WO2022191303A1 - タンパク質分解物の製造方法、及び酵素剤 - Google Patents

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啓太 奥田
恵太 日浦
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天野エンザイム株式会社
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    • C12Y305/01002—Glutaminase (3.5.1.2)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing cysteine from protein, an enzymatic agent for producing cysteine-containing protein hydrolysates, and uses thereof.
  • Patent Document 1 discloses that in a method for producing soybean protein using transglutaminase and protease, protease is used for the purpose of reducing viscosity increased by transglutaminase.
  • amino acids and peptides are not only nutrients, but also important elements for the taste and flavor of food.
  • Patent Document 2 discloses a method of producing a low-molecular-weight peptide by reacting two or more enzymes having only endoprotease activity on soybean protein. Methods for producing amino acids as seasonings are also being researched in order to impart taste.
  • Patent Document 3 discloses a method for obtaining an amino acid seasoning with a high glutamic acid content by hydrolyzing a protein raw material with a thermostable protease and a thermostable glutaminase.
  • cysteine is known to impart meat flavor by forming Maillard reactants. Cysteine is mainly extracted from animal-derived raw materials (hair and feathers), and it is not preferred to add it to food.
  • Patent Document 4 discloses a method of producing cysteine by reacting glutathione with an acid protease and glutaminase, but the content of glutathione differs depending on the food, and the situations where it can be used are limited.
  • Patent Document 5 discloses that free aspartic acid and free glutamic acid are increased by treating soybean protein with a glutamic acid-specific endoprotease.
  • Patent Document 6 when soy protein is treated with subtilisin protease (ALCALASE) derived from Bacillus licheniformis or serine protease (SP1) derived from Nocardiopsis plastina, SP1 hydrolyzate is preferred over ALCALASE hydrolyzate. is disclosed to be less bitter.
  • ACALASE subtilisin protease
  • SP1 hydrolyzate is preferred over ALCALASE hydrolyzate. is disclosed to be less bitter.
  • JP 2006-141231 A JP-A-5-252979 JP-A-48-82068 WO2021/002195 Japanese Patent Publication No. 2008-526261 Japanese Patent Publication No. 2011-530274
  • An object of the present invention is to provide practical means for improving the richness or umami of foods.
  • the present inventors conducted repeated studies with the aim of improving the richness or umami of foods using enzymes. As a result, the present inventors have found that foods with improved richness or umami can be produced by combining glutaminase, which is one of ⁇ -glutamyl peptide hydrolases, with filamentous fungal protease and bacterial protease.
  • glutaminase which is one of ⁇ -glutamyl peptide hydrolases
  • filamentous fungal protease and bacterial protease The present invention has been completed through further studies based on this finding. That is, the present invention provides inventions in the following aspects.
  • a method for producing a protein hydrolyzate which comprises a step of reacting a protein material with a ⁇ -glutamyl peptide hydrolase, a filamentous fungus-derived protease, and a bacterial protease.
  • a ⁇ -glutamyl peptide hydrolase is glutaminase, ⁇ -glutartransferase or ⁇ -glutamyl cyclotransferase.
  • the ⁇ -glutamyl peptide hydrolase is glutaminase derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus.
  • filamentous fungal protease is an Aspergillus oryzae-derived acidic protease, an Aspergillus oryzae-derived neutral protease, or an Aspergillus meleus-derived neutral protease. .
  • the bacterial protease is a protease derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus or Geobacillus.
  • the bacterial protease is Geobacillus stearothermophilus-derived protease.
  • the protein material is a vegetable protein material.
  • the protein material is peas, soybeans, broad beans, chickpeas, barley, wheat, oats, rice, buckwheat, millet, millet, hemp, algae, almonds, cashews, hazelnuts, pecans, macadamia nuts, pistachios, walnuts , Brazil nuts, peanuts, coconut-derived protein material, the method according to any one of [1] to [9].
  • a food comprising a protein hydrolyzate produced by the method according to any one of [1] to [11].
  • An enzymatic agent for producing a protein hydrolyzate containing a ⁇ -glutamyl peptide hydrolase, a filamentous fungus-derived protease, and a bacterial protease.
  • FIG. 1 shows the results of hardness evaluation in Example 2.
  • FIG. 2 shows the results of free amino acid analysis in Example 2.
  • FIG. 3 shows the results of free amino acid analysis in Example 3.
  • FIG. 4 shows the results of free amino acid analysis in Example 3.
  • FIG. 5 shows the results of free amino acid analysis in Example 3.
  • FIG. 6 shows the results of free amino acid analysis in Example 3.
  • a method for producing a protein hydrolyzate which comprises the step of reacting a protein material with ⁇ -glutamyl peptide hydrolase, filamentous fungus-derived protease, and bacterial protease.
  • the present invention further provides enzymatic agents for producing protein hydrolysates, including ⁇ -glutamyl peptide hydrolase, filamentous fungus-derived protease, and bacterial protease.
  • the step of allowing the ⁇ -glutamyl peptide hydrolase, the filamentous fungus-derived protease, and the bacterial protease to act on the protein material may be carried out in a single step (that is, the step of simultaneously acting the above three types of enzymes on the protein material). Then, in a two-step or three-step process (that is, a step of acting one or two of the above three types of enzymes on the protein material, and a step of further acting another enzyme among the above three types) you can go
  • ⁇ -glutamyl peptide hydrolases include glutaminase, ⁇ -glutartransferase and ⁇ -glutamyl cyclotransferase.
  • a microorganism-derived ⁇ -glutamyl peptide hydrolase can be used, and examples thereof include glutaminase, ⁇ -glutamyltransferase, and ⁇ -glutamyl cyclotransferase derived from Bacillus microorganisms. be able to.
  • the ⁇ -glutamyl peptide hydrolase is preferably a glutaminase derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus, more preferably a glutaminase derived from Bacillus amyloliquefaciens (for example, glutaminase SD-C100S provided by Amano Enzyme Co., Ltd.). ).
  • the ⁇ -glutamyl peptide hydrolase derived from microorganisms does not have to be a purified product.
  • the culture medium, lysate/extract, partially purified products thereof, etc. of microorganisms that produce ⁇ -glutamyl peptide hydrolase may be used.
  • can be Two or more microorganism-derived ⁇ -glutamyl peptide hydrolases may be used in combination.
  • some microorganism-derived ⁇ -glutamyl peptide hydrolases are commercially available (for example, the above-mentioned glutaminase SD-C100S), and are readily available and available.
  • an acidic protease derived from a microorganism belonging to the genus Aspergillus and a neutral protease derived from a microorganism belonging to the genus Aspergillus are preferred.
  • acid proteases derived from Aspergillus microorganisms are Aspergillus oryzae-derived acid proteases (for example, Protease M “Amano” SD and Protease HF “Amano” 150SD provided by Amano Enzyme Co., Ltd.).
  • Aspergillus microorganism-derived neutral protease examples include Aspergillus oryzae-derived neutral protease and Aspergillus melleus-derived neutral protease.
  • Aspergillus oryzae-derived neutral protease PR-AX, product name: Proteax
  • Aspergillus oryzae-derived neutral protease PR-ASD, product name: Protease A “Amano” SD
  • Aspergillus oryzae They are Aspergillus melleus-derived neutral protease (PR-P6SD, product name is Protease P "Amano" 6SD) and Aspergillus oryzae-derived neutral protease (PR-AN100SD).
  • the filamentous fungus-derived protease does not have to be a purified product.
  • the culture solution, lysate/extract, or partially purified product of a microorganism that produces the filamentous fungus-derived protease may be used.
  • Two or more filamentous fungus-derived proteases may be used in combination.
  • Some proteases derived from filamentous fungi are commercially available (for example, the above Protease M "Amano" SD, Protease HF "Amano" 150S, Proteax, Protease A "Amano” SD, Protease P “Amano” 6SD). , PR-AN100SD) are readily available and available.
  • the bacterial protease is preferably derived from a Bacillus or Geobacillus microorganism-derived protease, more preferably Geobacillus stearothermophilus-derived protease.
  • Samoase PC10F provided by Amano Enzyme Co., Ltd. can be mentioned as an example of the bacterial protease.
  • the bacterial protease does not have to be a purified product.
  • the culture solution, lysate/extract, or partially purified products of microorganisms that produce bacterial proteases may be used.
  • Two or more bacterial proteases may be used in combination. Note that several bacterial proteases are commercially available (eg Samoase PC10F, above) and are readily available and available.
  • the enzymatic preparation of the present invention containing ⁇ -glutamyl peptide hydrolase, filamentous fungus-derived protease, and bacterial protease contains active ingredients (three types of enzymes mentioned above), excipients, buffers, suspending agents, and stabilizers. , preservatives, preservatives, physiological saline, and the like.
  • active ingredients three types of enzymes mentioned above
  • excipients include lactose, sorbitol, D-mannitol, maltodextrin, and sucrose.
  • Phosphate, citrate, acetate and the like can be used as buffers.
  • Propylene glycol, ascorbic acid and the like can be used as stabilizers.
  • Preservatives that can be used include phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like.
  • As antiseptics benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • the content of the active ingredients (three types of enzymes mentioned above) in the present enzymatic preparation is not particularly limited, and can be set as appropriate.
  • the enzymatic agent of the present invention is usually solid (for example, granules, powders, immobilized enzymes obtained by immobilizing the enzyme on the surface or inside of a material such as silica or porous polymer) or liquid. provided.
  • Conditions for allowing the ⁇ -glutamyl peptide hydrolase, filamentous fungus-derived protease, and bacterial protease to act on the protein material are, for example, a reaction temperature of 15°C to 70°C, preferably 30°C to 65°C, more preferably 40°C to 60°C. be.
  • the reaction time and the amount of enzyme are not particularly limited as long as the expected action is exhibited. Examples of reaction time include 5 minutes to 48 hours, preferably 10 minutes to 12 hours, more preferably 15 minutes to 6 hours.
  • the concentration of each of the three enzymes in the reaction solution is, for example, 0.001% (W/W) to 10% (W/W), preferably 0.01% (W/W) to The amount can be set to 2% (W/W).
  • the protein material is preferably an animal protein material, a vegetable protein material or a microbial protein material, more preferably a vegetable protein material.
  • proteinaceous materials include peas, soybeans, broad beans, chickpeas, barley, wheat, oats, rice, buckwheat, millet, millet, hemp, algae, almonds, cashews, hazelnuts, pecans, macadamia nuts, pistachios, Walnuts, brazil nuts, peanuts, coconut derived protein materials may be mentioned.
  • a protein hydrolyzate containing a large amount of cysteine capable of forming a Maillard reaction (cysteine-containing protein hydrolyzate) can be produced.
  • Cysteine capable of forming a Maillard reaction includes peptides having a cysteine residue capable of Maillard reaction, in addition to cysteine in the free amino acid state. Cysteine in the free amino acid state is preferred.
  • Example 1 The following experiments were conducted with the aim of establishing a method for efficiently producing cysteine from proteins.
  • Absorbance at 412 nm was measured immediately after completion of the reaction.
  • the amount of cysteine residues in the supernatant was calculated from a standard curve prepared using a 10 ⁇ M to 50 ⁇ M cysteine solution (1 mM EDTA) instead of the supernatant.
  • 2 mL of the supernatant was neutralized to pH 7 with hydrochloric acid, 1 mL of 20% glucose was added, and the Maillard reaction was performed by boiling for 30 minutes. confirmed. Specifically, changes in taste were confirmed by sensory evaluation by panelists.
  • Example 2 105 g (1.5 times the amount) of water was added to 70 g of soy meat (soy TVP (textured vegetable protein) (soybean meat minced type, Marukome Co., Ltd.) and allowed to stand for 10 minutes. Metolose was added to the above mixture. 8.7 g of sunflower oil, 48.5 g of sunflower oil, and 26.7 g of Sunrubber 10 (soybean protein powder) were uniformly mixed.To 25 g of the above mixture, 1% of the enzyme solution shown in Table 2 below (based on soybean TVP) was added. ) was added and reacted for 1 hour at 50° C. After the reaction, 6 mL of water was added and molded, and then baked (in an oven at 110° C. for 10 minutes).Sensory evaluation (umami) of the baked product The results of the sensory evaluation are shown in Table 3. The larger the number, the greater the improvement, with 1 being no change and 4 being greatly improved. indicates that
  • the hardness of the obtained fired product was evaluated under the following conditions.
  • Equipment used Rheometer (COMPAC-100II) Pushing speed: 60mm/min Table moving distance: 7mm (Measure the firmness 7mm after touching the meat)
  • the results of hardness evaluation are shown in FIG.
  • the unit of the vertical axis in FIG. 1 is N (Newton).
  • Free amino acids in the obtained baked product were analyzed as follows. 1 mL of distilled water was added to 1 g of a sample of the baked product, mixed and centrifuged. The supernatant and ethanol were mixed at a ratio of 1:1 (supernatant: ethanol) (protein removal). The mixture was centrifuged and the supernatant was recovered, diluted 12.5 times with water, filtered through a microfiltration membrane (MF) and subjected to HPLC analysis. The conditions for HPLC analysis are as follows. The analysis results of free amino acids are shown in FIG.
  • Example 3 To a 10% (w/v) vegetable protein solution (peas: pea protein (Usuki Pharmaceutical Co., Ltd.), soybeans: Sunrubber 10 (Fuji Oil)), 4% of the enzyme was added to the weight of the vegetable protein (2 % filamentous protease + 1% bacterial protease + 1% glutaminase). The mixture was reacted at 50° C. for 2 hours at 400 rpm. The reaction was boiled for 10 minutes, centrifuged and the supernatant collected. The obtained sample supernatant was subjected to sensory evaluation and free amino acid analysis.
  • peas pea protein (Usuki Pharmaceutical Co., Ltd.)
  • soybeans Sunrubber 10 (Fuji Oil)
  • 4% of the enzyme was added to the weight of the vegetable protein (2 % filamentous protease + 1% bacterial protease + 1% glutaminase). The mixture was reacted at 50° C. for 2 hours at 400 rpm. The reaction was

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Abstract

本発明の課題は、食品分野（食品用途）への利用にも適した、タンパク質からシステインを生成するための実用的な手段を提供することである。本発明によれば、タンパク質材料にγ－グルタミルペプチド加水分解酵素、糸状菌由来プロテアーゼ及び細菌プロテアーゼを作用させる工程を含む、システイン含有タンパク質分解物の製造方法が提供される。

Description

タンパク質分解物の製造方法、及び酵素剤
　本発明はタンパク質からシステインを生成する方法、システイン含有タンパク質分解物の製造のための酵素剤、及びその用途に関する。
　食品中のタンパク質は栄養素として重要であり、嗜好性の点から主に畜肉や魚介類などの動物性タンパク質が好まれてきた。近年は環境保護の観点や健康意識の高まりから、動物性タンパク質の代替として、植物性タンパク質への需要が増えてきているが、嗜好性の点で課題が多く、物性や呈味性の改良を目的に様々な研究がされてきた。例えば、特許文献１には、トランスグルタミナーゼとプロテアーゼを用いた大豆タンパク質の製造方法において、プロテアーゼが、トランスグルタミナーゼによって上昇した粘度を低下させる目的で用いられることが開示されている。一方、アミノ酸やペプチドは栄養素としてだけでなく、食品の味や風味にも重要な要素である。例えばグルタミン酸やアスパラギン酸は旨味や酸味を、グリシン、アラニン、トレオニン等は甘みを、トリプトファン、イソロイシン、バリン等は苦みを呈する。そのため、タンパク質からアミノ酸やペプチドを生成する研究がされている。特許文献２には、大豆タンパク質にエンドプロテアーゼ活性のみを持つ酵素を二種以上作用させることで低分子ペプチドを生成する方法が開示されている。また、呈味性を付与するために調味料としてのアミノ酸を生成する方法も研究されている。例えば、特許文献３には、蛋白質原料を耐熱性蛋白質分解酵素と耐熱性グルタミナーゼで加水分解することでグルタミン酸含量の多いアミノ酸調味料を得る方法を開示している。
　ところで、システインはメイラード反応物を形成することで肉の風味を付与することが知られている。システインは主に動物由来の原料（毛髪や羽毛）から抽出されており、食品に添加することは好まれない。特許文献４には、グルタチオンに酸性プロテアーゼとグルタミナーゼを作用させることでシステインを生成する方法が開示されているが、グルタチオンは食品によって含有量に差があり、活用できる場面は限られる。
　また、特許文献５には、グルタミン酸特異的エンドプロテアーゼで大豆タンパク質を処理することにより、遊離アスパラギン酸及び遊離グルタミン酸が増加することが開示されている。さらに特許文献６には、バチルス・リケニフォルミス由来のサブチリシンプロテアーゼ（ALCALASE）又はノカルディオプシス・プラシナ由来セリンプロテアーゼ（SP1）によって大豆タンパク質を処理した場合、ALCALASE 加水分解物よりSP1加水分解物の方が苦みが少ないことが開示されている。
特開２００６－１４１２３１号公報 特開平５－２５２９７９号公報 特開昭４８－８２０６８号公報 ＷＯ２０２１／００２１９５号 特表２００８－５２６２６１号公報 特表２０１１－５３０２７４号公報
　本発明の課題は、食品などのコク味またはうま味を向上できる実用的な手段を提供することである。
　上記課題の下で本発明者らは、酵素によって食品のコク味またはうま味を向上させることを目指して検討を重ねた。その結果、γ－グルタミルペプチド加水分解酵素の一つであるグルタミナーゼと糸状菌プロテアーゼ、細菌プロテアーゼの併用によってコク味またはうま味を向上させた食品を製造できることを見出した。本発明は、この知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。即ち、本発明は下記に掲げる態様の発明を提供する。
［１］タンパク質材料にγ－グルタミルペプチド加水分解酵素、糸状菌由来プロテアーゼ及び細菌プロテアーゼを作用させる工程を含む、タンパク質分解物の製造方法。
［２］前記γ－グルタミルペプチド加水分解酵素がグルタミナーゼ、γ－グルタルトランスフェラーゼ又はγ－グルタミルシクロトランスフェラーゼである、［１］に記載の方法。
［３］前記γ－グルタミルペプチド加水分解酵素がバチルス属微生物由来グルタミナーゼである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記γ－グルタミルペプチド加水分解酵素がバチルス・アミロリケファシエンス由来グルタミナーゼである、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］前記糸状菌プロテアーゼがアスペルギルス属微生物由来酸性プロテアーゼ又はアスペルギルス属微生物由来中性プロテアーゼである、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］前記糸状菌プロテアーゼがアスペルギルス・オリゼ由来酸性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼ由来中性プロテアーゼ、又はアスペルギルス・メレウス由来中性プロテアーゼである、［１］～［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］前記細菌プロテアーゼがバチルス属又はジオバチルス属微生物由来プロテアーゼである、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］前記細菌プロテアーゼがジオバチルス・ステアロサーモフィラス由来プロテアーゼである、［１］～［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］前記タンパク質材料が動物性タンパク質材料、植物性タンパク質材料又は微生物性タンパク質材料である、［１］～［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］前記タンパク質材料が植物性タンパク質材料である、［１］～［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］前記タンパク質材料がエンドウ豆、大豆、そら豆、ひよこ豆、大麦、小麦、オーツ麦、米、そば、ひえ、あわ、ヘンプ、藻類、アーモンド、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ペカンナッツ、マカダミアナッツ、ピスタチオ、クルミ、ブラジルナッツ、ピーナッツ、ココナッツ由来タンパク質材料である、［１］～［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］［１］～［１１］のいずれか一項に記載の方法により製造されるタンパク質分解物を含む、食品。
［１３］γ－グルタミルペプチド加水分解酵素、糸状菌由来プロテアーゼ及び細菌プロテアーゼを含む、タンパク質分解物の製造のための酵素剤。
［１４］前記γ－グルタミルペプチド加水分解酵素がグルタミナーゼ、γ－グルタルトランスフェラーゼ又はγ－グルタミルシクロトランスフェラーゼである、［１３］に記載の酵素剤。
［１５］前記γ－グルタミルペプチド加水分解酵素がバチルス属微生物由来グルタミナーゼである、［１３］又は［１４］に記載の酵素剤。
［１６］前記γ－グルタミルペプチド加水分解酵素がバチルス・アミロリケファシエンス由来グルタミナーゼである、［１３］～［１５］のいずれか一項に記載の酵素剤。
［１７］前記糸状菌プロテアーゼがアスペルギルス属微生物由来酸性プロテアーゼ又はアスペルギルス属微生物由来中性プロテアーゼである、［１３］～［１６］のいずれか一項に記載の酵素剤。
［１８］前記糸状菌プロテアーゼがアスペルギルス・オリゼ由来酸性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼ由来中性プロテアーゼ、又はアスペルギルス・メレウス由来中性プロテアーゼである、［１３］～［１７］のいずれか一項に記載の酵素剤。
［１９］前記細菌プロテアーゼがバチルス属又はジオバチルス属微生物由来プロテアーゼである、［１３］～［１８］のいずれか一項に記載の酵素剤。
［２０］前記細菌プロテアーゼがジオバチルス・ステアロサーモフィラス由来プロテアーゼである、［１３］～［１９］のいずれか一項に記載の酵素剤。
　本発明によれば、食品等にコク味またはうま味を付与したり、食品のコク味またはうま味を増強することができる。
図１は、実施例２における固さの評価の結果を示す。 図２は、実施例２における遊離アミノ酸分析の結果を示す。 図３は、実施例３における遊離アミノ酸分析の結果を示す。 図４は、実施例３における遊離アミノ酸分析の結果を示す。 図５は、実施例３における遊離アミノ酸分析の結果を示す。 図６は、実施例３における遊離アミノ酸分析の結果を示す。
　本発明によれば、タンパク質材料にγ－グルタミルペプチド加水分解酵素、糸状菌由来プロテアーゼ及び細菌プロテアーゼを作用させる工程を含む、タンパク質分解物の製造方法が提供される。
　本発明によればさらに、γ－グルタミルペプチド加水分解酵素、糸状菌由来プロテアーゼ及び細菌プロテアーゼを含む、タンパク質分解物の製造のための酵素剤が提供される。
　タンパク質材料にγ－グルタミルペプチド加水分解酵素、糸状菌由来プロテアーゼ及び細菌プロテアーゼを作用させる工程は、一段階の工程（即ち、タンパク質材料に上記３種類の酵素を同時に作用させる工程）で行ってもよいし、二段階又は三段階の工程（即ち、タンパク質材料に上記３種類のうちの１種又は２種の酵素を作用させる工程と、さらに上記３種類のうちの別の酵素を作用させる工程）で行ってもよい。
　γ－グルタミルペプチド加水分解酵素としては、グルタミナーゼ、γ－グルタルトランスフェラーゼ又はγ－グルタミルシクロトランスフェラーゼが挙げられる。
　γ－グルタミルペプチド加水分解酵素としては、微生物由来のγ－グルタミルペプチド分解酵素を使用することができ、その例としては、バチルス属微生物由来のグルタミナーゼ、γ－グルタミルトランスフェラーゼ、γ－グルタミルシクロトランスフェラーゼを挙げることができる。
　γ－グルタミルペプチド加水分解酵素は、好ましくは、バチルス属微生物由来グルタミナーゼであり、さらに好ましくは、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）由来グルタミナーゼ（例えば、天野エンザイム株式会社が提供するグルタミナーゼSD-C100S）である。
　微生物由来γ－グルタミルペプチド加水分解酵素は精製品でなくてもよく、例えば、γ－グルタミルペプチド加水分解酵素を産生する微生物の培養液、破砕液／抽出物、これらの部分精製物等を用いることにしてもよい。２種類以上の微生物由来γ－グルタミルペプチド加水分解酵素を併用することにしてもよい。尚、いくつかの微生物由来γ－グルタミルペプチド加水分解酵素が市販されており（例えば、上記のグルタミナーゼSD-C100S）、容易に入手及び利用可能である。
　糸状菌プロテアーゼとしては、好ましくは、アスペルギルス属微生物由来酸性プロテアーゼ、及びアスペルギルス属微生物由来中性プロテアーゼを挙げることができる。
　アスペルギルス属微生物由来の酸性プロテアーゼの例は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来酸性プロテアーゼ（例えば天野エンザイム株式会社が提供するプロテアーゼM「アマノ」SD及びプロテアーゼHF「アマノ」150SD）である。
　アスペルギルス属微生物由来中性プロテアーゼの例は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来中性プロテアーゼ、及びアスペルギルス・メレウス（Aspergillus melleus）由来中性プロテアーゼであり、例えば、天野エンザイム株式会社が提供する、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来中性プロテアーゼ（PR-AX、製品名はプロテアックス）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来中性プロテアーゼ（PR-ASD、製品名はプロテアーゼA「アマノ」SD）、アスペルギルス・メレウス（Aspergillus melleus）由来中性プロテアーゼ（PR-P6SD、製品名はプロテアーゼP「アマノ」6SD）、及びアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来中性プロテアーゼ（PR-AN100SD）である。
　糸状菌由来プロテアーゼは精製品でなくてもよく、例えば、糸状菌由来プロテアーゼを産生する微生物の培養液、破砕液／抽出物、これらの部分精製物等を用いることにしてもよい。２種類以上の糸状菌由来プロテアーゼを併用することにしてもよい。尚、いくつかの糸状菌由来プロテアーゼが市販されており（例えば、上記のプロテアーゼM「アマノ」SD、プロテアーゼHF「アマノ」150S、並びにプロテアックス、プロテアーゼA「アマノ」SD、プロテアーゼP「アマノ」6SD、PR-AN100SD）、容易に入手及び利用可能である。
　細菌プロテアーゼとしては、金属プロテアーゼが好ましい。細菌プロテアーゼの由来としては、好ましくは、バチルス属又はジオバチルス属微生物由来プロテアーゼを挙げることができ、より好ましくは、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス由来プロテアーゼを挙げることができる。細菌プロテアーゼの一例としては、天野エンザイム株式会社が提供するサモアーゼＰＣ１０Ｆを挙げることができる。
　細菌プロテアーゼは精製品でなくてもよく、例えば、細菌プロテアーゼを産生する微生物の培養液、破砕液／抽出物、これらの部分精製物等を用いることにしてもよい。２種類以上の細菌プロテアーゼを併用することにしてもよい。尚、いくつかの細菌プロテアーゼが市販されており（例えば、上記のサモアーゼＰＣ１０Ｆ）、容易に入手及び利用可能である。
　γ－グルタミルペプチド加水分解酵素、糸状菌由来プロテアーゼ及び細菌プロテアーゼを含む本発明の酵素剤は、有効成分（上記の３種の酵素）の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としては乳糖、ソルビトール、D-マンニトール、マルトデキストリン、白糖等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
　本酵素剤における有効成分（上記の３種の酵素）の含有量は特に限定されず、適宜設定できる。
　本発明の酵素剤は通常、固体状（例えば、顆粒、粉体、シリカや多孔質ポリマー等の表面又は内部に酵素を固定させうる素材に当該酵素を固定化した固定化酵素）又は液体状で提供される。
　タンパク質材料にγ－グルタミルペプチド加水分解酵素、糸状菌由来プロテアーゼ及び細菌プロテアーゼを作用させる条件は、例えば反応温度15℃～70℃、好ましくは30℃～65℃、更に好ましくは40℃～60℃である。
　反応時間及び酵素量は、期待される作用が発揮される限り特に限定されない。反応時間の例として5分～48時間、好ましくは10分～12時間、更に好ましくは15分～6時間を挙げることができる。酵素量については、反応液中の3種類の酵素のうちのそれぞれの酵素の濃度が、例えば0.001％(W/W)～10％(W/W)、好ましくは0.01％(W/W)～2％(W/W)となる量とすることができる。
　タンパク質材料としては、好ましくは、動物性タンパク質材料、植物性タンパク質材料又は微生物性タンパク質材料であり、より好ましくは植物性タンパク質材料である。タンパク質材料の具体例としては、エンドウ豆、大豆、そら豆、ひよこ豆、大麦、小麦、オーツ麦、米、そば、ひえ、あわ、ヘンプ、藻類、アーモンド、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ペカンナッツ、マカダミアナッツ、ピスタチオ、クルミ、ブラジルナッツ、ピーナッツ、ココナッツ由来タンパク質材料を挙げることができる。
　本発明によれば、メイラード反応を形成可能なシステインを多く含有するタンパク質分解物（システイン含有タンパク質分解物）を製造することができる。メイラード反応を形成可能なシステインは、遊離アミノ酸の状態のシステインの他に、メイラード反応が可能な状態のシステイン残基を有するペプチドも含まれる。好ましくは遊離アミノ酸の状態のシステインが挙げられる。
　本発明によればさらに、本発明によるシステイン含有タンパク質分解物の製造方法により製造されるシステイン含有タンパク質分解物を含む、食品が提供される。
　以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
＜実施例１＞
　タンパク質からシステインを効率的に生成する方法の確立を目指して以下の実験を行った。
１．システイン生成の検討
（１）方法
　１２ｇの各種タンパク質材料を水に懸濁してタンパク質溶液（１５％（Ｗ／Ｗ）、ｐＨ５）を調製した。１．４ｇの糸状菌プロテアーゼ（プロテアーゼHF「アマノ」１５０ＳＤ、天野エンザイム株式会社）と０．７ｇのグルタミナーゼ（グルタミナーゼＳＤ－Ｃ１００Ｓ、天野エンザイム株式会社）、０．７ｇの細菌プロテアーゼ（サモアーゼＰＣ１０Ｆ、天野エンザイム株式会社）を水２０ｍＬに溶解して酵素溶液を調製した。５０℃のタンパク質溶液３０ｍＬに酵素溶液を１ｍＬ添加後、混合して、５０℃で２時間処理した。処理液を遠心分離後、上清を回収した。上清に含まれるシステインのチオール基をＤＴＮＢ試薬を用いて定量した。０．１Ｍトリス緩衝液（１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０５）２．６ｍＬに２５ｍＭ　ＤＴＮＢ溶液（５０ｍＭ酢酸アンモニウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ５．０）０．２ｍＬと適当な濃度に希釈した上清０．２ｍＬを加えて混合後、反応が完了するまで１０～１５分待った。反応完了後、すぐに４１２ｎｍの吸光度を測定した。上清の代わりに１０μＭ～５０μＭのシステイン溶液（１ｍＭ　ＥＤＴＡ）を用いて作成した検量線から上清中のシステイン残基の量を算出した。また、呈味性変化を確認するために、上清を塩酸でｐＨ７に中和したものを２ｍＬ取り、２０％グルコースを１ｍＬ添加して、３０分煮沸することでメイラード反応させたもののコク味を確認した。具体的には、パネラーによる官能評価によって呈味性の変化を確認した。
（２）結果
　酵素処理によって全てのタンパク質材料において、システインの遊離を確認できた。また、ヘンプタンパク質以外ではメイラード反応物において、肉風味の重要な要素であるコク味の向上も確認できた。ヘンプタンパク質に関しては、ヘンプ特有の風味が強すぎてコク味の変化を確認することが出来なかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜実施例２＞
　大豆ミート（大豆ＴＶＰ（Ｔｅｘｔｕｒｅｄ　Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ダイズラボ　大豆のお肉　ミンチタイプ、マルコメ社）７０ｇに、１０５ｇ（１．５倍量）の水を添加し、１０分間静置した。上記混合物に、Ｍｅｔｏｌｏｓｅ　８．７ｇ、ひまわり油４８．５ｇ、及びサンラバー１０（大豆タンパク粉）２６．７ｇを均一になるように混合した。上記混合物２５ｇに、下記の表２に示す酵素液１％（大豆ＴＶＰに対して）を添加し、５０℃において１時間反応させた。反応後、水を６ｍＬ添加して成型した後、焼成（オーブンで１１０℃、１０分）した。得られた焼成物について官能評価（旨味と香りの５段階評価）を行った。官能評価の結果を表３に示す。酵素なしを基準として数字が大きいほど向上していることを示しており、1は変化なし、4は大きく向上していることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　得られた焼成物の固さを　以下の条件において評価した。
使用機器：レオメーター（ＣＯＭＰＡＣ－１００II）
押し込み速度：６０ｍｍ／ｍｉｎ
台の移動距離：７ｍｍ
（肉に触れてから７ｍｍの位置の固さを測定する）
　固さの評価の結果を図１に示す。図１の縦軸の単位は、N（ニュートン）である。
　得られた焼成物における遊離アミノ酸を以下の通り分析した。
　焼成物のサンプル１ｇに蒸留水１ｍＬを添加し、混合し、遠心分離した。上清とエタノールとを、上清：エタノール＝１：１で混合した（タンパク質の除去）。混合物を遠心分離し、上清を回収し、水で１２．５倍に希釈し、精密ろ過膜（ＭＦ）でろ過し、ＨＰＬＣ分析を行った。ＨＰＬＣ分析の条件は以下の通りである。遊離アミノ酸の分析結果を図２に示す。
Agilent HPLC (1260 InfinityII)
Ａ　ｂｕｆｆｅｒ：　２０ｍＭ　Ｎａ2ＨＰＯ4・Ｈ3ＰＯ4　ｐＨ８．２
Ｂ　ｂｕｆｆｅｒ：メタノール：アセトニトリル　：水＝　４５：４５：１０
カラム：ＨＰＨ－Ｃ１８　２．７　μｍ　３．０×１００　ｍｍ　（Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ）
流量：０．６５　ｍＬ／ｍｉｎ
０－０．３５　ｍｉｎ　：　Ａ：９６％，　Ｂ：４％
０．３５－１３．４　ｍｉｎ　：　Ａ：４３％，　Ｂ：５７％
１３．４－１３．５　ｍｉｎ　：　Ａ：０％，　Ｂ：１００％
１３．５－１５．７　ｍｉｎ　：　Ａ：０％，　Ｂ：１００％
１５．７－１５．８　ｍｉｎ　：　Ａ：９６％，　Ｂ：４％
１５．８－１８　ｍｉｎ　：　Ａ：９６％，　Ｂ：４％
＜実施例３＞
　１０％（ｗ／ｖ）植物性タンパク質溶液（エンドウ：ｐｅａ　ｐｒｏｔｅｉｎ（うすき製薬）、大豆：サンラバー１０（不二製油））に対して、植物タンパク質重量に対して４％の酵素を添加した（２％糸状菌プロテアーゼ＋１％細菌プロテアーゼ＋１％グルタミナーゼ）。混合物を５０℃で２時間、４００ｒｐｍで処理して反応させた。反応物を１０分間煮沸し、遠心分離し、上清を回収した。得られたサンプル上清について、官能評価及び遊離アミノ酸分析を行った。
（官能評価）
　サンプル上清４ｍＬを採取し、２０％グルコースを２ｍＬ添加した。得られた混合物を煮沸水に入れ、３０分間処理し、官能評価を行った。結果を表４に示す。酵素なしを基準として数字が大きいほど向上していることを示しており、1は変化なし、5は大きく向上していることを示す 。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（遊離アミノ酸分析）
　サンプル上清とエタノールとを、サンプル上清：エタノール＝１：１で混合した（タンパク質の除去）。混合物を遠心分離し、上清を回収し、水で１２．５倍に希釈し、精密ろ過膜（ＭＦ）でろ過し、ＨＰＬＣ分析（アミノ酸分析）を実施例２と同様の条件で行った。遊離アミノ酸の分析結果を図３～図６に示す。

Claims (16)

  1. タンパク質材料にγ－グルタミルペプチド加水分解酵素、糸状菌由来プロテアーゼ及び細菌プロテアーゼを作用させる工程を含む、システイン含有タンパク質分解物の製造方法。
  2. 前記γ－グルタミルペプチド加水分解酵素がグルタミナーゼ、γ－グルタルトランスフェラーゼ又はγ－グルタミルシクロトランスフェラーゼである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記γ－グルタミルペプチド加水分解酵素がバチルス属微生物由来グルタミナーゼである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記γ－グルタミルペプチド加水分解酵素がバチルス・アミロリケファシエンス由来グルタミナーゼである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記糸状菌プロテアーゼがアスペルギルス属微生物由来酸性プロテアーゼ又はアスペルギルス属微生物由来中性プロテアーゼである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記糸状菌プロテアーゼがアスペルギルス・オリゼ由来酸性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼ由来中性プロテアーゼ、又はアスペルギルス・メレウス由来中性プロテアーゼである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記タンパク質材料が動物性タンパク質材料、植物性タンパク質材料又は微生物性タンパク質材料である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記タンパク質材料が植物性タンパク質材料である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記タンパク質材料がエンドウ豆、大豆、そら豆、ひよこ豆、大麦、小麦、オーツ麦、米、そば、ひえ、あわ、ヘンプ、藻類、アーモンド、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ペカンナッツ、マカダミアナッツ、ピスタチオ、クルミ、ブラジルナッツ、ピーナッツ、ココナッツ由来タンパク質材料である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の方法により製造されるシステイン含有タンパク質分解物を含む、食品。
  11. γ－グルタミルペプチド加水分解酵素、糸状菌由来プロテアーゼ及び細菌プロテアーゼを含む、システイン含有タンパク質分解物の製造のための酵素剤。
  12. 前記γ－グルタミルペプチド加水分解酵素がグルタミナーゼ、γ－グルタルトランスフェラーゼ又はγ－グルタミルシクロトランスフェラーゼである、請求項１１に記載の酵素剤。
  13. 前記γ－グルタミルペプチド加水分解酵素がバチルス属微生物由来グルタミナーゼである、請求項１１又は１２に記載の酵素剤。
  14. 前記γ－グルタミルペプチド加水分解酵素がバチルス・アミロリケファシエンス由来グルタミナーゼである、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の酵素剤。
  15. 前記糸状菌プロテアーゼがアスペルギルス属微生物由来酸性プロテアーゼ又はアスペルギルス属微生物由来中性プロテアーゼである、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の酵素剤。
  16. 前記糸状菌プロテアーゼがアスペルギルス・オリゼ由来酸性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼ由来中性プロテアーゼ、又はアスペルギルス・メレウス由来中性プロテアーゼである、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の酵素剤。
PCT/JP2022/010765 2021-03-11 2022-03-11 タンパク質分解物の製造方法、及び酵素剤 WO2022191303A1 (ja)

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