 좌표들을 갖는 픽셀들의 세트들로 함께 그룹화되며, 이들 세트들의 각각은 "시간적 픽셀" 이라 불린다.
각각의 픽셀의 형광 신호의 값은 2-광자 여기된 형광 신호의 시간 주기에 걸친 적분에 의해 획득될 수도 있다. 형광 신호의 적분은 특히 규칙적인 간격들로, 특히 1 내지 3 ns 사이, 예를 들어 1, 1.5, 2, 2.5 또는 3 ns 와 동일한 주기에 걸쳐 실시될 수 있다.
형광 신호들의 감소의 슬로프는 형광 수명들의 로그의 선형 회귀에 의해 획득될 수 있다. 이 방법은, 제한된 수의, 예를 들어 획득 시간과 정밀도 사이의 양호한 타협을 제시하는 3 개 내지 5 개 사이의 3 차원 시간적 이미지들만의 획득을 요구할 수도 있다. 로그의 선형 회귀에 의해 획득된 슬로프들의 사용은, 이러한 획득들의 수의 제한을 용이하게 한다.
FLIM 기술과 비교하면, 본 발명은 시간적 획득들의 수를 감소시키고, 그 방법의 구현을 보다 용이하고 보다 신속하게 한다. FLIM 기술은 형광 수명의 보다 양호한 추정을 허용하지만 3 차원 이미지의 분해능의 저하를 갖는 상당히 긴 획득 시간 (대략 30 s) 을 요구하는 한편, 본 발명에 따른 방법은 현미경의 이론적 분해능과 동등한 분해능을 유지시킴과 동시에 보다 신속하고 3 차원 시각화 또는 정량화를 획득하기 위해 특히 유리하다.
소정 샘플의 좌표들 (x, y, z) 의 시간적 픽셀들에 대한 총 획득 시간은 FLIM 에서의 수 ms 대신에 대략 0.28 ㎲ 이다.
각각의 시간적 픽셀에 대한 시간적 획득들의 수는, 예를 들어 4 와 동일하고, 각각의 픽셀에 대해, 2-광자 여기된 형광 신호는 특히 2 ns 의 규칙적인 간격으로, 2 개의 획득들 사이에서 시간 경과에 따라 적분된다.
본 발명에 따른 방법은 생체 내에서 (in vivo) 구현될 수 있지만, 생체 밖에서 (ex vivo) 그리고 시험관 내 (in vitro) 샘플들에서 구현될 수 있다.
본 발명은 획득 방법 및 이미지 프로세싱 방법의 신속성을 향상시킨다. 본 발명에 의하면, 조직의 3D 특징화가 가능하고, 높은 쓰루풋으로 생체 내 응용을 허용한다.
조직은 사람의 케라틴 물질들로 이루어질 수도 있다. 용어 "케라틴 물질들" 은 그 중에서도 머리카락, 속눈썹들, 눈썹들, 피부, 손톱들, 점막들, 두피를 의미하도록 의도된다.
본 발명에 따른 생체 조직, 특히 케라틴 물질들은 천연 또는 인공일 수도 있고; 샘플은, 예를 들어 사람의 피부 또는 재현된 또는 인공 피부이다.
생체 조직은 배양조직 (culture) 에서의 멜라닌화된 세포들일 수도 있다.
정보는, 적어도 하나의 이미지, 특히 2 차원 또는 3 차원 이미지의 형태로 생성될 수도 있다.
생성된 정보는 상기 조직에서의 멜라닌에 의해 차지되는 체적 및/또는 표면에 대한 그리고 또한 조직의 다른 구성성분들에 비교된 그것의 3D 분포에 대한 정보를 제공할 수도 있다.
본 발명의 양태들 중 다른 양태에 따른 본 발명의 과제는, 생체 조직에 대한, 특히 전색소침착, 탈색 또는 색소침착 방지되는, 처리 및/또는 자극의 작용을 평가하는 방법이며, 이 방법은,
- 앞서 기재된 바와 같은 방법에 의해서 생체 조직에서의 색소침착을 평가하는 단계,
- 광 방사선, 특히 태양, 자외선 (UVA 및/또는 UVB) 또는 적외선 (IR) 방사선으로부터 선택된 자극, 또는 특히 적어도 하나의 전색소침착, 탈색 또는 색소침착 방지 제품에 의한 처리에 샘플을 노출시키는 단계로서, 자극은 염증 반응, 및 역학적 작용 (인장, 압력, 박피, 탈리, 박리, 연마) 을 야기하는, 샘플을 노출시키는 단계,
- 앞서 기재된 바와 같은 방법에 의해서 생체 조직에서의 색소침착의 제 2 평가를 수행하는 단계,
- 이 2 개의 평가들 동안 생성된 정보를 비교하는 단계, 및
- 적어도 이 비교에 기초하여 색소침착에 대한 처리 또는 자극의 작용을 평가하는 단계를 포함한다.
처리는 비치료적, 특히 미용적일 수도 있다.
처리는 제품, 특히 미용 제품의 도포, 주사, 섭취 또는 흡입으로부터 선택될 수도 있다.
처리는 식품 보충제들 및/또는 약제들을 복용하는 것에 대응할 수도 있다. 그것은 또한 제품, 특히 미용 제품의 도포, 주사, 섭취 또는 흡입으로부터 선택된 처리에 생체 조직들의 노출, 또는 식품 보충제들 및/또는 약제들의 복용을 포함할 수도 있다.
용어 "미용 제품" 은 Directive 76/768/EEC 를 개질한, 1993년 6월 14일의 Directive 93/35/EEC 에서 정의된 바와 같은 제품을 의미하도록 의도된다.
제품은 탈색 효과를 가질 수도 있다. 그리하여, 처리는 임의의 색소침착-조절 화학작용제의 도포를 포함할 수도 있다.
전색소침착 또는 탈색 미용 제품은 루시놀일 수도 있다.
본 발명에 따른 방법은 탈색, 색소침착 방지 또는 전색소침착 활성제들의 무해 또는 효능을 평가하기 위해 이용될 수도 있다. 활성제들은, 예를 들어 히드로퀴논 또는 레티노이드들의, 치료 목적을 위한 것일 수도 있고 및/또는 미용 목적을 위한 것일 수도 있다.
본 발명에 따른 방법은 또한, 어떤 제품들, 예를 들어 데르모코르티코이드들의 색소침착에 대한 부작용을 평가하기 위해 이용될 수도 있다.
본 발명의 양태들 중 다른 양태에 따른 본 발명의 과제는, 생체 조직에 대한, 특히 색소침착 방지, 전색소침착 또는 탈색되는, 처리 및/또는 자극의 작용을 평가하는 방법이며, 이 방법에서는, 생체 조직의 적어도 2 개의 영역들이 자극에 상이하게 노출되고 그리고/또는 상이하게 처리되고, 상기 처리 또는 상기 자극에의 노출 전후에, 앞서 기재된 바와 같은 방법에 의해서 획득된, 상기 영역들에서의 멜라닌의 양 및/또는 존재에 대한 정보가 비교된다.
제품의 작용을 시험하기 위해, 제품의 위약 (placebo) 에 의한 처리 이후의 평가와 이 제품에 의한 처리 이후의 평가를 비교할 수도 있다.
위약은, 예를 들어 처리에 사용되는 제품의 미용 매체와 동일한 미용 매체이지만, 대응하는 활성제(들)를 갖지 않는 것이다.
미용 화합물에 의해 처리되어 있는 인공 또는 재현된 피부의 샘플들 상에서 또는 개인의 생체 조직들에서의 멜라닌의 분포의 평가를 실시하고, 그리고 미용 화합물의 위약으로 처리되어 있는 인공 또는 재현된 피부의 동일한 샘플들 또는 동일한 개인의 생체 조직들에서의 멜라닌의 분포의 평가와 비교할 수 있다.
처리는 제품, 특히 미용 제품의 도포에 대응할 수도 있다. 제품은 예를 들어 크림, 로션, 연고, 오일, 분말의 형태로 있을 수도 있으며, 이 리스트에 제한되지 않는다.
제품은 또한 생체 조직들, 특히 재현된 또는 인공적 사람 피부에 가해지는 지지대, 예를 들어 패치, 드레싱, 붕대 또는 마스크에 함유되어 있을 수도 있다.
제품은, 오로지 생체 조직들에서의 멜라닌의 분포 및/또는 양에 대해 작용하도록 의도된 색소침착 또는 탈색 제품이 아닐 수도 있다. 그리하여, 제품은, 생체 조직들에서의 멜라닌의 분포 및/또는 양에 대한 효과들을 갖는 동시에, 예를 들어, 생체 조직들을 보호하기 위해, 수분을 제공하기 위해 또는 메이크업하기 위해, 특히 태양으로부터 보호하거나 또는 생체 조직들을 수복하기 위해, 의도될 수도 있다. 그리하여 제품은 다양한 화합물들, 특히 생체 조직들의 멜라닌에 대해 작용하도록 의도된 활성제들 이외의 다른 활성제들을 함유할 수도 있다.
이 방법은 생체 조직들에서의 멜라닌을 시각화하는 것을 가능하게 할 수도 있고; 예를 들어, 피부의 표피의 다양한 층들에서의 멜라닌의 분포를 알 수 있게 할 수도 있다.
본 발명의 양태들 중 다른 양태에 따른 본 발명의 다른 과제는, 처리, 특히 비치료 처리를 촉진시키는 방법이며, 이 방법에서는 상기 정의된 바와 같은 방법에 의해서 증명된, 멜라닌에 대한 처리의 작용이 참조된다.
본 발명의 양태들 중 다른 양태에 따른 본 발명의 다른 과제는, 제품의 마케팅 동안, 예를 들어 광고 또는 포장에, 상기 정의된 바와 같은 방법에 의해서 제품의 효능이 검증되었다는 사실을 참조하게 하는 단계를 포함하는 방법이다.
본 발명은 본 발명의 구현의 비제한적인 예들의 하기 설명을 판독하고 그리고 첨부 도면의 도면들을 검토함으로써 더욱 잘 이해될 수도 있다.
도 1 은 본 발명에 따른 방법의 다양한 단계들을 나타낸다.
도 2 는 본 발명에 따른 방법에 사용될 수도 있는 다광자 디바이스의 예를 도해하여 그리고 부분적으로 나타낸다.
도 3 의 (a) 내지 (d) 는 본 발명에 따른 이미지 획득의 예를 나타낸다.
도 4 의 (a) 및 (b) 는 샘플 내부의 형광의 시간적 변화의 다양한 예들을 나타낸다.
도 5 는 고정된 깊이에서 피부 샘플의 부분에 대한 형광 수명들의 파라미터 표현을 나타낸다.
도 6 및 도 7 은 본 발명에 따른 방법에 의해서 획득된, 피부 샘플에서의 멜라닌 분포의 2 차원 및 3 차원 마스크들을 나타낸다.
도 8 은 종래 기술의 방법에 의해서 획득된, 피부 샘플에서의 멜라닌 분포의 2 차원 마스크를 나타낸다.
도 9 의 (a) 내지 (d) 는 처리 전후의 피부 샘플에서의 멜라닌의 양을 나타낸다.
도 10a, 도 10b 및 도 10c 는 멜라닌의 양에 의한 사람의 피부 포토타입 I 내지 IV 의 특징화를 나타낸다.
본 발명에 따른 방법의 단계 1 은, 생체 조직 샘플의 다양한 깊이들에서의 2 차원 시간적 이미지들의 세트들을, 다광자 현미경 검사법에 의해 획득하는 것에 있을 수도 있다.
각각의 픽셀은, 예를 들어 TCSPC (time-correlated single photon counting) 광자 카운팅 디바이스를 사용하여, 2-광자 여기된 형광 신호의 시간 주기에 걸친 적분에 의해 획득될 수도 있다.
다광자 현미경 검사법 디바이스의 사용은 생체 조직 이미지 획득 단계들의 자동화를 허용할 수도 있다.
3 차원 시간적 이미지는 특히 다양한 깊이들에서의 2 차원 시간적 이미지들의 스택으로부터 생성될 수도 있다. 각각의 스택은, 수십 개의 2 차원 시간적 이미지들, 예를 들어 50 개 내지 100 개의 이미지들, 특히 65 개 내지 80 개의 이미지들을 포함할 수도 있다.
단계 2 에서, 좌표들 (x, y, z) 의 각각의 픽셀에 대해, 형광 강도의 변화는 형광 강도의 로그를 계산함으로써 시간 함수로서 연구된다. 로그는 그 후에, 형광 수명에 관련되는, 선형 회귀의 슬로프를 추정하기 위해 선형 회귀에 의해 조정된다.
획득된 데이터는 그리하여 형광 강도의 로그의 선형 회귀에 의해 획득된 슬로프들의 이미지로 표현될 수도 있다.
파라미터 이미지라고도 불리는, 슬로프 이미지는, 2 타입의 픽셀들: 낮은 슬로프에 의해 특징화되는 픽셀들 및 높은 슬로프 값에 의해 특징화되는 픽셀들을 함유한다. 높은 값의 슬로프들을 갖는 픽셀들은, 케라틴, NAD(P)H, FAD 등과 같이, 표피의 세포들의 다른 내생적 형광단들에 비교해서 더 짧은 수명을 갖는, 멜라닌에 기인한다.
사실상, 멜라닌은 2 개의 형광 수명들에 의해 특징화된다. 주요한 하나의 형광 수명은 매우 짧으며, 0.1-0.2 ns (나노초) 정도이다. 멜라닌의 다른 형광 수명은 소수이며, 0.7 내지 1.4 ns 사이로, 더 길다. 그에 비해서, 케라틴, NAD(P)H, FAD 등과 같이, 표피의 세포들의 다른 내생적 형광단들은, 1.5 ns 보다 더 큰, 우세하게 더 긴 형광 수명들을 갖는다.
단계 3 은 슬로프 이미지로부터 멜라닌에 대응하는 픽셀들을 추출하는 것에 있다. 노이즈를 제거하고 그리고 멜라닌을 보다 특정적으로 검출하기 위해서, 멜라노솜들 (melanosomes) 의 사이즈를 고려하는, 즉, 그것을 대략 1 ㎛2 의 참조 표면적과 비교하는, 표면 필터링이 예를 들어 각각의 2 차원 이미지에 적용된다.
샘플에서의 멜라닌의 양 및/또는 존재에 대한 정보는, 예를 들어 1 ㎛2 미만의 사이즈를 갖는 구조들 및 낮은 값의 슬로프들을 갖는 형광 신호들을 제거한 후에 생성된다.
정보는, 멜라닌의 공간 분포의 적어도 하나의 표현의 형태로, 특히 샘플의 하나의 깊이에 대한 멜라닌 마스크에 대응하는 2 차원 이미지의 형태로 생성될 수도 있다.
슬로프들을 계산하는 단계 2 및 연관된 마스크를 필터링하는 단계 3 은, 소정 깊이에 대응하는 2 차원 이미지의 전체에 대해 실시될 수도 있고, 3 차원 스택의 각각의 이미지에 대해 반복될 수도 있다.
이 방법은 멜라닌 마스크의 3 차원 이미지를 형성하는 2 차원 표현들의 스택을 획득하는 것을 가능하게 한다.
이 방법에 의해서 획득된 3 차원 멜라닌 마스크에 기초하여, 멜라닌의 밀도 및/또는 멜라닌의 공간 분포를 계산함으로써 멜라닌을 특징화할 수 있다.
계산의 신속성을 고려하면, 이 방법은 스크리닝 방법 (screening method) 에서 이용될 수도 있다.
형광 수명을 측정하기 위한 시스템과 조합되어, 임의의 공지된 다광자 현미경 검사법 시스템이, 상기 방법을 구현하기 위해 사용될 수도 있다.
사용된 여기 파장은 700 내지 1000 nm 사이에, 바람직하게는 약 760 nm 일 수도 있다. 이 파장 범위는 조직들의 대부분의 형광 구성성분들을 이미징하는 것을 가능하게 한다.
도 2 는 본 발명에 따른 방법에 사용될 수도 있는 다광자 디바이스 (100) 의 예를 도해하여 그리고 부분적으로 나타낸다.
다광자 디바이스 (100) 는, 예를 들어 Jenlab 사에 의해 개발된 DermaInspect® 타입의 것이다.
디바이스 (100) 는, 적외선 파장 범위로 튜닝될 수도 있고 그리고 80 MHz 정도의 반복률에서 100 펨토초 정도의 펄스들을 제공할 수도 있는, 펨토초 레이저 (10), 예를 들어 티탄-사파이어 (Ti : Sa) 레이저를 포함한다. 레이저 (10) 는, "XY 스캐너" 의 형태의 레이저 빔 스캐닝 디바이스 (12) 를 향해 지향되는 적외선 빔 (11) 을 방출한다. 레이저 빔의 스캔은 스캐닝 디바이스 (12) 의 2 개의 갈바노메트릭 미러들 (galvanometric mirrors) 의 각 이동 (angular movement) 에 의해 획득될 수도 있다. 그 후 빔은 다이크로익 미러 (dichroic mirror) (14) 에 의해 반사되고 대물렌즈 (15) 에 의해서 케라틴 물질들 (13) 상에 포커싱된다. 그리하여, 2 개의 갈바노메트릭 미러들은 빔의 전파 방향 (z 축) 에 수직인 평면 (x, y) 에서의 초점의 스캐닝을 허용한다.
압전 디바이스는 대물렌즈 (15) 를 병진시키고 그리하여 케라틴 물질들 (13) 에 포커싱하는 평면을 변화시키는 것을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 획득된 이미지들의 중첩에 의해 케라틴 물질들에서의 멜라닌의 3 차원 분포를 재구성할 수 있다.
이와 같이 하기 위해, 초점에서 생성된 신호들이 그 후에, 즉 여기 대물렌즈 (15) 를 통한 에피콜렉션 (epicollection) 에 의해 검출될 수도 있다. 제 1 다이크로익 미러 (14) 는 생성된 다광자 신호들, 특히 케라틴 물질들 (13) 로부터 유래하는 자가형광 (AF) 을 선택하는 것을 가능하게 할 수도 있다.
그 후, 제 2 다이크로익 미러 (16) 는 예를 들어 SHG (second harmonic generation) 에 대응하는, 다른 다광자 신호들로부터 자가형광 (AF) 신호들을 분리하는 것을 가능하게 할 수도 있다. 임의의 경우에, 신호들은 필터들 (17) 을 통과하고 광자 카운팅 검출기들 (TCSPC: time-correlated single photon counting) (18, 19) 에 도달하여, 조합된 이미지, 예를 들어 AF/SHG 이미지를 생성하는 것을 가능하게 한다.
제 1 및 제 2 검출기들 (18 및 19) 은, 신호 획득 및 프로세싱을 위한 전자 디바이스 (20) 에 송신되는 신호들 (18a 및 19a) 을 생성하는 것을 가능하게 할 수도 있다.
예 1 : 사람의 피부의 생체 내 관찰
시험 동안, 사람들의 팔뚝 상의 생체 내에서 3 차원 이미지들이 연속적으로 획득되었고, 하나의 3 차원 이미지는, 40x/1.3 NA 대물렌즈 및 760 nm 의 여기 파장으로, DermaInspect® 디바이스를 사용하여 획득되는, 피부의 표면으로부터 2.346 ㎛ 까지 이르는 깊이에서 획득된 70 개의 2 차원 이미지들을 포함하는 스택으로 이루어진다.
도 3 의 (a) 내지 (d) 는, 피부의 표면에 대해 50 ㎛ 의 깊이에서 표피의 기저층 가까이에서, 건강한 지원자의 팔뚝의 피부 상의 생체 내에서 획득된 4 개의 2 차원 시간적 이미지들만이 도시되어 있는, 3 차원 이미지들의 시간적 시퀀스를 나타낸다. 각각의 시간적 이미지에 대해, 형광 신호는 2 ns 의 주기에 걸쳐 적분되었다.
실험 조건들 하에서, 멜라닌을 함유하는 샘플의 지점에 대해, 방출된 다수의 형광 광자들은 제 1 시간적 획득 동안 수집된다. 멜라닌의 농도가 클수록, 이러한 제 1 획득의 광자들의 수가 더 높다. 제 1 시간적 채널에 대응하는 도 3 의 (a) 의 화살표 I 는 강도 기준에 기초하여 높은 멜라닌 농도의 구역을 나타낸다. 이 레벨에서, 고 농축 멜라닌은 다른 내생적 형광단들의 강도보다 더 강한 강도의 형광 신호를 생성한다.
도 4 의 (a) 및 (b) 는 멜라닌을 갖는 샘플의 지점에 대응하는 이미지의 픽셀에 대해 그리고 멜라닌을 갖지 않는 샘플의 지점에 대응하는 픽셀에 대해 시간적 전개 곡선 (도 4 의 (a)) 및 선형 회귀에 의한 형광 강도의 로그의 조정 (도 4 의 (b)) 의 예를 도시한다.
도 5, 도 6, 및 도 8 은 50 ㎛ 의 깊이에서의 사람의 피부의 2 차원 표현들에 대응한다. 도 5 는 형광 강도의 로그의 선형 회귀에 의해 획득된 슬로프들의 파라미터 이미지를 도시한다. 이미지는, 앞서 서술된 이유들로 멜라닌에 기인하는, 2 종류의 픽셀들: 낮은 슬로프에 의해 특징화되는 픽셀들, 및 높은 슬로프 값에 의해 특징화되는 픽셀들을 갖는다.
도 6 은 멜라닌에 기인하는 픽셀들의 추출에 의해 도 5 로부터 획득된 멜라닌의 2 차원 마스크를 도시하며, 한편 도 8 은 형광 강도에 오로지 기초하는 종래 기술의 방법으로 획득된 결과를 나타낸다.
도 5 및 도 8 을 비교하면, 강렬한 픽셀들만이 멜라닌에 기인하기 때문에, 멜라닌의 존재는 도 8 에 의해 과소 평가되는 것으로 관찰된다.
3 차원 스택의 각각의 2 차원 이미지에 대해, 도 7 에 나타낸 바와 같이, 연관된 멜라닌 마스크를 3 차원적으로 시각화하기 위해서 그리고 각질층을 포함하여, 표피 전체에 걸쳐서 3 차원적으로 그것의 분포를 특징화하기 위해서, 각각의 픽셀에 대응하는 시간의 함수로서의 형광 강도의 로그의 슬로프들의 계산 및 대응하는 2 차원 마스크의 필터링이 반복된다.
이 방법으로 실시되는 후속하는 예 2 및 예 3 에 대응하는 시험들은, 멜라닌의 양의 차이를 증명하였다.
예 2: 데르모코르티코이드들에 의한 처리의 평가
데르모코르티코이드들에 의한 처리 전후의 피부의 동일한 구역에 대해 앞서 설명한 바와 같은 DermaInspect® 현미경을 사용하여 관찰들이 실시되었다.
도 9 의 (a) 는 처리 전의 피부 구역의 샘플의 형광의 원 이미지 (raw image) 를 도시하고, 도 9 의 (c) 는 본 발명에 따른 방법에 의해서 획득된 대응하는 멜라닌 마스크를 도시한다.
피부는 (폐색 하에서) 데르모코르티코이드들로 처리된다.
도 9 의 (b) 및 (d) 는 3 주의 처리 후에 샘플의 형광의 원 이미지 그리고 본 발명에 따른 방법에 의해서 획득된 대응하는 멜라닌 마스크를 나타낸다.
본 발명에 따른 방법은 멜라닌의 특정 검출을 허용하고; 도 8 의 (c) 및 (d) 에 나타낸 마스크들의 비교는 멜라닌의 양의 감소를 증명하며, 그리하여 피부에서의 멜라닌의 3 차원 정량화를 통해 데르모코르티코이드들에 의해 유발된 개질들의 더욱 양호한 평가를 허용한다.
예 3: 사람의 피부 포토타입들 I 내지 IV 의 특징화
사람의 피부는 태양에 노출될 때의 피부의 반응에 따라 6 개의 포토타입들로 분류된다. 거무스름한 피부 (포토타입들 V 및 VI) 는 UV 광선들을 선천적으로 스크리닝하는 멜라닌의 더 많은 양을 갖는다. 본 발명에 따른 방법은, 매우 흰 (very fair) 것에서부터 적당히 갈색 (moderate brown) 인 것에 이르는 피부에 대응하는 포토타입들 I 내지 IV 의 구성 색소침착의 보다 양호한 분석을 허용한다.
도 10a 및 도 10b 는 다양한 포토타입들에 대한 피부 샘플들에 대한 형광의 원 이미지 그리고 본 발명에 따른 방법에 의해서 획득된 대응하는 멜라닌 마스크를 도시한다.
도 10b 의 마스크들에 기초하여, 포토타입에 의한 멜라닌의 양의 증가를 증명하는 도 10c 의 비교 그래프를 획득하기 위해 멜라닌의 3D 밀도가 계산되었다.
포토타입 I 에 대응하는 도 10b 의 마스크에 의해 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은, 심지어 낮은 농도에서도 멜라닌의 존재를 정량화하는 것을 가능하게 한다. 그러므로 이 방법은 멜라닌을 함유하는 임의의 타입의 조직에 대해 사용될 수도 있다.

Claims (12)

  1. 생체 조직에서의 내생적 형광단 (endogenous fluorophore) 의 검출, 정량화 및/또는 시각화를 위한 방법으로서,
    a) 다광자 여기 (multiphoton excitation) 이후에, 샘플에서의 형광 신호들의 시간 경과에 따른 감소에 대한 정보를 제공하는 연속적인 3 차원 또는 2 차원 이미지들의 세트를 획득하는 단계,
    b) 상기 형광 신호들의 로그의 선형 회귀를 수행하여 이들 이미지들을 프로세싱함으로써, 상기 선형 회귀의 슬로프들의 상기 샘플에서의 공간 분포를 결정하는 단계, 및
    c) 이 공간 분포에 적어도 기초하여 상기 샘플에서의 상기 형광단의 체적 밀도 또는 표면 밀도 및/또는 존재에 대한 정보를 생성하는 단계를 포함하고,
    상기 형광단은 멜라닌이고,
    상기 정보는, 낮은 값의 슬로프들을 갖는 픽셀들을 제거한 후에 생성되는, 생체 조직에서의 내생적 형광단의 검출, 정량화 및/또는 시각화를 위한 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 이미지들의 세트는 3 개 내지 5 개 사이의 이미지들을 포함하는, 생체 조직에서의 내생적 형광단의 검출, 정량화 및/또는 시각화를 위한 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 형광 신호의 적분이 규칙적인 간격들로 1 내지 3 ns 사이의 주기에 걸쳐 실시되는, 생체 조직에서의 내생적 형광단의 검출, 정량화 및/또는 시각화를 위한 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 정보는, 멜라닌의 공간 분포의 적어도 하나의 표현의 형태로 생성되는, 생체 조직에서의 내생적 형광단의 검출, 정량화 및/또는 시각화를 위한 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    생성된 상기 정보는, 상기 생체 조직에서의 멜라닌에 의해 차지되는 체적 및/또는 표면에 대한 정보를 제공하는, 생체 조직에서의 내생적 형광단의 검출, 정량화 및/또는 시각화를 위한 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 생체 조직에 대해 생체 내에서 (in vivo) 구현되는, 생체 조직에서의 내생적 형광단의 검출, 정량화 및/또는 시각화를 위한 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 생체 조직은 사람의 피부, 재현된 또는 인공 피부, 또는 배양조직 (culture) 에서의 멜라닌화된 세포들인, 생체 조직에서의 내생적 형광단의 검출, 정량화 및/또는 시각화를 위한 방법.
  8. 생체 조직에 대한, 전색소침착 (pro-pigmenting) 또는 탈색 (depigmenting) 되는, 처리 및/또는 자극의 작용을 평가하는 방법으로서,
    - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해서 상기 생체 조직에서의 색소침착 (pigmentation) 을 평가하는 단계,
    - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해서 상기 생체 조직에서의 색소침착의 제 2 평가를 수행하는 단계로서, 상기 생체 조직은, 광 방사선, 염증 반응을 야기하는 자극, 및 역학적 작용으로부터 선택된 자극, 또는 적어도 하나의 전색소침착 또는 탈색 미용 제품 또는 임의의 다른 색소침착-조절 화학작용제에 의한 처리의 작용에 노출되는, 상기 색소침착의 제 2 평가를 수행하는 단계,
    - 이 2 개의 평가들 동안 생성된 정보를 비교하는 단계, 및
    - 적어도 이 비교에 기초하여 색소침착에 대한 처리 또는 자극의 작용을 평가하는 단계를 포함하는, 생체 조직에 대한, 전색소침착 또는 탈색되는, 처리 및/또는 자극의 작용을 평가하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 광 방사선은 태양, 자외선 (UV) 또는 적외선 (IR) 방사선인, 생체 조직에 대한, 전색소침착 또는 탈색되는, 처리 및/또는 자극의 작용을 평가하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 전색소침착 또는 탈색 미용 제품은 루시놀인, 생체 조직에 대한, 전색소침착 또는 탈색되는, 처리 및/또는 자극의 작용을 평가하는 방법.
  11. 생체 조직에 대한, 색소침착 방지 (anti-pigmenting), 전색소침착 또는 탈색되는, 처리 및/또는 자극의 작용을 평가하는 방법으로서,
    상기 생체 조직의 적어도 2 개의 영역들이 상기 자극에 상이하게 노출되고 그리고/또는 상이하게 처리되고, 상기 처리 또는 상기 자극에의 노출 전후에, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해서 획득된, 상기 영역들에서의 멜라닌의 양 및/또는 존재에 대한 정보가 비교되는, 생체 조직에 대한, 색소침착 방지, 전색소침착 또는 탈색되는, 처리 및/또는 자극의 작용을 평가하는 방법.
  12. 삭제
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