JP5537002B2

JP5537002B2 - ストレプトミセス属に属する新規微生物、その微生物が産生する新規化合物、及びその化合物を有効成分とする医薬

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Publication number: JP5537002B2
Application number: JP2008212415A
Authority: JP
Inventors: 康弘五十嵐; 貴子飯田; 浩治宮野内
Original assignee: Toyama Prefecture
Current assignee: Toyama Prefecture
Priority date: 2008-08-21
Filing date: 2008-08-21
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2028-08-21
Also published as: JP2010046004A

Description

本発明は、新規微生物、その微生物が産生する新規化合物、及びその化合物を有効成分とする医薬に関する。より詳細には、ストレプトミセス（Streptomyces）属に属する新規微生物、その微生物が産生する少なくとも３種類の新規化合物、及びその化合物を有効成分とする抗癌剤その他の医薬に関する。

従来、癌治療には、癌細胞の増殖を阻害する薬物が使用されてきた。こうした癌治療に用いられる薬剤としては、ムスチン、シクロホスファミド、クロラムブシル等のアルキル化剤、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、ドキソルビシン等の細胞毒抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン等のビンカアルカロイド、葉酸拮抗薬であるメトトレキセート、抗ピリミジン薬であるフルオロウラシルやシタラビン、抗プリン薬であるメルカプトプリンその他の代謝拮抗剤、プレドニゾロンその他のグルココルチコイド、エストロゲン拮抗薬であるタモキシフェン、スチルベストロルその他の各種ホルモン、アザチオプリンその他の免疫抑制剤等が使用されている。

こうした薬剤は、単独で使用されることもあり、併用されることもあるが、単独薬を持続的に投与するよりも、間欠的に併用する方が高い効果を示すことが多い。

しかし、上記の薬物は、癌細胞に対してある程度の選択作用を示すとはいえ、骨髄、胃腸管上皮、毛嚢等の増殖の速い正常細胞に対してもダメージが大きく、副作用が問題とされている。

一方で、癌細胞の増殖のメカニズムには、原発巣から周辺組織への浸潤と、原発巣で増殖した癌細胞の一部が血管壁をすり抜け、血流に乗って他の部位へ移動する転移とが知られている。
このため、癌細胞に対する細胞毒性を有するだけでなく、このような癌細胞の浸潤阻害活性を有していれば、抗癌剤として有用である。

さらに、癌細胞の発生及び増殖には、スーパーオキサイドが関与するといわれており、スーパーオキサイドを含むフリーラジカルを消去できれば、抗癌剤としてさらに有用なものとなり得る。
したがって、細胞毒性活性の他、癌細胞の浸潤阻害活性やスーパーオキサイド消去活性を有する化合物に対する、高い要請があった。

本発明者らは、以上のような状況の下で、上記のような活性を示す新規化合物を産生するStreptomyces属に属する新規微生物を見出し、本願発明を完成したものである。

すなわち、本発明は、特許生物寄託センターに寄託番号ＮＩＴＥＰ−６３０として寄託されたストレプトミセス（Streptomyces）属に属する新規微生物である。

また、本発明は、微生物を所定の条件で培養する培養工程を備え、下記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物を同時並行で産生させる、化合物の製造方法である。

（削除）

ここで、前記所定の培養工程は、上記微生物を、28〜32℃にて数日間、本培養する本培養工程を備えることが好ましい。また、前記本培養は、150〜250rpmで行う振蘯培養であることが好ましい。

また、前記所定の培養工程は、前記本培養に先立って、前記本培養工程とは異なる培地に接種して、28〜32℃の温度範囲で３〜５日間前培養する、前培養工程をさらに備えることが好ましい。また、前記前培養は、150〜250rpmで行う振蘯培養であることが好ましい。

本発明の別の態様は、上記の製造方法で製造された上記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物からなる群から選ばれる化合物、生理学的に許容されるそれらの塩、及びそれらの水和物からなる群から選ばれる、少なくとも１つを有効成分とする抗癌剤である。

（削除）

本発明の別の態様は、上記の製造方法で製造された上記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物、生理学的に許容されるそれらの塩、及びそれらの水和物からなる群から選ばれる、いずれかを有効成分とする、癌細胞の周辺組織浸潤阻害剤である。

本発明の更に別の態様は、上記の方法で製造された上記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物、生理学的に許容されるそれらの塩、及びそれらの水和物からなる群から選ばれる、少なくとも１つを有効成分とする、フリーラジカル消去剤である。

また、本発明の別の態様は、上記の方法で製造された、癌細胞の周辺組織浸潤活性及びフリーラジカル消去活性を有する上記式（Ｉ）で表わされる化合物である。

本発明において、上述したストレプトミセス（Streptomyces）属に属する新規微生物は、上記式（Ｉ）又は（II）で表される新規化合物を産生する。そして、上記新規化合物は、癌細胞に対する細胞傷害活性、癌細胞の周辺組織浸潤阻害活性（基底膜浸潤阻害活性）、及び抗菌性を有する。

図１は、ストレプトミセス属に属する新規微生物、TP-A0807の走査型電子顕微鏡写真である。図２は、本発明の新規化合物をＨＰＬＣに供したときのクロマトグラムである。図３は、本発明の１実施形態に係る化合物BG32-4-AのＨＭＢＣ法のＤＱＦＣＯＳＹに基づく構造を示す図である。図４は、本発明の１実施形態に係る化合物BG32-4-BのＨＭＢＣ法のＤＱＦＣＯＳＹに基づく構造を示す図である。図５は、本発明の１実施形態に係る化合物BG32-4-CのＨＭＢＣ法のＤＦＱＣＯＳＹに基づく構造を示す図である。図６Ａは、標準のＬ−セリン及びＤ−セリンのＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトグラムである。図６Ｂは、本発明の１実施形態に係る化合物BG32-4-Aの酸加水分解物のＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトグラムである。図６Ｃは、標準のＬ−セリン及びＤ−セリンのＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトグラムである。図６Ｄは、本発明の１実施形態に係る化合物BG32-4-Bの酸加水分解物のＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトグラムである。図６Ｅは、本発明の１実施形態に係る化合物BG32-4-Cの酸加水分解物のＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトグラムである。

本発明に係るストレプトミセス属に属する新規微生物（ＴＰ−Ａ０８７４株）は、以下のようにして単離する。
まず、生ゴミ処理物を滅菌シャーレ上で風乾後、乳鉢で細かく粉砕し、所定の培地に懸濁させる。ついで、室温にて静置し、順次１０倍希釈を行って試料を調製する。生ゴミ処理物としては、例えば、事業所系の生ゴミ、動物残渣・牛糞・魚腸骨、家庭からの生ゴミ、野菜残渣・魚残渣その他の各種生ゴミ由来の堆肥を使用することができる。

所定の培地としては、例えば、ＹＳ培地等を使用することができ、これらの培地を用いて10倍希釈を行う。
次いで、平板培地上にこれらの試料を塗布し、恒温器中で培養し、平板上に出現したコロニーを採取することにより、菌を分離することができる。平板培地としては、例えば、Ｂｎ２培地、ＨＭＧ培地等を使用することができる。恒温器での培養は、約３０℃〜６４℃の間の所望の温度で行うことができる。

上記のようにして得られたストレプトミセス属に属する新規微生物は、形態学的には、ループ状の気菌糸と、表面が平滑な球形の胞子が５〜１０個連鎖した胞子とを有するものである。また、寒天培地における生育状態では、ＩＳＰ培地Ｎｏ.３（オートミール寒天培地、３２℃培養）、ＩＳＰ培地Ｎｏ.４（スターチ・無機塩寒天培地、３２℃培養）及びＩＳＰ培地Ｎｏ．７（チロシン寒天培地、３２℃培養）で良く増殖する。

一方、ＩＳＰ培地Ｎｏ.２（イースト・麦芽寒天培地、３２℃培養）では中程度の増殖が見られ、ＩＳＰ培地Ｎｏ.５（グリセリン・アスパラギン寒天培地、３２℃培養）では増殖は不良である。

上記のように特徴付けられる菌を、種母培地に接種して、例えば、約２８〜３２℃で３〜５日間振とう培養し、所定量の培地を他の培地に接種して数日間、上記の温度で振とう培養する。こうした種母培地としては、例えば、Ｖ−２２液体培地等を挙げることができ、V-22液体培地を使用することが好ましく、また、振とう培養は、例えば、１５０〜２５０ｒｐｍで行うことができ、約２００ｒｐｍで行うことが菌の生育の面から好ましい。

培養終了後、培養液を遠心して菌体と水相とを分け、菌体部分に有機溶媒を加えて抽出し、有機相を減圧濃縮する。ここで使用する有機溶媒は、後述するように、先に分けた水相と合わせてカラムクロマトグラフィーに供するため、水と相溶性があるものであることが好ましく、メタノール、エタノール等を使用することができる。
上記の減圧濃縮液と先の水相とを合わせ、カラムクロマトグラフィーに供する。

ここで使用するカラムクロマトグラフィーとしては、例えば、ダイヤイオン（Diaion HP-20、三菱化学（株）製）その他のカラムを使用することができるが、Diaion HP-20を使用することが分離効率の面から好ましい。
次に、吸着物質の溶出を行う溶離液を調製する。この溶出は、溶離液の極性を変えながら行うため、所定の割合で上記有機溶媒を含有する溶離液を数種類用意して、ステップグラジエント法によって行ってもよく、連続的な濃度勾配となるようグラジエント法で行ってもよい。

ステップグラジエント法による場合には、例えば、有機溶媒としてメタノールを使用し、蒸留水１００％、２０％メタノール水溶液、４０％メタノール水溶液、というように20％刻みにメタノールの量を増加させた溶離液を調製し、これらの溶離液を用いて順次溶出させることによって分画する。
各溶出画分を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に供して分画し、各画分に化合物が含まれるか否かを確認する。

ここで使用するＨＰＬＣ用カラムとしては、例えば、COSMOSIL 5C18-AR-II Waters 4.6ｘ250mm（nacalai tesque 社製）、cadenza CD-C18 75ｘ4.6mm（Imtakt社製）、MICROSORB-MV 75ｘ4.6mm（RAININ INSTRUMENT COMPANY INC.製）等を使用することができ、MICROSORB-MV 75ｘ4.6mmを使用することが好ましい。

化合物の存在が認められた画分をそれぞれ減圧濃縮し、この濃縮液を凍結乾燥することにより、本発明の化合物の粗精製物を得ることができる。

次いで、上記各粗精製物を逆相ＨＰＬＣに供し、それぞれの精製物を得ることができる。精製用のカラムとしては、例えば、Waters Xterra（登録商標）RP₁₈（日本ウォーターズ（株）製）、COSMOSIL 5C18-AR-II Waters 20ｘ250mm（nacalai tesque社製）、cadenza CD-C18 250ｘ20mm（Imtakt社製）等を挙げることができ、ピークの分離の良さの面から、Waters Xterra RP₁₈を使用することが好ましい。
以上のようにして、本発明の新規化合物を得ることができる。これらの化合物を公知の方法に従って処理し、所望の塩や水和物を得ることができる。

また、本発明は、上述した方法で得られた下記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物、それらの誘導体、生理学的に許容されるそれらの塩、及びそれらの水和物からなる群から選ばれる、少なくとも１つを有効成分とする抗癌剤である。

（削除）

また、本発明の抗癌剤は、上記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物、生理学的に許容されるそれらの塩、及びそれらの水和物からなる群から選ばれる、いずれかを有効成分として含有するものであることが、抗癌活性に加えて、後述する基底膜浸潤阻害活性及びフリーラジカル消去活性を有することから、さらに好ましい。

生理学的に許容されるそれらの塩としては、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、炭酸塩等を挙げることができる。また、それらの水和物としては、一水塩、二水塩等を挙げることができる。

本発明はさらにまた、上記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物、生理学的に許容されるそれらの塩、及びそれらの水和物からなる群から選ばれる、いずれかを有効成分とする、癌細胞の周辺組織浸潤阻害剤である。

本明細書中において、「癌細胞の周辺組織」とは、増殖した癌細胞と隣接する組織及び血管壁をいうものとする。また、「浸潤」とは、隣接する正常組織へ癌細胞（悪性新生物）が入り込んで局所的に広がることをいい、悪性新生物が上皮性腫瘍の場合には、その直下にある上皮基底膜に入り込むことをいう。さらに、癌細胞が、血管の外膜、中膜、及び内膜を通過することも、「浸潤」に含まれるものとする。

（削除）

さらに、前記有効成分が、上述した式（Ｉ）〜（III）で表されるいずれかの化合物、生理学的に許容されるそれらの塩、及びそれらの水和物からなる群から選ばれるものであることが、癌細胞の周辺組織への浸潤を阻害する一層高い活性が示されることに加え、上記抗癌活性及び後述するフリーラジカル消去活性をもあわせて発揮することから、さらに好ましい。

本発明はまた、上記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物、生理学的に許容されるそれらの塩、及びそれらの水和物からなる群から選ばれる、いずれかを有効成分とする、フリーラジカル消去剤である。
本明細書中、「フリーラジカル」は不対電子を有する分子種をいい、活性酸素も含む。一般に、活性酸素には、スーパーオキシドアニオン及び一重項酸素、過酸化水素等が含まれるため、本明細書中においては、これらも「フリーラジカル」に含まれるものとなる。

（削除）

さらに、前記有効成分が、上述した式（Ｉ）〜（III）で表されるいずれかの化合物、生理学的に許容されるそれらの塩、及びそれらの水和物からなる群から選ばれるものであることが、さらに高いフリーラジカル消去活性が発揮されるとともに、上述した抗癌活性と癌細胞の周辺組織への浸潤を阻害する活性とをあわせて発揮することから、さらに好ましい。

ここで、上記の抗癌剤中における前記有効成分の含量は、製剤の１用量当たり０．１〜１，０００ｍｇであることが好ましく、０．５〜５００ｍｇであることがより好ましい。

また、上記抗癌剤は、経口投与、静脈内投与、又は腹腔内投与が可能な剤形であることが好ましく、錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、トローチ剤、及び液剤からなる群から選ばれるものであることが好ましい。
上記の化合物を有効成分する抗癌剤は、上記以外の粉剤その他の固形剤としてもよく、注射剤用の凍結乾燥製剤、リポソーム剤等、各種の剤形とすることもできる。

上述したように製造したこれらの化合物、生理学的に許容されるそれらの塩、及びそれらの水和物を用いて製剤を製造する場合には、常法に従って、粉末とした後に散剤としてもよく、公知の賦形剤、崩壊剤等とともに打錠し、錠剤、トローチ剤等にしてもよい。錠剤の場合には、必要に応じて白糖その他の糖等を用いて、単層又は複数の層でコーティングを行い、糖衣錠としてもよい。また、矯味・矯臭剤を添加してもよい。

また、これらを適当な溶媒に溶解し、常法に従って乾燥させ、顆粒剤としてもよい。さらに、上記のような粉剤、顆粒剤を所定の大きさの軟カプセル又は硬カプセルに充填し、カプセル剤とすることもできる。

液剤とする場合には、必要に応じて、ｐＨ調整剤、分散剤等を添加することもできる。リポソーム剤とする場合には、適当なリン脂質を選択し、溶液中でこれらとともに懸濁することによって、製造することができる。

上記の癌細胞の周辺組織浸潤阻害剤中における前記有効成分の含量は、製剤の１用量当たり０．０５〜８００ｍｇであることが好ましく、０．１〜４００ｍｇであることがより好ましい。

また、上記癌細胞の周辺組織浸潤阻害剤は、経口投与、静脈内投与、又は腹腔内投与が可能な剤形であることが好ましく、錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、トローチ剤、及び液剤からなる群から選ばれるものであることが好ましい。
上記の化合物を有効成分する周辺組織浸潤阻害剤は、上記以外の粉剤その他の固形剤としてもよく、注射剤用の凍結乾燥製剤、リポソーム剤その他の各種の剤形とすることができる。こうした製剤は、上記と同様にして行うことができる。

ここで、上記のフリーラジカル消去剤中における前記有効成分の含量は、製剤の１用量当たり０．０１〜１００ｍｇであることが好ましく、０．０２〜３００ｍｇであることがより好ましい。

また、上記フリーラジカル消去剤は、経口投与、静脈内投与、又は腹腔内投与が可能な剤形であることが好ましく、錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、トローチ剤、及び液剤からなる群から選ばれるものであることが好ましい。
上記の化合物を有効成分するフリーラジカル消去剤は、上記以外の粉剤その他の固形剤としてもよく、注射剤用の凍結乾燥製剤、リポソーム剤その他の各種の剤形とすることができる。こうした製剤は、上記と同様にして行うことができる。

（実施例１）菌の探索と分離・同定
（１−１）試薬等
以下の試薬を使用した。
塩化カルシウム、炭酸カルシウム、ブドウ糖、グリセロール、硫酸マグネシウム７水和物（MgSO₄・7H₂O）、硫酸鉄７水和物（FeSO₄・7H₂O）、塩化マンガン（MnCl₂SO₄・4H₂O）４水和物、硫酸ニッケル４水和物（NiSO₄・4H₂O）、硫酸亜鉛４水和物（ZnSO₄・4H₂O）、水酸化ナトリウム、塩化ナトリウム、ＮＺケース（NZ Case）、NZアミン（NZ Amine）、溶性でんぷん（Soluble Starch）、メタノール、アセトン、アセトニトリル、リン酸水素２カリウム（K₂HPO₄）、リン酸水素２ナトリウム12水和物（Na₂HPO₄・12H₂O）、リン酸水素２ナトリウム、ギ酸、塩酸、没食子酸、1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル（DPPH）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ゲランガム（Gellan gum）、Cell Counting Kit及び寒天は、和光純薬工業（株）より購入した。

トリプトンはDifco Laboratoriesより、肉エキス及び酵母エキスは極東製薬工業（株）より購入した。Ｄ−セリン及びＤＬ−セリンは、シグマ−アルドリッチジャパン（株）（SIGMA-ALDRICH Japan K.K.）より、Ｌ−セリンは日本理化学（株）より購入した。
ファーマメディア（Pharmamedia）はTraders Protein社より購入した。
NMR用メタノールは関東化学（株）より、また、NMR用DMSOはセティ（株）より、それぞれ購入した。

ウシ胎児血清（ＦＢＳ）はJRH Biosciences社より、RPMI1640培地はInvitrogen-Gibco社より、それぞれ購入した。動物細胞は、富山大学和漢薬研究所病態生理学研究室にて済木育夫教授らにより樹立されたマウス大腸癌由来細胞Colon 26 L-5を使用した。MOPSは、同仁化学（株）より購入し、ヘマトキシリン及びエオシンは、武藤化学（株）より購入した。

（１−２）菌の探索
探索源として、下記表１に示す堆肥を使用した。これらの堆肥を滅菌シャーレ上で風乾し、乾燥後の堆肥を乳鉢で細かく粉砕した。

粉砕した堆肥１ｇを、10mLのＹＳ培地に懸濁し、ボルテックスミキサーで１分間攪拌した後に、室温にて30分間静置した。ＹＳ培地の組成を下記表２に示す。

静置30分後、この懸濁液をＹＳ培地で、順次10倍に段階希釈した。適当な濃度に調整した懸濁液0.1mLをＢｎ２平板培地又はＨＭＧ平板培地２枚に、コンラージ棒にて塗布し、各平板培地を表１に示す温度に設定した恒温器（恒温器：ADVANTEC INCUBATOR CI-612）に入れ、２〜４週間培養し、出現したコロニーから釣菌し、菌を単離した。上記の試料から、約60株が得られた。
下記の表３及び４に、Ｂｎ２培地及びＨＭＧ培地の組成を示す。

*1,*2：詳細は、下記表５及び表６に示す。

ここで、上記ＨＭＧ培地で使用した金属溶液の組成及びフミン酸溶液の組成を下記表５及び６に示す。

（１−３）菌の同定
以上のようにして得られた菌株の分類学的性質を、「放線菌の分類と同定」（日本放線菌学会編、日本学会事務センター刊 2001年２月）に従って決定した。
菌の同定に使用したISP（International Streptomyces Project）培地Ｎｏ.２及び同Ｎｏ.４は、DIFCO社より購入した。また、ISP培地Ｎｏ.３、同Ｎｏ.５、及び同Ｎｏ.７培地としては、日本放線菌学会規格放線菌培地ダイゴＮｏ.３、Ｎｏ.５、及び同Ｎｏ.７を日本製薬（株）より購入した。
色調は標準として、『新色名事典』（財団法人日本色彩研究所 1987年）を用いて決定し、色標名とともに括弧内にそのコードを併せて記した。観察は32℃、４週間目の各種培地における結果である。

本菌株の分類学的性質は下記の通りであった。
（１）形態学的性質
ループ状の気菌糸と、表面が平滑な球形の胞子が５〜10個連鎖した胞子とを有する（図参照）。

（２）寒天培地における生育状態
（ａ）ＩＳＰ培地Ｎｏ.３（オートミール寒天培地、32℃培養）で良く増殖した。灰みの黄緑色の気中菌糸を着生し、可溶性色素は認められなかった。基底菌糸裏面は灰みの黄色を呈した。
（ｂ）ＩＳＰ培地Ｎｏ.４（スターチ・無機塩寒天培地、32℃培養）で良く増殖した。白色の気中菌糸を着生し、可溶性色素は認められなかった。基底菌糸裏面は淡い黄色を呈した。
（ｃ）ＩＳＰ培地Ｎｏ.７（チロシン寒天培地、32℃培養）で良く増殖した。灰みの白色の気中菌糸を着生し、明るい橙色の可溶性色素を認めた。基底菌糸裏面は淡い赤みの黄色を呈した。

（ｄ）ＩＳＰ培地Ｎｏ.２（イースト・麦芽寒天培地、32℃培養）で中程度の増殖が見られた。灰みの黄緑色の気中菌糸を着生し、可溶性色素は認められず、基底菌糸裏面は灰みの黄色を呈した。
（ｅ）ＩＳＰ培地Ｎｏ.５（グリセリン・アスパラギン寒天培地、32℃培養）では、増殖は不良であった。白色の気中菌糸を着生し、可溶性色素は認められなかった。基底菌糸裏面も白色を呈した。
TP-A0874菌株の各種寒天培地上の生育状態を表７にまとめた。

（３）生理学的性質
（ａ）ベネット寒天培地（肉エキス0.1％、酵母エキス0.1％、NZアミン0.2％、ブドウ糖1.0％、及び寒天2.0％）において15〜40℃で増殖し、約30℃付近で良好に増殖した。
（ｂ）メラニン様色素生成は陽性である。
（ｃ）利用可能な炭素源は、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンニトールである。一方、利用可能でない糖は、Ｌ−アラビノース、スクロース、Ｌ−ラムノース、ラフィノース、ｍｙｏ−イノシトールである。
（ｄ）菌体分析の結果、全菌体加水分解物中のジアミノピメリン酸はＬＬ型を含み、グリシンを含むことが明らかになった。全菌体糖としては、ガラクトースとリボースとを含む。
以上の分類学的性質を示したことから、TP-A0874株をStreptomyces sp.と同定した。

（１−４）二次代謝産物の探索
TP-A0874株を、100ｍLの種母培地であるV-22液体培地（溶性デンプン1.0％、ブドウ糖0.5％、NZケース0.3％、酵母エキス0.2％、トリプトン0.5％、K₂HPO₄ 0.1％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、CaCO₃ 0.3％）が入った500mLのＫ型フラスコに接種し、200rpm、30℃にて４日間、室温にて振とう培養した（振とう機：サンキ精機（株）RGS-200R）。

その後、100mLの生産培地Ａ-3M（ブドウ糖0.5％、グリセロール2.0％、溶性デンプン2.0％、ファーマメディア（Pharmamedia）1.5％、酵母エキス0.3％、Diaion HP-20 1.0％）の入った500mLのＫ型フラスコ20個に、上記の種母培養液を３mLずつ移植し、200rpm、30℃にて６日間振とう培養した。

培養終了後、上記のフラスコから集めた２Ｌの培養液を5,000回転で10分間遠心し（遠心機：HITACHI himac CR20、ロータ：HITACHI R12A、いずれも日立製作所（株）製）、菌体と水相とを分離した。
次いで、菌体部分に１Ｌのメタノールを加え、３時間、EYELA NZ（カタログ番号NZ1200 TOKYO RIKAKIKAI社製）で攪拌して抽出するという操作を２回繰り返し、再度、上記のロータを用いて、5,000回転で10分間遠心し、菌体部分とメタノール相とを分離し、減圧濃縮した。

この濃縮抽出液と先の水相とを合わせ、ダイヤイオン（Diaion HP-20、三菱化学（株）製、300mL）を充填したカラムを用いるカラムクロマトグラフィーに供した。カラムに吸着した物質を、500ｍLの蒸留水、500ｍLの20％メタノール水溶液、500ｍLの40％メタノール水溶液、500ｍLの60％メタノール水溶液、500ｍLの80％メタノール水溶液、500ｍLの100％メタノール、次いで500ｍLの100％アセトンをこの順番で用いて、順次溶出した。

各溶出画分を、HPLCを用いて下記の条件で分析した結果、40％メタノール画分及び60％メタノール画分、80％メタノール画分、100％メタノール画分に、TP-A0874が産生した化合物が存在することが確認された。

＜HPLC条件＞
装置：HEWLETTPACKARD 1090
溶離液：アセトニトリル：0.15％KH₂PO₄水溶液(pH3.5)＝15：85〜85：15
流速：1.2mL/min
カラム：MICROSORB-MV 75ｘ4.6mm
カラム温度：室温

40％メタノール画分及び60％メタノール画分に存在する化合物をBG32-4-C、80％メタノール画分に存在する化合物をBG32-4-B、100％メタノール画分に存在する化合物をBG32-4-Aとそれぞれ命名した。

次いで、これらの画分をロータリーエバポレータ（ROTARY EVAPORATOR REN-1000, IWAKI製)を用いてそれぞれ減圧濃縮し、得られた水溶液を凍結乾燥し、BG32-4-Aを含む粗精製物（1.7g）、BG32-4-Bを含む粗精製物（200mg）、BG32-4-Cを含む粗精製物（1.0g）を得た。

次いで、上記の各粗精製物をHPLC用逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（カラム：Waters Xterra^TM RP₁₈、７μｍ、19ｘ300mm）を用いて、以下の条件で分取クロマトグラフィーを行い、分画した。

＜HPLC条件＞
装置：島津製作所製
システムコントローラ：SCL-10A VP
インジェクタ：SIL-10A
ポンプ：LC-8A
検出機：SPD-M10A VP
溶出溶媒：メタノール：0.1％ギ酸水溶液＝30：70〜80：20
流速：15mL/min
カラム：Waters Xterra RP₁₈
カラム温度：室温

分取したそれぞれの画分をロータリーエバポレータ（ROTARY EVAPORATOR REN-1000, IWAKI製)を用いて減圧濃縮後、凍結乾燥して、BG32-4-A（13mg）、BG32-4-B（20mg）及びBG32-4-C（24mg）を得た。
このHPLCのクロマトグラムを図２に示す。

（実施例２）菌の産生化合物の構造決定
次に、実施例１で得られた各粗精製物の構造決定を行った。構造決定のために、核磁気共鳴吸収（NMR）、紫外吸光（UV）分析、赤外吸収（IR）分析、質量分析（ＭS）、旋光度測定を行った。以下の機器を使用して分析を行い、ＵＶ及びＩＲスペクトラムの結果と合わせて、構造決定を行った。

^１Ｈ及び ¹³ＣＮＭＲ：BRUKER ULTRASHIELD^TM 500（500MHz）
ＵＶ：HITACHI U-3210
ＩＲ：PerkinElmer Spectrum 100
ＭＳ：BRUKER DALTONICOS micro TOF
旋光度：JASCO P-1030

（２−１）BG32-4-Aの構造決定と物性
^１H-NMRの結果、メチル基由来のシグナルが１個、メチン及びメチレンのシグナルが９プロトン分、芳香族水素が３プロトン分観測された。¹³C-NMRの結果、０〜70ppmの高磁場にシグナルが６個、芳香族炭素のシグナルが６個、カルボニル炭素のシグナルが２個、計14個のシグナルが観測された（CD₃OD、30℃）。
BG32-4-AのNMRデータを下記表８に示す。

次いで、炭素と水素の直接結合をHMQC（Heteronuclear Multiple Quantum Coherence）により決定した。COSYにより図２の太線で示すプロトン間のつながりを決定した。更に、HMBC及びNOESYスペクトルを解析することによって図３に示す相関が確認できた。以上の結果からBG32-4-Aの平面構造を決定した。
更に、HMBC（Heteronuclear Multiple-Bond Correlation)法）及びNOESY(nuclear Overhauser enhancement and exchange spectroscopy）スペクトルを解析することによって、図３に示す相関が確認できた。以上の結果からBG32-4-Aの平面構造を決定した。
BG32-4-Aの物理化学的性質を表９に示す。

上記表９におけるHPLC条件は下記の通りである。
カラム：MICROSORB-MV^TM (75ｘi.d. 4.6mm、バリアン・テクノロジーズ・ジャパン・リミテッド)
移動相：CH₃CN:0.15％ KH₂PO₄(pH3.5)(15:85〜85:15)
流速:1.2mL/min
温度：30℃
検出:UV 254nm

BG32-4-Aは淡黄色の油状物質として得られ、紫外吸収スペクトルでは、210nm、247nm及び318nmに極大吸収を示した。赤外スペクトルでは3356cm^-1にOH伸縮振動に由来する吸収帯が観測された。
また、質量分析では、高分解能ESI-TOF-MSにより[M＋Na]^＋がm/z 321.1101に検出された。このため、分子式をC₁₄H₁₉NO₆と決定した。

（２−２）BG32-4-Bの構造決定と物性
¹H-NMRでは、メチンとメチレンのシグナルが９プロトン分、芳香族水素が９プロトン分、NHプロトンが３プロトン分観測された。¹³C-NMRでは、0〜70ppmの高磁場にシグナルが６個、芳香族炭素のシグナルが18個、カルボニル炭素のシグナルが６個、計30個のシグナルが観測された（DMSO-d₆,30℃）。
BG32-4-BのNMRデータを下記表10に示す。

次いで、炭素と水素の直接結合をHMQCにより決定した。COSYにより図４の太線で示すプロトン間のつながりを決定した。更に、HMBC及びNOESYスペクトルを解析することによって図４に示す相関が確認できた。以上の結果からBG32-4-Bの平面構造を決定した。
BG32-4-Bの物理化学的性質を表11に示す。

上記表11におけるHPLC条件は、下記の通りである。
カラム：MICROSORB-MV^TM (75ｘ4.6mm)
移動相：CH₃CN:0.15％KH₂PO₄(pH3.5)(15:85〜85:15)
流速：1.2mL/min
温度：30℃
検出:UV 254nm

BG32-4-Bは淡黄色の油状物質として得られた。紫外吸収スペクトルでは209nm、248nm及び318nmに極大吸収を示した。赤外スペクトルでは3355cm^-1にOH伸縮振動に由来する吸収帯が観測された。
また、質量分析では高分解能ESI-TOF-MSにより、[M-H]^-がm/z 686.1468に検出された。このため、分子式をC₃₀H₂₉N₃O₁₆と決定した。

（２−３）BG32-4-Cの構造決定と物性
¹H-NMRでは、メチンとメチレンのシグナルが６プロトン分、芳香族水素が６プロトン分、NHプロトンが２プロトン分観測された。¹³C-NMRでは、0〜70ppmの高磁場にシグナルが４個、芳香族炭素のシグナルが12個、カルボニル炭素のシグナルが４個、計20個のシグナルが観測された（DMSO-d₆,30℃）。
BG32-4-CのNMRデータを下記表12に示す。

次いで、炭素と水素の直接結合をHMQCにより決定した。COSYにより図５の太線で示すプロトン間のつながりを決定した。更に、HMBC及びNOESYスペクトルを解析することによって図５に示す相関が確認できた。以上の結果からBG32-4-Cの平面構造を決定した。
BG32-4-Cの物理化学的性質を下記表13に示す。

上記表13におけるHPLC条件は下記の通りである。
カラム：MICROSORB-MV^TM (75ｘ4.6mm)
移動相：CH₃CN:0.15％KH₂PO₄ (pH3.5)(15:85〜85:15)
流速:1.2mL/min
温度：30℃
検出:ＵＶ 254nm

BG32-4-Cは淡黄色の油状物質として得られた。紫外吸収スペクトルでは208nm、248nm及び315nmに極大吸収を持つ。赤外スペクトルでは3260cm^-1にOH伸縮振動に由来する吸収帯が観測された。
また、質量分析では高分解能ESI-TOF-MSにより、[M-H]^- がm/z 463.0988に検出された。このため、分子式をC₂₀H₂₀N₂O₁₁と決定した。

（２−４）絶対配置の決定
上記（２−１）〜（２−３）で構造決定を行ったBG32-4-A、BG32-4-B及びBG32-4-Cの構造中のセリンの立体構造を調べるために、HPLCによるセリンの分析を行った。
BG32-4-A、BG32-4-B及びBG32-4-Cをそれぞれ１mgずつスクリューキャップ付バイアルに取り、これらのバイアルにそれぞれ500μLの６Ｎ塩酸を加えた。その後、130℃で４時間、加水分解を行った。

放冷後、各バイアルの内容物を濃縮乾固し、得られた酸加水分解物について、下記の条件でHPLC分析を行い、含まれるセリンの分析を行った。結果を図６Ａ〜６Ｅに示す。

HPLC条件
カラム：Sumichiral OA-5000 (4.0 mmφｘ150 mm，住化分析センター)
移動層：１mM CuSO₄水溶液
流速：0.7 mL/min
温度：30℃
検出：UV 254nm

その結果、標準のＬ−セリン（図６Ａ）と同じ保持時間に、BG32-4-Aの酸化水分解物（図６Ｂ）のピークが検出された。また、BG32-4-Bの酸加水分解物（図６Ｄ）及びBG32-4-Cの酸化水分解物（図６Ｅ）のピークも、標準のＬ−セリン（図６Ｃ）と同じ保持時間に、検出された。
このため、BG32-4-A及びBG32-4-B、BG32-4-Cの構造中のセリンは、Ｌ体であることが明らかになった。

（実施例３）
実施例２で構造決定を行ったBG32-4-A、BG32-4-B及びBG32-4-Cの生物学的活性を検討した。
（３−１）細胞傷害活性
WST-1細胞を使用するCell Counting Kit（和光純薬工業（株））を用いて、細胞傷害活性の測定を行った。10％牛胎児血清を含有するRPMI培地に、マウス大腸癌由来Colon 26Ｌ−５細胞を10ｘ10⁴cells/mLになるように懸濁した。
DMSOで溶解した上記の化合物を10〜1000μg/mLでこの細胞懸濁液に添加し、96ウェルマイクロプレートに、100μLずつ加えた（化合物の終濃度は、0.1〜10μg/mL）。

５％CO₂インキュベータ中にて、37℃で24時間培養した後に、各ウェルにWST-1（和光純薬Cell Counting Kit）を10μLずつ加え、37℃でさらに２時間培養した。
その後、ウェルプレートリーダー（サンライズクラシック、和光純薬工業（株））を用いて、450nmの吸光強度を測定した。コントロールにはDMSOのみを添加し、コントロールを100％としたときの各サンプルの細胞傷害活性を測定した。
その結果、BG32-4-Aは３μg/mLで、BG32-4-B及びBG32-4-Cはそれぞれ10μg/mLで細胞傷害活性が見られなかった。

（３−２）基底膜浸潤阻害活性
次に、BG32-4-A、BG32-4-B及びBG32-4-Cの基底膜浸潤阻害活性の測定を、membrane invasion culture system (MICS, Hendrix et al (1985) Clin. Exp. Metastasis 3:221-223)(癌と化学療法 31(4)：512−517 2004)を用いて行った。

トランスウェル・カルチャー・チャンバー（Transwell cell culture chamber, Corning Coster社製）に、メンブランフィルタ（孔径8.0μm; Nucleopore社製）を接着し、メンブランフィルタの外側に１μｇのフィブロネクチン（Iwaki社製）をコーティングし、クリーンベンチ内で２〜３時間乾燥した。

その後、メンブレンフィルタの内側に、マトリゲル（Matrigel、BD Science社製）１μｇをコーティングし、クリーンベンチ内で終夜乾燥した。24ウェルプレートの各ウェルに、DMSOに溶解した上記の化合物をそれぞれ試料として加え、600μLの0.1％牛血清アルブミン（BSA）含有RPMI1640培地を各ウェルに入れた。
マウス大腸癌由来Colon 26 Ｌ−５を４ｘ10⁴ cells/100μLとなるよう同培地に加え、DMSOで溶解したサンプルを、24ウェルプレートの各ウェルにおける最終濃度になるよう加えた。この細胞懸濁液を、フィブロネクチンとマトリゲルとを上記のようにしてコーティングしたトランスウェル・チャンバー内に、100μLずつ分注した。

チャンバーを24ウェルプレートに設置し、５％CO₂インキュベータ中で37℃にて８時間培養した。培養終了後、設置したチャンバーを24ウェルプレートから外し、エタノールに１分間つけて、細胞を固定した。次いで、ヘマトキシリンに３分間、エオシンに30秒間、それぞれ浸漬して、細胞を染色した。水洗後、綿棒でチャンバー内をふき取り、染色液が付着しなかった細胞を除去した。

このようにして得られたメンブラン表面を乾燥させ、光学顕微鏡でメンブランの中心とその周辺４視野の計５視野について、基底膜バリアーを破って浸潤した癌細胞の数をカウントした。その平均値を、基底膜の浸潤阻害活性の指標とした。
コントロールとなるウェルにはDMSOのみを添加し、コントロールを100％としたときの各試料の各濃度における基底膜浸潤阻害活性を測定した。

その結果、最終濃度が1.0μg/mLのときの各化合物の癌細胞の浸潤阻害率は、BG32-4-Aが38.2％、BG32-4-Bが44.1％、BG32-4-Cが38.9％であった。BG32-4-Aは3μg/mLで、BG32-4-BとBG32-4-Cは10μg/mLで細胞傷害活性を示さなかった。
以上より、細胞傷害活性を示さない濃度領域で、これらの化合物が癌細胞の浸潤阻害活性を有することが示された。

（３−３）フリーラジカル消去能の検討
DPPH法を用いて、BG32-4-A、BG32-4-B及びBG32-4-Cのそれぞれについて、フリーラジカル消去能の測定を行った。この試験においては、高いフリーラジカル消去能を持つ没食子酸を対照として使用した。

測定試料としては、100μLの上記３種類の化合物又は没食子酸、100μLのDPPH溶液（メタノール溶液、20mg/10mL）及び4.8mLのメタノールを混合して総量を５ｍLとなるように調製し、これらを使用した。
また、ブランクとしては、100μLのDPPH溶液（20mg/10mLメタノール溶液）と4.9mLのメタノールとの混合物を使用した。コントロールとしては、100μLのビタミンＣの水溶液又はビタミンＥのメタノール溶液と、4.9mLのメタノールとの混合物を使用した。

それぞれの溶液について、517nmで吸光度を測定した。結果を表14示す。
測定条件は以下の通りである。
吸光高度計：Hitachi U-3210
セル：Quartz cell F10-UV-10.00 (GL Sciences Inc.)
温度：室温

上記表14より、BG32-4-AはコントロールのビタミンＣ又はＥと同程度の濃度でフリーラジカルを50％消去することが示された。また、BG32-4-BとBG32-4-Cとは、コントロールの没食子酸と同程度の濃度でフリーラジカルを50％消去することが示された。

本発明の微生物は、有用な二次代謝産物を産生し、医薬の分野において有用である。

Claims

特許生物寄託センターに寄託番号ＮＩＴＥＰ−６３０として寄託されたストレプトミセス（Streptomyces）属に属する新規微生物。
請求項１に記載の微生物を所定の条件で培養する培養工程を備え、下記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物を同時並行で産生させる、化合物の製造方法。
前記所定の培養工程が、請求項１に記載の微生物を、28〜32℃にて数日間、本培養する本培養工程を備えることを特徴とする、請求項２に記載の化合物の製造方法。
前記本培養が、150〜250rpmで行う振蘯培養であることを特徴とする、請求項３に記載の化合物の製造方法。
前記所定の培養工程が、前記本培養に先立って、前記本培養工程とは異なる培地に接種して、28〜32℃の温度範囲で３〜５日間前培養する、前培養工程をさらに備えることを特徴とする、請求項３又は４に記載の化合物の製造方法。
前記前培養が、150〜250rpmで行う振蘯培養であることを特徴とする、請求項５に記載の化合物の製造方法。
請求項２〜６のいずれかに記載の製造方法で製造された下記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物からなる群から選ばれる化合物、生理学的に許容されるそれらの塩、及びそれらの水和物からなる群から選ばれる、少なくとも１つを有効成分とする抗癌剤。
請求項２〜６のいずれかに記載の製造方法で製造された下記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物からなる群から選ばれる化合物、生理学的に許容されるそれらの塩、及びそれらの水和物からなる群から選ばれる、少なくとも１つを有効成分とする癌細胞の周辺組織浸潤阻害剤。
請求項２〜６のいずれかに記載の方法で製造された下記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物からなる群から選ばれる化合物、生理学的に許容されるそれらの塩、及びそれらの水和物からなる群から選ばれる、少なくとも１つを有効成分とするフリーラジカル消去剤。
請求項２〜６のいずれかに記載の方法で製造された、癌細胞の周辺組織浸潤阻害活性及びフリーラジカル消去活性を有する下記式（Ｉ）で表される化合物。