JP2005274308A - 長波長紫外線誘導メラニン化抑制剤のスクリーニング方法および長波長紫外線誘導メラニン化抑制効果の評価方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 紫外線によって誘導されるメラニンモノマーのメラニン化を抑制する効果の程度を、少量の試料で正確に評価することのできる方法および長波長紫外線誘導メラニン化抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】 メラニンモノマーと被測定試料を含む溶液に紫外線を照射し、次いで、溶液に励起光を照射した時の蛍光強度から得られる紫外線照射後のメラニンモノマー残存率を前記被測定試料のメラニン化抑制作用の指標として用いる。
【選択図】 なし

Description

本発明は長波長紫外線誘導メラニン化抑制剤のスクリーニング方法および長波長紫外線誘導メラニン化抑制効果の評価方法に関し、さらに詳しくは紫外線によって誘導されるメラニンモノマーのメラニン化を抑制する効果の程度を利用して長波長紫外線誘導メラニン化抑制剤のスクリーニングを行う方法、および紫外線によって誘導されるメラニンモノマーのメラニン化を抑制する効果の程度を、少量の試料で正確に評価することのできる長波長紫外線誘導メラニン化抑制効果の評価方法に関する。

従来、紫外線による皮膚の黒化のメカニズムは、紫外線照射後に表皮基底層に存在するメラノサイト内において酵素チロシナーゼの活性が高まることにより、アミノ酸の一種であるチロシンから新規のメラニンが生成され、周囲のケラチノサイトがメラニンを受け取ることによると説明されてきた。この過程にはチロシナーゼ蛋白の新規生合成、基質チロシンからのメラニン合成と周囲のケラチノサイトによるメラニンの受け取りという過程が関与しているため、皮膚が黒く見えるまでには数日程度かかる。このような紫外線による皮膚黒化を防止する方法としては、紫外線を吸収あるいは散乱する紫外線遮蔽剤の他に、チロシナーゼの合成や活性を抑制するいわゆる美白剤と称されるコウジ酸やアルブチン等が用いられてきた。

一方、レジャーや海水浴で過度に太陽光線を浴びた場合には１日以内という短い時間で皮膚の黒化が起こる場合があるが、上記の皮膚黒化の作用機序では説明がつかないため、異なる作用機序が存在していると考えられていた。近年、この比較的短時間で生じる皮膚黒化のメカニズム解析が進み、表皮基底層に存在している無色透明な化合物ジヒドロキシインドールカルボン酸やその関連化合物等のメラニンモノマーが、紫外線Ａ波（３２０ｎｍ〜４００ｎｍ）にあたることによって重合しメラニンになることが、短時間に生じる皮膚黒化のメカニズムの一つであることが明らかになった（例えば特許文献１、非特許文献１）。
このような皮膚黒化を抑制する化合物は、美白剤としての応用の他に、紫外線、特にＵＶＡの関与する皮膚症状、例えば持続性即時型黒化の改善や防止への応用が可能である。

そのような化合物のスクリーニング方法およびメラニン化抑制効果の評価について、従来は以下に示す方法によって行われていた。すなわち、メラニンモノマーと被測定試料を含む溶液に紫外線を照射し、照射後のメラニン生成の程度を、吸光度により算出し、前記被測定試料のメラニン化抑制作用の指標として用いていた。そのような方法により上記のメラニン化抑制効果を有する化合物として、既にアスコルビン酸およびその誘導体が知られている。

評価方法の一例として、メラニンモノマーの一種であるＤＨＩＣＡ（５，６―ジヒドロキシインドールー２−カルボン酸）の黒色メラニン化に対する化合物の抑制効果評価方法を示す。

ＤＨＩＣＡを０．０１〜０．１質量％となるよう、水またはリン酸緩衝液等の緩衝液に溶解し、マイクロプレートウェルに１００μｌ分注する。各濃度に調製した被測定試料、例えばアスコルビン酸やその誘導体を１００μｌ添加してＦＬ−２０ＢＬＢ蛍光ランプを用いて長波長紫外線を１時間照射し、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍの吸光度を測定して、黒褐色メラニン化の程度を算出し、化合物の抑制効果を評価する。

特開２００３−５５２６０号公報 J.Invest.Dermatol.vol.122,pp503-509(2004)

しかしながら、上記の紫外線誘導メラニン化の抑制効果の評価方法では、メラニンモノマーはメラニン化を吸光度で評価できる程度の濃度（０．０１〜０．１質量％）の溶液が必要であり、それに伴い、被測定試料も同程度の濃度の溶液が必要となってくる。ここでいう必要な濃度とはすべて最終濃度のことであり、混合前にはより高い濃度での各試料の調製が必要となり、リン酸緩衝液等の溶媒に溶解性が悪い化合物については評価することができないという欠点があった。

また、製造コストが高いメラニンモノマーにおいては、１回の評価にかかるコストを低減するためにより低濃度での評価法が望まれていた。

さらに、長波長紫外線領域に吸収を持つ化合物の場合には、化合物の吸収によるメラニン生成抑制効果を無視できず、メラニン生成抑制効果を評価できないという問題点もあった。

本発明はこのような従来の評価方法の問題点を解決するためになされたもので、吸光度に代わる新たな指標を用いて微量の被測定試料で正確に長波長紫外線誘導メラニン化抑制剤のスクリーニングを行う方法および長波長紫外線誘導メラニン化抑制効果を評価する方法を提供することを目的とする。

本発明者等は上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、紫外線照射前後における特定波長の蛍光強度を測定することによって、紫外線照射後のメラニンモノマー残存率を算出し、これを被測定試料のメラニン化抑制効果の指標として用いることができることを見出した。

すなわち本発明は、メラニンモノマーと被測定試料を含む溶液に長波長紫外線を照射し、次いで、溶液に励起光を照射した時の蛍光強度から得られる紫外線照射後のメラニンモノマー残存率を用いて長波長紫外線誘導メラニン化の抑制に働く薬剤のスクリーニングを行うことを特徴とする長波長紫外線誘導メラニン化抑制剤のスクリーニング方法である。

また本発明は、メラニンモノマーと被測定試料を含む溶液に紫外線を照射し、次いで、溶液に励起光を照射した時の蛍光強度から得られる紫外線照射後のメラニンモノマー残存率を前記被測定試料のメラニン化抑制作用の指標として用いることを特徴とする長波長紫外線誘導メラニン化抑制効果の評価方法である。

本発明においては、照射する紫外線が波長３２０〜４００ｎｍの長波長紫外線であることが好ましい。

本発明の長波長紫外線誘導メラニン化の抑制に働く薬剤のスクリーニング方法および長波長紫外線誘導メラニン化抑制効果の評価方法によれば、用いるメラニンモノマーの濃度は、従来の評価方法に比べておよそ百分の一から千分の一であり、また被測定試料の濃度は十分の一から百分の一で評価が可能となる。
よって、本発明の方法によれば、従来のスクリーニング方法および評価方法での問題点である、被測定試料の溶解性の問題を解決し、より多くの化合物を評価することができる。また、評価に要するメラニンモノマーのコストを低減化することができると共に、被測定試料による紫外線吸収を除いた評価が可能となる。

以下に、本発明の最良の実施の形態について説明する。
本発明の方法で、適用可能な、あるいは用いられうる紫外線は、蛍光ランプやソーラーシュミレーター、モノクロメーター等の２９０〜４００ｎｍの連続または単波長紫外線である。本発明の評価方法は、上記したようにＵＶＡによる即時型黒化の抑制効果の評価に用いられることを好適とするものであるから、好ましくは３２０〜４００ｎｍのＵＶＡ領域の紫外線である。

本発明で用いられるメラニンモノマーとしては、ＤＨＩＣＡ（５，６−ジヒドロキシインドールー２−カルボン酸）やその塩、ＤＨＩ（５，６−ジヒドロキシインドール）、６Ｈ５ＭＩＣＡ（６−ヒドロキシー５−メトキシインドールー２−カルボン酸）、５Ｈ６ＭＩＣＡ（５−ヒドロキシー６−メトキシインドールー２−カルボン酸）、６Ｈ５ＭＩ（６−ヒドロキシー５−メトキシインドール）、５Ｈ６ＭＩ（５−ヒドロキシー６−メトキシインドール）等が挙げられる。

このうち、蛍光強度の点から、ＤＨＩＣＡ（５，６−ジヒドロキシインドールー２−カルボン酸）やその塩、６Ｈ５ＭＩＣＡ（６−ヒドロキシー５−メトキシインドールー２−カルボン酸）、５Ｈ６ＭＩＣＡ（５−ヒドロキシー６−メトキシインドールー２−カルボン酸）が好ましく、特に６Ｈ５ＭＩＣＡ（６−ヒドロキシー５−メトキシインドールー２−カルボン酸）やその塩が望ましい。

本発明においては、メラニンモノマーに長波長紫外線を照射したときに長波長紫外線誘導メラニン化が生じるが、長波長紫外線照射前のメラニンモノマーは励起光を照射した時に蛍光を発するものの、長波長紫外線照射後に生じるメラニンについては励起光を照射しても蛍光を発しないことを利用して、メラニンモノマーと被測定試料を含む溶液に長波長紫外線を照射し、次いで、溶液に励起光を照射した時の蛍光強度からメラニンモノマー残存率を測定し、長波長紫外線誘導メラニン化の抑制に働く薬剤のスクリーニングを行うものである。なお本発明者による実験の結果、メラニンモノマーに励起光を照射した時のメラニンモノマーの濃度と蛍光強度（蛍光波長３９０ｎｍ）とは低濃度領域でほぼ比例関係にあることが分かっている。

更に本発明のスクリーニング方法について説明する。
まず、薬剤が入っていない場合の紫外線照射によるメラニンモノマーの重合率を次の方法によって測定する。

メラニンモノマー０．００００１〜０．００１質量％を水またはリン酸緩衝液などの緩衝液に溶解し、マイクロプレートウェルに１００〜２００μl分注する。このウェルにモノクロメーターを用いて特定波長の励起光を照射し、それによって発生する蛍光強度(Ｎ0)をマイクロプレートリーダーにより測定する。
次いでこのウェルに３２０〜４００ｎｍ波長を有する蛍光ランプを１０分から１時間照射し、メラニンモノマーの重合を行った後、前述した方法で再度励起光を照射し、重合後の蛍光強度(Ｎ1)をマイクロプレートリーダーにより測定する。ちなみに６Ｈ５ＭＩＣＡの場合は、３２０ｎｍの励起光で３９０ｎｍの蛍光強度を測定する。

これらの測定値を基に下記の計算式（１）により、薬剤が入っていない場合のメラニンモノマーの重合率（Ｎj）を求める。
Ｎj＝｛（Ｎ0−Ｎ1）／Ｎ0｝×１００ ‥（１）

次いで、スクリーニング対象となる薬剤を別のウエルに添加し、薬剤が入った場合のメラニンモノマーの重合率を測定する。より詳しくは、所定の濃度に調製した薬剤１〜１００μｌをメラニンモノマーが終濃度で０．００００１〜０．００１質量％となるように調製したマイクロプレートウェルに添加し、このウェルにモノクロメーターを用いて特定波長の励起光を照射し、それによって発生する蛍光強度(Ｙ0)をマイクロプレートリーダーにより測定する。
更に、３２０〜４００ｎｍ波長を有する蛍光ランプを用いて、薬剤が入っていなかったウェルに照射した時間と同じ時間照射して、メラニンモノマーの重合を行った後、再度励起光を照射し、それによって発生する蛍光強度(Ｙ1)をマイクロプレートリーダーにより測定する。

これらの測定値を基に下記計算式（２）により、メラニンモノマーの重合率（Ｙj）を求める。
Ｙj＝｛（Ｙ0−Ｙ1）／Ｙ0｝×１００ ‥（２）

前記式（１）から求めたメラニンモノマーの重合率（Ｎj）と式（２）から求めたメラニンモノマーの重合率（Ｙj）から、次式（３）によって薬剤のメラニンモノマーのメラニン化抑制率（％）を求め、この結果から薬剤のスクリーニングを行う。
メラニン化抑制率（％）＝｛（Ｎj−Ｙj）／Ｎj｝×１００ ‥（３）

なお、上記スクリーニング方法においてはＵＶＡを照射しない時の励起光照射後の蛍光強度(Ｎ0)と、ＵＶＡを照射した時の励起光照射後の蛍光強度(Ｎ1)を同一のマイクロプレートウェルを用いてＵＶＡの照射前後で測定したが、２つのマイクロプレートウェルを並置し、一方はアルミホイルなどで遮光し、他方は遮光せずにＵＶＡを照射した後、それぞれを励起光照射して測定することもできる。この方法は、蛍光強度(Ｙ0)および蛍光強度(Ｙ1)の測定においても同様である。

メラニンモノマーの重合に用いられる蛍光ランプは、一般的にＵＶＡ領域の波長である３２０ｎｍから４２０ｎｍの波長を有するものであれば良く、市販のＢＬＢランプ、ソーラーシミュレーター、モノクロメーターなどを用いることができる。

次に、本発明を、実施例を挙げて更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（１）６Ｈ５ＭＩＣＡを使った薬剤のスクリーニング
６Ｈ５ＭＩＣＡを溶解したリン酸緩衝液（０．０００２質量％）に、薬剤としてアスコルビン酸、薬剤Ａ、薬剤Ｂ、薬剤Ｃを５０μl添加し、各種薬剤のメラニン化抑制率(％)を下記条件で測定した。

メラニンモノマー重合用光源：ＢＬＢランプ（照射時間１０分、照射強度１０J/ｃｍ^２）
薬剤濃度：１０μＭ
既に明示した計算式（３）により得られた結果を表１に示す。この結果から、長波長紫外線誘導メラニン化抑制剤のスクリーニングを行うことができる。

（２）従来の測定方法との比較
本発明の蛍光強度による測定方法と吸光度を指標とする従来の測定方法を比較した。メラニンモノマーとしては、６Ｈ５ＭＩＣＡ、ＤＨＩＣＡ、５Ｈ６ＭＩＣＡを選択し、薬剤としてはアスコルビン酸を使って本発明の有用性を確認した。なお、メラニンモノマー重合用光源としてはＢＬＢランプを用いて、照射時間１０分、照射強度１０J/ｃｍ^２で測定した。その結果をそれぞれ表２〜表４に示す。
ａ．６Ｈ５ＭＩＣＡによる比較

ｂ．ＤＨＩＣＡによる比較

ｃ．５Ｈ６ＭＩＣＡによる比較

ａ〜ｃに示されるように、いずれのメラニンモノマーを用いてもスクリーニング対象薬剤が１００分の１以下で、使用されるメラニンモノマーも１０００分の１から２０００分の１の量で従来の吸光度による測定方法とほぼ同等の測定結果が得られた。

Claims (3)

1. メラニンモノマーと被測定試料を含む溶液に長波長紫外線を照射し、次いで、溶液に励起光を照射した時の蛍光強度から得られる紫外線照射後のメラニンモノマー残存率を用いて長波長紫外線誘導メラニン化の抑制に働く薬剤のスクリーニングを行うことを特徴とする長波長紫外線誘導メラニン化抑制剤のスクリーニング方法。
2. 照射する長波長紫外線が波長３２０〜４００ｎｍの長波長紫外線であることを特徴とする請求項１記載の長波長紫外線誘導メラニン化抑制剤のスクリーニング方法。
3. メラニンモノマーと被測定試料を含む溶液に紫外線を照射し、次いで、溶液に励起光を照射した時の蛍光強度から得られる紫外線照射後のメラニンモノマー残存率を前記被測定試料のメラニン化抑制作用の指標として用いることを特徴とする長波長紫外線誘導メラニン化抑制効果の評価方法。