JP5486110B2 - ポリヒドロキシ酪酸産生欠失スフィンゴモナス属の細菌変異株およびスフィンガンの清澄化方法 - Google Patents
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Description
本発明は、無発現変異により内部の貯蔵高分子であるポリヒドロキシ酪酸(「PHB」)の産生に欠陥があるが、一般にスフィンガン(sphingan)と呼ばれる正常な質のカプセル(capular)多糖を産生する、スフィンゴモナス(Sphingomonas)属の細菌変異株に関する。本発明はまた、PHBの産生を欠失するスフィンゴモナスの変異株によって産生されたスフィンガンを清澄化する方法に関する。本発明は、さらに、PHB欠失スフィンガンおよび/または清澄化されたスフィンガンを含む、食品または工業製品に関する。
スフィンガンは、スフィンゴモナス属の細菌から分泌されるカプセル多糖である。スフィンガン同士は、構造的に関連があるが、まったく同じではない。スフィンゴモナス属の通常のメンバーと、それらが産生するスフィンガンには、ゲラン(gellan)(S−60)を産生するスフィンゴモナス・エロデア(Sphingomonas elodea)ATCC 31461、ウェラン(welan)(S−130)を産生するスフィンゴモナス種 ATCC 31555、ラムサン(rhamsan)(S−194)を産生するスフィンゴモナス種ATCC 31961、ジウタン(diutan)(S−657)を産生するスフィンゴモナス種 ATCC 53159、まだ無名の多糖(S−88)を産生するスフィンゴモナス種 ATCC 31554、まだ無名の多糖(S−198)を産生するスフィンゴモナス種 ATCC 31853、まだ無名の多糖(S−7)を産生するスフィンゴモナス種 ATCC 21423、まだ無名の多糖(NW−11)を産生するスフィンゴモナス種 ATCC 53272、アルカラン(バイオポリマーB−16)を産生するスフィンゴモナス種 FERM−BP2015(旧名Alcaligenes latus B−16)、などがある。スフィンゴモナスおよびそれらが産生する多糖についての記載は、米国特許第4,377,636号、第4,326,053号、第4,326,052号、および第4,385,123号(ATCC 31461およびそのS−60多糖について);米国特許第4,342,866号(ATCC 31555およびS−130について);米国特許第4,401,760号(ATCC 31961およびS−194について);米国特許第5,175,278号(ATCC 53159およびS−657について);米国特許第4,331,440号および第4,535,153号(ATCC 31554およびS−88について);米国特許第4,529,797(ATCC 31853およびS−198について);米国特許第3,960,832号(ATCC 21423およびS−7について);米国特許第4,874,044号(ATCC 53272およびNW−11について);米国特許第5,175,279号(FERM BP−2015およびB−16について)に出ており、これらのすべてを参照により本明細書に組み込む。
図2は、プラスミドpEBI中の408bp挿入断片の配列を示す(SEQ ID NO:6)。
図3は、スフィンゴモナス・エロデアのphaC遺伝子中の内部欠失をクローン化し、構築するために使用するステップの模式図である。
図4は、phaC領域の配列を示す(SEQ ID NO:7)。PstIに対する制限酵素部位(CTGCAG)には下線を引いてある。プライマー結合部位を、矢印で示す。phaC遺伝子の部分は、最初のPstI部位からTGA終止コドンまで延びている(太字)。変異株で欠失している塩基は、字間をあけて並べてある。XbaI部位(TCTAGA、二重下線)を、本文中で述べたように、変異株の欠失領域と置換する。
図5は、変異させたphaC遺伝子の、スフィンゴモナス・エロデア染色体への相同的組換え、および染色体中に無処置のまたは変異させたphaC遺伝子を残すようにした、組み込まれたベクターの切除の概略図である。
図6は、プラスミドpLO2の説明図である。
図7は、phaC欠失を含むベクターの、スフィンゴモナス・エロデア染色体への組込みを説明する概略図である。
図8は、10L発酵物からのブロスサンプルを培養することによって求められた、細胞数のグラフ表示である。
図9は、EcoRIを用いて消化させ、ATCC 53159のphaC遺伝子に対するプローブとハイブリダイズさせたスフィンゴモナスゲノムDNA調製物のサザンハイブリダイゼーションを示す。レーン1および2は、サイズマーカーを含む(それぞれ、λ HindIII、λ HindIII+EcoRI)。レーン3〜6は、スフィンゴモナス種のATCC 53159、31461、31555、および31961株からのゲノムDNA消化物を含む。
図10は、ATCC 53159のphaC遺伝子、および隣接領域のDNA配列である(SEQ ID NO:13)。BamHI(ggatc)、EcoRI(gaattc)、およびNotI(gcggccgc)に対する制限酵素部位には下線、プライマー重複部位には二重下線を引いてある。プライマー部位を矢印で示す。phaC遺伝子は、太字で強調してある。
図11は、phaC領域の遺伝子地図およびPCR増幅のためのプライマーを示す。
図12は、PCRを用いて、phaCに隣接する領域のみを含み、phaC遺伝子全体を欠く生成物を構築するクローニング戦略を示す。
図13は、透過率に対する水酸化カリウム濃度の効果のグラフである。
図14は、ゲル強度に対する水酸化カリウム濃度の効果のグラフである。
図15は、透過率に対するカルゴン(Cargon)濃度の効果のグラフである。
図16は、ゲル強度に対するカルゴン濃度の効果のグラフである。
本発明は、PHB合成を不活性化させる無発現変異により内部の貯蔵高分子であるポリヒドロキシ酪酸(「PHB」)を合成する能力に欠失があるスフィンゴモナス属の、遺伝子操作株に関する。本発明によるPHB欠陥性のスフィンゴモナス変異株は、当分野でよく知られた比濁法によって定性的に決定されるところの、PHBを含まない、商業的に有用なスフィンガンの合成が可能である(以下の実施例4、および米国特許第5,300,429号(その内容を参照により組み込む)を参照のこと)。PHBは、スフィンゴモナスにおいて、最適濃度のスフィンガンを産生する条件と同様の、高炭素および低窒素の条件下で細胞内に蓄積する貯蔵高分子である。
PHB合成酵素遺伝子の高度に保存された領域を同定するため、別種の生物からのPHB合成酵素配列を、National Center for Biotechnology Information(「NCBI」)Gene Bankから検索した。Rhizobium meliloti(gb:U17227)(SEQ ID NO:1)、Rhodobacter spaeroides(gb:L17049)(SEQ ID NO:4)、Methylobacterium extorquens(gb:07893)(SEQ ID NO:5)、Alcaligenes eutrophus(gb:J05003)(SEQ ID NO:2)、およびAcinetobacter種 RA3849株(gb:L37761)(SEQ ID NO:3)からの配列を選択し、研究した。選択したPHB合成酵素遺伝子のタンパク質配列を、図1に並べて示した。保存領域の中で、領域I(R.melilotiのコドン411〜417)および領域II(R.melilotiのコドン535〜541)をそれらの位置および比較的低い縮重の程度に基づいて選択し、約408bpのPCR生成物を得た。
サザンハイブリダイゼーションを使用して、スフィンゴモナスS−60 phaC遺伝子のより大きなフラグメント、ただし逆PCRによって容易に再生するのにあまり大きすぎないもの、をもたらす適切な制限酵素を決定した。QIAGEN(登録商標)(Valencia,California)DNA精製キットに記載された方法に従って、Gps31から染色体DNAを単離した。pEB1でクローン化した408bp挿入断片(SEQ ID NO:6)から作成したプローブを用いたサザン分析では、S.エロデアDNAのPstI消化物において、408bp phaCフラグメント(SEQ ID NO:6)は、約2kbのフラグメント中にあることが示された。
pEB4中の1.7kb挿入断片を配列決定し、408bpフラグメント(SEQ ID NO:6)の配列と結合させた。結合させた1920bp DNA配列(SEQ ID NO:7)を、図4に示す。この配列のPstI部位からTGA終止コドンまでの部分(塩基1〜2000)は、他のphaC遺伝子のカルボキシ側2/3と相同なタンパク質(SEQ ID NO:8)をコードする。配列アラインメントで、正確な遺伝子がクローン化されたことを確認した。
phaC欠失変異を、スフィンゴモナス・エロデアに移送するために、プラスミドの構築に適した宿主、例えば大腸菌(E.coli)中では複製することができるが、スフィンゴモナス中では複製することができない「自殺」プラスミドを使用した。スフィンゴモナスにおいて、このプラスミドによってコードされる抗生物質耐性について選択することにより、相同的組換えの結果としてプラスミドが染色体に組み込まれているコロニーが同定される。抗生物質耐性の喪失について選択することにより、図5に図示される、変異の保持(すなわち、欠失)または野生型の遺伝子をもたらす可能性がある、複製された領域が完全に再結合したコロニーが同定される。欠失を有するクローンと野生型DNAをもつクローンの区別は、形質発現(PHB合成)によって決定することができる。PHBの形質発現を測定するため、定性的な比濁法を用いた。ブロスのアリコート約1mlをClorox(登録商標)(Clorox Co.,Oakland,CA)9体積に加え、37℃で少なくとも4時間または終夜インキュベートした。白色沈殿の出現が、PHBの存在を示す。
2種のカナマイシン耐性組込み体を精製し、非選択性YEME培地(0.25% 酵母エキス、0.025%麦芽エキス)に3回通し、その後7.5%スクロースで培養し、交叉体について選択した。7つのカナマイシン感受性交叉体が得られたが、全てPHB陽性であった。PCR試験を用いて、ベクターphaCvが、染色体のphaC領域に挿入されていることを実証し、また、野生型のphaCと比較したときの挿入断片の位置を決定した。欠失の側面領域およびベクターの端部に相同的なプライマーを設計した。図7に示すように、組換えは、次の(1)または(2)をもたらす2つの配向で起こる可能性がある。(1)ベクターの左側に欠失があるphaC遺伝子があり、およびベクターの右側にphaC遺伝子のフラグメントがあり、PHB陰性のクローンをもたらすこととなる配向、または(2)ベクターの左側に無処置のphaC遺伝子があり、およびベクターの右側にphaCvがあり、PHB陽性のクローンをもたらすこととなる配向。
NPG−1、NPG−2、およびNPG−3を、14Lの発酵槽に送り込んだ発酵液10L中で試験し、化学的変異原性剤(米国特許第5,300,429号)によって単離したPHB欠失変異株であるLPG−2と比較した。使用する発酵液および培地のステージは、ステージ2の培地をすべての接種ステージで使用すること以外は、米国特許第5,300,429号に記載されるものとほぼ同じであった。最終の培地に接種する前に、3つの接種ステージを使用した。移送体積は、2.5〜5%であった。promosoy0.5g/Lの代わりに、異なる有機窒素(0.41g/L、Quest Nzamine EKC,Chicago,Illinois)を使用した。接種ステージにおけるコーンシロップの濃度は3.75%ではなく3%であった。最終の10L発酵液は、接種培地とほぼ同じであったが、含まれるリン酸塩が少なく(0.5g/L K2HPO4)、pHを必要に応じてKOHを加えることによって調節した。無機窒素、NaNO3(1.5g/L)と同様、有機窒素は、より高濃度(1.1 g/L)であった。消泡剤H−60−Kを0.6ml/Lに加えた。コーンシロップの濃度は、3.85%であった。最終ステージの培地にカルシウムおよびマグネシウムを補足した脱イオン水を補って完全にした。
PHB合成遮断による代謝中間体(例えば、有機酸)の蓄積は、ゲラン合成に悪影響を及ぼす可能性がある。ゲラン合成を促進する培地での増殖中、ゲラン合成を正常なレベルで進行させる補償変異を生じ得ることが予想された。10Lの発酵液から一定分割量の発酵ブロス(実施例6)を塗布し、細胞数を測定した(図8)。発酵終了近くで(すなわち、44時間から69時間で)、約0.5%から2%の間でコロニーがNPG株よりも大きく、かつより粘液性であることが認められた。これらのコロニーを精製し、振とうフラスコ発酵液におけるPHBおよびゲラン生産について試験した。新たな単離物はPHBが欠乏しており、元のNPG変異体よりも高収量のゲランを有していた。最良の補償変異体は、総計LPG−2と同等で野生型の80%以上(凡そ10〜15%のTPM減少が、PHBの重量損失のためと予想される)の沈殿性物質を有した。これらの株は、PDG変異体と名付けた:PDG−1はNPG−1から誘導され、PDG−3はNPG−3から誘導される。各々の株は、PHBとゲラン生産について振とうフラスコ発酵液において評価された。
phaCに相同な遺伝子が、スフィンゴモナス・エロデア以外のスフィンゴモナス株に確認され、それによりスフィンゴモナス・エロデア以外のスフィンゴモナス株においてPHB欠失変異体が生成する可能性を証明した。
組換えDNA技術を用いて、phaC遺伝子を完全に失ったスフィンゴモナスATCC53159の変異株を構築した。変異株の構築は、以下のように実施された:phaC遺伝子の側面DNA領域をPCRにより増幅して自殺ベクターにクローン化し、側面PCR産物を含有する該自殺ベクターは、ATCC53159細胞への接合により導入され、次いでスフィンゴモナスATCC53159染色体におけるphaCの直接上流または下流の相同座における全プラスミドの組込みを、カナマイシン耐性(ベクターによりコード化された)に対する選択により達成した。該染色体からのphaC座プラスベクターDNAの切除は、ベクター上にコード化されたショ糖感受性により選択された続く第2の交叉事象の結果、生じた。
苛性剤の水酸化カリウム(「KOH」)濃度の影響が、最初のプロトコルとして上記に概説したステップを含んで成る清澄プロセスで評価された。PHB欠失変異体を含んで成るゲラン発酵ブロスを前処理してKOHの濃度を変えて15分間混合し、次いでキレート化剤として1000ppmのカルゴン(Calgon)と1時間、引き続き22ppmのリゾチーム並びに220ppmのプロテアーゼ各々と55℃で2時間混合した。KOH濃度を、約0.0g/Lと約0.45g/Lとの間で変えて試験した。図13に示すように、透過度は、KOHの濃度を0.45g/Lに増すとほぼ20%増加した(31%の相対的増加)。
カルゴンとしても知られているヘキサメタリン酸ナトリウム(「SHMP」)の透過度、穿刺力およびパーセント距離に及ぼす影響を、上記実施例10に記載された清澄化工程に従って評価した。PHB欠失変異体を含むゲラン発酵ブロスを前処理し、0.45g/LのKOHと15分間混合し、次いでカルゴンの濃度を変えて1時間、引き続き22ppmのリゾチーム並びに220ppmのプロテアーゼ各々と55℃で2時間混合した。SHMP濃度を、約1000ppmと約3000ppmの間で変えると、この範囲に亘って線形の相関関係が図15に示したようにSHMP濃度と透過度との間に存在した。SHMPを約1000ppm増加すると、透過度が約5%増加する。図16に示されるように、穿刺力およびパーセント距離は、試験範囲でのSHMP濃度の増加により比較的影響を受けないことから、SHMPがゲル強度に影響するとは思われない。
清澄方法の2つの変法を、2Lスケールで天然のゲランブロスに対して実施した。製造元のGenencor International社(ニューヨーク州ロチェスター)により提供された情報によれば、Multifect(登録商標)リゾチームは、酸性から中性pHレベルで安定であり、アルカリ性pHで短時間に不活化できる。清澄工程に従って0.45g/LのKOH添加後、一般にこのpHはリゾチームにとって準最適であるpH8を超えるが、一方、プロテアーゼはこれらの条件下でよく作用するとのことである。斯様に清澄化工程を第2のプロトコルに従って変更し、リゾチーム酵素による処理後にKOHを加えた(工程順序の要約:リゾチーム、次にKOH、次にプロテアーゼ)。KOHをリゾチーム酵素処理の前に添加しても処理後に添加しても、以下の表に示されるように5.5%の相対的標準偏差(「RSD」)が観察された。
本実施例は、優れた透明性および安定性を示す、伸縮弾性がある十分に噛む必要のある菓子を製造するために使用し得る配合物を示す。
成分 %
A部分
ぶどう糖シロップ 45.00
水 21.67
B部分
ショ糖 30.00
清澄化高アシルゲラン 1.33
Kelocogel F(登録商標)ゲラン 0.67
(米国CP Kelco社、カリフォルニア州サンディエゴ)
C部分
クエン酸溶液、54% 0.67
クエン酸ナトリウム溶液、33% 0.67
B部分の成分を乾式混合し、混合加熱容器に速やかに加えて沸騰させる。該混合物を72%固体まで減量した。C部分の成分を合わせて、フレーバーおよび着色剤に加えて均一になるまで混合する。
この配合物は、優れた透明性および安定性を有する伸縮弾性のあるデザートゲルを製造するために使用された。
成分 %
A部分
ショ糖 13.20
アジピン酸 0.40
清澄化高アシルゲラン 0.16
クエン酸ナトリウム 0.13
リン酸二ナトリウム 0.13
フマール酸 0.11
Kelocogel F(登録商標)ゲラン 0.04
(米国CP Kelco社、カリフォルニア州サンディエゴ)
B部分
水 85.83
A部分の成分を乾燥フレーバーおよび着色剤に加えて乾式混合し、B部分に分散させて混合し、90℃に加熱した。次いで該混合物を好適な容器に注いで、室温で固めた。
本配合物は、優れた透明性、保存安定性、フレーバー放出および拡散性を有するゼリーを提供した。
成分 %
A部分
調和性グレープジュース 45.69
高フルクトースコーンシロップ 30.46
水 22.85
B部分
清澄化高アシルゲラン 0.18
クエン酸ナトリウム 0.10
SHMP 0.10
ソルビン酸カリウム 0.09
C部分
クエン酸、50%溶液 0.53
Claims (20)
- 清澄化されたネイティブの高アシルジェラン調製物であり、
スフィンゴモナス・エロデアのPHB欠失変異株から産生され、
1%w/wで溶解させたときの光線透過率が、600〜650nmの波長で測定して60%超であり、
a)ジェラン水溶液を30℃から70℃の清澄化温度に加熱するステップと、
b)前記ジェラン水溶液を、少なくとも1種のキレート剤で処理するステップと、
c)ステップb)の後に、前記キレート剤で処理したジェラン水溶液をリゾチーム酵素で処理するステップと、
d)前記ジェラン水溶液を、苛性剤又は酸化剤で処理するステップと、
e)前記ジェラン水溶液を、プロテアーゼ酵素で処理するステップと、
f)得られた処理したジェラン溶液から、アルコールを用いた沈殿により、清澄化されたジェランを単離するステップと
を含む方法により調製される、
ことを特徴とする、調製物。 - 1%w/wで溶解させたときの光線透過率が、600〜650nmの波長で測定して少なくとも77.9%であり、パーセント距離により測定したゲル強度が、少なくとも87.2であり、グラムで表される穿刺力が、少なくとも428グラムである、
請求項1に記載の清澄化されたネイティブの高アシルジェラン調製物。 - 1%w/wで溶解させたときの光線透過率が、600〜650nmの波長で測定して、5.50の相対標準偏差で少なくとも82.38%であり、パーセント距離により測定したゲル強度が、0.02の相対標準偏差で少なくとも87.84であり、グラムで表される穿刺力が、0.28の相対標準偏差で少なくとも428グラムである、
請求項1に記載の清澄化されたネイティブの高アシルジェラン調製物。 - 請求項1に記載の清澄化されたジェラン調製物を含む溶液。
- 請求項1に記載の清澄化されたジェラン調製物を含む食品。
- 前記光線透過率は、70%超である、請求項1に記載の清澄化されたジェラン調製物。
- 請求項6に記載の清澄化されたジェラン調製物を含む溶液。
- 請求項6に記載の清澄化されたジェラン調製物を含む食品。
- 前記光線透過率は、80%超である、請求項1に記載の清澄化されたジェラン調製物。
- 請求項9に記載の清澄化されたジェラン調製物を含む溶液。
- 請求項9に記載の清澄化されたジェラン調製物を含む食品。
- 清澄化された高アシルジェラン溶液を調製する方法であり、
前記ジェラン溶液はスフィンゴモナス・エロデアのPHB欠失変異株から産生され、
a)ジェラン水溶液を30℃から70℃の清澄化温度に加熱するステップと、
b)前記ジェラン水溶液を、少なくとも1種のキレート剤で処理するステップと、
c)ステップb)の後に、前記キレート剤で処理したジェラン水溶液をリゾチーム酵素で処理するステップと、
d)前記ジェラン水溶液を、苛性剤又は酸化剤で処理するステップと、
e)前記ジェラン水溶液を、プロテアーゼ酵素で処理するステップと、
f)アルコールを用いた沈殿により、清澄化されたジェランを回収するステップと
を含み、
ここで、得られた前記清澄化されたジェランの、1%w/wで溶解させたときの光線透過率は、600〜650nmの波長で測定して60%超である
ことを特徴とする、方法。 - 前記ジェラン水溶液を、次亜塩素酸ナトリウム又は他の次亜塩素酸塩、二酸化塩素、過酸化水素、過酢酸、及びオゾンからなる群から選択される少なくとも1種の酸化剤で処理する、請求項12に記載の方法。
- 少なくとも1種のキレート剤が、エチレンジアミン四酢酸、リン酸、メタリン酸、炭酸、クエン酸、酒石酸、グルコン酸、グルタミン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、メタリン酸、糖酸、エチレングリコール−ビス−(β−アミノエチルエーテル)−N,N,N’,N’−四酢酸(EGTA)、エチレンジアミン、2,3−ジアミノブタン、1,2−ジアミノシクロヘキサン、トリアミノトリエチルアミン、又はそれらの塩から選択される請求項12に記載の方法。
- 少なくとも1種のキレート剤が、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二カリウム、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸四カリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三カリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸カリウム、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、陽イオン交換樹脂、エチレンジアミン二塩酸、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミンリチウム塩、エチレンジアミンジヒドロヨウ素、及びそれらの混合物から選択される、請求項12に記載の方法。
- 苛性剤が、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、及びリン酸三ナトリウムからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- ステップb)で、前記ジェラン水溶液を更に界面活性剤で処理する、請求項12に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、SDS、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、レシチン、モノグリセリド、モノグリセリドの酒石酸エステル、リン酸モノグリセリド、乳酸モノグリセリド、アセチル化モノグリセリド、コハク酸モノグリセリド、エトキシ化モノグリセリド、ソルビタンエステル、ポリソルベート、ポリグリセリンエステル、ショ糖エステル、ステアロイル乳酸ナトリウム、及びプロピレングリコールエステルから選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記リゾチーム酵素での処理を、3から7.5のpHで行う、請求項12に記載の方法。
- 前記プロテアーゼ酵素での処理を、6.5から9のpHで行う、請求項12に記載の方法。
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