ES2306709T3 - Cepas bacterianas mutantes del genero sphingonomas deficientes en la produccion de poli hidroxibutirato y un procedimiento de clarificacion de esfinganos. - Google Patents

Abstract

Una cepa mutante del género Sphingomonas, en la que se muta selectivamente o elimina un gen que codifica una proteína implicada en la síntesis de polihidroxibutirato de tal modo que la cepa mutante produzca un esfingano sin producir también polihidroxibutirato.

Description

Cepas bacterianas mutantes del género Sphingonomas deficientes en la producción de poli hidroxibutirato y un procedimiento de clarificación de esfinganos.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a cepas bacterianas mutantes del género Sphingomonas que son deficientes en la producción de un polímero de almacenamiento interno, polihidroxibutirato ("PHB"), debido a una mutación completa, pero que producen la calidad normal de polisacáridos capsulares designados comúnmente como esfinganos. La presente invención se refiere también a un método de clarificación de los esfinganos producidos por una cepa mutante de Sphingomonas que es deficiente en la producción de PHB. La presente invención se refiere adicionalmente a productos alimentarios o industriales que comprenden esfinganos deficientes en PHB y/o clarificados.

Discusión de la técnica relacionada

Los esfinganos son polisacáridos capsulares secretados por bacterias del género Sphingomonas. Los esfinganos están relacionados estructuralmente, pero no son idénticos. Los miembros comunes del género Sphingomonas y los esfinganos que producen incluyen Sphingomonas elodea, ATCC 31461, que produce gelano (S-60); Sphingomonas sp. ATCC 31555, que produce welano (S-130); Sphingomonas sp. ATCC 31961, que produce ramsano (S-194); Sphingomonas sp. ATCC 53159, que produce diutano (S-657); Sphingomonas sp. ATCC 31554, que produce un polisacárido todavía sin nombre (S-88); Sphingomonas sp. ATCC 31853, que produce un polisacárido todavía sin nombre (S-198); Sphingomonas sp. ATCC 21423, que produce un polisacárido todavía sin nombre (S-7); Sphingomonas sp. ATCC 53272, que produce un polisacárido todavía sin nombre (NW-11); Sphingomonas sp. FERM-BP2015 (anteriormente Alcaligenes latus B-16), que produce alcalano (biopolímero B-16), y similares. Puede encontrarse una descripción de las esfingomonas y los polisacáridos que producen en las patentes de EE.UU. nº 4.377.636, 4.326.053, 4.326.052 y 4.385.123 (para ATCC 31461 y su polisacárido S-60); en la patente de EE.UU. nº 4.342.866 (para ATCC 31555 y S-130); en la patente de EE.UU. nº 4.401.760 (para ATCC 31961 y S-194); en la patente de EE.UU. nº 5.175.278 (para ATCC 53159 y S-657); en las patentes de EE.UU. nº 4.331.440 y 4.535.153 (para ATCC 31554 y S-88); en la patente de EE.UU. nº 4.529.797 (para ATCC 31853 y S-198); en la patente de EE.UU. nº 3.960.832 (para ATCC 21423 y S-7); en la patente de EE.UU. nº 4.874.044 (para ATCC 53272 y NW-11); en la patente de EE.UU. nº 5.175.279 (para FERM BP-2015 y B-16), todas las cuales se incorporan como referencia a la presente memoria.

Los polisacáridos de esfingano están estructuralmente relacionados por la estructura primaria de su cadena principal, que comprende los azúcares D-glucosa, ácido D-glucurónico y L-ramnosa (o L-manosa). Por ejemplo, la estructura primaria del gelano, S-60, comprende los azúcares D-glucosa, ácido D-glucurónico y L-ramnosa en una relación molar 2:1:1, que están ligados conjuntamente formando una unidad repetida tetrasacárida en el siguiente orden: glucosa, ácido glucurónico, glucosa, ramnosa. En la forma nativa, el gelano está modificado por sustituyentes acetilo y glicerilo en el mismo residuo de glucosa. De promedio, el gelano tiene un sustituyente glicerato por unidad repetida tetrasacárida y un sustituyente acetato por cada dos unidades repetidas tetrasacáridas. La estructura primaria de otro esfingano, diutano, S-657, difiere del gelano en que tiene una cadena lateral disacárida adicional de L-ramnosa unida a un residuo de glucosa, formando así una unidad repetida hexapolisacárida. S-657 contiene grupos acetilo en la posición 2 y/o en la posición 6 del otro residuo de glucosa.

Los polisacáridos de esfingano, que se designan también como gomas, se usan principalmente para espesar o gelificar disoluciones acuosas y se clasifican frecuentemente en dos grupos: espesantes y agentes gelificantes. Los espesantes típicos incluyen almidones, goma guar, carboximetilcelulosa, alginato, metilcelulosa, goma xantana, goma karaya y goma de tragacanto. Los agentes gelificantes comunes incluyen gelano, gelatina, almidón, alginato, pectina, carragenina, agar y metilcelulosa.

Los agentes gelificantes se usan en la industria alimentaria en una variedad de aplicaciones, incluyendo jaleas de pastelería, mermeladas, geles para postres, glaseados, productos lácteos, bebidas y similares. Adicionalmente, los agentes gelificantes pueden usarse como componentes de medios microbiológicos. Los agentes gelificantes difieren en las condiciones en que pueden usarse y en la textura de los geles que forman. Estas propiedades distintivas de los geles han conducido al uso exclusivo de ciertos agentes gelificantes en productos particulares (por ejemplo, almidón en jaleas de pastelería; gelatina en geles para postres; agar en glaseados y alginato en tiras de pimiento
morrón).

A pesar del uso de ciertos agentes gelificantes en productos particulares, existen desventajas para las formulaciones alimentarias convencionales. Por ejemplo, la gelatina, que se usa frecuentemente en formulaciones de gel para postres, es de origen animal, requiere refrigeración para solidificar y es de aplicación limitada debido a su inestabilidad al calor. La carragenina, combinaciones de carragenina y goma de algarrobilla y pectina, que se usan frecuentemente en gel para postres, pastelería y formulaciones de mermelada/jalea, están generalmente limitadas a formulaciones que son de textura quebradiza e inelástica, sufren una mala estabilidad al almacenamiento y pueden estar geográficamente limitadas para uso en algunos países, tales como Japón. El almidón, que se usa frecuentemente en formulaciones de pastelería, proporciona una mala transparencia y mala liberación de aroma. En consecuencia, sería deseable desarrollar un agente gelificante para uso en formulaciones alimentarias que estuviese libre de los problemas asociados a los agentes gelificantes convencionales.

Es un agente gelificante particularmente útil el gelano (S-60), que es un polisacárido capsular producido por la bacteria Sphingomonas elodea, ATCC 31461. Comercialmente, la goma se forma mediante la inoculación de un medio de fermentación en condiciones aeróbicas con bacterias Sphingomonas elodea. El medio de fermentación contiene una fuente de carbono, fosfato, fuentes de nitrógeno orgánicas e inorgánicas y oligoelementos apropiados. La fermentación se realiza en condiciones estériles con un estricto control de aireamiento, agitación, temperatura y pH. Tras la terminación de la fermentación, se pasteuriza el caldo viscoso para matar las células viables antes de la recuperación de la goma. Sin embargo, las condiciones óptimas de fermentación para producir gelano promueven también la producción del polímero de almacenamiento interno polihidroxibutirato ("PHB"), que interfiere con la clarificación y recuperación última del gelano. Durante la fermentación, la síntesis de PHB y la síntesis de gelano compiten por la fuente de carbono disponible, y la síntesis de PHB puede competir con la síntesis de gelano.

El gelano exhibe diferentes características dependiendo del método de recuperación desde el caldo de fermentación. La recuperación directa desde el caldo de fermentación proporciona gelano en su forma nativa o rica en acilo, que se modifica por S. elodea con sustituyentes acetilo y glicerilo en un residuo de glucosa. El aislamiento de gelano en esta forma nativa o rica en acilo proporciona un gel blando, flexible y elástico. El gelano puede desacilarse mediante tratamiento con bases en caliente, proporcionando así gelano en su forma pobre en acilo. El aislamiento de gelano en esta forma desacilada proporciona un gel duro, consistente y quebradizo, que tiene aplicaciones comerciales limitadas. Las combinaciones de gelano nativo y desacilado producen geles de textura intermedia.

Ciertas aplicaciones requieren gelano transparente. Sin embargo, actualmente sólo puede clarificarse el gelano desacilado. Durante el procedimiento de desacilación, se trata el gelano con base a alta temperatura, que retira los sustituyentes acilo del gelano y lisa las células de S. elodea. Se retiran después los sólidos y desechos celulares mediante filtración, proporcionando un gelano transparente no acilado. Hasta la fecha, no ha sido posible clarificar el gelano en su forma nativa o rica en acilo mediante filtración debido a la alta temperatura de solidificación (la temperatura a la que una goma forma un gel tras enfriamiento) necesaria y a la naturaleza capsular del organismo, que no permite una separación sencilla del gelano de las células de S. elodea. Para aplicaciones que requieren gelano nativo, las células de S. elodea pueden lisarse química o enzimáticamente; sin embargo, el PHB restante estará presente en el producto final, y vuelve a las disoluciones resultantes turbias, en lugar de transparentes.

Además del uso de gelano como agente de gelificación, otros polisacáridos de esfingano han encontrado también aplicación comercial útil. El polisacárido S-657 confiere un seudoplasticidad significativa a disolventes polares tales como agua, de tal modo que S-657 puede actuar como un modificador reológico que es capaz de suspensión de partículas, reducción de la fricción, estabilización de emulsión y espuma, disposición de torta de filtrado y control de filtración. En consecuencia, S-657 ha encontrado utilidad industrial como modificador reológico en una variedad de sistemas cementantes, como se da a conocer en la patente de EE.UU. nº 6.110.271.

Además de perjudicar la transparencia, el PHB encontrado en los esfinganos afecta a las propiedades reológicas de sus gomas. En particular, el PHB en goma S-657 afecta a la capacidad del polisacárido de modificar la reología en entornos de flujo medio poroso tales como campos petrolíferos, en los que la reología desempeña un papel significativo en perforaciones de sondeo, fluidos de completación y reacondicionamiento. Además, el residuo de PHB en S-657 puede causar daños durante la formación de yacimientos y puede reducir la productividad de los pozos. La presencia de PHB limita además la aplicabilidad de la goma S-657 en productos domésticos y de higiene personal, en los que la apariencia es crítica para la aceptación por el consumidor.

En consecuencia, se han hecho intentos de eliminar la producción de PHB en esfinganos. Un modo de aliviar el problema de la producción de PHB interferente en especies de Sphingomonas ha sido inducir químicamente una mutación aleatoria en una cepa que inhiba la producción de PHB, tal como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.300.429 (o su miembro de la familia de patentes EP 0.473.222), que da a conocer LPG-2, una cepa mutante de Sphingomonas elodea que inhibe la producción de PHB, pero que sigue siendo capaz de producir gelano. Sphingomonas elodea era conocida anteriormente como Pseudomonas elodea y designa el mismo organismo. La cepa LPG-2 está en depósito en la American Type Culture Collection y se designa ATCC 53967. Aunque que la cepa LPG-2 produce gelano, su calidad es inconstante,

\hbox{presuntamente debido a la(s)
mutación(es)  adicional(es) que aparece(n) con
la mutagénesis química.}

La ingeniería genética es un enfoque de mutagénesis más selectivo para generar cepas de mutantes completos de Sphingomonas deficientes de producción de PHB. La ingeniería genética permite la mutación selectiva o deleción de un gen en la ruta de síntesis de PHB, que a su vez permite la inhibición completa de la producción de PHB sin afectar a la calidad de la producción de goma.

En consecuencia, sería altamente deseable desarrollar cepas mutantes de Sphingomonas que fueran deficientes en su capacidad de sintetizar PHB, mientras que maximizan su producción de esfingano y, simultáneamente, mitigan el esfuerzo necesario para retirar el PHB de los esfinganos.

Fukui et al., Journal of Bacteriology, Washington DC, EE.UU., vol. 179, nº 15, agosto de 1997, páginas 4821-4830 (ISSN: 0021-9193) da a conocer la clonación y análisis de los genes de biosíntesis de poli-(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato) de Aeromonas caviae.

Sumario de la invención

La invención se refiere a cepas mutantes del género Sphingomonas en las que se muta selectivamente o elimina al menos un gen que codifica una proteína implicada en la síntesis de polihidroxibutirato ("PHB") de tal modo que las cepas mutantes produzcan esfinganos pero no PHB.

Otra realización de la invención está dirigida a secuencias de ADN aisladas a partir del ADN de múltiples especies de Sphingomonas, concretamente, de ATCC 31461 y 53159, que codifica la proteína PHB sintasa.

Otra realización de la invención está dirigida a un procedimiento de preparación de un esfingano clarificado deficiente en PHB que comprende las etapas de fermentar una cepa mutante del género Sphingomonas y clarificar el esfingano deficiente en PHB a partir de un caldo de fermentación.

Aún otra realización de la invención está dirigida a un procedimiento para preparar una disolución de esfingano clarificado que comprende calentar un caldo de fermentación de esfingano que comprende esfingano deficiente en PHB a una temperatura de clarificación de 30ºC a 70ºC, tratar el caldo de fermentación de esfingano con un agente de clarificación y tratar después el caldo de fermentación con enzimas. Aún otra realización de la invención está dirigida a un procedimiento de preparación de una disolución de esfingano clarificado que comprende las etapas de calentar un caldo de fermentación de esfingano que comprende esfingano deficiente en PHB a una temperatura de clarificación de 30ºC a 70ºC, tratar el caldo de fermentación con un agente quelante, tratar el caldo de fermentación con una enzima lisozima, tratar el caldo de fermentación con un agente cáustico u oxidante, y tratar el caldo de fermentación con una enzima proteasa.

Otra realización de la invención está dirigida a cepas mutantes de Sphingomonas elodea que permiten la preparación de un gelano clarificado deficiente en PHB rico en acilo (nativo) con alta resistencia de gel.

Aún otra realización de la invención está dirigida a un producto alimentario o industrial que comprende un esfingano deficiente en PHB y/o clarificado.

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Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 representa las secuencias de proteína PHB sintasa de Rhizobium meliloti (U17227) (SEC ID Nº 1), Alcaligenes eutrophus (J05003) (SEC ID Nº 2), Acinetobacter sp. cepa RA3849 (L37761) (SEC ID Nº 3), Rhodobacter spaeroides (L17049) (SEC ID Nº 4) y Methylobacterium extorquens (L07893) (SEC ID Nº 5) alineadas usando el software DNA Star MegAlign® de LaserGene (Madison, WI). Se seleccionaron las regiones I y II como regiones conservadas con degeneración moderada y se situaron para proporcionar un producto de reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") de aproximadamente 400 pares de bases ("pb").

La Fig. 2 muestra la secuencia del inserto de 408 pb en el plásmido pEB1 (SEC ID Nº 6).

La Fig. 3 es un esquema que ilustra las etapas usadas para clonar y construir una deleción interna en el gen phaC de Sphingomonas elodea.

La Fig. 4 representa la secuencia de la región phaC (SEC ID Nº 7). Los sitios de enzima de restricción para PstI (CTGCAG) están subrayados. Los sitios de unión a cebador están indicados por flechas. Una porción del gen phaC se extiende desde el primer sitio PstI al codón de terminación TGA (en negrita). Las bases que se eliminan en los mutantes se exponen separadamente. El sitio XbaI (TCTAGA, doble subrayado) está sustituido por la región eliminada en los mutantes, como se describe en el texto.

La Fig. 5 es un diagrama esquemático de la recombinación homóloga de gen phaC mutado en el cromosoma de Sphingomonas elodea y la escisión del vector integrado, dejando un gen phaC intacto o mutado en el cromosoma.

La Fig. 6 es una ilustración del plásmido pLO2.

La Fig. 7 es un diagrama esquemático que demuestra la integración de un vector que contiene una deleción de phaC en un cromosoma de Sphingomonas elodea.

La Fig. 8 es una representación gráfica de los recuentos celulares determinados sembrando muestras de caldo de fermentaciones de 10 l.

La Fig. 9 muestra una hibridación Southern de preparaciones de ADN genómico de Sphingomonas digeridas con EcoRI e hibridadas con una sonda del gen phaC de ATCC 53159. Los carriles 1 y 2 contienen marcadores de tamaño (\lambda HindIII y \lambda HindIII + EcoRI, respectivamente). Los carriles 3-6 contienen digestiones de ADN genómico de Sphingomonas sp. cepas ATCC 53159, 31461, 31555 y 31961, respectivamente.

La Fig. 10 es la secuencia de ADN del gen phaC y regiones flanqueantes de ATCC 53159 (SEC ID Nº 13). Los sitios de enzima de restricción para BamHI (ggatc), EcoRI (gaattc) y NotI (gcggccgc) están subrayados y los sitios de cebador superpuesto están doblemente subrayados. Los sitios de cebador están indicados por flechas. El gen phaC está destacado en negrita.

La Fig. 11 representa un mapa genético de la región phaC y cebadores para amplificación por PCR.

La Fig. 12 representa la estrategia de clonación en la que se usó PCR para construir un producto que contenía sólo las regiones flanqueantes de phaC y omitía el gen phaC entero.

La Fig. 13 es una representación gráfica del efecto de la concentración de hidróxido de potasio sobre la transmitancia.

La Fig. 14 es una representación gráfica del efecto de la concentración de hidróxido de potasio sobre la resistencia de gel.

La Fig. 15 es una representación gráfica del efecto de la concentración de Calgon sobre la transmitancia.

La Fig. 16 es una representación gráfica del efecto de la concentración de Calgon sobre la resistencia de gel.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a cepas modificadas por ingeniería genética del género Sphingomonas deficientes en su capacidad de sintetizar el polímero de almacenamiento interno polihidroxibutirato ("PHB") debido a una mutación completa que inactiva la síntesis de PHB. Las cepas de Sphingomonas mutantes deficientes en PHB de esta invención son capaces de sintetizar esfinganos comercialmente útiles que están libres de PHB, como se determina cualitativamente mediante métodos turbidimétricos bien conocidos en la técnica (véanse el ejemplo 4 siguiente y la patente de EE.UU. nº 5.300.429). El PHB es un polímero de almacenamiento que se acumula intracelularmente en Sphingomonas en condiciones ricas en carbono y pobres en nitrógeno, que son las mismas condiciones que producen niveles óptimos de esfinganos.

Se ha estudiado la síntesis de PHB en una serie de organismos, y se han identificado al menos tres genes para la síntesis de PHB (Anderson, A.J. y E.A. Dawes, Microbiol. Rev. 54: 450-472 (1990)). El PHB deriva de acetilcoenzima A (CoA) en tres etapas. La primera etapa está catalizada por 3-cetotiolasa (phaA) y da como resultado la formulación de acetoacetil-CoA. En la segunda etapa, la enzima acetoacetil-CoA reductasa (phaB) convierte la acetoacetil-CoA en \beta-hidroxibutiril-CoA, que se polimeriza finalmente por PHB sintasa (phaC) en la tercera etapa, formando PHB. Una mutación en la que se muta selectivamente o elimina al menos un gen que codifica una proteína implicada en la síntesis de polihidroxibutirato, concretamente phaA, phaB o phaC, puede dar como resultado una cepa de Sphingomonas deficiente en PHB.

Por ejemplo, las cepas mutantes de Sphingomonas descritas en la presente memoria son el resultado de al menos dos mutaciones: (1) una deleción de o dentro del gen phaC que codifica la PHB sintasa para bloquear la producción de PHB, que tenía el resultado inesperado de reducir la producción de esfingano; y (2) una mutación espontánea para restaurar la producción de esfingano. La presente invención proporciona también una mutación preliminar opcional que comprende una mutación espontánea para aumentar la capacidad de mutantes de Sphingomonas de captar ADN de plásmido, concretamente, la mutación S-60wtc en Sphingomonas elodea.

Adicionalmente, la presente invención da a conocer un método de clarificación de gelano deficiente en PHB y otros esfinganos deficientes en PHB producidos por cepas mutantes de Sphingomonas usando agentes quelantes, agentes cáusticos u oxidantes y enzimas para lisis celular y digestión de proteína. La presente invención da a conocer también productos alimentarios o industriales que comprenden esfinganos deficientes en PHB y/o clarificados.

Para ilustrar los detalles de la invención, se describen las etapas implicadas en la modificación por ingeniería genética de Sphingomonas elodea y Sphingomonas sp. ATCC 53159, sin embargo, como se observa a continuación, la invención no está limitada a modificar por ingeniería genética Sphingomonas elodea y Sphingomonas sp. ATCC 53159 ni ningún gen particular que codifique una proteína implicada en la síntesis de PHB.

Se obtuvo un fragmento interno del gen phaC de la cepa de S. elodea ATCC 31461 por PCR con cebadores degenerados diseñados a partir de dos regiones conservadas de proteínas codificadas por phaC. Se utilizó la secuencia nucleotídica de este fragmento, como se muestra en la Fig. 2, para diseñar cebadores para PCR inversa que permitieran el aislamiento de una porción mayor del gen phaC y secuencia 3' flanqueante. Generalmente, la técnica de PCR inversa clona las regiones flanqueantes de los nucleótidos de interés en una orientación inversa a su orientación natural (véase la Fig. 3). El procedimiento de clonación que disponía los fragmentos de PCR invertidos en su orientación natural dio como resultado una deleción de 232 pares de bases ("pb"). El intercambio alélico de este fragmento con el gen phaC cromosómico eliminó la producción de PHB en S. elodea. La deleción interna de 232 pb tenía el efecto inesperado de reducir la producción de gelano.

Se aislaron derivados espontáneos con producción de gelano restaurada a partir del crecimiento a gran escala de S. elodea mutante. Los derivados deficientes en PHB de la presente invención no contienen ADN extraño, contienen una deleción de 232 pb del cromosoma nativo y una mutación espontánea no caracterizada. Las cepas PDG-1 y PDG-3 están en depósito en la American Type Culture Collection y se designan como ATCC nº y ATCC nº, respectivamente.

Las técnicas de biología molecular particulares, concretamente PCR inversa y mutaciones de deleción, usadas para generar el mutante de Sphingomonas para la producción de PHB no son críticas. Está dentro del conocimiento de un experto en la técnica usar técnicas de biología molecular convencionales para generar mutantes de Sphingomonas. Otras técnicas de biología molecular útiles que pueden usarse para mutar genes similares a phaC en diferentes cepas de Sphingomonas incluyen, pero sin limitación, mutagénesis de transposón, mutaciones puntuales y mutaciones de elemento de inserción.

El gen phaC es sólo un gen en la ruta de síntesis de PHB, por tanto es posible generar mutantes de Sphingomonas con el fenotipo deseado, concretamente, deficiente en producción de PHB, mutando selectivamente o eliminando otros genes implicados en la ruta de síntesis de PHB. Los genes de interés que pueden mutarse selectivamente para proporcionar el fenotipo deseado incluyen, pero sin limitación, phaA (3-cetotiolasa) y phaB (acetoacetil-CoA reductasa).

Una vez se generan los mutantes de Sphingomonas, se cultivan o fermentan en una disolución acuosa conocida como caldo de fermentación en la que se secretan los esfinganos en forma de polisacáridos capsulares. Después de la fermentación de los mutantes de Sphingomonas deficientes en PHB, pueden prepararse los esfinganos mediante pasteurización del caldo y precipitación del esfingano con un alcohol tal como isopropanol, usando técnicas bien conocidas en la técnica.

Preferiblemente, después de la fermentación, los esfinganos pueden clarificarse y aislarse de los sólidos suspendidos y desechos celulares que son parte del medio del caldo de fermentación, proporcionando esfinganos clarificados deficientes en PHB. Como se describe en la presente memoria, el procedimiento de clarificación comprende calentar el caldo de fermentación y tratar el caldo de fermentación con uno o más agentes quelantes, uno o más agentes cáusticos u oxidantes, o una mezcla de los mismos, seguido de tratamiento con cualquier enzima lisozima y/o enzima proteasa.

Específicamente para el gelano, el mutante de S. elodea deficiente en producción de PHB, combinado con el procedimiento de clarificación de esta invención, posibilita la producción de gelano clarificado en su forma rica en acilo. El gelano resultante de este mutante y procedimiento exhibe buena transparencia y alta resistencia de gel, lo que es útil para preparar geles para postres, pastelería, bebidas y similares.

En una realización de esta invención, designada en adelante en la presente memoria como el "primer protocolo", pueden clarificarse disoluciones acuosas de esfinganos mediante un procedimiento que comprende tratar la disolución de esfingano con uno o más tensioactivos opcionales, uno o más agentes quelantes, uno o más agentes cáusticos u oxidantes, o una mezcla de los mismos, y tratarla después

\hbox{con cualquier enzima lisozima y/o
cualquier enzima  proteasa.}

En otra realización de esta invención, designada en adelante en la presente memoria como el "segundo protocolo", pueden clarificarse disoluciones acuosas de esfingano mediante un procedimiento que comprende tratar la disolución de esfingano con uno o más agentes quelantes, seguido de cualquier enzima lisozima, seguido de uno o más agentes cáusticos u oxidantes, seguido de cualquier enzima proteasa o una mezcla de enzimas proteasa.

En el primer protocolo, puede realizarse el procedimiento de esta invención por etapas, en el que la disolución de esfingano se trata en primer lugar con el(los) agente(s) quelante(s), tensioactivo(s) opcional(es), agente(s) cáustico(s)
u oxidante(s) o una mezcla de los mismos, y se trata después con cualquier enzima lisozima y/o cualquier enzima proteasa. En el segundo protocolo, puede realizarse el procedimiento por etapas, en el que la disolución de esfingano se trata en primer lugar con el(los) agente(s) quelante(s), después cualquier enzima lisozima, después el(los) agente(s) cáustico(s) u oxidante(s) y después cualquier enzima proteasa en ese orden.

Ventajosamente, el procedimiento para producir disoluciones de esfingano clarificado descrito en la presente memoria proporciona disoluciones de esfingano que pueden usarse, si se desea después de dilución apropiada, sin ningún tratamiento químico o mecánico adicional (excepto por pasteurización y precipitación). Para algunas aplicaciones, los esfinganos pueden aislarse a partir de estos caldos de esfingano clarificado pasteurizando el caldo, ajustando el caldo al pH deseado y precipitando el esfingano con un alcohol (concretamente, alcohol isopropílico) según técnicas convencionales.

La rehidratación y disolución de este esfingano en agua proporciona una disolución de esfingano sustancialmente transparente. Una disolución de esfingano sustancialmente transparente (1% p/p), según esta invención, tiene una transmitancia de luz mayor de aproximadamente 60%, preferiblemente mayor de 70%, y lo más preferiblemente mayor de 80%. La transmitancia de luz puede medirse a cualquier longitud de onda del espectro visible usando técnicas y equipos convencionales (por ejemplo, espectrofotómetros comercialmente disponibles). La transmitancia de luz se mide típicamente a longitudes de onda de 600 nm a 650 nm. La transmitancia de luz puede determinarse para varios tipos de disoluciones de esfingano: caldo no tratado, caldo parcialmente tratado (por ejemplo, caldo tratado sólo con agente(s)
quelante(s), agente(s) cáustico(s) u oxidante(s), mezcla de agente quelante/cáustico o agente quelante/oxidante, o un caldo tratado sólo con enzima lisozima y/o proteasa), caldo tratado o disoluciones de esfingano reconstituidas. Las disoluciones sustancialmente transparentes descritas en la presente memoria, que tienen una transmitancia de luz mayor de aproximadamente 60%, son disoluciones acuosas que contienen aproximadamente un 1% en peso del esfingano, aislado de un caldo tratado mediante el método según esta invención.

Las disoluciones de esfingano que pueden clarificarse usando el procedimiento de esta invención incluyen el caldo de fermentación completo que contiene esfinganos deficientes en PHB obtenidos mediante fermentación de un microorganismo productor de esfingano deficiente en PHB en un medio nutriente, disoluciones obtenidas mediante la adición de esfinganos deficientes en PHB aislados a medios acuosos y disoluciones de esfinganos deficientes en PHB parcialmente purificadas. Las disoluciones acuosas de esfinganos deficientes en PHB que contienen sólidos de fermentación indeseables útiles en el procedimiento de esta invención pueden contener 0,01% a 10% en peso de esfingano del peso total de la disolución. Puede usarse en la práctica de esta invención cualquier disolución acuosa que contenga cualquiera de los esfinganos.

La primera etapa de cualquier procedimiento de clarificación de esta invención comprende calentar una disolución de esfingano deficiente en PHB a la temperatura de clarificación mediante técnicas convencionales tales como control de temperatura en un tanque revestido o inyección directa de vapor. Se prefiere la inyección directa de vapor para minimizar el tiempo de calentamiento. La temperatura de clarificación está en el intervalo de 30ºC a 70ºC y, preferiblemente, de 50ºC a 60ºC. La cantidad de tiempo necesaria para calentar la disolución de esfingano a la temperatura deseada puede variar significativamente dependiendo del tamaño y el volumen de la disolución de esfingano a tratar. Por ejemplo, aunque puede llevar sólo varios minutos aumentar la temperatura de un volumen pequeño (por ejemplo, 50 ml) de disolución de esfingano desde temperatura ambiente a aproximadamente 60ºC, puede llevar varias horas aumentar de forma similar la temperatura de 40.000 l de disolución (por ejemplo, como puede estar presente en el procesamiento en lotes).

La siguiente etapa del procedimiento de esta invención comprende tratar una disolución acuosa de esfingano deficiente en PHB con un agente de clarificación seleccionado de al menos un agente quelante, al menos un agente cáustico u oxidante, o una mezcla de los mismos, según uno de los dos protocolos. Como alternativa, la adición de un agente de clarificación puede realizarse simultáneamente al calentamiento del caldo de esfingano a la temperatura de clarificación descrita anteriormente.

En el primer protocolo, la siguiente etapa es la adición del (de los) agente(s) quelante(s) a la disolución de esfingano en presencia de agente(s) cáustico(s) u oxidante(s). Típicamente, el tiempo de contacto para el(los) agente(s)
quelante(s) y agente(s) cáustico(s)/oxidante(s) está en el intervalo de 0,5 horas a 2 horas cada uno y, preferiblemente, de aproximadamente 1 hora para el(los) agente(s) quelante(s) y de 0,5 horas a 1,0 horas para el(los) agente(s) cáustico(s)
u oxidante(s). Típicamente, se añade el(los) agente(s) cáustico(s) u oxidante(s) a la disolución de esfingano a una concentración en el intervalo de 0 g/l a 2 g/l y, preferiblemente, de 0,5 g/l a 1,5 g/l. Típicamente, se añade el(los) agente(s)
quelante(s) a la disolución de esfingano a una concentración en el intervalo de 0 partes por millón ("ppm") a 3000 ppm y, preferiblemente, de 1000 ppm a 2000 ppm.

Después del tratamiento con el agente de clarificación en este primer protocolo, se somete el caldo de esfingano a una etapa de tratamiento enzimático, en la que se añaden las enzimas lisozima y/o proteasa al caldo de esfingano por separado o simultáneamente. Típicamente, se ponen en contacto las enzimas con el caldo de esfingano durante un periodo de tiempo en el intervalo de al menos 0,5 h a 8 h cada una, preferiblemente al menos 1 h cada una, y lo más preferiblemente al menos 2 h cada una. La concentración de lisozima típica está en el intervalo de 11.000 unidades MCG/l a 44.000 unidades MCG/l, preferiblemente de 20.000 unidades MCG/l a 25.000 unidades MCG/l; la concentración de proteasa típica está en el intervalo de 65.000 unidades Delft/l a 260.000 unidades Delft/l, preferiblemente de 100.000 unidades Delft/l a 150.000 unidades Delft/l. Como se usa en esta solicitud, una "unidad MCG" designa la velocidad de lisis de Micrococcus lysodeikticus comparada con un patrón de referencia a pH 6,6 y 37ºC como se describe por Genencor International Inc.; de forma similar, el término "unidad Delft" designa un ensayo específico que implica la velocidad de extinción de un caso en disolución proporcionado por el vendedor
Genencor.

Las enzimas usadas en la etapa de tratamiento enzimático degradan el desecho celular sólido a compuestos solubles, mejorando así la transmitancia de la disolución de esfingano y ayudando al procedimiento de clarificación. Las enzimas proteasa adecuadas para uso en este procedimiento pueden ser proteasas ácidas, neutras o alcalinas de fuentes bacterianas, fúngicas o vegetales. Las enzimas proteasa ácidas ilustrativas útiles en el procedimiento de esta invención incluyen, pero sin limitación, proteasas producidas por microorganismos del género Aspergillus, tales como A. niger. Las enzimas proteasa neutras útiles en el procedimiento de esta invención incluyen, pero sin limitación, proteasas tales como de Bacillus amyloliquifaciens. Las enzimas proteasa alcalinas útiles en el procedimiento de esta invención incluyen, pero sin limitación, de microorganismos del género Bacillus tales como B. subtilis, B. licheniformis y B. pumilis, proteasas elaboradas por especies de Streptomyces, tales como S. fradiae, S. griseus y S. rectus, y proteasas obtenidas a partir de subtilisinas, tales como subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, incluyendo proteasas tales como subtilopeptidasa A y subtilopeptidasa B. Las lisozimas adecuadas para uso en este procedimiento incluyen la lisozima Multifect® de Genencor International Inc. (Rochester, Nueva York) o cualquier lisozima que pueda obtenerse a partir de una planta, animal o fuente derivada de microbio. La fuente de cualquiera de las enzimas proteasa o lisozimas usadas en la presente invención no es crítica. Estas enzimas y los métodos de obtención de las mismas son bien conocidos en la técnica.

Como se describe anteriormente en el primer protocolo, las enzimas que comprende el tratamiento enzimático (tratamiento con enzimas lisozima y/o enzimas proteasa) pueden añadirse simultánea o separadamente. Tratamiento simultáneo designa la adición de la enzima proteasa y la enzima lisozima a la disolución de esfingano en cualquier orden durante cualquier periodo de tiempo, a condición de que ambas enzimas estén presentes en la disolución de esfingano durante el tratamiento. Cuando se añaden simultáneamente, el procedimiento de tratamiento enzimático de esta invención se realiza en condiciones tales que tanto las enzimas lisozima como las enzimas proteasa están activas y proporcionan la función enzimática deseada. El procedimiento de tratamiento enzimático simultáneo de esta realización puede realizarse a una temperatura de 30ºC a 70ºC a un pH de 5 a 9 y, preferiblemente, de 6 a 8. Aunque el intervalo de temperatura y pH específico de esta realización puede variar dependiendo de las enzimas usadas, en este tratamiento simultáneo, el procedimiento de la presente invención se realiza a temperaturas relativamente suaves y en condiciones casi neutras de tal modo que tanto las enzimas lisozima como las enzimas proteasa (proteasas ácida, neutra o alcalina) demuestren niveles aceptables de actividad para clarificar la disolución de
esfingano.

Preferiblemente, se realiza el tratamiento enzimático de tal modo que cualquier enzima lisozima y/o proteasa se añada separadamente cada una a la disolución de esfingano. Lo más preferiblemente, se añade separadamente cada enzima a la disolución de esfingano en sus condiciones de pH óptimas respectivas, concretamente, un intervalo de pH ácido a neutro para lisozima (intervalo de pH de 3 a 7,5) y un intervalo de pH neutro a básico para proteasa (intervalo de pH de 6,5 a 9). El intervalo de temperatura y pH al que diferentes enzimas lisozima y proteasa demuestran una actividad de clarificación óptima puede variar. Además, si debe hacerse una elección entre enzimas lisozima o enzimas proteasa para uso en el tratamiento enzimático, entonces el tratamiento enzimático comprende preferiblemente una o más enzimas proteasa.

En el segundo protocolo, la etapa quelante es seguida por el tratamiento enzimático con cualquier enzima lisozima, que es seguido por el tratamiento con uno o más agentes cáusticos u oxidantes, seguido del tratamiento enzimático con cualquier enzima proteasa. Como se ilustra anteriormente, el tratamiento enzimático se bifurca entre enzima(s) lisozima y enzima(s) proteasa. Esta secuencia alternativa permite a cualquier enzima lisozima actuar en sus condiciones de pH preferidas de neutras a ácidas, y permite a cualquier enzima proteasa actuar en sus condiciones de pH preferidas de neutras a básicas. Pueden usarse las mismas enzimas lisozima y proteasa, y agentes quelantes, tensioactivos y cáusticos u oxidantes, en la práctica del segundo protocolo como se describe anteriormente en el primer protocolo.

La agitación de la disolución de esfingano no es esencial, aunque cuando es factible se agita o remueve suave o periódicamente la disolución de esfingano para evitar un asentamiento indebido de los sólidos y promover el contacto con las enzimas.

Los agentes quelantes que son adecuados para uso en el procedimiento de esta invención son compuestos o composiciones que son capaces de secuestrar iones metálicos multivalentes (por ejemplo, Mg^{+2}, Ca^{+2}, etc.) en la disolución de esfingano formando complejos polidentados con los iones metálicos, formando un precipitado con los iones metálicos o adsorbiendo los iones metálicos. Preferiblemente, los agentes quelantes son compuestos o composiciones solubles en agua o agua-alcohol y son sales de metales alcalinos o alcalinotérreos de ácidos orgánicos y/o inorgánicos o sales de ácido orgánico/inorgánico de compuestos orgánicos básicos (que contienen amina), así como los ácidos orgánicos y/o inorgánicos o los compuestos básicos mismos. Otros agentes quelantes útiles en el procedimiento de esta invención son resinas de intercambio iónico catiónico, ácido carbónico y sales de ácido carbónico. Los compuestos y composiciones salinos que son particularmente útiles en el procedimiento de esta invención incluyen las sales de ácido etilendiaminotetraacético, ácido fosfórico, ácido metafosfórico, ácido carbónico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido pirofosfórico, ácido polifosfórico, ácidos metafosfóricos, ácido sacárico, ácido etilenglicol-bis-(beta-aminoetileter)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA), etilendiamina, 2,3-diaminobutano, 1,2-diaminociclohexano, triaminotrietilamina y similares. Las sales útiles pueden incluir las sales mono-, di-, tri- y/o tetrametálicas de los ácidos anteriores y las sales de mono-, di- o triácido de las bases anteriores, según sea apropiado. Preferiblemente, los agentes quelantes usados en el procedimiento de esta invención incluyen sales de ácido etilendiaminotetraacético, ácido cítrico, ácido fosfórico, ácido pirofosfórico, ácido polifosfórico, ácido carbónico, ácido metafosfórico y etilendiamina. Los ejemplos de agentes quelantes útiles incluyen, pero sin limitación, etilendiaminotetraacetato de disodio, etilendiaminotetraacetato de dipotasio, etilendiaminotetraacetato de tetrasodio, etilendiaminotetraacetato de tetrapotasio, citrato de trisodio, citrato de tripotasio, hexametafosfato de sodio, hexametafosfato de potasio, polifosfato de sodio, polifosfato de potasio, pirofosfato de sodio, pirofosfato de potasio, fosfato de monosodio, fosfato de monopotasio, fosfato de disodio, fosfato de dipotasio, fosfato de trisodio, fosfato de tripotasio, bicarbonato de sodio, carbonato de sodio, carbonato de potasio, bicarbonato de potasio, una resina de intercambio iónico catiónico, diclorhidrato de etilendiamina, diacetato de etilendiamina, sal de litio de etilendiamina, diyodhidrato de etilendiamina y similares. Más preferiblemente, se usa hexametafosfato de sodio como agente
quelante.

Como se describe en los protocolos anteriores, pueden usarse opcionalmente tensioactivos junto con los agentes cáusticos, oxidantes y quelantes para mejorar adicionalmente la transmitancia en el producto de gelano final. Los tensioactivos que son adecuados para uso en el procedimiento de esta invención son compuestos o composiciones que son capaces de formar emulsiones acuosas en presencia de sustancias hidrófilas e hidrófobas (sólidas o líquidas). Preferiblemente, los tensioactivos son compuestos o composiciones solubles en agua o agua-alcohol. Los ejemplos de tensioactivos útiles incluyen, pero sin limitación, SDS, monooleato de polioxietilensorbitán (Tween 80® de ICI Americas, Inc., Bridgewater, NJ), pero sin limitación SDS, lecitina, monoglicéridos, ésteres tartáricos de monoglicéridos, monoglicéridos fosfatados (por ejemplo, en forma de la sal monosódica), monoglicéridos lactilados, monoglicéridos acetilados, monoglicéridos succinilados, monoglicéridos etoxilados, ésteres de sorbitán, polisorbatos, ésteres de poliglicerol, ésteres de sacarosa, estearoil-lactilato de sodio, ésteres de propilenglicol y similares.

Los tensioactivos opcionales se añaden al caldo de esfingano en cualquier momento durante el tratamiento con
el(los)agente(s) quelante(s), agente(s) cáustico(s) u oxidante(s), durante un tiempo de contacto en el intervalo de 0,5 horas a 8 horas cada uno y, preferiblemente, de aproximadamente 2 horas. Típicamente, los tensioactivos se añaden a la disolución de esfingano a una concentración en el intervalo de 0,0 g/l a 3,0 g/l y, preferiblemente, de 0,1 g/l a 1,0 g/l. Típicamente, el(los) tensioactivo(s) se añade(n) a la disolución de esfingano a una concentración en el intervalo de 0 partes por millón ("ppm") a 300 ppm y, preferiblemente, de 300 ppm a 1.000 ppm.

Los agentes cáusticos que son adecuados para uso en el procedimiento de esta invención incluyen, pero sin limitación, hidróxido de potasio, hidróxido de sodio, fosfato de trisodio y similares. El hidróxido de potasio es el agente cáustico preferido. Como alternativa, pueden usarse agentes oxidantes en lugar de agentes cáusticos. Los agentes oxidantes que pueden usarse en el procedimiento de clarificación de la presente invención incluyen hipoclorito de sodio u otras sales de hipoclorito, dióxido de cloro, peróxido de hidrógeno, ácido peracético, ozono y otros agentes oxidantes bien conocidos en la técnica. En la presente invención, el agente oxidante preferido es hipoclorito de
sodio.

Debe observarse que el grado de clarificación efectuado por el tratamiento de la disolución de esfingano con agente(s) quelante(s), tensioactivo(s), agente(s) cáustico(s) u oxidante(s) o mezcla de los mismos puede afectar a las concentraciones de enzima o al tiempo necesario para completar el tratamiento enzimático posterior. Por ejemplo, aumentar la cantidad del(de los) agente(s) quelante(s), tensioactivo(s), agente(s) cáustico(s) u oxidante(s) o una mezcla de los mismos usados en este procedimiento puede reducir la cantidad de enzimas usada y/o el tiempo necesario para efectuar la clarificación de una disolución de esfingano. Es preferible el ajuste y equilibrado de la concentración y cantidad de tiempo de tratamiento de agente(s) quelante(s), tensioactivo(s), agente(s) cáustico(s) u oxidante(s) o mezcla de los mismos con la concentración y cantidad de tiempo de tratamiento de lisozima y/o proteasa para obtener disoluciones de esfingano para optimizar la producción de los esfinganos clarificados deficientes en PHB descritos en la presente memoria.

Los esfinganos deficientes en PHB y/o clarificados descritos en la presente memoria pueden usarse en una variedad de aplicaciones alimentarias o industriales. Por ejemplo, puede usarse un esfingano deficiente en PHB y/o clarificado tal como gelano nativo (rico en acilo) para mejorar el sabor, textura, estabilidad y apariencia de productos alimentarios tales como geles para postres, pastelería, mermeladas y jaleas, bebidas, películas, recubrimientos y similares. Como ejemplo adicional, un esfingano deficiente en PHB y/o clarificado tal como S-657 puede encontrar una eficacia mejorada como modificador reológico en aplicaciones industriales tales como la perforación de campos petrolíferos o sistemas de cementado. Otros esfinganos deficientes en PHB y/o clarificados de la presente invención encontrarán también un intervalo mayor de aplicación tanto en productos alimentarios como en la
industria.

Los siguientes ejemplos proporcionan ilustraciones de la presente invención y no debe malinterpretarse que limiten en modo alguno el alcance de la presente invención.

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Ejemplo 1

Generación de un fragmento de phaC de Sphingomonas elodea

Para identificar regiones altamente conservadas del gen PHB sintasa, se recuperaron secuencias de PHB sintasa de diversos organismos del Banco Genético del National Center for Biotechnology Information ("NCBI"). Se seleccionaron y estudiaron secuencias de Rhizobium meliloti (gb: U17227) (SEC ID Nº 1), Rhodobacter spaeroides (gb: L17049) (SEC ID Nº 4), Methylobacterium extorquens (gb: 07893) (SEC ID Nº 5), Alcaligenes eutrophus (gb: J05003) (SEC ID Nº 2) y Acinetobacter sp. cepa RA3849 (gb: L37761) (SEC ID Nº 3). Se alinearon las secuencias proteicas de los genes de PHB sintasa seleccionados como se representa en la Fig. 1. Entre las regiones conservadas, se seleccionaron la región I (codones 411-417 de R. meliloti) y la región II (codones 535-541 de R. meliloti) para proporcionar un producto de PCR de aproximadamente 408 pb basándose en su posición y relativamente bajo nivel de
degeneración.

Se diseñaron cebadores de PCR degenerados para amplificar la secuencia entre la región I y la región II basándose en las secuencias de proteína conservada y la preferencia de codón aparente de Sphingomonas elodea ATCC 31461. Se dedujo la preferencia de codón del uso de codón en cinco genes de la región que codifica enzimas biosintéticas exopolisacáridas en S. elodea ATCC 31461, secuenciados por el Dr. Luis Ielpi (no publicado) y del complejo génico de enzima biosintética exopolisacárida completa de Sphingomonas ATCC 31554 estrechamente relacionada, que produce goma S-88 (Yamazaki et al., J. Bacteriol. 178: 2676-2687 (1996)).

El cebador N-terminal, designado PHADG5 (SEC ID Nº 9), comprendía una región de abrazadera 5'-AGTT, un sitio XbaI TCTAGA y una región de hibridación degenerada TTC GAY CTS CTS TAY TGG AAY3' orientada a la región I. El cebador C-terminal, designado PHADG7 (SEC ID Nº 10), comprendía una región de abrazadera 5'-GTAT, un sitio SpeI ACTAGT, y una región degenerada CCA III SGG CCA CCA GCT GCC orientada a la región II. En la SEC ID Nº 10, "I" designa inosina, un nucleótido que es compatible con cualquier otra base, es decir, A, C, T
o G.

Se utilizaron los cebadores PHADG5 (SEC ID Nº 9) y PHADG7 (SEC ID Nº 10) en una reacción de PCR con ADN cromosómico de una cepa no mucoide, Gps31, que sirve como molde. La Gps31 es un mutante no productor de gelano de S-60. La polimerasa Taq con el anticuerpo Taq Start® de Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) proporcionó un inicio en caliente para PCR con 2,5 mM de cada dNTP, MgCl_{2} 4 mM y 50 pmol de cada cebador en un volumen de reacción de 100 \mul. El programa de temperatura fue de 5 minutos a 96ºC, 30 ciclos de 1 min a 96ºC, 1 min a 58ºC, 1 min a 72ºC y 5 min a 72ºC, antes de detener la reacción enfriando a 4ºC. La reacción PCR dio como resultado una sola banda al tamaño esperado de 416 pb (408 pb más abrazaderas). Después de la digestión con XbaI y SpeI, se clonó el fragmento en un vector pUC19 digerido con XbaI tratado con fosfatasa alcalina intestinal ("CIAP"), proporcionando el plásmido pEB1. Se ilustra en la Fig. 2 la secuencia de ADN del inserto de 408 pb (SEC ID Nº 6) de ambas cadenas. El fragmento contenía sitios de restricción de EcoRI, KpnI y PvuII. Un alineamiento del fragmento clonado traducido con otras proteínas PHB sintasa demostró que se había clonado una PHB sintasa.

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Ejemplo 2

Construcción de una deleción de phaC por PCR inversa

Se usó hibridación Southern para determinar una enzima de restricción apropiada que proporcionaría un fragmento mayor del gen phaC de S-60 de Sphingomonas que todavía no fuera demasiado grande para una recuperación sencilla por PCR inversa. Se aisló ADN cromosómico de Gps31 según el método descrito en el kit de purificación de ADN de QIAGEN® (Valencia, California). Un análisis Southern que usa una sonda generada a partir del inserto de 408 pb (SEC ID Nº 6) clonado en pEB1 demostró que, en una digestión con PstI de ADN de S. elodea, el fragmento de phaC de 408 pb (SEC ID Nº 6) residía en un fragmento de aproximadamente 2 kb.

Se usó la secuencia del fragmento de phaC de S-60 de Sphingomonas de 408 pb (SEC ID Nº 6) para seleccionar la lectura hacia fuera de cebadores de PCR, como se ilustra en la Fig. 2. El cebador PHAC12 (SEC ID Nº 11) lee hacia el extremo N-terminal de la proteína codificada por phaC con una abrazadera 5'GTTC, un sitio XbaI TCTAGA y una región de hibridación GGC GCG ATC AGC TTG TTG TC 3'. El cebador PHAC11 (SEC ID Nº 12) lee hacia el extremo C-terminal de la proteína codificada por phaC con una abrazadera 5' GTTC, un sitio XbaI TCTAGA y una región de hibridación GAG TCG CTC GAA TCC TTT GTC 3'. Se digirió ADN cromosómico de S. elodea con PstI y se ligaron 0,5 \mug de ADN en un volumen de 200 \mul para permitir la circularización. Se usó una digestión con KpnI para generar una molécula de ADN lineal como molde en una reacción PCR inversa para generar un fragmento de 1,7 kb de regiones flanqueantes del fragmento de phaC de 408 pb (SEC ID Nº 6), como se representa en la Fig. 3.

El fragmento de 1,7 kb comprende las dos regiones flanqueantes ligadas en una orientación inversa respecto a la orientación nativa en sus extremos PstI. La escisión en el sitio PstI indicaba que las regiones flanqueantes eran de tamaños similares, 850 pb y 980 pb. Para reorientar el fragmento a su orientación nativa y, simultáneamente, generar un fragmento con la mayoría del clon de 408 pb original eliminado, se digirió el fragmento de 1,7 kb con XbaI, se ligó consigo mismo en condiciones diluidas para permitir la circularización y se digirió después con PstI. Se clonó el fragmento resultante en pUC19 digerido con PstI y tratado con CIAP, y se designó pEB4.

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Ejemplo 3

Secuenciación del clon de phaC

Se secuenció el inserto de 1,7 kb en pEB4 y se combinó con la secuencia del fragmento de 408 pb (SEC ID Nº 6). Se representa en la Fig. 4 la secuencia de ADN combinada de 1920 pb (SEC ID Nº 7). Parte de esta secuencia, desde el sitio PstI al codón de terminación TGA (bases 1-1200) codifica una proteína (SEC ID Nº 8) que es homóloga con los dos tercios carboxi de otros genes phaC. El alineamiento de secuencia confirmó que se había clonado el gen apropiado.

El clon phaC tenía una deleción de 232 pb en el segmento de 408 pb y una inserción de 6 pb, TCTAGA, correspondiente al sitio XbaI. La deleción e inserción causaron una mutación del marco de lectura que alteró el extremo carboxi e introdujo un nuevo codón de terminación en el par de bases 1102.

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Ejemplo 4

Construcción de un vector de integración y transferencia a Sphingomonas mediante recombinación homóloga

Para transferir la mutación de deleción de phaC a Sphingomonas elodea, se usó un plásmido "suicida", que es capaz de replicación en un hospedador adecuado para la construcción de plásmido, por ejemplo, E. coli, pero incapaz de replicación en Sphingomonas. La selección en Sphingomonas de resistencia a antibiótico codificada por el plásmido identifica aquellas colonias en las que el plásmido se ha integrado en el cromosoma como resultado de recombinación homóloga. La selección de la pérdida de resistencia a antibiótico identifica aquellas colonias en las que la región duplicada se ha eliminado por recombinación, lo que puede dar como resultado la retención de la mutación (es decir, la deleción) o genes de tipo silvestre, que se representan esquemáticamente en la Fig. 5. La diferenciación entre clones con la deleción frente a clones con el ADN de tipo silvestre puede determinarse mediante la expresión fenotípica (síntesis de PHB). Para medir la expresión fenotípica de PHB, se usó un ensayo turbidimétrico cualitativo: se añadió una alícuota de caldo de aproximadamente 1 ml a 9 volúmenes de Clorox® (Clorox Co., Oakland, CA), y se incubó a 37ºC durante al menos 4 horas o durante una noche. La aparición de un precipitado blanco es indicativa de la presencia de PHB.

Para facilitar la detección de eventos de recombinación cruzada secundaria, se adaptó un sistema de selección positiva para S. elodea. El gen sacB de Bacillus subtilis, que codifica una levanosacarasa, puede transferirse a bacterias gramnegativas (Kamoun, S. et al., Mol. Microbiol. 6: 809-816 (1992); Gay, P. et al., J. Bacteriol. 164: 918-921 (1985)). El crecimiento de estas bacterias en sacarosa promueve la síntesis de levano, que es tóxico para las bacterias. En consecuencia, si el gen sacB está presente en un vector, puede usarse el crecimiento en sacarosa para identificar aquellos aislamientos que han perdido el vector.

Se obtuvo el plásmido pLO2 de Steven Slater de Cereon, Monsanto. El plásmido pLO2 contiene el gen sacB en un vector con resistencia a kanamicina, el origen de replicación ColEI y el origen de transferencia RP4 como se ilustra en la Fig. 6 (Lenz, O., et al., J. Bacteriol. 176: 4385-4393 (1994)). El plásmido pLO2 puede usarse para transferir genes mediante el procedimiento natural de conjugación. El plásmido puede replicarse en E. coli, pero no en Sphingomonas, y contiene un sitio para la movilización del plásmido pero no contiene funciones de transferencia. Es decir, el plásmido pLO2 es movilizable pero no autotransmisible. Los genes para función de transferencia conjugada se suministran en un segundo plásmido y funcionan en trans. Aunque este ejemplo usa el plásmido pLO2, su uso no es crítico. Un experto en la técnica sabría cómo diseñar y modificar por ingeniería genética un plásmido alternativo adecuado y transferirlo a Sphingomonas usando técnicas convencionales, tales como electroporación, transformación y similares. De forma similar, el uso de kanamcina como marcador seleccionable no es crítico. Un experto en la técnica sabría cómo elegir un marcador seleccionable alternativo apropiado.

Se ligó el fragmento PstI de 1,7 kb que contiene la deleción de phaC en pLO2 digerido con PstI, se designó pLO2-phaCv o pEB11, y se transfirió a YMC9 de E. coli (F-\DeltalacU169 thi endA hsdR) mediante transformación usando electroporación. Se purificó la cepa de E. coli y se mezcló con la cepa S-60wtc de Sphingomonas elodea, junto con la cepa JZ279 de E. coli que porta el plásmido pRK2013, que suministra funciones para transferencia conjugada (Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7347-7351 (1980)). S-60wtc es un derivado de la cepa S. elodea ATCC 31461, que se seleccionó como aislamiento espontáneo con capacidad aumentada de incorporar ADN de plásmido. Se realizó la transferencia conjugada usando cultivos en fase estacionaria (durante una noche), concretamente, 1 ml de YMC9/pLO2-phaC\Delta, 1 ml de JZ279/pRK2013 y 2-3 ml de Sphingomonas elodea. Se mezclaron los cultivos y se concentraron en un filtro, que se dispuso a su vez en una placa Petri TYE (8 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura y 5 g/l de cloruro de sodio) y se incubó a 37ºC durante 7 horas. Se suspendieron después las células en agua desionizada y se sembraron en medios selectivos. Después de aproximadamente 7 horas de incubación, se seleccionaron transconjugados resistentes a kanamicina de S-60wtc en medio YM (extracto de levadura 3 g/l, extracto de malta 3 g/l, peptona 5 g/l y glucosa 10 g/l) con estreptomicina 25 \mug/ml (para contraseleccionar E. coli) y kanamicina 7,5 \mug/ml para seleccionar el plásmido. La integración, medida por la resistencia a kanamicina, ocurrió a una frecuencia de 1,5 x 10^{-6}.

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Ejemplo 5

Selección de cepas de deleción cruzada secundaria

Se purificaron dos integrantes resistentes a kanamicina y se pasaron tres veces por medio YEME no selectivo (0,25% de extracto de levadura, 0,025% de extracto de malta), después se sembraron en sacarosa al 7,5% para seleccionar los cruzamientos. Se obtuvieron siete cruzamientos sensibles a kanamicina, pero todos eran positivos de PHB. Se usó un ensayo PCR para verificar que el vector phaCv estaba insertado en la región phaC del cromosoma y para determinar la localización del inserto respecto a los genes phaC de tipo silvestre. Se diseñaron cebadores homólogos con regiones flanqueantes de la deleción y con los extremos del vector. La recombinación puede ocurrir en dos orientaciones que dan como resultado: (1) el gen phaC con una deleción a la izquierda y un fragmento del gen phaC a la derecha del vector, que debería proporcionar un clon negativo de PHB; o (2) el gen phaC intacto a la izquierda y phaCv a la derecha del vector, que debería proporcionar un clon positivo de PHB como se representa en la
Fig. 7.

Los ensayos en seis de los integrantes cruzados simples pLO2phaCv demostraron que todos estaban en la segunda orientación, positiva de PHB, posiblemente favorecida. Puede haber una fuerte preferencia por la recombinación en un lado de la deleción o, como alternativa, la cepa positiva de PHB puede crecer mejor que el recombinante negativo de PHB. Las colonias en las que el plásmido se había integrado de la manera menos preferida de la primera orientación negativa de PHB podrían experimentar más probablemente un segundo evento de recombinación en el sitio preferido, dando como resultado un doble cruzamiento que retuviera el fenotipo mutante.

Se examinaron los transconjugados por PCR y se ensayó la expresión de PHB para identificar integrantes en la primera orientación, o negativa de PHB. De 24 colonias ensayadas, los resultados de PCR demostraron que 21 eran integrantes positivos de PHB y 3 eran negativos de PHB. Los ensayos de PHB confirmaron los resultados. Se seleccionaron las tres cepas negativas de PHB (3, 15 y 22), se purificaron, se cultivaron durante tres pasadas en condiciones no selectivas y se sembraron en sacarosa. De cinco colonias sensibles a kanamicina de cada original, una era negativa de PHB. Por tanto, se aislaron tres mutantes deficientes en PHB sensibles a kanamicina y se designaron NPG-1, NPG-2 y NPG-3.

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Ejemplo 6

Caracterización de mutantes para la biosíntesis de gelano

Se ensayaron NPG-1, NPG-2 y NPG-3 en fermentaciones de 10 l realizadas en fermentadores de 14 l y se compararon con LPG-2, que es un mutante deficiente en PHB aislado mediante mutagénesis química (patente de EE.UU. nº 5.300.429). Las etapas de fermentación y los medios usados fueron similares a los descritos en la patente de EE.UU. nº 5.300.429, excepto porque se usó el medio de la etapa 2 para todas las etapas de siembra. Se usaron tres etapas de siembra antes de la inoculación del medio final. Los volúmenes de transferencia fueron de 2,5-5%. Se usó un nitrógeno orgánico diferente (Quest Nzamine EKC, Chicago, Illinois a 0,41 g/l) en lugar de Promosoy a 0,5 g/l. el nivel de jarabe de maíz fue del 3% en lugar del 3,75% en las etapas de siembra. La fermentación de 10 l final fue similar a los medios de siembra, pero contenía menos fosfato (K_{2}HPO_{4} 0,5 g/l) y se controló el pH mediante la adición de KOH según fuera necesario. El nitrógeno orgánico fue mayor (1,1 g/l), así como el nitrógeno inorgánico (NaNO_{3}) (1,5 g/l). Se añadió antiespumante H-60-K a 0,6 ml/l. El nivel de jarabe de maíz fue del 3,85%. El medio en la etapa final estaba constituido por agua desionizada suplementada con calcio y magnesio.

Los mutantes NPG producían significativamente menos gelano que LPG-2, basándose en el material precipitable total ("MPT") y la viscosidad, como se muestra en la Tabla 1. Se determinó la viscosidad del caldo en un viscosímetro Brookfield con el huso número 4 a 60 rpm. Se determinó el material precipitable total calentando el caldo en un autoclave durante 10 minutos, después precipitando con dos veces el volumen de isopropanol y secando. Estos resultados fueron reproducibles. El análisis de las muestras de caldo durante la fermentación indicaron que se produjeron una gran cantidad de ácidos orgánicos. En consecuencia, el bajo rendimiento de gelano para los mutantes NPG se correlaciona con la mayor cantidad de hidrólisis de carbohidrato a intermedios de dos y tres carbonos y dióxido de carbono en ausencia de síntesis de PHB.

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TABLA 1 Sumario de los datos de fermentación de 10 l para cepas NPG

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1

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Ejemplo 7

Aislamiento de mutantes con productividad de gelano restaurada

La acumulación de intermedios metabólicos (por ejemplo, ácidos orgánicos) debido al bloqueo de la síntesis de PHB puede tener un efecto adverso sobre la síntesis de gelano. Se esperaba que, durante el crecimiento en un medio que promueve la síntesis de gelano, pudiera ocurrir una mutación compensatoria que permitiera proceder la síntesis de gelano a niveles normales. Se sembraron alícuotas de caldo de fermentación de fermentaciones de 10 l (ejemplo 6) para determinar los recuentos celulares (Fig. 8). Se observó que, hacia el final de la fermentación (concretamente a las 44 y 69 horas), aproximadamente entre 0,5% y 2% de las colonias era mayores y más mucoides que las cepas de NPG. Se purificaron estas colonias y se ensayó la producción de PHB y gelano en fermentaciones de matraz agitado. Los nuevos aislamientos eran deficientes en PHB y tenían un mayor rendimiento de gelano que los mutantes de NPG originales. Los mejores mutantes compensatorios tenían un material precipitable total comparable a LPG-2 y \geq 80% del tipo silvestre (se espera una reducción aproximada de 10-15% de MPT debido a la pérdida de peso de PHB). Estas cepas se designaron mutantes PDG. PDG-1 deriva de NPG-1 y PDG-3 deriva de NPG-3. Se evaluó la producción de PHB y gelano en cada una de las cepas en fermentaciones de matraz agitado.

TABLA 2 Experimento 1 Fermentación en matraz agitado para cepas deficientes en PHB

2

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Además, se determinaron las viscosidades de caldo de un segundo lote de S60-wtc, LPG-2, PDG-1 y PDG-3 usando un viscosímetro Brookfield con el huso número 4 a 60 rpm. Se muestran las viscosidades de caldo en la Tabla 3 siguiente.

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TABLA 3 Experimento 2 Viscosidades de caldo de cepas deficientes de PHB

3

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El medio usado para los matraces agitados fue similar al descrito en la patente de EE.UU. nº 5.300.429. La primera siembra contenía medio YM. Las etapas segunda y final eran de 100 ml por matraces agitados de 500 ml, que contenían medio como se describe anteriormente, pero con más fosfato para tamponar (K_{2}HPO_{4} 2,8 g/l, KH_{2}PO_{4} 1,2 g/l) y nitrógeno orgánico a 1,0 g/l.

Sin limitarse a teoría alguna, las nuevas mutaciones pueden ser mutantes espontáneos que limitan la degradación de glucosa a ácidos orgánicos. El análisis de las muestras de fermentadores durante el ciclo indicaron que la producción de ácidos orgánicos con PDG-1 y PDG-3 era aproximadamente la misma que la de las cepas de control S-60wtc y LPG-2.

La cepa PDG-1 producía constantemente un buen rendimiento de gelano de alta viscosidad con un MPT > 14 g/l.

Se evaluó la morfología de las colonias en las placas de estos cultivos para comprobar la estabilidad de las cepas y, particularmente, para comparar los mutantes PDG-1 espontáneos con las cepas NPG originales que tenían bajos rendimientos de gelano. Después de crecer en agar YM aproximadamente a 37ºC durante aproximadamente 60 horas, la PDG-1 mostró distintamente diferente morfología que su original NPG-1. No se observaron colonias con morfología de tipo NPG-1 en caldo de fermentaciones de PDG-1, lo que indica la estabilidad de la cepa.

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Ejemplo 8

Presencia de genes phaC homólogos en cepas de Sphingomonas distintas de S. elodea

Se identificaron genes homólogos de phaC en cepas de Sphingomonas distintas de Sphingomonas elodea, demostrando así la viabilidad de generar mutantes deficientes en PHB en cepas de Sphingomonas distintas de Sphingomonas elodea.

Se realizó hibridación de ADN Southern con cuatro cepas de Sphingomonas: ATCC 53159, que produce diutano (S-657); ATCC 31555, que produce welano (S-130); ATCC 31961, que produce ramsano (S-194) y ATCC 31461, que produce gelano (S-60) como control. Se aisló el ADN genómico de cada cepa y se digirió con la enzima EcoRI. Se separaron muestras de ADN genómico digerido (1 \mug) en un gel de agarosa al 1% y se transfirieron a membranas de nailon mediante acción capilar usando un Turboblotter® de Schleicher y Schuell (Keene, Nueva Hampshire) en condiciones neutras.

Usando los cebadores degenerados PHADG5 y PHADG7 (véase el ejemplo 1), se preparó una sonda marcada con digoxigenina mediante amplificación por PCR de una región interna del gen phaC de S-657 de Sphingomonas con digoxigenina-11-dUTP según el protocolo del fabricante, Roche Molecular Biochemicals, Suiza. Se realizó la hibridación en condiciones neutras usando DigEasyHyb® de Roche Diagnostics (Mannhein, Alemania) según el protocolo del fabricante. Se hibridaron los filtros a 44ºC, que es 10ºC menos que la T_{ópt} calculada. Se espera que estas condiciones den como resultado la hibridación de moléculas de ADN que son más de un 90% idénticas (Birren, B. et al., ed. "Genomic Analysis, A Laboratory Manual" (1997). Como se usa en la presente memoria, el término T_{ópt} se define como T_{m-20}, en el que T_{m} se define por la fórmula 50 + 0,41 (%GC) - 600/longitud de la sonda, en la que el %GC es 65% y la longitud de la sonda es de 400 nucleótidos. Se lavaron los filtros con 2 x SSC, 0,1% de SDS dos veces durante 15 minutos a 44ºC y se revelaron usando un conjugado anti-digoxigenina-fosfatasa alcalina y un kit de detección de digoxigenina según el protocolo del fabricante (Roche Molecular
Biochemicals).

Se muestran los resultados de la hibridación en la Fig. 9. Se detectó una banda digerida con EcoRI del tamaño esperado (2,6 kb) en las cepas de Sphingomonas ATCC 31461. Las cepas de Sphingomonas ATCC 53159 y ATCC 31961 produjeron una banda de exactamente el mismo tamaño. Sphingomonas ATCC 31555 contenía un fragmento de 2,4 kb que hibridaba con la sonda phaC. Por tanto, la hibridación de ADN Southern confirmaba que estas tres cepas contienen un gen similar a phaC y que podrían generarse cepas deficientes en PHB según los métodos descritos en la presente memoria.

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Ejemplo 9

Construcción de cepas mutantes de ATCC 53159 que tienen deleciones de phaC

Usando técnicas de ADN recombinante, se construyeron cepas mutantes de Sphingomonas ATCC 53159 en las que se eliminó completamente el gen phaC. La construcción de la cepa mutante se realizó como sigue: se amplificaron regiones de ADN flanqueantes del gen phaC por PCR y se clonaron en un vector suicida, se transfirió el vector suicida que contenía los productos de PCR flanqueantes mediante conjugación a células ATCC 53159, después se consiguió la integración del plásmido entero en un locus homólogo directamente cadena arriba o cadena abajo de phaC en el cromosoma de Sphingomonas ATCC 53159 mediante selección de resistencia a kanamicina (como se codifica por el vector). La escisión del locus phaC más el ADN de vector del cromosoma fue el resultado de un evento cruzado secundario posterior que se seleccionó mediante sensibilidad a sacarosa codificada en el
vector.

Para aislar clones que contienen el gen phaC y regiones flanqueantes, se prepararon bibliotecas de ADN genómico y se examinaron por PCR, usando cebadores PHADG5 y PHADG7 (véase el ejemplo 1 anterior). Se prepararon dos bibliotecas genómicas, una con fragmentos de enzima de restricción NotI en el vector pZERO-2 (Invitrogen, Carlsbad, CA), la segunda con fragmentos de digestión parcial con Sau3A en pLAFR3 (Staskawicz et al., J. Bacteriol. 169: 5789-5784 (1987)). Se aisló un clon positivo de cada biblioteca. Se subclonaron fragmentos BamHI-NotI de estos plásmidos y se secuenciaron los fragmentos apropiados para determinar la secuencia de ADN del gen phaC y las regiones 5' y 3' flanqueantes. Los plásmidos p21-7 y pJCS104-2 contienen respectivamente los extremos 5' y 3' del gen phaC y regiones flanqueantes.

Se muestran en la Fig. 10 las secuencias de ADN del gen phaC y regiones flanqueantes. Se muestra un mapa genético en la Fig. 11. Se determinaron los marcos abiertos de lectura mediante la presencia de codones de inicio y terminación y análisis BLAST combinado con las regiones de codificación predichas usando análisis de Borodovsky (módulo Lasergene GeneQuest) y la matriz P_aeruginosa_3.mat de GeneMark. Se liga la secuencia de las secuencias de inserto en clones p21-7 y pJCS104-2. La unión entre las dos secuencias es en el sitio NotI.

La Fig. 12 representa cómo se usó PCR para preparar un producto pJCS105 112-1 que contiene sólo las regiones flanqueantes de phaC, eliminando el gen phaC entero (1737 pb), desde el primer nucleótido del codón de inicio al último nucleótido del codón de terminación. Se combinaron dos cebadores externos (cebador 1Xba y cebador 4Xba) con un cebador (superposición1) que cubre la unión deseada entre las regiones cadena arriba y cadena abajo de phaC. Se muestran en la Tabla 4 las secuencias cebadoras.

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TABLA 4 Secuencias cebadoras para deleción de phaC en ATCC 53159

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Se mezclaron los plásmidos pJCS104-2 y p21-7 (200 ng cada uno) con los cebadores 1Xba y 4Xba (50 pmol cada uno), el cebador superposición1 (2 pmol), dNTP y polimerasa Taq del kit de PCR Advantage High Fidelity 2 de Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) según el protocolo del fabricante. Se realizó después la amplificación durante 1 min a 95ºC, 5 ciclos de 30 s a 95ºC, 30 s a 44ºC, 2 min a 68ºC, después 20 ciclos de 30 s a 95ºC, 30 s a 53-68ºC, 2 min a 68ºC, seguido de un solo ciclo de 3 min a 68ºC, en un Thermocycler Matrix. Se purificó el fragmento de ADN amplificado de un gel y se amplificó adicionalmente con los mismos cebadores, produciendo más producto. Las condiciones de amplificación fueron 1 min a 95ºC, 25 ciclos de 30 s a 95ºC, 30 s a 64ºC, 2 min a 68ºC, después un solo ciclo a 68ºC. Se aisló después una banda de 1,1 kb del gel usando el kit de purificación de gel SNAP® (Invitrogen) y se clonó en el vector pCRII-TOPO (Invitrogen) usando topoisomerasa, un vector con salientes 3'T y células TOP10 químicamente competentes, según el protocolo de Invitrogen, formando pJC105-112-1 como se muestra en la
Fig. 12.

Se purificó en gel el fragmento XbaI de 1,1 kb que contenía el constructo de deleción de phaC de pJCS105 112-1 y se clonó en pLO2 digerido con XbaI. Se recuperaron dos orientaciones del inserto y se designaron pJCS106-5 y pJC106-16.

Se usó el intercambio de marcadores para preparar una cepa deficiente en PHB de ATCC 53159. Se introdujeron los plásmidos pJCS106-5 y pJC106-16 en ATCC 53159 mediante transconjugación, como por el ejemplo 4 anterior. La selección de la primera y segunda cepas de deleción cruzada secundaria procedió como por los ejemplos 4 y 5 anteriores, concretamente, seleccionado en primer lugar la integración como se muestra por la resistencia a kanamicina y sembrando después en sacarosa para seleccionar los cruzamientos sensibles a kanamicina. Se detectaron los cruzamientos de deleción (frente a tipo silvestre) mediante PCR de diagnóstico, y se designaron NPD-3 (derivado de pJCS106-5) y NPD-6 (derivado de pJCS106-16). Las cepas NPD-3 y NPD-6 resultantes tienen una deleción cromosómica precisa de phaC sin ADN extraño restante. Sin embargo, los rendimientos de goma de estas cepas de deleción se redujeron en gran medida, pero se aislaron posteriormente supresores que restauraron la producción de goma tras crecer en fermentación.

Se cultivaron NPD-3 y NDP-6 en condiciones de promoción de la síntesis de S-657, y se seleccionaron las cepas supresoras que tienen grandes colonias mucoides, como se hizo para la síntesis de gelano del ejemplo 7 anterior. Estas grandes colonias mucoides se designaron PDD-3 y PDD-6, como por las colonias de las que derivaban, y se analizó la producción de PHB y S-657. Las cepas PDD-3 y PDD-6 están en depósito en la American Type Culture Collection y se designan como ATCC Nº y ATCC nº, respectivamente. La Tabla 5 siguiente indica que PDD-6 proporcionaba mayor producción de goma que su cepa NPD-6 predecesora, aunque tampoco producía cualitativamente
PHB.

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TABLA 5 Resultados de fermentación para S-657 en cepas deficientes en PHB

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Ejemplo 10

Efecto de la concentración de hidróxido de potasio sobre la transmitancia y resistencia de gel

Se evaluó el efecto de la concentración del agente cáustico hidróxido de potasio ("KOH") en el procedimiento de clarificación que comprende las etapas expuestas anteriormente como primer protocolo. Se pretrató un caldo de fermentación de gelano que comprendía un mutante deficiente en PHB y se mezcló con concentraciones variables de KOH durante 15 min, seguido de 1000 ppm de Calgon como agente quelante durante 1 h, seguido secuencialmente de 22 ppm de lisozima y 220 ppm de proteasa durante 2 horas cada una a 55ºC. La concentración de KOH ensayada variaba entre aproximadamente 0,0 g/l y aproximadamente 0,45 g/l. Como se representa en la Fig. 13, la transmitancia aumentó casi un 20% (31% de aumento relativo), a medida que la concentración de KOH aumentaba a
0,45 g/l.

El TA-TX2 Texture Analyzer® (Texture Technologies Corp., Scarsdale, NY) mide los datos de resistencia de gel como el producto de dos indicadores, la cantidad de fuerza de punción y la distancia necesaria para fracturar una superficie de gel preparada con un émbolo sensible a la presión. La fuerza de punción se determina cuando una celda de carga detecta una rotura en la superficie del gel, y la fuerza de punción se determina como el cambio porcentual de altura. Como se representa en la Fig. 14, la resistencia de gel con respecto a la fuerza de punción se reducía 280 g, o un 32%, frente al mismo intervalo de KOH ensayado, lo que puede ser atribuido a la desacilación parcial del gelano. Sin embargo, la resistencia de gel con respecto a la distancia porcentual no parecía afectarse significativamente, reflejando sólo un 1,5% de cambio.

Se realizó un pequeño estudio factorial de 2 x 2 según el procedimiento de clarificación del primer protocolo. Se pretrató un caldo de fermentación de gelano que comprendía un mutante deficiente en PHB y se mezcló con concentraciones variables de KOH durante 15 min, seguido de 2000 ppm de Calgon como agente quelante durante 1 h, seguido secuencialmente de 22 ppm de lisozima y 220 ppm de proteasa durante 2 horas cada una a 55ºC. En este estudio, se estudiaron la transmitancia porcentual, la fuerza de punción y la distancia porcentual debido a que se cree que están interrelacionados con la cinética. La concentración de KOH variaba entre aproximadamente 0,225 g/l y aproximadamente 0,45 g/l, y la temperatura variaba entre aproximadamente 55ºC y aproximadamente 60ºC, produciendo los resultados mostrados en las siguientes tablas, que demuestran que los resultados de transmitancia porcentual, fuerza de punción y distancia porcentual evalúan el efecto de la concentración de KOH y la temperatura sobre la clarificación del gelano.

TABLA 3

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7

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Como se demuestra en las tablas, la transmitancia no cambió mucho tras aumentar la concentración de KOH o la temperatura separadamente. Sin embargo, la transmitancia aumentó aproximadamente un 6% cuando aumentaron tanto la concentración de KOH como la temperatura, lo que indica que ambos parámetros son críticos y aditivos para conseguir una transmitancia aumentada. De forma similar, la resistencia de gel exhibía un efecto aditivo. La fuerza de punción se redujo en aproximadamente 130 g a aproximadamente 190 g tras aumentar la temperatura o la concentración de KOH individualmente; sin embargo, tras aumentar tanto la temperatura como la concentración de KOH, la fuerza de punción se redujo en aproximadamente 326 g, sugiriendo por tanto que la resistencia de gel es sensible a cambios tanto de temperatura como de concentración de KOH.

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Ejemplo 11

Efecto de hexametafosfato de sodio sobre las propiedades de gelano

Se evaluó el efecto del hexametafosfato de sodio ("SHMP"), que es también conocido como Calgon, sobre la transmitancia, fuerza de punción y distancia porcentual según el procedimiento de clarificación descrito en el ejemplo 10 anterior. Se pretrató un caldo de fermentación de gelano que comprendía un mutante deficiente en PHB y se mezcló con KOH 0,45 g/l durante 15 min, seguido de concentraciones variables de Calgon durante 1 h, seguido secuencialmente de 22 ppm de lisozima y 220 ppm de proteasa durante 2 horas cada una a 55ºC. La concentración de SHMP variaba entre aproximadamente 1.000 ppm y aproximadamente 3.000 ppm, y como se demuestra en la Fig. 15, existe una correlación lineal entre la concentración de SHMP y la transmitancia en este intervalo. Un aumento de aproximadamente 1.000 ppm de SHMP da como resultado un aumento de aproximadamente un 5% de transmitancia. Como se muestra en la Fig. 16, el SHMP no parece afectar a la resistencia de gel, porque tanto la fuerza de punción como la distancia porcentual están relativamente no afectadas por el aumento de la concentración de SHMP en el intervalo ensayado.

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Ejemplo 12

Secuencias de clarificación alternativas con SHMP

Se realizaron dos variaciones del método de clarificación en caldo de gelano nativo a escala de 2 l. Según la información suministrada por el fabricante Genencor International, Inc., (Rochester, Nueva York), la lisozima Multifect® es estable a niveles de pH ácido a neutro y puede inactivarse a pH alcalino en un corto periodo de tiempo. Después de la adición de 0,45 g/l de KOH según el procedimiento de clarificación, el pH generalmente supera el pH 8, que es subóptimo para la lisozima, mientras que la proteasa funciona supuestamente bien en estas condiciones. Por tanto, se modificó el procedimiento de clarificación como por el segundo protocolo, para añadir KOH después del tratamiento con enzima lisozima (sumario de secuencia: lisozima, después KOH, después proteasa). Si se añadía KOH antes o después del tratamiento enzimático con lisozima, se observaba una desviación estándar relativa del 5,5% ("DER"), como se muestra en la siguiente tabla.

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TABLA 5

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8

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Ejemplo 13

Formulación de pastelería

Este ejemplo demuestra una formulación que puede usarse para producir un dulce masticable elástico y resistente que exhibe una excelente transparencia y estabilidad.

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Se combinaron los componentes que comprenden la parte A en un recipiente de calentamiento y se calentaron a 40ºC.

Se combinaron en seco los componentes de la parte B, se añadieron rápidamente al recipiente de calentamiento, y se llevaron a ebullición. Se redujo la muestra a un 72% de sólidos. Se combinaron los componentes de la parte C, se añadieron aroma y color y se mezclaron hasta homogeneidad.

Se dispuso el material en un depositador y se coló en moldes de almidón preparados. Se almacenaron después los moldes de almidón rellenos a 30ºC y 35% de humedad relativa durante 3 a 4 días hasta que el nivel de sólidos alcanzó entre aproximadamente 82% y 85%. Se desmoldeó el material, se enceró y almacenó en bolsas selladas.

Puede añadirse agua adicional a los ingredientes de la parte A para facilitar la hidratación completa de los hidrocoloides.

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Ejemplo 14

Formulación de gel para postres

Se usó esta formulación para producir un gel para postres elástico y resistente con excelente transparencia y estabilidad.

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Se combinaron en seco los ingredientes de la parte A, además de aroma y color secos, se dispersaron en la parte A, se mezclaron y se calentaron a 90ºC. Se vertió después la mezcla en envases adecuados y se dejó asentar a temperatura ambiente.

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Ejemplo 15

Formulación de jalea

Esta formulación proporcionó una jalea con excelente transparencia, estabilidad al almacenamiento, liberación de aroma y capacidad de dispersión.

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Se combinaron los ingredientes de la parte A. Se combinaron en seco los ingredientes de la parte B y se dispersaron con los ingredientes de la parte A con mezclado. Se llevó a ebullición la mezcla resultante con mezclado y se mantuvo durante aproximadamente 1 a aproximadamente 3 minutos, en cuyo momento se añadieron con agitación los ingredientes de la parte C a la mezcla. Se depositó después la mezcla en jarras esterilizadas y se sellaron.

Aunque la presente invención se describe anteriormente con respecto a lo que se considera actualmente que son sus realizaciones preferidas, ha de entenderse que la invención no está limitada a lo descrito anteriormente. Por el contrario, se pretende que la invención cubra diversas modificaciones y disposiciones equivalentes incluidas dentro del espíritu y alcance de las reivindicaciones adjuntas.

<110> Bower, Stan

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Burke, Ellen

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Harding, Nancy E.

\hskip1cm

Patel, Yamini N.

\hskip1cm

Schneider, J. Carrie

\hskip1cm

Meissner, Dagmar

\hskip1cm

Morrison, Neil

\hskip1cm

Bezanson, Ralph

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<120> CEPAS BACTERIANAS MUTANTES DEL GÉNERO SPHINGOMONAS DEFICIENTES EN LA PRODUCCIÓN DE POLIHIDROXIBUTIRATO Y UN PROCEDIMIENTO DE CLARIFICACIÓN DE POLISACÁRIDOS Y COMPOSICIONES DEL MISMO

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<130> 2047.144

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<140>

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<141>

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<150> 60/186.433

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<151> 02-03-2000

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<160> 16

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 577

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<212> PRT

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<213> Rhizobium meliloti

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<400> 1

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13

14

15

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<210> 2

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<211> 589

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<212> PRT

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<213> Alcaligenes eutrophus

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<400> 2

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16

17

18

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<210> 3

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<211> 590

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<212> PRT

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<213> Acinetobacter sp. cepa RA3849

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<400> 3

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19

20

21

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<210> 4

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<211> 601

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<212> PRT

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<213> Rhodobacter sphaeroides

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<400> 4

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22

23

24

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<210> 5

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<211> 605

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<212> PRT

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<213> Methylobacterium extorquens

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<400> 5

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25

26

27

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<210> 6

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<211> 408

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<212> ADN

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<213> Sphingomonas elodea

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<400> 6

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28

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<210> 7

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<211> 1925

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<212> ADN

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<213> Sphingomonas elodea

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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29

30

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<210> 8

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<211> 399

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<212> PRT

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<213> Sphingomonas elodea

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<400> 8

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31

32

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<210> 9

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador PHADG5 de PCR para asociar con fragmento del gen phaC de Sphingomonas elodea

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<400> 9

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33

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<210> 10

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador PHADG7 de PCR para asociar con fragmento del gen phaC de Sphingomonas elodea

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<400> 10

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34

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<210> 11

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador PHAC12 de PCR para asociar con fragmento del gen phaC de Sphingomonas elodea

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<400> 11

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35

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<210> 12

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador PHAC11 de PCR para asociar con fragmento del gen phaC de Sphingomonas elodea

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<400> 12

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36

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<210> 13

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<211> 3180

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<212> ADN

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<213> Sphingomonas ATCC 53159

\newpage

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<400> 13

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37

38

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<210> 14

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 1Xba de PCR para asociar con fragmento del gen ATCC 53159 de Sphingomonas sp.

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<400> 14

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39

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<210> 15

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 4Xba de PCR para asociar con fragmento del gen ATCC 53159 de Sphingomonas sp.

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<400> 15

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40

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<210> 16

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Sphingomonas sp. ATCC 531559

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<400> 16

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41

Claims (27)

1. Una cepa mutante del género Sphingomonas, en la que se muta selectivamente o elimina un gen que codifica una proteína implicada en la síntesis de polihidroxibutirato de tal modo que la cepa mutante produzca un esfingano sin producir también polihidroxibutirato.

2. La cepa mutante según la reivindicación 1, en la que la cepa mutante produce un esfingano seleccionado del grupo consistente en S-7, S-60, S-88, S-130, S-194, S-198, S-657, NW-11 y B-16.

3. La cepa mutante según la reivindicación 1, en la que se selecciona al menos un gen que codifica una proteína implicada en la síntesis de polihidroxibutirato del grupo consistente en phaA, phaB y phaC.

4. La cepa mutante según la reivindicación 3, en la que se muta selectivamente o elimina el gen phaC.

5. La cepa mutante según la reivindicación 4, en la que el esfingano es S-60.

6. La cepa mutante según la reivindicación 4, en la que el esfingano es S-657.

7. Un procedimiento para producir un esfingano deficiente en PHB, en el que el procedimiento comprende fermentar una cepa mutante del género Sphingomonas definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un caldo de fermentación acuoso.

8. Una secuencia de ADN aislada de Sphingomonas elodea, en la que la secuencia de ADN codifica una PHB sintasa que tiene la secuencia nucleotídica expuesta en la SEC ID Nº 7.

9. El procedimiento según la reivindicación 7, comprendiendo dicho procedimiento las etapas a) a c) para la clarificación de dicho esfingano deficiente en PHB:

a) calentar dicho caldo de fermentación a una temperatura de clarificación de 30ºC a 70ºC;

b) tratar el caldo de fermentación con al menos un agente de clarificación seleccionado del grupo consistente en un agente quelante, agente cáustico, agente oxidante y una mezcla de los mismos; y

c) tratar el caldo de fermentación con enzimas.

10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que la etapa a) y la etapa b) se realizan simultáneamente.

11. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que el caldo de fermentación se trata con al menos un agente quelante.

12. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que el caldo de fermentación se trata con al menos un agente cáustico.

13. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que el caldo de fermentación se trata con al menos un agente oxidante seleccionado del grupo consistente en hipoclorito de sodio u otras sales hipoclorito, dióxido de cloro, peróxido de hidrógeno, ácido peracético y ozono.

14. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que el caldo de fermentación se trata al menos un agente cáustico y al menos un tensioactivo.

15. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que el tratamiento con la enzima se realiza a un pH de 5 a 9.

16. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que se selecciona el al menos un agente quelante de ácido etilendiaminotetraacético, ácido fosfórico, ácido metafosfórico, ácido carbónico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido pirofosfórico, ácido polifosfórico, ácidos metafosfóricos, ácido sacárico, ácido etilenglicol-bis-(beta-aminoetileter)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA), etilendiamina, 2,3-diaminobutano, 1,2-diaminociclohexano, triaminotrietilamina o una sal de los mismos.

17. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que se selecciona el al menos un agente quelante de etilendiaminotetraacetato de disodio, etilendiaminotetraacetato de dipotasio, etilendiaminotetraacetato de tetrasodio, etilendiaminotetraacetato de tetrapotasio, citrato de trisodio, citrato de tripotasio, hexametafosfato de sodio, hexametafosfato de potasio, polifosfato de sodio, polifosfato de potasio, pirofosfato de sodio, pirofosfato de potasio, fosfato de monosodio, fosfato de monopotasio, fosfato de disodio, fosfato de dipotasio, fosfato de trisodio, fosfato de tripotasio, bicarbonato de sodio, carbonato de sodio, carbonato de potasio, bicarbonato de potasio, una resina de intercambio iónico catiónico, diclorhidrato de etilendiamina, diacetato de etilendiamina, sal de litio de etilendiamina, diyodhidrato de etilendiamina y mezclas de los mismos.

18. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que el agente cáustico se selecciona del grupo consistente en hidróxido de potasio, hidróxido de sodio y fosfato de trisodio.

19. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que el procedimiento incluye las etapas de:

a) calentar dicho caldo de fermentación a una temperatura de clarificación de 30ºC a 70ºC;

b) tratar con un agente quelante;

c) tratar con una enzima lisozima;

d) tratar con un agente cáustico o agente oxidante; y

e) tratar con una enzima proteasa.

20. El procedimiento según la reivindicación 19, en el que el tratamiento con la enzima lisozima se realiza a un pH de 3 a 7,5.

21. El procedimiento según la reivindicación 19, en el que el tratamiento con la enzima proteasa se realiza a un pH de 6,5 a 9.

22. El procedimiento según la reivindicación 9 ó 19, en el que dicho procedimiento comprende adicionalmente aislar el esfingano deficiente en PHB clarificado del caldo de fermentación.

23. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que el caldo de fermentación se trata adicionalmente con un tensioactivo en la etapa b).

24. El procedimiento según la reivindicación 23, en el que el caldo de fermentación se trata con un agente quelante y al menos un tensioactivo.

25. El procedimiento según la reivindicación 23, en el que el al menos un tensioactivo se selecciona de SDS, monooleato de polioxietilensorbitán, lecitina, un monoglicérido, un éster tartárico de monoglicérido, un monoglicérido fosfatado, un monoglicérido lactilado, un monoglicérido acetilado, un monoglicérido succinilado, un monoglicérido etoxilado, un éster de sorbitán, un polisorbato, un éster de poliglicerol, un éster de sacarosa, un estearoil-lactilato de sodio y un éster de propilenglicol.

26. El procedimiento según la reivindicación 22, en el que una disolución acuosa del esfingano deficiente en PHB aislado posee una transmitancia de luz de al menos 60%.

27. Una secuencia de ADN aislada de Sphingomonas sp. ATCC 53159, en la que la secuencia de ADN codifica una PHB sintasa y regiones flanqueantes que tienen la secuencia nucleotídica expuesta en la SEC ID Nº 13.