JP5481377B2 - Ｎ末端のアミノ酸が変性したインスリン分泌ペプチド誘導体 - Google Patents

Description

本発明はインスリン分泌活性が向上したインスリン分泌ペプチド誘導体に関する。より詳しくは、本発明は高い安定性及びインスリン分泌活性を有するＮ末端アミノ酸が変性したインスリン分泌ペプチドに関する。

ペプチドは、一般に安定性が低くて容易に変性され、体内タンパク質分解酵素によって分解されてその活性を失い、さらに相対的に小さくて腎臓を通じて容易に除去される。よって、薬理成分としてペプチドを含む医薬品の血中濃度及び力価を維持するためには、ペプチド薬物を患者にたびたび投与する必要がある。しかし、ペプチド薬物は大部分注射剤の形態で患者に投与され、よって生理活性ペプチドの血中濃度を維持するためにたびたび注射することになるが、これは患者の激しい痛みを引き起こすことになる。このような問題点を解決するために多様な試みがあった。その一つとして、ペプチド薬物の生体膜透過度を増加させ、口腔または鼻腔を通じての吸入でペプチドの薬物を体内に伝達する試みがあった。しかし、このような方法は、注射剤に比べてペプチドの体内伝達効率が著しく低く、ペプチド薬物の体内活性を要求条件に維持するのには未だ困難が多い。

一方、ペプチド薬物の血中安定性を増加させ、血中薬物濃度を長時間高く維持させて薬効を最大化しようとする努力が続いて行われた。このようなペプチド薬物の持続型製剤はペプチド薬物の安定性を高めるとともに薬物そのもの力価が充分に高く維持されなければならなく、患者に免疫反応を誘発してはいけない。

ペプチドを安定化させ、タンパク質分解酵素による分解を抑制するための方法として、タンパク質分解酵素に敏感な特定のアミノ酸配列を変更する試みがあった。例えば、血中グルコース濃度を減少させる作用をして第２型糖尿病治療効能を持つＧＬＰ−１（７−３７または７−３６ａｍｉｄｅ）の場合、生理活性半減期が約４分以下と（Ｋｒｅｙｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９８７）非常に短い。これはジペプチジルペプチダーゼ（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｄｉｄａｓｅ ＩＶ、以下‘ＤＰＰ ＩＶ’という）によるＧＬＰ−１のアミノ酸８番（Ａｌａ）と９番（Ａｓｐ）の間の切断によるＧＬＰ−１の力価の喪失に起因する。したがって、ＤＰＰ ＩＶに抵抗性を持つＧＬＰ−１類似体に対する多くの研究が行われたが、Ａｌａ８をＧｌｙに置換するか（Ｄｅａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９８；Ｂｕｒｃｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９９９）またはＬｅｕ，Ｄ−Ａｌａに置換して（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．、２００１）ＤＰＰ ＩＶに対する抵抗性を増加させるとともに活性を維持する試みがあった。また、ＧＬＰ−１のＮ末端アミノ酸Ｈｉｓ７はＧＬＰ−１の活性に非常に重要であり、ＤＰＰ ＩＶのターゲットである。したがって、米国特許第５，５４５，６１８号ではＮ末端をａｌｋｙｌまたはａｃｙｌ ｇｒｏｕｐに変形し、Ｇａｌｌｗｉｔｚらは７番ＨｉｓをＮ−メチル化（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、アルファ−メチル化（ａｌｐｈａ−ｍｅｔｙｌａｌｔｉｏｎ）させるかＨｉｓ全体をイミダゾールに置換してＤＰＰ ＩＶ抵抗性を増加させて生理活性を維持した。しかし、このような場合、ＤＰＰ ＩＶによる切断の抵抗性が増加して安定性が向上したが、７番Ｈｉｓを変性させた誘導体の受容体親和性（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ）が著しく減少し、同一濃度でｃＡＭＰの分泌能も落ちることが分かった（Ｇａｌｌｗｉｔｚ． ｅｔ ａｌ．、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ ７９：９３−１０２（１９９９），Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ ８６：１０３−１１１（２０００））。

ＧＬＰ−１以外に、エキセンディン（ｅｘｅｎｄｉｎ）はアリゾナ州と北メキシコのトカゲであるアメリカドクトカゲ及び唾液分泌物で発見されるペプチドである。エキセンディン−３はメキシコドクトカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ ｈｏｒｒｉｄｕｍ）の唾液分泌物に存在し、エキセンディン−４はアメリカドクトカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ ｓｕｓｐｅｃｔｕｒｍ）の唾液分泌物に存在するもので、ＧＬＰ−１配列と高い相同性である５３％を示す（Ｇｏｋｅ， ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２６８：１９６５０−５５（１９９３））。エキセンディン−４は特定のインスリン分泌性細胞上のＧＬＰ−１受容体、テンジクネズミ膵膓からの分散した腺房細胞及び胃壁細胞で作用することができると報告されている。また、このようなペプチドはソマトスタチン遊離を刺激し、分離された胃でのガストリン放出を抑制すると報告された。また、エキセンディン−３及びエキセンディン−４は膵腺房細胞でのｃＡＭＰ生成と、このような細胞からのアミラーゼ放出を刺激することが明かされた。米国特許第５，４２４，６８６号には、エキセンディン−４の場合、ＤＰＰ ＩＶの基質として作用するＧＬＰ−１の配列であるＨｉｓ−ＡｌａでないＨｉｓ−Ｇｌｙの配列でなっているのでＤＰＰ ＩＶに対する抵抗性とともにＧＬＰ−１より高い生理活性を持ち、よって体内半減期が２〜４時間で、ＧＬＰ−１に比べて長くなったことを開示している。しかし、天然型エキセンディンの場合、ＧＬＰ−１より体内半減期が増加したが、依然としてその治療学的効果は改善の余地が多い。例えば、現在市販されているエキセンディン−４（エキセナティド、ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）の場合、患者に一日２回注射して投与しなければならないが、これは依然として患者に大きな負担である。

天然型エキセンディンの治療学的効能を改善するために、類似体、誘導体及び変異体が製造された。ここで、用語「類似体または変異体」は天然型ペプチドと一つ以上のアミノ酸が置換、欠失または組み入れされて製造されたものを意味する。用語「誘導体」は天然型ペプチドに一つ以上のアミノ酸が、アルキル化、アシル化、エステル化またはアミド化によって化学的に変性されたペプチドを意味する。

新規のエキセンディンアゴニスト化合物は国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６３８７によって既に開示された。これに基づき、米国特許第６，９５６，０２６号はエキセンディンを利用した飲食物摂取抑制方法を開示している。また、ヨーロッパ特許ＥＰ０９９６４５９では、前記ＰＣＴ出願に基づき、飲食物摂取抑制のためのエキセンディン及びその誘導体について開示し、米国特許第７，１５７，５５５号にはエキセンディンアゴニスト化合物が記載されている。しかし、前記特許らは一部のエキセンディン類似体の配列のみを記述しているだけで、その活性及び特性に関する実施例は具体的に記述していない。

したがって、本発明者はエキセンディンの一番アミノ酸であるＨｉｓを化学的に変性させた誘導体が天然型エキセンディンより優れた血中安定性及び高いインスリン分泌活性を示すという事実を見つけてこの発明を完成した。

本発明の目的は、インスリン分泌ペプチドの血中安定性及び高いインスリン分泌活性が増加したインスリン分泌ペプチド誘導体を提供することである。

本発明の他の目的は、血中安定性及び高いインスリン分泌活性が増加した前記インスリン分泌ペプチド誘導体を含む糖尿病治療用薬剤学的組成物を提供することである。

エキセンディン−４誘導体の血漿内安定性を示す図であり、Ａはエキセンディン−４、ＤはＤＡ−エキセンディン−４、ＨはＨＹ−エキセンディン−４、ＣはＣＡ−エキセンディン−４である。 エキセンディン−４、及びエキセンディン−４誘導体であるＣＡ−エキセンディン−４のインスリン分泌活性を示す図である。 エキセンディン−４及びＣＡ−エキセンディン−４の糖尿病モデル動物での血糖低下能力を示す図である。

一様態において、本発明は血中安定性及びインスリン分泌活性が増加したインスリン分泌ペプチド誘導体に関する。

本発明のインスリン分泌ペプチド誘導体は、インスリン分泌ペプチドのＮ末端のヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，Ｈｉｓ）残基の化学的変異誘導体あるいはＮ末端ヒスチジン残基のアミノグループを化学的に変化させた誘導体である。

好ましくは、本発明の前記インスリン分泌ペプチドは、エキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）、エキセンディン−３（ｅｘｅｎｄｉｎ−３）またはこれらの誘導体である。ここで「エキセンディン−４またはエキセンディン−３の誘導体」は、天然型のエキセンディン−４またはエキセンディン−３の一つ以上のアミノ酸が置換、欠失または組み入れされたものであるか、一つ以上のアミノ酸残基が、例えば、アルキル化、アシル化、エステル化形成またはアミド形成などによって化学的に変形されたペプチドを示し、天然型の活性を持つものを言う。

このようなエキセンディン−３またはエキセンディン−４の誘導体については、エキセンディン−４のＣ末端を一部削除するか非天然型アミノ酸であるノルルシン（Ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）に置換したエキセンディン変異体に関するＷＯ９７／４６５８４、ペンチルグリシン（ｐｅｎｔｙｌ ｇｌｙｃｉｎｅ）、ホモプロリン（ｈｏｍｏｐｒｏｌｉｎｅ）、テルトブチルグリシン（ｔｅｒｔｂｕｔｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）のような非天然型アミノ酸を含むエキセンディンのアミノ酸を置換した変異体に関するＷＯ９９／０７４０４、エキセンディン４のＣ末端アミノ酸残基一部を切断して、天然型より短いアミノ酸配列で構成されたエキセンディン変異体と他のアミノ酸に置換したエキセンディン変異体に関するＵＳ２００８／０１１９３９０などで開示している。これら文献は参照して引用する。

具体的に、本発明のインスリン分泌ペプチド誘導体は、インスリン分泌ペプチドのＮ末端アミノグループが除去された誘導体（ジメチル−ヒスチジル−誘導体）、アミノグループをヒドロキシルグループに置換した誘導体（ベータ−カルボキシイミダゾプロピル−誘導体）、アミノグループに二つのメチル（ｍｅｔｈｙｌ）残基で修飾された誘導体（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ−誘導体）、アミノ末端のアミノグループをカルボキシルグループに置換した誘導体（ベータ−ヒドロキシイミダゾプロピオニル−誘導体）またはアミノ末端ヒスチジン残基のアルファカーボンを削除してイミダゾールアセチル（ｉｍｉｄａｚｏａｃｅｔｙｌ）グループのみを残してアミノグループの正電荷（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅ）を除去した誘導体（Ｉｍｉｄａｚｏａｃｅｔｙｌ−誘導体）などを含むことができ、またその他の形態のＮ末端アミノグループ変異誘導体が本発明の範疇に属する。

好ましくは、本発明は、エキセンディン−４のＮ末端アミノグループまたはアミノ酸残基を化学的に変性させた誘導体、より好ましくは、エキセンディン−４のアミノ末端の一番アミノ酸であるヒスチジン残基のアルファカーボンに存在するアルファアミノグループまたはアルファカーボンを置換または除去したエキセンディン−４誘導体、さらにより好ましくはＮ末端アミノグループを除去したデサミノ−ヒスチジル−エキセンディン−４（Ｄｅｓａｍｉｎｏ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ−ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＤＡ−エキセンディン−４）、ヒドロキシルグループまたはカルボキシルグループに置換したベータ−ヒドロキシイミダゾプロピオニル−エキセンディン−４（ＨＹ−エキセンディン−４）、ベータ−カルボキシイミダゾプロピル−エキセンディン−４（ＣＸ−エキセンディン−４）、二つのメチル残基で修飾したジメチル−ヒスチジル−エキセンディン−４（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ−ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＤＭ−エキセンディン−４）、またはアミノ末端ヒスチジン残基のアルファカーボンを除去したイミダゾアセチル−エキセンディン−４（ＣＡ−エキセンディン−４）を提供する。

具体的な一様態において、本発明は下記化学式１のアミノ酸を含むインスリン分泌ペプチド誘導体に関する。

Ｒ１−Ｘ−Ｒ２ ＜化学式１＞
ここで、Ｒ１は、デサミノ−ヒスチジル（ｄｅｓａｍｉｎｏ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ）、Ｎ−ジメチル−ヒスチジル（Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ）、ベータ−ヒドロキシイミダゾプロピオニル（ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｉｍｉｄａｚｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ）、４−イミダゾアセチル（４−ｉｍｉｄａｚｏａｃｅｔｙｌ）及びベータ−カルボキシイミダゾプロピオニル（ｂｅｔａ−ｃａｒｂｏｘｙｉｍｉｄａｚｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ）よりなる群から選ばれ、
Ｒ２は、−ＮＨ_２ 、−ＯＨ及び−Ｌｙｓよりなる群から選ばれ、
Ｘは、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｙ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｚ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｙ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｚ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、及びＳｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｙ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｚ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒよりなる群から選ばれ、
Ｙは、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ及びＡｒｇよりなる群から選ばれ、
Ｚは、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ及びＡｒｇよりなる群から選ばれる。

好ましいインスリン分泌ペプチド誘導体は化学式１を有し、ここで、Ｒ１は、デサミノ−ヒスチジル、Ｎ−ジメチル−ヒスチジル、ベータ−ヒドロキシイミダゾプロピオニル、４−イミダゾアセチル及びベータ−カルボキシイミダゾプロピオニルよりなる群から選ばれ、Ｙは、ＬｙｓまたはＳｅｒであり、Ｚは、Ｌｙｓであり、Ｒ２は−ＮＨ_２ である。

他の具体的な一様態において、本発明は下記化学式２のアミノ酸を含むインスリン分泌ペプチド誘導体に関する。

Ｒ３−Ｘ’−Ｒ４＜化学式２＞
ここで、Ｒ３は４−イミダゾアセチルであり、
Ｘ’は、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｙ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｚ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ＳｅｒまたはＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｙ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｚ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙであり、
Ｒ４は、−ＮＨ_２ であり、
Ｙは、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ及びＡｒｇよりなる群から選ばれ、
Ｚは、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ及びＡｒｇよりなる群から選ばれる。

活性の観点から、エキセンディン−４のＮ末端ヒスチジン残基の化学的変化は公知の他のインスリン分泌ペプチドであるＧＬＰ−１の同一位置の化学的変化による活性の影響とは違う意味である。ＧＬＰ−１、例えばａ−メチル−ＧＬＰ−１、ｎ−メチル−ＧＬＰ−１またはｉｍｉ−ＧＬＰ−１などの場合、Ｎ末端ヒスチジン残基の化学的変化は、ジペプチジルペプチダーゼによる分解を抑制し、それによる安定性増加の効果は予想することができる。それによって実質的に分解速度が減少することが報告されたが、相対的にその受容体に対する結合力は前記誘導体のいずれも天然型より劣って実質的な活性の尺度であるｃＡＭＰの生産能力は天然型に比べて低いことが報告された。

しかし、エキセンディン−４の場合、ジペプチジルペプチダーゼによって分解されないため、Ｎ末端の化学的変化がその活性に及ぶ影響はいまだ予想しにくく、特に受容体との結合力及び血中グルコース濃度の変化に及ぶ影響は容易に予測することができないものである。

したがって、本発明は化学的に変化されたＮ末端ヒスチジン残基を有するか化学的に変化されたＮ末端ヒスチジン残基を有するエキセンディン−４誘導体を提供し、これは、天然のエキセンディン−４に比べて予測することができなかった、優れたインスリン分泌活性を示す。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で、本発明によるインスリン分泌ペプチド誘導体はエキセンディン−４に比べて優れた血中安定性及びインスリン分泌活性を示した（図２参照）。実際には、糖尿病モデル動物であるｄｂ／ｄｂマウスに対し、天然型エキセンディン−４に比べて優れた血糖低下の効果を確認した（図３参照）。Ｎ末端のヒスチジン残基のアミノグループの変化によるｎｅｔ ｃｈａｒｇｅの変化またはヒスチジン残基の大きさ変化は血中分解タンパク質に対する感受性の差を誘発するか、あるいは受容体との親和力に影響を及ぼすと予測できるが、より深い分子的研究が必要である。本発明によるインスリン分泌ペプチド誘導体のこのような性質はエキセンディン−４の固有の活性であるインスリン分泌による第２型糖尿病の治療の効果を最大化させると予想され、エキセンディン−４の他の効果である飲食物摂取の減少、胃内容排出の抑制などでも優れた効果を示すと予想される。

本発明のデサミノ−ヒスチジル−エキセンディン−４（ＤＡ−エキセンディン−４）、ベータ−ヒドロキシイミダゾプロピオニル−エキセンディン−４（ＨＹ−エキセンディン−４）、ベータ−カルボキシイミダゾプロピオニル−エキセンディン−４（ＣＸ−エキセンディン−４）、ジメチル−ヒスチジル−エキセンディン−４（ＤＭ−エキセンディン−４）及びイミダゾアセチル−エキセンディン−４（ＣＡ−エキセンディン−４）を含むエキセンディン−４誘導体は、Ｎ末端ヒスチジン残基のアルファアミノグループの除去及び置換、またはＮ末端ヒスチジン残基のアルファカーボンの除去によって作られる。したがって、それ以外のアミノ酸配列はその活性が維持される限り制限されない。また、ペプチドの治療効果を高めるために使用されているＰＥＧ、糖鎖などの高分子の修飾のような通常の技術を利用してエキセンディン−４誘導体を変性させる場合、天然型エキセンディン−４より優れた治療学的効果が現れるのは当業者にとって周知の事実である。

他の一様態において、本発明は、前記インスリン分泌ペプチド誘導体を含む糖尿病治療用薬剤学的組成物を提供する。

本発明において、「投与」という用語は、ある適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記組成物の投与経路は、薬物が目的組職に到達することができる限り、どの一般的な経路を通じても投与できる。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などの多様な投与方法が考慮できるが、これらに制限されない。しかし、経口投与の際、ペプチドは消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコートするか胃での分解から保護されるために剤形化することが好ましい。好ましくは、この組成物は注射剤の形態で投与できる。また、薬剤学的組成物は活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与できる。

本発明の誘導体を含む薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容可能な担体を含むことができる。薬剤学的に許容される担体は、経口投与の際には、結合剤、潤滑剤、分解剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、鎮痛剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬剤学的組成物の剤形は、前述したような薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造できる。例えば、経口投与の際には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップまたはウェハースなどの形態に製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形態に製造することができる。その他に、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、長時間作用型製剤などに剤形化できる。

一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ジェラチン、カルシウムフォスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝固剤、潤滑剤、保湿剤、香料、防腐剤などをさらに含むことができる。

本発明の薬剤学的組成物の投与量と回数は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別、体重及び疾患の重症度などの多くの関連因子とともに活性成分である薬物の種類によって決定される。本発明の薬剤学的組成物は生体内持続性及び力価に優れるので、本発明の薬剤学的製剤の投与回数及び頻度を著しく減少させることができる。

本発明によるインスリン分泌ペプチド誘導体は以前の他の発明者によって全く開示されていないか、あるいはその配列が特定されなかったままで広範囲に開示されていたが、その活性において、天然型のエキセンディン−４、他の誘導体または変異体と比較したことがなく、Ｎ末端のアルファアミノグループまたはアルファカーボンが置換または除去されたエキセンディン−４誘導体が天然型に比べて数等優越な活性を示すとは予測しにくかった。したがって、本発明によるインスリン分泌ペプチド誘導体の優れた血中安定性及びインスリン分泌活性は第２型糖尿病の治療効果を最大化させる。

以下、下記の実施例によって本発明をより詳細に説明するが、下記の実施例は本発明を例示するためのものであるだけであり、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。

実施例１．エキセンディン−４誘導体の血漿安定性
エキセンディン−４誘導体の血漿内安定性を測定する方法として、天然型試料とエキセンディン−４誘導体をそれぞれ血漿に曝露させ、変性されずに残っている量を逆相（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ）ＨＰＬＣで測定して曝露時間による変性程度を比較する試験を行った。

本試験では、血漿に曝露された試料の分析のために、血漿混合試料からタンパク質を除去した後に分析した。

天然型エキセンディン−４、デサミノ−ヒスチジル−エキセンディン−４（ＤＡ−エキセンディン−４）、ベータ−ヒドロキシイミダゾプロピオニル−エキセンディン−４（ＨＹ−エキセンディン−４）、ベータ−カルボキシイミダゾプロピオニル−エキセンディン−４（ＣＡ−エキセンディン−４）、ジメチル−ヒスチジル−エキセンディン−４（ＤＭ−エキセンディン−４）、及びイミダゾアセチル−エキセンディン−４（ＣＡ−エキセンディン−４）をそれぞれ１ｍｇ／ｍｌの濃度で製造した。エキセンディン−４誘導体試料２００μＬ（リットル）をそれぞれラット血清２００μＬと混合した。サンプリング時間別に３７℃で反応させながら０ｈｒ、１ｈｒ、２ｈｒ、４ｈｒ、６ｈｒ、８ｈｒ、１８ｈｒ、２４ｈｒの時点でそれぞれ１００μＬずつサンプリングした。サンプリングした試料１００μＬに４００μＬのｉｃｅ−ｃｏｌｄ ｍｅｔｈａｎｏｌを入れて反応を中止させ、よく混合されるように２０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）した。この混合物を１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上層液を取って分析試料を準備した。

ＴＦＡを含むＡＣＮを移動相としてｇｒａｄｉｅｎｔの条件で逆相ＨＰＬＣ分析を行った。この際、Ｃ１８カラムを使用した。

分析結果は、全体ピークの面積の中でエキセンディン−４の主ピークの面積の％割合で計算し、この結果を、それぞれの誘導体の曝露０時間での結果を基準１００％にして、血漿曝露時間別に主ピークの面積の割合が減少する様相をグラフで示した。

２４時間まで曝露されるとき、天然型エキセンディン−４は約７０％まで減少するが、三種の誘導体ＤＡ−エキセンディン−４、ＨＹ−エキセンディン−４、ＣＡ−エキセンディン−４はそれぞれ約７７％、７８％、７７％までだけ減少した（図１参照）。

実施例２．エキセンディン−４誘導体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の測定
デサミノ−ヒスチジル−エキセンディン−４を含むエキセンディン−４誘導体の効力を測定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞活性を測定した。天然型エキセンディン−４とエキセンディン−４誘導体はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ社で合成した。通常ＧＬＰ−１のｉｎ−ｖｉｔｒｏ活性の測定方法に使用されるｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ ｃｅｌｌまたはランゲルハンス島（ｉｓｌｅｔ ｏｆ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ）を分離し、ＧＬＰ−１処理によるｃＡＭＰ生成の変化を分析した。

本試験において、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ活性は、Ｒａｔ ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ細胞として知られＧＬＰ−１ｒｅｃｅｐｔｏｒを持っているのでＧＬＰ−１系のｉｎ−ｖｉｔｒｏ ａｃｔｉｖｉｔｙを測定する方法に多く利用されているＲＩＮ−ｍ５Ｆ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１６０５）を使用して測定した。ＲＩＮ−ｍ５Ｆを多様な濃度のＧＬＰ−１、天然型エキセンディン−４、及びＮ末端−α−デサミノ−ヒスチジル−エキセンディン−４を含むエキセンディン−４誘導体で処理し、試験物質によるｃＡＭＰ発生程度を測定してＥＣ５０値を決定した。

実施例３．エキセンディン−４誘導体のインスリン分泌活性の測定
ＲＩＮｍ５Ｆ細胞においてエキセンディン−４誘導体のインスリン分泌活性を比較した。解凍の後、１回以上継代培養したＲＩＮｍ５Ｆ細胞を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるようにＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１１０８２）を含む倍地とともに接種し、３７℃の５％ＣＯ_２ 培養器で４８時間培養した。インスリン分泌試験のために、培養したＲＩＮｍ５Ｆ細胞の倍地を、０．５％ＦＢＳを含む培養倍地に交換した後、１時間培養した。ＣＡ−エキセンディン−４とエキセンディン−４（ｂｙｅｔｔａ、Ａｍｙｌｉｎ）をそれぞれ０．５％ＦＢＳ及びグルコースを含む培養倍地希釈溶液で希釈して１０ｎＭから０．００１ｎＭまで準備した。エキセンディン試料を除いた希釈溶液を準備して対照群として使用した。前記ＲＩＮｍ５Ｆ細胞の倍地をすべて除去し、準備した試料を添加し、３７℃の５％ＣＯ_２ 培養器で１時間培養した後、それぞれのｗｅｌｌの倍地をすべて回収した。ラットインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ社製）を利用して、回収した倍地のインスリン濃度を測定し、その結果を図２及び表２に示した。

図２及び表２から分かるように、エキセンディン−４誘導体の一つであるＣＡ−エキセンディン−４は、同一濃度範囲で天然型エキセンディン−４より約２倍のインスリン分泌活性を示した。

実施例４．エキセンディン−４誘導体のｉｎ ｖｉｖｏ効力の比較
エキセンディン−４誘導体のｉｎ ｖｉｖｏ効力を測定するために、糖尿病モデル動物における血糖低下能力を天然型エキセンディン−４と比較して試験した。ｄｂ／ｄｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ，１０〜１２週齢）を２時間断食させた後、０．０１〜１０００ｍｃｇ／ｋｇのエキセンディン−４とＣＡ−エキセンディン−４をそれぞれ投与した。薬物投与１時間の後、しっぽから血液を採取し、血糖を血糖測定器で測定した。エキセンディン−４、ＣＡ−エキセンディン−４及びｖｅｈｉｃｌｅを、皮下経路を通じて投与し、各投与濃度での投与薬物による血糖変化はｖｅｈｉｃｌｅに対する％変化値で計算した。それぞれの投与濃度で血糖低下効果に対するＥＤ５０はＰｒｉｓｍプログラムを利用して求めた（図３及び表３参照）。

図３及び表３から分かるように、糖尿病モデル動物におけるＣＡ−エキセンディン−４の血糖低下能力は天然型エキセンディン−４よりその効力が約５倍高いことを確認した。

本発明によるインスリン分泌ペプチド誘導体は、天然型及び従来の他のインスリン分泌ペプチド類似体より優れた治療学的効果、つまりエキセンディンの固有の活性であるインスリン分泌による第２型糖尿病治療の効果を最大化させるだけでなく、他の効果である飲食物摂取の減少、胃内容排出の抑制などにも優れた生理活性を示す。したがって、本発明によるインスリン分泌ペプチド誘導体及びこれを含む薬剤学的組成物は、前記疾患に対する効果的な治療法を提供することができる。

Claims (4)

1. 天然型エキセンディン−４のＮ末端ヒスチジン残基が、４−イミダゾアセチルに置換されたことを特徴とする、エキセンディン−４誘導体。
2. 前記エキセンディン−４誘導体は下記化学式１のアミノ酸であることを特徴とする、請求項１に記載のエキセンディン−４誘導体。
   Ｒ１−Ｘ−Ｒ２＜化学式１＞
   ここで、Ｒ１は、４−イミダゾアセチルであり、
   Ｒ２は、−ＮＨ_２ または−ＯＨであり、
   Ｘは、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｙ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｚ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、またはＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｙ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｚ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙであり、
   Ｙは、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ及びＡｒｇよりなる群から選ばれ、
   Ｚは、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ及びＡｒｇよりなる群から選ばれる。
3. Ｒ１は４−イミダゾアセチル、ＹはＬｙｓまたはＳｅｒ、ＺはＬｙｓ、Ｒ２は−ＮＨ_２であることを特徴とする、請求項２に記載のエキセンディン−４誘導体。
4. 請求項１のエキセンディン−４誘導体を含む糖尿病治療用薬剤学的組成物。

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