JP5510799B2 - チロシナーゼ阻害剤 - Google Patents
チロシナーゼ阻害剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5510799B2 JP5510799B2 JP2010018061A JP2010018061A JP5510799B2 JP 5510799 B2 JP5510799 B2 JP 5510799B2 JP 2010018061 A JP2010018061 A JP 2010018061A JP 2010018061 A JP2010018061 A JP 2010018061A JP 5510799 B2 JP5510799 B2 JP 5510799B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- general formula
- hydroxyindole
- represented
- compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Cosmetics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Indole Compounds (AREA)
Description
すなわち本発明は、以下の(1)〜(7)に示すとおりである。
(2)一般式(I)で示される化合物が式(2)で示される6−ヒドロキシインドールであることを特徴とする、上記(1)に記載の薬剤。
(N−(3,4−ジヒドロキシベンゾイル)−7−ヒドロキシトリプタミン(R1:水素、R2:水酸基)
(N−(3,5−ジヒドロキシベンゾイル)−7−ヒドロキシトリプタミン(R1:水素、R2:水酸基)
(N−〔3−(3,4−ジヒドロキシフェニル)プロパノイル〕−7−ヒドロキシトリプタミン(R1:水素、R2:水酸基))
(N−〔3−(3,5−ジヒドロキシフェニル)プロパノイル〕−7−ヒドロキシトリプタミン(R1:水素、R2:水酸基))
6-ヒドロキシインドールと7-ヒドロキシインドールについては、髪染め染色剤成分等として盛んに利用されている(特開2006-1935、特開平6-92828、PCT Int. Appl. WO 2009068830、PCT Int. Appl. WO 9320794、PCT Int. Appl. WO 9302655、PCT Int. Appl. WO 2007137676、Eur. Pat. Appl. EP 462883、Fr. Demande FR 2923711)ものではあるが、毛髪の染色とはむしろ逆の、チロシナーゼ阻害作用を有することは、本発明において初めて見いだされたものである。
以下に本発明の実施例を示すが本発明はこれらにより限定されるものではない。
ヒトHMV-IIメラノーマ細胞株(大日本−住友製薬株式会社から購入)を15%の牛胎子血清を含むRPMI-1640培地で3日間培養後新鮮培地に交換し、2日間培養後テオフィリンを533μMになるように添加し、さらに3日間培養した。細胞をセルスクレーパーで集め、冷PBS溶液で洗浄後、遠心分離で集め、使用まで−85℃で保存した。この細胞を文献(Efdi M. et al., Biol. Pharm. Bull., 30, 1972 - 1974 (2007))の方法で超音波破砕し、12000 r.p.m.で10分間遠心分離し不溶分を除き遠心上清を得、これを酵素液として使用した。チロシナーゼ反応速度は前記非特許文献2の方法に基づき、L-DOPAを基質とし酵素を添加後37℃で5分間インキューベーションした前後における475nmの吸光度の増加から求めた。基質液は2.5 mMのL-DOPAを含む50 mMのリン酸緩衝液(pH 6.8)に試験化合物のエタノール溶液(0.3〜100 mM)10μl又はコントロールとしてエタノール10μlを混合した溶液であり、これに酵素液(50μl)を添加して反応を開始した。酵素量は通常コントロール反応において475 nmの吸光度の増加が5分間で0.1になる量とした。試験化合物存在下における酵素反応速度のコントロールに対する%を求め、これを試験化合物濃度に対してプロットした曲線からIC50値を求めた。また、100μMにおける相対反応速度(%)と100との差をこの濃度における阻害率(%)とした。さらに、マウスB16メラノーマ細胞株(理研セルバンクから購入)を用いて同様の実験を行なった。
ヒトHMV-IIメラノーマ細胞を96-wellのプレートに1ウェルあたり1.5×104個づつ0.2mlの培地とともに植え込んだ。培地は前記したところと同様である。1日間培養後各ウェルの培地を500μMのテオフィリンを含む新鮮培地0.2 mlづつと交換し、次いで6−ヒドロキシインドール(0.1〜10mM)又はコウジ酸(1〜30mM)のエタノール溶液ないしは純エタノールを2μlづつ各ウェルに添加し、3日間培養した。培地を吸引除去後、各ウェルを冷PBSの0.2mlづつで洗浄し、テトラゾリウム試薬(CellTiter 96、Promega社製)を用いて細胞生存率(コントロールに対する%)を測定した。一方、HMV-II細胞を12-wellのプレートに1ウェルあたり2×105個づつ2 mlの培地とともに植え込んだ。1日後40mMのテオフィリン水溶液を25μlづつ各ウェルに添加し、次いで6−ヒドロキシインドール(3〜100mM)又はコウジ酸(10〜300mM)のエタノール溶液ないしは純エタノールを2μlづつ各ウェルに添加し、3日間培養した。培地を吸引除去し、冷PBSを1 mlづつ各ウェルに入れ、セルスクレーパーで細胞をはがし各ウェルごとに0.5 ml容のエッペンドルフチューブに移し遠心分離で細胞を集めた。1N NaOHを0.2mlづつ各チューブに入れ、トミー精工製UR-20P型ソニケーターで細胞を超音波破砕した。この処理液の415 nmにおける吸光度をプレートリーダーで測定し、コントロールウェルの細胞を同様に処理して得た液の値との割合をメラニンの生成率(%)とした。
ヒトのケラチノサイトとメラノサイトの混合培養からなるヒト3次元皮膚モデル(クラボウ(株)製MEL-312-Bキット)を用い、キットのマニュアルに従って6−ヒドロキシインドールのメラニン抑制活性を試験した。4日間の前培養後1又は3mMの6−ヒドロキシインドールを含む水溶液を試験液として6日間培養したところ、通常標準とされる37mMアルブチン水溶液には及ばないものの、6−ヒドロキシインドール試験液のウェルではコントロールに比べて細胞の黒化が明らかに抑制されていることを確認した。顕微鏡写真を図1に示す。
6−ベンジルオキシトリプタミン(0.5硫酸塩、Toronto Research Chemicals Inc.製)にピリジンを含むDMF中で3,4-ジアセトキシベンゾイルクロライド又はO,O-ジアセチルカフェイン酸クロライドをカップリングさせ、次いでベンジル基とアセチル基をそれぞれ接触還元とヒドラジン処理で除去してN-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-6-ヒドロキシトリプタミン(5a)とN-[3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロパノイル]-6-ヒドロキシトリプタミン(6a)を合成した。それぞれの1H-NMRスペクトルは予想される構造に合致した。これらの化合物のチロシナーゼ阻害活性を前記と同様に測定した。ただし、6−ヒドロキシトリプタミンの試料溶液は微量の水を含むエタノール溶液で調製し、他の化合物はいずれもエタノール溶液とし、コントロールには純エタノールを用いた。結果を表3に示す。この結果から、ヒトHMV-II細胞のチロシナーゼに対して化合物(5a)と(6a)は6−ヒドロキシトリプタミンよりさらに強力な阻害活性を有することがわかる。
6−ベンジルオキシトリプタミン・ヘミスルフェート(Toronto Research Chemicals社製)の100 mgをジメチルホルムアミド(DMF)の5mlとピリジン2mlの混液に懸濁した。これに3,5−ジヒドロキシ安息香酸(3,5-DHBA)の100 mgとジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)の100 mgを溶かしたDMF溶液0.5 mlを添加した。この混合液に超音波をかけ(TOMY精工製UR-20P型Handy Sonicで5分照射)、次いで約1時間撹拌した。遠心分離により上清と沈殿に分け、上清には3,5-DHBAの200mgとDCCの400 mgを添加し、室温で撹拌を続けた。上記沈殿をTLCで調べると未反応の6−ベンジルオキシトリプタミンを含んでいたのでジメチルスルホキシドの1 mlとピリジン0.2mlの混液に懸濁し、3,5-DHBAの100 mgとDCCの200 mgを添加し、室温で撹拌を続けた。一晩撹拌後、上清反応物と沈殿反応物のそれぞれをろ過し、エバポレーターで溶媒を除去、残渣を酢酸エチル30 mlづつに溶かし、10%のクエン酸水溶液、10%の炭酸水素ナトリウム水溶液、及び飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチル層を合せ、濃縮し、カラムクロマトグラフィー(Wakogel C-300,1×10cm、ヘキサン/酢酸エチル)で精製した。100%の酢酸エチルで溶出された目的物をロータリーエバポレーターで濃縮し、エタノール4 mlに溶かし酢酸0.2 mlとPd/Cの30 mgを加え、常圧で接触水素添加を行なった。4時間反応後、触媒を濾別し、濾液を濃縮後、残渣をシリカゲルカラム(Wakogel C-300、1.5x14 cm、ヘキサン/酢酸エチル)にかけ、100%の酢酸エチルで溶出される分画を集めた。これを濃縮して得た62 mgの油状物を酢酸エチルとベンゼンの混合液から結晶化させ、N−(3,5−ジヒドロキシベンゾイル)−6−ヒドロキシトリプタミン(以下、化合物10という。)の34mgを結晶性白色粉末として得た。収率34%、分解点213−217℃、元素分析値:C、65.61%;H、5.22%;N、8.00% [計算値(C17H16N2O4):C、65.38%;H、5.16%;N、8.97%]、FAB-MS m/z 312 (M+)、1H-NMR(270MHz、acetone-d6)δ:2.986 (2H, t, J = 7 Hz, CH2), 3.640 (2H, m, CH2N), 6.467 (1H, t, J = 2 Hz, H-4), 6.635 (1H, q, J = 8, 2 Hz, H-5’), 6.818 (1H, d, J = 2 Hz, H-7’), 6.841 (2H, d, J = 2 Hz, H-2, 5), 6.992 (1H, m, H-2’), 7.434 (1H, d, J = 8 Hz, H-4’), 7.563 (1H, br. s, NHCO), 7.823 (1H, br. s, OH), 8.407 (2H, br. s, OH x 2), and 9.636 (1H, br. s, H-1’)。これらの分析結果から化合物10の構造が確認された。該化合物の構造は以下の式10に示される。
N−(3,5−ジヒドロキシベンゾイル)−6−ヒドロキシトリプタミン(化合物10)によるチロシナーゼ阻害の特徴として、基質であるDOPA(ジヒドロキシフェニルアラニン)の存在下において特に強力に酵素の活性低下もしくは失活を引き起こすことが指摘できる。本発明者らは阻害機構の検討のため、アッセイ開始に先立ってチロシナーゼを本発明の化合物で一定時間前処理する実験を行なったところ、その前処理液に低濃度のDOPAを加えておくと酵素の活性が顕著に低下することを見出した。すなわち、96-ウェルプレートの各ウェル中で、化合物10、6−ヒドロキシインドール、又はコウジ酸のエタノール溶液(2μ1づつ)を25μMのDOPAを含むか、もしくは含まない50mMのリン酸緩衝液(120μl)及び酵素液(12μl)と混合し37℃において1時間インキューベート後、5.3mMのDOPAを含むリン酸緩衝液を120μlづつ加え、さらに20時間室温に放置してから反応液の着色度(490nmにおける吸光度;メラニン生成量を表す)を測定した。各反応条件につき2つのウェルを用いて測定した値(酵素は含むがDOPAを全く含まないブランク値を補正した値)の平均をコントロールに対する%として図2のグラフにまとめた。
マウスB16メラノーマ細胞を24-wellのプレートに1ウェルあたり1×105個づつ0.7mlの培地(10%のFBSを含むDMEM培地)とともに植え込んだ。1日間培養後各ウェルに40mMのテオフィリン水溶液8.9μlを加え、次いで化合物10又はコウジ酸のエタノール溶液ないしは純エタノールを2μlづつ各ウェルに添加した。倍地中の化合物10の濃度は3及び10μM、コウジ酸の濃度は30及び100μMとした。2日間培養後、培地を100μlづつ96-wellのプレートに入れ、プレートリーダーで490nmの吸光度を測定し、その値から倍地中メラニンの生成率(コントロールに対する%)を求めた。次いで24-wellプレートに残った培地を吸引除去後、各ウェルを冷PBSの0.5mlづつで洗浄し、テトラゾリウム試薬(CellTiter 96、Promega社製)を用いて細胞生存率(コントロールに対する%)を測定した。以上の結果を図3にまとめて示した。この図の値はそれぞれ3つのウェルについての平均と標準偏差である。**はStudentのt-検定によりp < 0.01でコントロールに対して有意差があることを示す。この図の結果は、化合物10は10μMで細胞毒性なく倍地中におけるメラニンの生成を26%抑制するが、一方、コウジ酸はそれより10倍の濃度でもこの実験条件ではほとんど効果が無いことを示す。なお、細胞内に蓄積されるメラニン量を実施例2と同様の方法で測定したが、この場合は化合物10による抑制作用について安定した結果は得られなかった。しかし、メラニンの細胞外への分泌抑制乃至放出抑制機能は、美白化粧料の重要な要素の一つである。化合物10は、上記チロシナーゼ阻害効果に加え、メラニンの細胞外へ放出抑制機能を有する。
Claims (7)
- 下記一般式(I)又は(II)で示される6−又は7−ヒドロキシインドール骨格を有する化合物を活性成分として含むことを特徴とする、チロシナーゼ阻害剤。
- 一般式(I)で示される化合物が式(2)で示される6−ヒドロキシインドールであることを特徴とする、請求項1に記載の薬剤。
- 一般式(I)で示される化合物が式(3)で示される7−ヒドロキシインドールであることを特徴とする、上記(1)に記載の薬剤。
- 一般式(I)で示される化合物が下記式(4a)で示される6−ヒドロキシトリプタミンであることを特徴とする、請求項1に記載の薬剤。
- 一般式(I)で示される化合物が、下記式(5a)または(10)で示される6−ヒドロキシトリプタミン誘導体であることを特徴とする、請求項1に記載の薬剤。
- 一般式(II)で示される化合物が下記式(7a)で示される2−ヒドロキシカルバゾールであることを特徴とする、請求項1に記載の薬剤。
- 薬剤の使用形態が、皮膚外用剤あるいは化粧品であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の薬剤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010018061A JP5510799B2 (ja) | 2009-08-28 | 2010-01-29 | チロシナーゼ阻害剤 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009197643 | 2009-08-28 | ||
JP2009197643 | 2009-08-28 | ||
JP2010018061A JP5510799B2 (ja) | 2009-08-28 | 2010-01-29 | チロシナーゼ阻害剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011068632A JP2011068632A (ja) | 2011-04-07 |
JP5510799B2 true JP5510799B2 (ja) | 2014-06-04 |
Family
ID=44014274
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010018061A Active JP5510799B2 (ja) | 2009-08-28 | 2010-01-29 | チロシナーゼ阻害剤 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5510799B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5844561B2 (ja) * | 2011-07-01 | 2016-01-20 | 株式会社 日本薬用食品研究所 | 美白用組成物 |
-
2010
- 2010-01-29 JP JP2010018061A patent/JP5510799B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2011068632A (ja) | 2011-04-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NZ735612A (en) | Level measuring device, method for operating a level measuring device and assembly consisting of a level measuring device and at least one spacer | |
US20060216253A1 (en) | Whitening cosmetics containing morus alba extracts | |
WO2006068254A1 (ja) | 美白剤 | |
FR3060566A1 (fr) | Procede de preparation de derives de c-glycosides et composes intermediaires | |
WO2009108926A1 (en) | Inhibitors of glycolysis useful in the treatment of brain tumors | |
WO2006137139A1 (ja) | マンゴスチンの単離方法とそれを含有する医薬品、及び健康食品 | |
JP2011032173A (ja) | チロシナーゼ阻害剤 | |
KR101735996B1 (ko) | 레스베라트릴 트리글리콜레이트를 포함하는 피부미백용 화장료 조성물 | |
JPH1179936A (ja) | マルベリンを含有する美白化粧料 | |
JP5510799B2 (ja) | チロシナーゼ阻害剤 | |
JP5627585B2 (ja) | カナクギノキ由来抽出物、分画物または、化合物を含有する皮膚美白用組成物 | |
FR3045039A1 (fr) | Derives de resorcinol pour leur utilisation cosmetique | |
WO2006035142A1 (fr) | Preparation de composes phenol-amides a proprietes antioxydantes | |
FR3067027B1 (fr) | Derives de resorcinol pour leur utilisation cosmetique | |
JP2014198683A (ja) | 小眼球症関連転写因子抑制剤、メラニン産生抑制剤、化粧品組成物及び抗ガン剤 | |
KR101592373B1 (ko) | 고장초 추출물을 포함하는 미백 조성물 및 그 제조 방법 | |
TWI308148B (en) | Novel compound of 6-methyl-3-phenethyl-3,4-dihydro-1h-quinazoline-2-thione, its preparation and a depigmentation composition containing the same as an effective component | |
TWI732967B (zh) | 基於石斛屬成分的皮膚保護組合物 | |
KR20060110577A (ko) | c-Kit 활성 저해제, 피부미백제 및 이를 함유하는피부미백용 조성물 | |
JP5703313B2 (ja) | 3−ヒドロキシ−2−ピロンを含有する美白剤 | |
WO2009102083A1 (en) | Novel clitocybin derivatives, preparation method thereof and composition containing the extract of clitocybe aurantiaca kctc 11143bp or the novel clitocybin derivatives for prevention of aging as an active ingredient | |
CN113304129B (zh) | 单烯酮类单羰基姜黄素类似物在制备抗氧化药物的应用 | |
JP2004231574A (ja) | メラニン産生不全症治療剤 | |
JP4223723B2 (ja) | メラニン産生不全症予防治療剤 | |
KR20190004991A (ko) | 피부 미백용 조성물 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120818 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20131217 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140214 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140311 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140313 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5510799 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |