JP5539306B2 - 酵素的プロセス - Google Patents

Description

開示するのは、新規な成分および、食品において、特に減ナトリウムまたは低ナトリウム含量の食品において塩味を増強して、それらの風味を改善するために前記成分を形成するための酵素的プロセスである。

大量のナトリウム摂取は、健康に有害であると考えられており、したがって、同時に所望の塩味を低減せずに食品において塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の量を減少させるという欲求がある。塩味は、特に良好な風味の食品について、知覚されたフレーバー強度およびプロフィールに対して極めて重要である。

ＮａＣｌを減少させることができるように、食品の塩味を増強する成分を提供する食品産業における必要性が存在する。

塩化カリウム（ＫＣｌ）は、他の塩、特にＮａＣｌを交換するのに用いられる。ＫＣｌを、ＮａＣｌを減少させるために所望される濃度において用いる場合には、所望されない苦く、金属様の風味が、消費者によって知覚される。さらに、特定の個人は、健康懸念のためにＫＣｌを回避することを望む。したがって、ＮａＣｌの塩味を増強することができ、したがってＫＣｌを部分的に、または完全に交換することができるようにする製品を見出すことに、興味が持たれる。

セロリ、および特にセロリの揮発性部分、特に特定の揮発性フタリドは、チキンブロスにおける塩味および旨味(umami)風味を増強することが記載されている(Y. Kurobayashi et al. (2007), J. Agric. Food. Chem. 56, 512-516.)。しかし、塩味の強度および持続時間は、多くの食品については尚不十分であり、改善され得た。さらに、揮発性部分の単離／濃縮は、実用的でない。

提供するのは以下である：
（１）塩味増強成分を形成する方法であって、以下の段階
（ｉ）Apium graveolens植物材料の水性スラリーを形成する段階、および
（ｉｉ）Apium graveolens植物材料の加水分解物を、１種または２種以上のタンパク質分解酵素を用いて酵素的加水分解をそれに施すことによって形成する段階
を含む、前記方法。
（２）生成した塩味増強成分を、加熱により不活性化させる、項目（１）の下に記載した方法。

（３）１種または２種以上のタンパク質分解酵素が、プロテイナーゼ、ペプチダーゼおよびグルタミナーゼからなる群から選択される、項目（１）〜（２）のいずれか１つの下に記載した方法。
（４）１種または２種以上のタンパク質分解酵素が、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ酵素を共に含む、項目（１）〜（３）のいずれか１つの下に記載した方法。
（５）１種または２種以上のタンパク質分解酵素が、Aspergillus oryzaeからの酵素調製物（Umamizyme（登録商標））を含み、加水分解を、４０℃〜６０℃にて行う、項目（１）〜（４）のいずれか１つの下に記載した方法。

（６）加水分解物を、１種または２種以上のカルボヒドラーゼ酵素を用いた酵素的加水分解をApium graveolens植物材料に、１種または２種以上のタンパク質分解酵素による酵素的加水分解と平行して、またはその後に施すことによって生成する、項目（１）〜（５）のいずれか１つの下に記載した方法。
（７）加水分解物に、ラクトバチルス属を用いた発酵を施す、項目（１）〜（６）のいずれか１つの下に記載した方法。
（８）ラクトバチルス属微生物が、L. plantarum、L. casei、L. brevisおよびL. helveticusからなる群から選択される、項目（７）の下に記載した方法。

（９）項目（１）〜（８）のいずれか１つの下に記載した方法により生成した、塩味増強成分。
（１０）水を除去することによって少なくとも１．５倍濃縮される、項目（９）の下に記載した塩味増強成分。
（１１）塩味増強成分が噴霧乾燥される、項目（９）〜（１０）のいずれか１つの下に記載した塩味増強成分。

（１２）食品のためのフレーバー組成物であって、項目（９）〜（１１）のいずれか１つの下に記載した塩味増強成分および１種または２種以上の食品等級添加物を含む、前記フレーバー組成物。
（１３）請求項９に記載の塩味増強要素の濃度が、濃縮されていない塩味増強成分を基準として０．０２％〜０．３％（ｗｔ／ｗｔ）である、項目（１２）の下に記載したフレーバー組成物。

（１４）項目（９）〜（１１）のいずれか１つの下に記載した塩味増強成分を含む、食品。
（１５）項目（９）〜（１１）のいずれか１つの下に記載した塩味増強成分の濃度が、濃縮されていない塩味増強成分を基準として０．００１％〜０．０１５％（ｗｔ／ｗｔ）である、項目（１４）の下に記載した食品。

（１６）減ナトリウムまたは低ナトリウム食品である、項目（１４）〜（１５）のいずれか１つの下に記載した食品。
（１７）塩化ナトリウム濃度が０．１５％（ｗｔ／ｗｔ）〜３％（ｗｔ／ｗｔ）である、項目（１６）の下に記載した食品。
（１８）塩化ナトリウム濃度が０．１５％（ｗｔ／ｗｔ）〜１．５％（ｗｔ／ｗｔ）である、項目（１６）の下に記載した食品。

（１９）さらにＫＣｌを、任意に０．１％〜２％（ｗｔ／ｗｔ）のＫＣｌの濃度で含む、項目（１６）〜（１８）のいずれか１つの下に記載した減ナトリウムまたは低ナトリウム食品。
（２０）塩味が増強された食品を提供する方法であって、項目（９）〜（１１）のいずれか１つの下で定義された塩味増強成分を食品に混合する、前記方法。
（２１）食品が、任意にＫＣｌを任意に０．１％〜２％（ｗｔ／ｗｔ）のＫＣｌの濃度で含む減ナトリウムまたは低ナトリウム食品である、項目（１６）の下に記載した方法。

詳細な説明
驚くべきことに、ここで、セロリを、プロテアーゼ、ペプチダーゼおよびグルタミナーゼの酵素群が含まれるがこれには限定されない１種または２種以上のタンパク質分解酵素で酵素的に処理した際に、食品において塩味の知覚に対する増強効果を有し、より高い強度、より遅延した発現およびより長い持続時間の塩味を示す成分を形成することができることが見出された。

塩味増強によって、塩味増強効果を有する成分を含む食物を、塩味増強成分を加えていない食物と比較した場合に、塩味に対して敏感な訓練されたパネリストによって分析して、その風味強度においてより顕著であり（より強度の、増強された）、かつ／またはその持続時間においてより長いと見出された食物における塩味に対する成分の効果を意味する。

塩味増強成分による塩味の知覚の増強された強度および持続時間を、さらにカルボヒドラーゼ酵素を平行して、または連続的にその生成において用いることにより増大させることができる。
塩味の知覚の増強された強度および持続時間を、ラクトバチルス属細菌、例えばLactobacillus plantarumを用いる任意の発酵段階によってさらに増大させることができる。

有用な植物材料（「セロリ」／Apium graveolens)
本明細書中で用いる「セロリ」によって、Apium graveolensを意味する。Apium graveolensは、セリ科の植物種であり、セロリおよび根用セロリを産出する。Apium graveolens dulceからの茎は、本明細書中に記載するプロセスおよび成分に有用であるが、すべてのApium graveolens植物からのすべての材料を用いることができる。植物材料は新鮮であり得るか、または乾燥したセロリ全体もしくはその不揮発性の画分を再水和することができる。通常、植物の堅いが砕けやすい葉柄（葉の茎）または肉厚の主根を用いるが、葉を同様に用いることができる。

有用なセロリの変種／栽培品種群には、Apium graveolens graveolens（野性型）、Apium graveolens secalinum（Alef.）Mansf（スープセロリ(leaf celery)）、Apium graveolens dulce (Mill.) Pers.（キンサイ(stalk celery)）およびApium graveolens rapaceum (Mill.) Gaudin（根用セロリ、胚軸を包含する丸みがある塊茎ならびに主根および茎の一部を有する）が含まれる。

豊富な種類の有用な栽培品種があり、例えば、限定されずに、根用セロリ栽培品種には、「Balder」および「Giant Prague」が含まれ；キンサイ栽培品種には、「Pascal」、「Utah」、「Golden Self-Blanching」および「Tendercrisp」、「Plein Blanc Pascal」、「Tall Utah」および「Elne」が含まれ；スープセロリ栽培品種には、「Juji」、「Duka」および「Safiya」が含まれる。

酵素
有用な酵素の群には、タンパク質中の結合を加水分解するタンパク質分解酵素、および任意にカルボヒドラーゼが含まれる。

タンパク質分解酵素調製物は通常、タンパク質を加水分解して小ペプチドを形成するプロテイナーゼ、および小タンパク質またはペプチドを加水分解して、通常アミノ酸をそれらの末端から遊離させるペプチダーゼを含有する。しばしば、エンドペプチターゼ活性およびエキソペプチダーゼ活性を共に有するプロテイナーゼおよびペプチダーゼが、そのような調製物中に含まれて、各々のタンパク質および得られたペプチド内から、およびその末端からタンパク質を効率的に分解する。

有用なタンパク質分解酵素には、以下の活性の１種または２種以上を有する酵素が含まれるが、これには限定されない：
プロテアーゼ、ペプチダーゼ、グルタミナーゼ（Ｌ−グルタミン−アミド−ヒドロラーゼ（ＥＣ ３．５．１．２）が含まれるが、これには限定されない）、エンドプロテアーゼ、セリンエンドペプチターゼ、サブチリシンペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．６２）。

他のタンパク質分解酵素が、同様に有用であり；豊富な種類が知られており、入手できる。いくつかの追加のタイプおよび例を、以下に示す。
タンパク質分解酵素（またプロテアーゼ、プロテイナーゼまたはペプチダーゼと呼ばれる）は現在、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼおよびグルタミン酸プロテアーゼを含む６つの群に分類されている。タンパク質分解酵素は、タンパク質の末端において切断する（エキソペプチダーゼ）かまたはタンパク質の内部のペプチド結合を攻撃する（エンドペプチターゼ）ことができる。エキソペプチダーゼには、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼＡが含まれるが、これには限定されない。エンドペプチダーゼには、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパインおよびエラスターゼが含まれるが、これには限定されない。

タンパク質分解酵素（ＥＣ ３．４およびＥＣ ３．５）は、ＥＣ番号（酵素委託番号）によって分類され、各々の群は、特定の反応タイプの種々の既知の酵素を含む。
ＥＣ ３．４は、ペプチド結合に対して作用する酵素（ペプチダーゼ／プロテイナーゼ）を含み、ＥＣ ３．５は、ペプチド結合以外の炭素−窒素結合に対して作用する酵素を含む。

ＥＣ ３．４についての例には、以下のものが含まれるが、これには限定されない：アミノペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．１１）、ジペプチダーゼ（３．４．１３）、ジペプチジル−ペプチダーゼ（３．４．１４）、ペプチジル−ジペプチダーゼ（３．４．１５）、セリン−カルボキシペプチダーゼ（３．４．１６）、メタロカルボキシペプチダーゼ（３．４．１７）、システイン−カルボキシペプチダーゼ（３．４．１８）、オメガペプチダーゼ（３．４．１９）、セリン−エンドペプチターゼ（３．４．２１）、システイン−エンドペプチターゼ（３．４．２２）、アスパラギン酸−エンドペプチターゼ（３．４．２３）、メタロエンドペプチダーゼ（３．４．２４）、トレオニン−エンドペプチターゼ（３．４．２５）。
ＥＣ ３．５についての例には、直鎖状アミド中を切断するタンパク質分解酵素（３．５．１）、例えば限定せずにグルタミナーゼ（ＥＣ ３．５．１．２）が含まれるが、これには限定されない。

種々のタンパク質分解酵素が、商業的に入手できる。以下のタンパク質分解酵素は、Sigma-Aldrichから入手できる：
アクロモペプチダーゼ(Achromopeptidase)、アミノペプチダーゼ、アンクロッド、アンジオテンシン変換酵素、ブロメライン、カルパイン、カルパインＩ、カルパインＩＩ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＧ、カルボキシペプチダーゼＰ、カルボキシペプチダーゼＷ、カルボキシペプチダーゼＹ、カスパーゼ、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１３、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＧ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、キモパパイン、キマーゼ、キモトリプシン、

ａ−クロストリパイン(Clostripain)、コラゲナーゼ、補体Ｃ１ｒ、補体Ｃ１ｓ、補体Ｄ因子、補体Ｉ因子、ククミシン(Cucumisin)、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ、エラスターゼ、白血球、エラスターゼ、膵臓、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐＮ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、フィシン、フリン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＨＩＶプロテアーゼ、ＩＧアーゼ、カリクレイン組織、ロイシンアミノペプチダーゼ、（一般的）、ロイシンアミノペプチダーゼ、サイトゾル、ロイシンアミノペプチダーゼ、ミクロソーム、マトリックスメタロプロテアーゼ、メチオニンアミノペプチダーゼ、ニュートラーゼ、パパイン、ペプシン、プラスミン、プロリダーゼ、プロナーゼＥ、前立腺特異抗原、プロテアーゼ、Streptomyces griseusからの好アルカリ性、

アスペルギルス属からのプロテアーゼ、Aspergillus saitoiからのプロテアーゼ、Aspergillus sojaeからのプロテアーゼ、プロテアーゼ（B. licheniformis）（アルカリ性）、プロテアーゼ（B. licheniformis）（アルカラーゼ(Alcalase)）、Bacillus polymyxaからのプロテアーゼ、バチルス属種からのプロテアーゼ、バチルス属種からのプロテアーゼ（エスペラーゼ(Esperase)）、リゾプス属種からのプロテアーゼ、プロテアーゼＳ、プロテアソーム、Aspergillus oryzaeからのプロテイナーゼ、プロテイナーゼ３、プロテイナーゼＡ、プロテイナーゼＫ、プロテインＣ、ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ、レニン、レンニン、ストレプトキナーゼ、サブチリシン、サーモリシン、トロンビン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、トリプシン、トリプターゼ、ウロキナーゼ。

本明細書中に記載するタンパク質分解酵素の１種または２種以上を、カルボヒドラーゼと組み合わせてもよい。
有用な酵素の組み合わせには、少なくとも１種のタンパク質分解酵素を少なくとも１種のカルボヒドラーゼと組み合わせた組み合わせが含まれるが、これには限定されない。

炭水化物の植物材料を分解するのに有用なカルボヒドラーゼ酵素には、以下の活性の１種または２種以上を有するカルボヒドラーゼが含まれるが、これには限定されない：
β−グルカナーゼ（１，３−ベータ−グルカン−グルコ−ヒドロラーゼ（ＥＣ ３．２．１．５８）が含まれるが、これには限定されない）、β−アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ。

例えば、以下の組み合わせが有用である：

有用な組み合わせは、１，３−ベータ−グルカン−グルコ−ヒドロラーゼ（ＥＣ ３．２．１．５８）と、セリンエンドペプチターゼ、ペプチダーゼ／プロテアーゼまたはサブチリシンペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．６２）から選択されるプロテアーゼとの組み合わせである。
１，３−ベータ−グルカン−グルコ−ヒドロラーゼとして、例えば、限定されずに、Ceremix（登録商標）(Novozymes, Bagsvaerd, Denmark)またはViscozyme（登録商標）(Novozymes, Bagsvaerd, Denmark)の１種または２種以上を用いてもよい。
プロテアーゼ／ペプチダーゼ／グルタミナーゼとして、例えば、限定されずに、Alcalase（登録商標）、セリンエンドペプチターゼ(Novozymes, Bagsvaerd, Denmark)、Umamizyme（登録商標）、プロテアーゼ／ペプチダーゼ（Amano, 名古屋、日本国）またはFlavorpro 373（登録商標）（サブチリシンペプチダーゼ(Biocatalysts, Cardiff, UK)の１種または２種以上を用いてもよい。
用いるすべての酵素は、食品等級でなければならない。

酵素的加水分解
酵素的加水分解を、用いるすべての酵素に適する条件下で行う。当業者に明らかなように、温度およびｐＨを、好適な範囲内として、加水分解が所望される程度に発生するようにしなければならない。インキュベーションの長さは、適宜変動し、条件が最適条件により近い場合には、インキュベーションはより短時間である。通常、１〜４８時間、例えば１０〜２４時間が十分である。所要のイオンは、選択された酵素（１種または２種以上）のために必要であるかまたは有益である場合には、当業者が認識しているように存在しなければならない。インキュベーション混合物を例えば５０〜５００ｒｐｍまたは１００〜２００ｒｐｍにて撹拌することにより、通常加水分解が改善される。数種の酵素は、他のものよりも良好に撹拌に耐える。１つの要因に対する耐性は、しばしば他の要因に依存する。好適な条件に関するそのような情報は、多くの酵素に容易に利用可能であり、そうでない場合には容易に決定することができる。

Ceramix（登録商標）、Alcalase（登録商標）、Viscozyme（登録商標）およびUmamizyme（登録商標）を含む多数の酵素調製物は、４０℃〜５５℃、例えば約４５℃〜約５５℃の温度にて、ｐＨ調整を伴わずに、またはいかなる補助因子をも加えずに、水中のセロリの液化されたスラリー中で良好に作用する。他のものは、必要であり得るか、あるいはｐＨもしくは温度調整、または添加物から利益を享受する。Umamizyme（登録商標）は、約４０℃〜約６０℃の温度に耐え、約５５℃にて最適である。Umamizyme（登録商標）は、Aspergillus oryzaeから由来しており、エンドペプチターゼおよびエキソペプチダーゼ活性が豊富である。

所望の程度の塩味を達成するまでの相当な加水分解を達成するのに十分な単位の酵素を、用いなければならない。

酵素の量を、十分な活性を確実にし、苦いノートが発生するのを回避するように選択する。用いる量は、酵素の活性に依存し、この情報は、通常は知られており、他にはそれを、容易に試験することができる。酵素の量もまた、タンパク質の量に依存し、０．５：２０〜３：２０の酵素：タンパク質（２０部のタンパク質について０．５〜３部の酵素）、例えば１：２０の酵素：タンパク質の比率がなければならない（Ceremix（登録商標）、Novozymes, Bagsvaerd, Denmarkは、酵素１グラムあたり３００β−グルカナーゼ単位（ＢＧＵ）の活性を有し；Viscozyme（登録商標）、Novozymes, Bagsvaerd, Denmarkは、酵素１グラムあたり１００真菌β−グルカナーゼ単位ＦＢＧの活性を有し；Alcalase（登録商標）、Novozymes, Bagsvaerd, Denmarkは、酵素１グラムあたり２．４アンソン単位（ＡＵ）の活性を有し；Umamizyme（登録商標）、Amano, 名古屋、日本国は、７０Ｕ（ＬＧＧ法による単位、ＬＧＧ＝Ｌ−ロイシル−グリシル−グリシン）の活性を有し；Flavorpro 373（登録商標）、グルタミナーゼ、Biocatalysts, Cardiff, UKは、３０グルタミナーゼ単位（ＧＵ）の活性を有する）。

出発物質１グラムあたりの酵素単位の有用な量を、以下の数種の酵素について示す。
出発物質（液化されたセロリスラリー）１グラムあたりのβ−グルカナーゼ単位（ＢＧＵ）で０．０３〜１５ＢＧＵ、例えば０．１〜３ＢＧＵ。
出発物質１グラムあたりの真菌β−グルカナーゼ単位ＦＢＧで０．００２〜３ＦＢＧ、例えば０．０１〜１ＦＢＧ。
出発物質１グラムあたりのアンソン単位（ＡＵ）で０．０００２〜０．０２ＡＵ、例えば０．０００５〜０．０１。
出発物質１グラムあたりのＵ（ＬＧＧ法による単位、ＬＧＧ＝Ｌ−ロイシル−グリシル−グリシン）で０．００７〜０．７Ｕ、例えば０．０１〜０．１Ｕを用いる。
出発物質１グラムあたりのグルタミナーゼ単位（ＧＵ）で０．０００７５〜０．０７５ＧＵ、例えば０．００１〜０．０２ＧＵを用いる。

酵素の量は、酵素およびそれを用いる条件に依存して変化する。所要の量を、本明細書中に記載したように、種々の量を試行し、得られた生成物の効果を感覚的評価において試験することにより、容易に決定することができる。

１種または２種以上のタンパク質分解酵素および任意に１種または２種以上のカルボヒドラーゼ酵素によって加水分解されるセロリスラリーの加水分解物を、塩味増強成分として直接用いてもよい。
通常、それを、以下に詳述するように、酵素および任意に微生物を不活性化するのに十分高温かつ長時間の最終的な熱処理（殺菌または低温殺菌）によって使用前に熱失活させる。
あるいはまた、加水分解物を発酵させる。

発酵
発酵を、ラクトバチルス属の細菌、例えばLactobacillus plantarumを用いて行う。他のラクトバチルス属種もまた有用であり得、例えばL. casei、L. brevisおよびL. helveticusもまた、有用であり得る。
ラクトバチルス属の一晩培養物を用いてもよく、または加水分解物を、ラクトバチルス属クローンから直接接種してもよく、発酵を、適宜わずかにより長い時間にわたり行う。

以下の発酵のための種培養物／一晩培養物を、当該分野において十分知られている方法によって調製してもよい。それを、一晩、例えば１２時間、微生物のために適切な温度にて生育させてもよい。３７℃は、L. plantarumに適する温度である。すべての好適な媒体、例えばＭＲＳブロス(Difco, 米国)を、選択することができる。

接種した材料を、数時間、例えば５時間〜４８時間、１０時間〜３０時間または１５時間〜２５時間にわたり発酵させる。
ラクトバチルス属での発酵を、発酵ブロスとして加水分解物を用い、十分な容積の一晩種培養物を少なくとも６またはそれより高いｐＨ、例えば６〜７のｐＨにて加えて、開始する。発酵を、ｐＨが少なくともｐＨ５．５またはそれより低く、例えばｐＨ５．５〜ｐＨ４．５に低下するまで進行させる。

発酵温度を、微生物が順応するように選択する。有用な温度は、ラクトバチルス属について変動し、特にL. plantarumには、例えば約２０℃〜約４０℃、約３０℃〜約４０℃または約３５〜約４０℃が含まれ、約３６℃〜約３８℃が最適である。低温においては、生育速度が低く、高温においては、微生物が死滅するかまたは数が減少する。

発酵容器を、最小限に撹拌して、適切な混合を確実にするが、同時に細菌が嫌気的に生育することができるのを確実にしなければならない（ラクトバチルス属は通性嫌気性であるが、通常は嫌気性条件下でより速く生育し、耐気性(aerotolerance)はマンガン依存性であり得る）。
発酵生成物を塩味増強成分として直接用いることができるが、通常は続いて酵素および微生物を失活させるのに十分高温かつ長時間の最終的な熱処理（殺菌または低温殺菌）を行う。

通常、加水分解生成物または発酵生成物を、例えば約６０℃〜約１２１℃またはそれより高温に、酵素および細菌を失活させるのに十分長時間にわたり加熱することにより、使用前に熱失活させる（例えば限定されずに、すべての低温殺菌または殺菌方法、それは当該分野において十分知られており、例えば約７０℃〜約９０℃またはそれより高温にて３０分。約１００℃より高温、例えば約１２１℃にて３０分間加熱した場合には、加熱を、加圧下で、通常約１２〜１５ｐｓｉにて行わなければならない）。

発酵の間のｐＨを、約ｐＨ６〜約ｐＨ７としなければならない。ｐＨが６より低い場合には、Lactobacillus plantarumは、極めてゆっくりと生育し、通常十分には生育しない。発酵の間、ｐＨは、約ｐＨ４またはそれより低く、例えば約ｐＨ５．５〜約ｐＨ３．５に低下する。
その後、低温殺菌した発酵ブロスを濾過して、すべてのより大きい粒子を除去してもよく、例えば約１００℃までにて沸騰させることを含む例えば蒸発によって、濃縮してもよい。

使用の形態
塩味増強成分を、それ自体で、または濾過し、かつ／または濃縮した形態で用いてもよい。あるいはまた、濃縮した塩味増強成分を、ペーストもしくは粉末として用いるか、または当該分野において十分知られている方法によって噴霧乾燥してもよい。噴霧乾燥した塩味増強成分について、十分知られている担体およびアンチケーキング剤を、加えてもよい。

任意の濾過を、すべての好適な濾過方法により行ってもよく、そのような方法は、当該分野において十分知られており、例えば、それは、濾過遠心分離機においてフェルトフィルター袋を通過させることによるものである。濾過した培養物（残りのより小さい固体を含む上清から、より大きい未消化のタンパク質を含むバイオマスを除去した）を、濃縮する、例えば１００℃にて蒸発／沸騰させることによって２回濃縮することができる。得られた濃縮物の固形成分含有量を、水分分析装置(moisture analyzer)を用いて決定することができ、例えば好適な担体上で噴霧乾燥することができる。多くの担体は、当該分野において十分知られており、例えば限定されずに、ジャガイモマルトデキストリン担体である（例えば２倍濃縮の固体対担体の約１：１の比率が、好適であり得る）。任意に、アンチケーキング剤を加えてもよく、そのような剤は十分知られている。好適なアンチケーキング剤は、例えばリン酸三カルシウム（ＴＰＣ）であり；２倍濃縮物の合計重量を基準として約０．５％（ｗｔ／ｗｔ）が、好適な量である。

塩味増強成分の最終的な形態を、当該分野において十分知られている方法に従って選択してもよく、特定の食物用途に依存する。液体食、例えばスープについて、塩味増強成分を、さらに加工せずにその液体形態において用いることができる。乾燥用途、例えばクラッカーについて、噴霧乾燥した濃縮塩味増強成分を用いることができる。
塩味増強成分を、食品に直接加えてもよいか、または食品に風味を付与するためのフレーバー組成物の一部として提供してもよい。

フレーバー組成物は、塩味増強成分および任意に１種または２種以上の食品等級添加物を含む。フレーバー組成物のための好適な添加物は、当該分野において十分知られており、例えば、限定せずに溶媒（水、アルコール、エタノール、油、脂肪、植物油およびミグリオール(miglyol)が含まれる）、結合剤、希釈剤、崩壊剤、滑剤、香味剤、着色剤、防腐剤、酸化防止剤、乳化剤、安定剤、調味料、甘味料、アンチケーキング剤などが含まれる。

そのような担体またはフレーバーのための希釈剤の例は、例えば“Perfume and Flavor Materials of Natural Origin”, S. Arctander編、Elizabeth, N.J., 1960中；“Perfume and Flavor Chemicals”, S. Arctander編、Vol. I & II, Allured Publishing Corporation, Carol Stream, USA, 1994中；“Flavourings”, E. Ziegler and H. Ziegler (編), Wiley-VCH Weinheim, 1998、および“CTFA Cosmetic Ingredient Handbook”, J.M. Nikitakis (編)、第１版、The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1988中に見出され得る。

フレーバー組成物は、フレーバー化合物、植物源を含む天然源からのフレーバーを含み、発酵によって作製される成分を含む追加のフレーバー成分を含み得る。
フレーバー組成物は、すべての好適な形態を有し得、例えば液体もしくは固体、湿潤もしくは乾燥、または担体／粒子に結合したかもしくはその上にコーティングされたカプセル封入された形態、または粉末としての形態である。

塩味増強成分を濃縮されていない液体として加える場合には、約０．００５〜約０．５％（ｗｔ／ｗｔ）が、通常ナトリウムが減少したかまたは低い用途において、例えば限定せずにスープおよび局所的な食物用途、例えばチップ、クリスプおよび軽食において十分である。食品に依存して、より多量が必要であり得る。大部分の局所的用途について、約０．１％〜約０．５％（ｗｔ／ｗｔ）が十分である。濃縮物（例えば蒸留による）または噴霧乾燥した塩味増強成分を用いる場合には、示した濃度を、塩味増強成分中の濃度変化を考慮するのに適切な要因に伴って調節する必要がある。

食品
食品の用語を、口腔中に配置されるが必ずしも摂取されるわけではないすべての製品を含むように、広い意味において用い、それには、食物、飲料、栄養補助食品および口内洗浄液を含むデンタルケア用品が含まれるが、これには限定されない。

食品には、穀物製品、米製品、パスタ製品、ラビオリ、タピオカ製品、サゴ製品、パン屋の製品、ビスケット製品、ペストリー製品、パン製品、菓子類製品、デザート製品、ガム、チューインガム、チョコレート、アイス、蜂蜜製品、糖蜜製品、酵母製品、食塩および香辛料製品、良好な風味の製品、マスタード製品、酢製品、ソース（調味料）、加工食品、調理された果物および野菜製品、肉および肉製品、肉類似物／代替品、ゼリー、ジャム、果物ソース、卵製品、乳製品および酪農製品、チーズ製品、バターおよびバター代替製品、ミルク代替製品、大豆製品、食用油脂製品、医薬、飲料、ジュース、果物ジュース、野菜ジュース、食物エキス、植物エキス、肉エキス、調味料、栄養補給食品、ゼラチン、錠剤、トローチ剤、ドロップ、エマルジョン、エリキシル、シロップおよびこれらの組み合わせが含まれる。

特に興味深いのは、限定せずに、伝統的に減少したナトリウム塩濃度を有する、ナトリウム塩が多量である食品であり、これには、調味料およびソース（低温、暖かい、即席、保存された、サテー、トマト、ＢＢＱソース、ケチャップ、マヨネーズおよび類似物、ベシャメル）、グレイビー、チャツネ、サラダドレッシング（棚で安定な(shelf stable)、冷蔵）、生地混合物、酢、ピザ、パスタ、即席麺、フレンチフライ、クルトン、塩味のある軽食（ポテトチップス、クリスプ、ナッツ、トルティーヤ−トスターダ(tortilla-tostada)、プレッツェル、チーズ軽食、コーン軽食、ジャガイモ軽食、インスタントのポップコーン、電子レンジで調理可能なポップコーン、キャラメルコーン、ポークの皮、ナッツ）、クラッカー（塩振りクラッカー(Saltine)、「リッツ」タイプ）、「サンドイッチタイプ」のクラッカー軽食、朝食の穀物、チーズ類似物（ナトリウムが減少したチーズ、低温殺菌されたプロセスチーズ（食物、軽食およびスプレッド）、良好な風味のスプレッド、低温缶詰チーズ製品、チーズソース製品）を含むチーズおよびチーズ製品、肉、アスピック、塩漬け肉（ハム、ベーコン）、昼食／朝食肉（ホットドッグ、コールドカット、ソーセージ）、大豆ベースの製品、トマト製品、ジャガイモ製品、乾燥香辛料または調味料組成物、ペスト、マリネを含む液体の香辛料または調味料組成物、ならびにスープタイプ／食事代替飲料、ならびにトマトジュース、ニンジンジュース、混合野菜ジュースおよび他の野菜ジュースを含む野菜ジュースが含まれる。

加工食品には、マーガリン、ピーナッツバター、スープ（透明な、缶詰の、クリームの、インスタントの、ＵＨＴ）、グレイビー、缶詰ジュース、缶詰野菜ジュース、缶詰トマトジュース、缶詰果物ジュース、缶詰ジュース飲物、缶詰野菜、パスタソース、冷凍アントレ（entree）、冷凍ディナー、冷凍ハンドヘルドアントレ、乾燥包装された(dry packaged)ディナー（マカロニおよびチーズ、乾燥ディナー−肉添加、乾燥サラダ／付け合わせミックス、乾燥ディナー−肉添え）が含まれる。スープは、濃密な湿潤した(condensed wet)、インスタントの、ラーメン、乾燥およびブロス、加工された、および予め調理済みの低ナトリウム食品を含む種々の形態であり得る。

食品に依存して、類似の食品より約１０〜１００％、例えば２５〜５０％少ないナトリウムを含む食品（例えば２５％減少の「減ナトリウム」製品または５０％の減少を有する「ナトリウムが軽度の」製品）について、塩味増強成分を、以下のように用いてもよい：ほとんどの食物用途についての有用な濃度は、例えば、濃縮していない塩味増強成分を基準として約０．００１％〜約０．０１５％（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。あるいはまた、例えば、噴霧乾燥した２倍濃縮物を基準として２５〜３００ｐｐｍまたは０．００２％〜０．０３％（ｗｔ／ｗｔ）を、用いてもよい。

塩味増強剤を、濃縮されていないかもしくは濃縮した形態で用いてもよいか、または濃縮物を、当該分野において知られている方法によってペーストもしくは粉末に配合してもよい。この場合において、用いるべき量を、適宜調整しなければならない。フレーバー組成物、例えば香辛料を、しばしば例えば１０倍の濃度にさらに濃縮し、当該濃度を、適宜より高く調整する（２５０ｐｐｍ〜３０００ｐｐｍ）。

均一なＮａＣｌ濃度を有する一般的な食品中のＮａＣｌ濃度は、ほとんどの製品について約０．５％〜約５％（ｗｔ／ｗｔ）のＮａＣｌの範囲内で変動する。調味料または調味料として用いる製品、例えば少量（例えばサラダもしくは麺に適用するために）で用いるクルトン、ソースもしくはサラダドレッシングは、例えば約２％〜約５％（ｗｔ／ｗｔ）のＮａＣｌの濃度を有する。スープは、通常約０．６％〜約１．２５％（ｗｔ／ｗｔ）のＮａＣｌを含む。塩味を有するクラッカーおよび肉製品（サラミ、ハム、ベーコン）は、通常約２％〜約４％（ｗｔ／ｗｔ）のＮａＣｌを含む。穀物は、通常約０．６〜３％（ｗｔ／ｗｔ）のＮａＣｌを含む。再構成する必要がある製品（乾燥スープ）は、通常再構成の後に示す濃度範囲内で変動する。

減少したナトリウム含量（一人前あたり３５３ｍｇ）を有する製品より尚少量のＮａＣｌを含む低ナトリウム製品について、塩味増強成分の量を増大させなければならない場合がある。

食品に依存したＫＣｌおよび前記成分が加えられた食品について、ＫＣｌの濃度を、ナトリウム濃度がどのくらい減少するかに依存して、約０．１％または０．２％から約１％まで、約１．５％まで、約２％（ｗｔ／ｗｔ）までまたはこれ以上としてもよい。約０．２５％〜約１．５％（ｗｔ／ｗｔ）のＫＣｌ濃度、例えば約０．５％〜約１．５％（ｗｔ／ｗｔ）のＫＣｌは、ほとんどの低ナトリウム製品に有用である。ＮａＣｌ濃度をほとんどの用途について有用に減少させてもよい範囲は、例えば約０．２５％（ｗｔ／ｗｔ）〜約２．５％（ｗｔ／ｗｔ）または約０．１２５％〜約１．２５％（ｗｔ／ｗｔ）である。成分として食品に加えるべき塩味増強成分の量は、用いるＫＣｌの濃度ならびに、特定のベースおよびフレーバーを含む特定の食品に依存する。ほとんどの食物用途に有用な濃度は、例えば濃縮していない塩味増強成分を基準として約０．００１％〜約０．０１５％（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。あるいはまた、例えば、噴霧乾燥した２倍濃縮物を基準として２５〜３００ｐｐｍまたは０．００２％〜０．０３％（ｗｔ／ｗｔ）を、用いてもよい。

塩味増強成分を、濃縮していない形態で用いてもよく、または濃縮物を、当該分野において知られている方法によってペーストもしくは粉末もしくは噴霧乾燥した塩味増強成分に配合してもよい。この場合において、用いるべき量を、適宜調整しなければならない。
塩味増強成分の適切な濃度を、感覚刺激性滴定によって容易に試験することができる。この手法は、感覚的分析の分野において十分知られている。

例
他に示さない限り、百分率または比率をｗｔ／ｗｔとして示す。

例１
セロリの酵素的加水分解および発酵
種々の異なる試料を調製し、以下の表中に示す。
新鮮なセロリの茎を、フードプロセッサーで微細に刻んだ。水を、刻んだセロリに１：２の比率で加え、スラリーを、フードプロセッサー中で液化した。

液化したセロリスラリーの一部を、蒸留によって揮発性物質および不揮発性物質／ポット残留物画分に分割した。
平行して、新鮮なセロリの液化したスラリーの代わりに、乾燥セロリの液化したスラリーを、水中で１５％の濃度において用い、同様の結果を達成した。

新鮮な、もしくは乾燥したセロリの液化したスラリー、またはそれらの揮発性の、もしくは不揮発性の画分を、５０℃に加熱し、各々タンパク質分解酵素とカルボヒドラーゼ酵素との組み合わせである以下の試料を、調製した：
ａ）Alcalase（登録商標）（０．１％） Ａ
ｂ）Umamizyme（登録商標）（０．１％） Ｕ
ｃ）Flavorpro 373（登録商標）（０．１％） Ｇ
ｄ）Alcalase（登録商標）（０．１％）およびCeramix（登録商標）（０．１％） Ａ＆Ｃ
ｅ）Umamizyme（登録商標）（０．１％）およびViscozyme（登録商標）（０．１％） Ｕ＆Ｖ
ｆ）ＡおよびＣおよびグルタミナーゼ（Flavorpro 373（登録商標）） Ａ＆Ｃ＆Ｇ
ｇ）ＵおよびＶおよびグルタミナーゼ（Flavorpro 373（登録商標）） Ｕ＆Ｖ＆Ｇ

Ceremix（登録商標）(Novozymes, Bagsvaerd, Denmark)は、酵素１グラムあたり３００β−グルカナーゼ単位（ＢＧＵ）の活性を有する；出発物質（液化したセロリスラリー）１グラムあたり０．３ＢＧＵを用いる。
Viscozyme（登録商標）(Novozymes, Bagsvaerd, Denmark)は、酵素１グラムあたり１００真菌β−グルカナーゼ単位ＦＢＧの活性を有する；出発物質１グラムあたり０．１ＦＢＧを用いる。
Alcalase（登録商標）(Novozymes, Bagsvaerd, Denmark)は、酵素１グラムあたり２．４アンソン単位（ＡＵ）の活性を有し、出発物質１グラムあたり０．００２４ＡＵを用いる。
Umamizyme（登録商標）（Amano, 名古屋、日本国）は、７０Ｕ（ＬＧＧ法による単位、ＬＧＧ＝Ｌ−ロイシル−グリシル−グリシン）の活性を有する；出発物質１グラムあたり０．０７Ｕを用いる。

グルタミナーゼであるFlavorpro 373（登録商標）(Biocatalysts, Cardiff, UK)を、タンパク質分解酵素として用いてもよい。Flavorpro 373（登録商標）は、３０グルタミナーゼ単位（ＧＵ）の活性を有する；出発物質１グラムあたり０．００７５ＧＵを用いる。
Alcalase（登録商標）、Umamizyme（登録商標）およびグルタミナーゼ（Flavorpro 373（登録商標））は、タンパク質分解／ペプチド分解酵素であり、一方Ceremix（登録商標）およびViscozyme（登録商標）は、カルボヒドラーゼ酵素である。
酵素的加水分解を、５０℃にて１８〜２２時間、１５０ｒｐｍにて撹拌しながら進行させて、加水分解物を生成した。

次に、加水分解物を、３７℃に冷却し、これに、Lactobacillus plantarumの菌株の一晩培養物（約１０^６個の細胞／ｇの細胞密度）を、加水分解した物質／発酵ブロスあたり０．３％の一晩培養物の濃度において接種した。
接種した材料を、約２４時間（またはｐＨが約ｐＨ４に低下した単位）にわたり３７℃にて、最小限に撹拌しながら発酵させた。発酵に続いて、１２１℃の３０分にわたる最終的な熱処理を行った。

例２
感覚的評価
例１の試料（Ｓ４〜Ｓ１７）を、訓練されたフレーバリストによって、０．０２％の試料または対照の濃度にて、脂肪を含まない減ナトリウムチキンブロス（ナトリウム４８０ｍｇ／一人前）において感覚刺激的に評価した。チキンブロスを、味見のために温かくして（約３７℃）供出した。
試料を、例１の３つの対照（Ｃ１〜Ｃ３）に対して提示し、その各々を、蒸留と同様の条件（１００℃および４〜５時間にわたる１５０ｒｐｍでの撹拌）下で調理した。

結果を、以下の表に示す。

新鮮なセロリの不揮発性画分の代わりに、試料を、酵素的に加水分解したか、または酵素的に加水分解し、発酵させた全体の新鮮なセロリまたは乾燥セロリを用いて作製した場合には、結果は、試料Ｓ４〜Ｓ１７と極めて類似していた。

プロセス、成分および食品を、特定の例示的態様と関連させて上記で記載した一方、他の同様の態様を用いてもよいか、または修正および追加を、記載した態様に対して行って、同一の機能（１または２以上）を発揮させてもよいことを理解するべきである。さらに、種々の態様を組み合わせて、所望の特徴を提供してもよいように、すべての開示した態様が、必ずしも代替的であるわけではない。変化を、本開示の精神および範囲から逸脱せずに通常の当業者によって行うことができる。したがって、プロセス、成分および食品は、いかなる単一の態様にも限定されるべきではなく、むしろ幅および範囲においては、添付した特許請求の範囲の記述に従って解釈されるべきである。

Claims (14)

1. 塩味増強成分を形成する方法であって、以下の段階
   （ｉ）Apium graveolens植物材料の水性スラリーを形成する段階、
   （ｉｉ）Apium graveolens植物材料の加水分解物を、１種または２種以上の酵素を用いて酵素的加水分解をそれに施すことによって形成する段階、および
   （ｉｉｉ）Apium graveolens植物材料の加水分解物に、ラクトバチルス属微生物を用いた発酵を施す段階
   を含み、
   １種または２種以上の酵素が、カルボヒドラーゼおよび Aspergillus oryzaeからのタンパク質分解酵素を含む、
   前記方法。
2. 生成した塩味増強成分中の１種または２種以上の酵素およびラクトバチルス属微生物を、加熱により不活性化させる、請求項１に記載の方法。
3. １種または２種以上の酵素が、グルタミナーゼをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
4. １種または２種以上の酵素が、エンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼ活性を共に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 加水分解を、４０℃〜６０℃にて行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 加水分解物を、１種または２種以上のカルボヒドラーゼ酵素を用いた酵素的加水分解をApium graveolens植物材料に、１種または２種以上の酵素による酵素的加水分解と平行して、またはその後に施すことによって生成する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 請求項６に記載の方法により得られる、塩味増強成分。
8. 請求項７に記載の塩味増強成分および１種または２種以上の食品等級添加物を含む食品のためのフレーバー組成物であって、塩味増強成分の濃度が、濃縮されていない塩味増強成分を基準として０．０２％〜０．３％（ｗｔ／ｗｔ）である、前記フレーバー組成物。
9. 請求項７に記載の塩味増強成分を含む食品であって、塩味増強成分の濃度が、濃縮されていない塩味増強成分を基準として０．００１％〜０．０１５％（ｗｔ／ｗｔ）である、前記食品。
10. 減ナトリウムまたは低ナトリウム食品である、請求項９に記載の食品。
11. 塩化ナトリウム濃度が０．１５％（ｗｔ／ｗｔ）〜３％（ｗｔ／ｗｔ）である、請求項１０に記載の食品。
12. さらにＫＣｌを含む、請求項１０または１１に記載の減ナトリウムまたは低ナトリウム食品。
13. 塩味が増強された食品を提供する方法であって、請求項７に記載の塩味増強成分を食品に混合する、前記方法。
14. 食品が、減ナトリウムまたは低ナトリウム食品である、請求項１３に記載の方法。