CN114051533A - 由谷胱甘肽生成半胱氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于，提供也适合用于食品领域的、用于由谷胱甘肽生成半胱氨酸的实用方法。通过使源自微生物的γ‑谷氨酰肽水解酶作用于还原型谷胱甘肽而生成半胱氨酰甘氨酸的第1步骤以及使源自微生物的酸性蛋白酶作用于上述半胱氨酰甘氨酸而生成半胱氨酸的第2步骤，从而由谷胱甘肽生成半胱氨酸。

Description

由谷胱甘肽生成半胱氨酸的方法
技术领域
本发明涉及由谷胱甘肽生成半胱氨酸的方法及其用途。本申请基于2019年7月2日提出申请的日本专利申请第2019-124052号要求优先权，通过参考而援引该专利申请的全部内容。
背景技术
食品中的氨基酸、肽不仅作为营养素，而且对于食品的味道、风味也是重要的要素。例如，谷氨酸、天冬氨酸呈现出鲜味、酸味，甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸等呈现出甜味，色氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等呈现出苦味。另外，氨基酸中存在与其它成分(糖类、脂质等)反应而产生独特风味的氨基酸。其具体例为半胱氨酸，半胱氨酸的美拉德反应物赋予肉的风味。例如，如果对含有半胱氨酸的食品、食材进行加热处理，则能够实现鲜味的增强。另外，如果在食品等中添加半胱氨酸并进行同样的处理，则可期待鲜味的赋予或增强。但是，半胱氨酸主要由源自动物的原料(毛发、羽毛)提取，不宜将半胱氨酸作为添加物用于食品等。
另外，部分食品等中包含较多的作为半胱氨酸化合物谷胱甘肽。因此，如果能够由谷胱甘肽生成半胱氨酸，则能够解决添加半胱氨酸时的上述问题。
在生物体内，谷胱甘肽在酶作用下逐步被分解(例如，参照非专利文献1、2)。具体而言，首先，γ-谷氨酰转肽酶切断谷胱甘肽的γ-谷氨酰键，生成谷氨酸(Glu)和二肽半胱氨酰甘氨酸(CysGly)。接着，CysGly被二肽酶分解，形成半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)。如果也能够将上述生物体中的两阶段分解用于食品等，则能够由食品等中原本包含的成分(谷胱甘肽)生成半胱氨酸而实现风味的赋予或增强。在此，作为与第一阶段的反应相关的技术，提出了使用源自微生物的谷氨酰胺酶由谷胱甘肽生成CysGly，增强食品等的风味(专利文献1)。另一方面，关于第二阶段的反应，报告了利用源自动物(例如源自大鼠、兔子、猪、马)的酶分解CysGly(非专利文献1、2)。但是，源自动物的酶难以用于食品等。尚不存在通过适合用于食品领域的酶成功分解CysGly的示例。
现有技术文献
特許文献
专利文献1：日本专利第4453057号公报
非特許文献
非专利文献1：J.Biol.Chem.1950,186:731-735.
非专利文献2：J.Biol.Chem.1937,120:209-217.
发明内容
发明所要解决的技术问题
由食品等中原本存在的谷胱甘肽生成半胱氨酸的技术，有望成为赋予或增强食品等的风味的方法，但是未能实现。鉴于该状况，本发明的课题在于，提供也适合用于食品领域(食品用途)的、用于由谷胱甘肽生成半胱氨酸的实用方法。
用于解决问题的技术方案
鉴于上述课题，本发明人等设想用于食品领域且通过源自微生物的酶由谷胱甘肽高效生成半胱氨酸为目标反复进行研究。其结果，通过并用作为γ-谷氨酰肽水解酶之一的谷氨酰胺酶与酸性蛋白酶，成功实现由谷胱甘肽高效生成半胱氨酸。另外，发现了特别有效的反应条件、实用化方面有益的信息。基于这些成果提供以下发明。
[1]一种由谷胱甘肽生成半胱氨酸的方法，其包括：
使源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶作用于还原型谷胱甘肽而生成半胱氨酰甘氨酸的第1步骤；以及
使源自微生物的酸性蛋白酶作用于上述半胱氨酰甘氨酸而生成半胱氨酸的第2步骤。
[2]根据[1]记载的方法，其中，在含谷胱甘肽组合物或其溶液、或者谷胱甘肽溶液中添加源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶和源自微生物的酸性蛋白酶后，在pH3～9、温度15℃～70℃下进行反应，由此进行上述第1步骤，然后，将反应液调节为pH2～7，在温度20℃～70℃下进行反应，由此进行上述第2步骤。
[3]根据[1]记载的方法，其中，在含谷胱甘肽组合物或其溶液、或者谷胱甘肽溶液中添加源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶后，在pH3～9、温度15℃～70℃下进行反应，由此进行上述第1步骤，然后，在反应液中添加源自微生物的酸性蛋白酶，在pH2～7、温度20℃～70℃下进行反应，由此进行上述第2步骤。
[4]根据权利要求1记载的方法，其中，在含谷胱甘肽组合物或其溶液、或者谷胱甘肽溶液中添加源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶和源自微生物的酸性蛋白酶后，在pH3～6、温度15℃～70℃下进行反应，由此进行上述第1步骤以及上述第2步骤。
[5]根据[2]或[3]记载的方法，其中，上述第1步骤的反应条件为pH4～8、温度30℃～60℃，上述第2步骤的反应条件为pH3～6、温度20℃～60℃。
[6]根据[2]或[3]记载的方法，其中，上述第1步骤的反应条件为pH5～7、温度30℃～50℃，上述第2步骤的反应条件为pH3～5、温度30℃～50℃下。
[7]根据[1]～[6]中任一项记载的方法，其中，上述源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶为谷氨酰胺酶、γ-谷氨酰转移酶或γ-谷氨酰环化转移酶。
[8]根据[1]～[6]中任一项记载的方法，其中，上述源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶为源自芽孢杆菌属微生物的谷氨酰胺酶。
[9]根据[1]～[6]中任一项记载的方法，其中，上述源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶为源自解淀粉芽孢杆菌的谷氨酰胺酶。
[10]根据[1]～[9]中任一项记载的方法，其中，上述源自微生物的酸性蛋白酶为源自曲霉属微生物的酸性蛋白酶。
[11]根据[1]～[9]中任一项记载的方法，其中，上述源自微生物的酸性蛋白酶为源自米曲霉的酸性蛋白酶。
[12]根据[1]～[11]中任一项记载的方法，其中，上述含谷胱甘肽组合物为食肉、食肉加工品、水产类、水产类加工品、蔬菜、蔬菜加工品、酵母提取物或肉提取物。
具体实施方式
本发明涉及由谷胱甘肽生成半胱氨酸的方法(以下，也称为“本发明的半胱氨酸生成法”)。本发明的半胱氨酸生成法的通用性高，可用于由食品、食材中存在的谷胱甘肽生成半胱氨酸的目的、由纯化的或粗纯化的谷胱甘肽得到半胱氨酸的目的等。如后述所示，本发明中以包含谷胱甘肽的食品、食材、或者谷胱甘肽溶液等为处理对象(被处理物)，只要被处理物中的谷胱甘肽的至少一部分为能够被本发明中使用的酶(源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶)分解的形态(例如还原型)即可。
本发明的半胱氨酸生成法大体使用两种酶，通过两阶段的切割或分解反应由谷胱甘肽生成半胱氨酸。具体而言，通过使源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶作用于还原型谷胱甘肽而生成半胱氨酰甘氨酸的步骤(第1步骤)以及使源自微生物的酸性蛋白酶作用于生成的半胱氨酰甘氨酸而生成半胱氨酸的步骤(第2步骤)，从而由谷胱甘肽生成半胱氨酸。
第1步骤为通过源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶的作用切断还原型谷胱甘肽的γ-谷氨酰键，生成半胱氨酰甘氨酸(CysGly)的反应(也生成谷氨酸作为副产物)。只要能够实现还原型谷胱甘肽的γ-谷氨酰键的切断，则源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶没有特别限定。作为源自微生物的的γ-谷氨酰肽水解酶的示例，可列举源自芽孢杆菌属微生物的谷氨酰胺酶、γ-谷氨酰转移酶、γ-谷氨酰环化转移酶。源自芽孢杆菌属微生物的谷氨酰胺酶的示例为源自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的谷氨酰胺酶(例如天野酶制品株式会社提供的谷氨酰胺酶SD-C100S)。源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶可以不是纯化品，例如，可以使用产生γ-谷氨酰肽水解酶的微生物的培养液、破碎液/提取物、它们的部分纯化物等。也可以并用两种以上的源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶。应予说明，一些源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶可市售(例如，上述的谷氨酰胺酶SD-C100S)，可容易获得并利用。
第2步骤为利用源自微生物的酸性蛋白酶的作用分解通过第1步骤生成的CysGly，生成半胱氨酸的反应(也生成甘氨酸作为副产物)。只要能够实现CysGly的分解，则源自微生物的酸性蛋白酶没有特别限定。作为源自微生物的酸性蛋白酶的示例，可举出源自曲霉属微生物的酸性蛋白酶。源自曲霉属微生物的酸性蛋白酶的示例为源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的酸性蛋白酶(例如，天野酶制品株式会社提供的蛋白酶M“AMANO”SD和蛋白酶HF“AMANO”150SD)。源自微生物的酸性蛋白酶可以不是纯化品，例如，可以使用产生酸性蛋白酶的微生物的培养液、破碎液/提取物、它们的部分纯化物等。也可以并用两种以上的源自微生物的酸性蛋白酶。应予说明，一些源自微生物的酸性蛋白酶可市售(例如，上述的蛋白酶M“AMANO”SD、蛋白酶HF“AMANO”150S)，可容易获得并利用。
本发明中，在其整体工艺中形成在第1步骤后进行第2步骤的状态即可。因此，本发明的一个方式(第1方式)中，在含谷胱甘肽组合物或其溶液、或者谷胱甘肽溶液中添加源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶和源自微生物的酸性蛋白酶，然后，在源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶发挥作用的条件(称为“第1条件”)下使其反应而进行第1步骤，然后，变更为源自微生物的酸性蛋白酶发挥作用的条件(称为“第2条件”)并使其反应，进行第2步骤。根据该方式，无需在中途添加酶(源自微生物的酸性蛋白酶)，操作性变得良好。
使用含谷胱甘肽组合物或其溶液作为被处理物之一。含谷胱甘肽组合物没有特别限定，例如，包括含有谷胱甘肽的食品、食材。术语“食材”采取广义来解释，除肉、鱼、蔬菜等天然的食品材料以外，它们的加工品、提取物、调味料等也包含于食材中。如果举出食品和食材的具体例，为食肉、食肉加工品、水产类、水产类加工品、蔬菜、蔬菜加工品、酵母提取物、肉提取物。
除含谷胱甘肽组合物或其溶液以外，谷胱甘肽溶液也为本发明的被处理物。通常，将谷胱甘肽溶解于合适的溶剂(例如水)而制备谷胱甘肽溶液。谷胱甘肽可通过从酵母中提取、有机合成等来制造，且以试剂、药物、药物原料等形式提供(市售)。应予说明，如上述所示，被处理物中的谷胱甘肽需要至少一部分为还原型，通常使用还原型谷胱甘肽制备谷胱甘肽溶液。
源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶发挥作用的条件，即第1条件例如设为pH3～9、反应温度15℃～70℃。pH优选为4～8，进一步优选为5～7。反应温度优选为30℃～60℃，进一步优选为30℃～50℃。反应时间和酶量只要能够发挥期望的作用就没有特别限定。作为反应时间的示例，可举出5分钟～48小时。酶量设为使反应液中的源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶的浓度例如达到0.001％(W/W)～10％(W/W)、优选0.01％(W/W)～1％(W/W)的量。应予说明，在使用源自解淀粉芽孢杆菌的谷氨酰胺酶作为源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶时，特别优选的反应条件为pH5～7、反应温度35℃～45℃。
源自微生物的酸性蛋白酶发挥作用的条件，即第2条件例如设为pH2～7、反应温度20℃～70℃。pH优选为3～6，进一步优选为3～5。反应温度优选为20℃～60℃，进一步优选为30℃～50℃。反应时间和酶量只要能够发挥期望的作用就没有特别限定。作为反应时间的示例，可举出5分钟～12小时。如果反应时间长，则担心生成的半胱氨酸被氧化，因此优选通过酶量的增加、反应条件(特别是pH及温度)的最优化等提高反应效率。酶量设为使反应液中的源自微生物的酸性蛋白酶的浓度例如达到0.001％(W/W)～10％(W/W)、优选0.01％(W/W)～2％(W/W)的量。应予说明，在使用源自米曲霉的酸性蛋白酶作为源自微生物的酸性蛋白酶时，特别优选的反应条件为pH3～5、反应温度30℃～50℃。
关于由第1条件变更为第2条件时反应液的pH调节，通常可以使用酸(例如，盐酸、硫酸、硝酸、乙酸)、碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钙、氢氧化镁)。
生成的半胱氨酸可根据需要回收或纯化。例如，在使用谷胱甘肽溶液作为被处理物时，为了得到纯度高的半胱氨酸而进行回收/纯化。回收/纯化例如可利用柱色谱。
本发明的另一方式(第2方式)中，在含谷胱甘肽组合物或其溶液、或者谷胱甘肽溶液中，添加源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶，然后在源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶发挥作用的条件(称为“第1条件”)下使其反应而进行第1步骤，然后在反应液中添加源自微生物的酸性蛋白酶，在源自微生物的酸性蛋白酶发挥作用的条件(称为“第2条件”)下使其反应而进行第2步骤。根据该方式，第1步骤(利用源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶切断γ-谷氨酰键)时在反应液中不存在源自微生物的酸性蛋白酶，源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶不可能被源自微生物的酸性蛋白酶分解(消化)。因此，可期待利于源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶良好或高效切断γ-谷氨酰键。应予说明，第2方式的第1条件以及第2条件分别依据上述第1方式的第1条件以及第2条件。反应时间和酶量也相同。
本发明的另一方式(第3方式)中，在含谷胱甘肽组合物或其溶液、或者谷胱甘肽溶液中，添加源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶和源自微生物的酸性蛋白酶，然后在源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶和源自微生物的酸性蛋白酶两者能够发挥作用的条件下使其反应。即，同时进行第1步骤和第2步骤。根据该方式，无需在中途添加酶且无需变更反应条件，操作性良好。源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶和源自微生物的酸性蛋白酶能够同时发挥作用的条件，例如设为pH3～6、反应温度20℃～70℃。pH优选为4～6。反应温度优选为20℃～60℃，进一步优选为30℃～50℃。反应时间和酶量只要能够发挥期望的作用就没有特别限定。作为反应时间的示例，可举出5分钟～24小时。如果反应时间长，则担心生成的半胱氨酸被酸化，因此优选通过酶量的增加、反应条件(特别是pH和温度)的最优化等来提高反应效率。
实施例
设想在食品领域中利用且以建立由谷胱甘肽高效生成半胱氨酸的方法为目标进行以下实验。
1.通过单一酶处理的半胱氨酸生成的研究
(1)方法
在1.0mL的50mmol/L还原型谷胱甘肽中添加0.020mL的5％(w/v)酶液，在37℃静置反应16小时后，利用HPLC进行分析。通过L-半胱氨酸的峰面积相对于总峰面积的比率来评价半胱氨酸生成量。将使用的酶示于以下表(表1)中。
【表1】
制品名 酶
谷氨酰胺酶SD-C100S 源自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的谷氨酰胺酶
肽酶R 源自米根酶(Rhizopus oryzae)的肽酶
蛋白酶A“AMANO”SD 源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的中性蛋白酶
蛋白酶(ProteAX) 源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的肽酶
蛋白酶M“AMANO”SD 源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的酸性蛋白酶
蛋白酶P“AMANO”6SD 源自蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)的碱性蛋白酶
蛋白酶HF“AMANO”150SD 源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的酸性蛋白酶
(2)结果
单一酶处理的情况下，几乎不生成L-半胱氨酸(表2)。
【表2】
Figure BDA0003438752940000091
2.通过并用谷氨酰胺酶与各种酶的半胱氨酸生成的研究
(1)方法
在1.0mL的50mmol/L还原型谷胱甘肽(pH4、5、6或7)中添加0.02mL的5％(w/v)酶溶液，在37℃静置反应12小时后，利用HPLC进行分析。通过L-半胱氨酸的峰面积相对于总峰面积的比率来评价半胱氨酸生成量。
(2)结果
在pH4～6下，谷氨酰胺酶与酸性蛋白酶的组合高效生成半胱氨酸(表3)。
【表3】
Figure BDA0003438752940000101
3.处理条件的研究
(1)方法
在40mL的50mmol/L还原型谷胱甘肽(pH6.0)中添加0.8mL的5％(w/v)谷氨酰胺酶溶液，在37℃静置反应12小时。然后，利用盐酸将pH调节到4.0并定容到50mL后，以终浓度达到0.5％(w/v)或2.0％(w/v)的方式添加蛋白酶HF“AMANO”150SD，在37℃或50℃静置反应4～24小时后，利用HPLC进行分析。通过L-半胱氨酸的峰面积相对于总峰面积的比率来评价半胱氨酸生成量。
(2)结果
蛋白酶量越多，则半胱氨酸生成越快。另外，与37℃相比，在50℃反应的方式中半胱氨酸生成量增加(表4)。
【表4】
Figure BDA0003438752940000111
4.收率提高的研究
(1)方法
在9mL的0.153g(w/v)还原型谷胱甘肽(pH6.0)(终浓度50mM)中添加100mg的谷氨酰胺酶SD-C100S和400mg的蛋白酶HF“AMANO”150SD，在37℃静置反应3小时后，调节到pH4.0，进一步在37℃或50℃静置反应3小时。对反应液进行HPLC分析，计算生成的L-半胱氨酸浓度。
(2)结果
由50mM的还原型谷胱甘肽生成约40mM的半胱氨酸(表5)。在调节为pH4.0后将反应温度设为50℃的情况下，也达到充分的生成量，但是与37℃相比生成量略有减少。推测通过高温反应引起SH基被氧化，而使浓度降低。
【表5】
反应温度 半胱氨酸生成量(mM)
37℃ 40.2
50℃ 35.4
本发明例如在增加食品或食材中的半胱氨酸量方面是有用的。换而言之，根据本发明，能够制造半胱氨酸含量增加的食品或食材。因此，也可以将本发明作为增加半胱氨酸含量的组合物(例如食品、食材)的制造方法来处理。除增加食品或食材中的半胱氨酸量以外，也可以为了由纯化或粗纯化的谷胱甘肽得到半胱氨酸而利用本发明。因此，本发明的通用性高，可期待用于各种领域。
本发明不受到上述发明的实施方式和实施例的说明的任何限定。不脱离权利要求书的记载，在本领域技术人员可容易想到的范围内各种变形方式也包含于本发明。本说明书中明示的论文、公开专利公报以及专利公报等内容通过援引而引用其全全部内容。

Claims (12)

1.一种由谷胱甘肽生成半胱氨酸的方法，其中，包括：
使源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶作用于还原型谷胱甘肽而生成半胱氨酰甘氨酸的第1步骤；以及
使源自微生物的酸性蛋白酶作用于所述半胱氨酰甘氨酸而生成半胱氨酸的第2步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
在含谷胱甘肽组合物或其溶液、或者谷胱甘肽溶液中，添加源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶和源自微生物的酸性蛋白酶后，在pH3～9、温度15℃～70℃下进行反应，由此进行所述第1步骤，然后，将反应液调节为pH2～7，在温度20℃～70℃下进行反应，由此进行所述第2步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，
在含谷胱甘肽组合物或其溶液、或者谷胱甘肽溶液中，添加源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶后，在pH3～9、温度15℃～70℃下进行反应，由此进行所述第1步骤，然后，在反应液中添加源自微生物的酸性蛋白酶，在pH2～7、温度20℃～70℃下进行反应，由此进行所述第2步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，
在含谷胱甘肽组合物或其溶液、或者谷胱甘肽溶液中，添加源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶和源自微生物的酸性蛋白酶后，在pH3～6、温度15℃～70℃下进行反应，由此进行所述第1步骤以及所述第2步骤。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其中，
所述第1步骤的反应条件为pH4～8、温度30℃～60℃，所述第2步骤的反应条件为pH3～6、温度20℃～60℃。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其中，
所述第1步骤的反应条件为pH5～7、温度30℃～50℃，所述第2步骤的反应条件为pH3～5、温度30℃～50℃。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，
所述源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶为谷氨酰胺酶、γ-谷氨酰转移酶或γ-谷氨酰环化转移酶。
8.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，
所述源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶为源自芽孢杆菌属微生物的谷氨酰胺酶。
9.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，
所述源自微生物的γ-谷氨酰肽水解酶为源自解淀粉芽孢杆菌的谷氨酰胺酶。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，
所述源自微生物的酸性蛋白酶为源自曲霉属微生物的酸性蛋白酶。
11.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，
所述源自微生物的酸性蛋白酶为源自米曲霉的酸性蛋白酶。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，
所述含谷胱甘肽组合物为食肉、食肉加工品、水产类、水产类加工品、蔬菜、蔬菜加工品、酵母提取物或肉提取物。
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