JP5468680B2

JP5468680B2 - 新規なアルファ−ネオアガロビオース加水分解酵素及びそれを用いた単糖類の獲得方法

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Publication number: JP5468680B2
Application number: JP2012501937A
Authority: JP
Inventors: チェ，イン−ギョル; キム，キョン−ヒョン; リ，セ−ヨン
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Priority date: 2009-03-27
Filing date: 2010-03-24
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Description

本発明は、新規なアルファ-ネオアガロビオース加水分解酵素（α-ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ）及びそれを用いた単糖類の獲得方法に関する。

近年、大気中に排出される二酸化炭素量の増加による地球温暖化だけでなく、近い将来に発生し得る石油の枯渇及び価格上昇によって全世界的に新たな二酸化炭素低減型代替エネルギーの開発が急激に求められている。多様な代替エネルギーのうち、再生可能であり、豊富な地球資源の１つであるバイオマスを用いて生産されるバイオエネルギーが前述した要求を満たす主な再生エネルギーとして現在脚光を浴びている。特に、バイオエタノールは現在需要が大きく伸びている輸送用燃料の代案として考慮されており、米国をはじめとする先進国では既にバイオエタノールの使用が法律で義務付けられている。現在、バイオエタノールを生産するために使用している原料物質はトウモロコシやその他食糧資源に由来する糖質、でん粉などに制限されており（第１世代バイオ燃料）、人類の食糧資源と競争し、それにより国際穀物価格の上昇を誘発するという問題を抱えている。このような短所を克服できる対案として、食糧資源と競争しない新たな陸上木質系バイオマス（第２世代バイオ燃料）や海洋海藻類バイオマス（第３世代バイオ燃料）が次世代バイオエネルギーの原料としてさらに注目されており、これを活用してバイオエネルギーを生産する技術が現在活発に研究されている。

海藻類バイオマスは、木質系バイオマスに比べて微生物が利用可能な多糖類の含有量が多く、リグニンを含有していないため、前処理が比較的簡単であり、年に数回収穫できるなどの様々な長所を有している。特に、大韓民国は三面が海で囲まれており、海藻類の生物資源化が容易であり、海藻類の年間生産量は２００６年現在で１３,７５４トンであって、中国、日本、北朝鮮と共に世界的な海藻類の生産国に属しているが、その活用率の面では食用資源以外には低調であるのが現状である（漁業生産統計、２００６、統計庁社会統計局農漁業生産統計課）。最近になって、海藻類からバイオエネルギーを生産する研究が日本と大韓民国などで活発に議論されている。日本の水産業振興財団では‘ＯｃｅａｎＳｕｎｒｉｓｅＰｒｏｊｅｃｔ’というタイトルで日本の排他的経済水域と海洋ベルトの未使用海域４.４７百万ｋｍ^２で海藻類を大量養殖して５０億リットルの燃料用エタノールを生産しようとする計画を立てている（ＡｉｚａｗａＭｅｔａｌ., ＳｅａｗｅｅｄｂｉｏｅｔｈａｎｏｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＪａｐａｎ-ＴｈｅＯｃｅａｎＳｕｎｒｉｓｅＰｒｏｊｅｃｔ, ＯＣＥＡＮＳＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ, Ｓｅｐ. ２９-Ｏｃｔ. ０４, ２００７, Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）。また、韓国では２００９年１月に最終発表された政府の１７の新成長エンジン事業分野の１つである新再生エネルギー分野に海洋バイオ燃料が含まれ、海藻類への関心がさらに高まっている。２００９年の農林水産食品部の海洋バイオマスの確保及び活用技術の開発に関する研究企画発表によると、四方７１ｋｍの正四角形の海域で海藻類を養殖してバイオエタノールを生産する場合、年間３７.７４億リットルの生産が可能であり、これは２０３０年の韓国のガソリン予想消費量の３１.４％に替えられる量である。

現在知られている海藻類の中で特に紅藻類バイオマス（例えば、Ｇｅｌｉｄｉｕｍａｍａｎｓｉｉ）を原料物質として用いる研究が現在活発に進められている。紅藻類は乾重量全体の７０％以上が多糖類であって、微生物が利用可能な発酵性糖への変換が可能である。特に、紅藻類バイオマスに由来する多糖類の主要成分は寒天（アガー、ａｇａｒ）であって、乾重量全体の６０％程度を含有しており、バイオエネルギーの生産のための主要原料として考慮されている。寒天多糖体はガラクトース（Ｄ-ｇａｌａｃｔｏｓｅ）と３,６-アンヒドロガラクトース（３,６-ａｎｈｙｄｒｏ-Ｌ-ｇａｌａｃｔｏｓｅ；以下、「ＡＨＧ」と略する）を単位体にして、これらがそれぞれアルファ１,３結合（α-１,３-ｌｉｎｋａｇｅ）又はベータ１,４結合（β-１,４-ｌｉｎｋａｇｅ）で連結されたポリマーである（Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ，Ｍ. ａｎｄＷ. Ｙａｐｈｅ（１９７１）ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ１６，４３５-４４５）（図１参照）。

寒天多糖体を炭素源として用いる微生物の場合、βアガラーゼ（β-ａｇａｒａｓｅ）又はαアガラーゼ（α-ａｇａｒａｓｅ）を用いて寒天多糖体を小さなサイズのオリゴ糖に切断した後、最終的にβアガラーゼの場合にα-ネオアガロビオース（α-ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ，α-１,３-Ｄ-ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ-３,６-ａｎｈｙｄｒｏ-Ｌ-ｇａｌａｃｔｏｓｅ）に分解し、αアガラーゼの場合にはβ-アガロビオース（β-ａｇａｒｏｂｉｏｓｅ，β-１,４-ａｎｈｙｄｒｏ-Ｌ-ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ-Ｄ-ｇａｌａｃｔｏｓｅ）に分解することが知られている。βアガラーゼの分解産物であるネオアガロビオースの場合、微生物が代謝するためにはガラクトースへの変換が必要であり、そのために、α-１,３結合を切断する酵素（α-ネオアガロビオース加水分解酵素）が必須であることが知られている（Ｅｋｂｏｒｇ，Ｎ. Ａ. ｅｔａｌ（２００５）Ｉｎｔ. Ｊ. Ｓｙｓｔ. Ｅｖｏｌ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ５５，１５４５-１５４９；Ｅｋｂｏｒｇ，Ｎ.Ａ. ｅｔａｌ.，（２００６）Ａｐｐｌ. Ｅｎｖｉｒｏｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ７２，３３９６-３４０５）。しかし、これまではＳ. ｄｅｇｒａｄａｓでのネオアガロビオースのα-１,３結合を切断する酵素は発見されなかった（Ｅｋｂｏｒｇ，Ｎ. Ａ. ｅｔａｌ.（２００６）Ａｐｐｌ. Ｅｎｖｉｒｏｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ７２，３３９６-３４０５）。

微生物でアガロースからオリゴアガロサッカリドを生産するβアガラーゼは、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属菌株（Ｈａ，Ｊ. Ｃ. ｅｔａｌ.（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ａｐｐｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. ２６：１-６）、アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属菌株（Ｐｏｔｉｎ，Ｐ.，ｅｔａｌ.（１９９３）Ｅｕｒ. Ｊ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. ２１４：５９９-６０７）、アガリボランス（Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ）属菌株（Ｏｈｔａ，Ｙ. ｅｔａｌ.（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ａｐｐｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. ４１：１８３-１９１）、シュードアルテロモナス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属菌株（Ｂｅｌａｓ，Ｒ.（１９８９）Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ. １７１：６０２-６０５）、マイクロシラ（Ｍｉｃｒｏｓｉｌｌａ）属菌株（Ｚｈｏｎｇ，Ｚ. ｅｔａｌ.（２００１）Ａｐｐｌ. Ｅｎｖｉｒｏｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ６７：５７７１-５７７９）及びビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属菌株（Ａｏｋｉ，Ｔ. ｅｔａｌ.（１９９０）Ｅｕｒ. Ｊ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. １８７：４６１-４６５）など多くの微生物により生産されることが報告された。

紅藻類に由来する寒天多糖体をバイオエネルギーの生産のための原料として用いる場合、複数段階の前処理過程を経て実際に微生物が利用可能な発酵性糖への変換が必須である。寒天多糖体の発酵性単糖類への変換は大きく、化学的前処理と生物学的前処理の２種類の工程を通じて可能である。最初は酸加水分解などを利用する化学的方法であって、比較的簡単な工程や多糖類で構成されたバイオマスを高温で化学的に前処理してフルフラール（ｆｕｒｆｕｒａｌ）、ＨＭＦ（ヒドロキシメチルフルフラール）などの毒性副産物を多量生成し、無作為に切断された単糖類及びオリゴの混合物が得られるという短所がある（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇｅｔａｌ.，１９９３，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＰｈｙｃｏｌｏｇｙ５：８５-９１；Ａｒｍｉｓ’ｅｎ，１９９５）。それに対し、アガラーゼのような酵素を用いる生物学的前処理及び糖化方法は常温で環境にやさしい方法で発酵性糖であるガラクトースが得られるという長所があるが、現在、商業的に求めることができる酵素はβアガラーゼに限定しており、アガラーゼの産物も通常の微生物が使用し難い二糖類（ネオアガロビオースやアガロビオース）を最終産物とするという短所がある。

βアガラーゼ反応の結果として生成されたネオアガロビオースの場合、バイオエネルギーの生産のために用いるためには、発酵性単糖類であるガラクトースへの変換が必須であり、この際、α-ネオアガロビオース加水分解酵素が必要である。従って、紅藻類バイオマスをバイオエタノールのようなバイオエネルギーの生産原料として用いるための効率的なバイオマス生物学的（酵素的）前処理及び糖化工程の最終段階にはα-ネオアガロビオース加水分解酵素が欠かせない。また、ネオアガロビオースの分解産物としてガラクトースと共に得られるＡＨＧは商業的にも販売されておらず、Ｄ型のＡＨＧのみ購入が可能な状況であり、しかも高価で販売されている（２００９年現在、２００ポンド（英国）／１００ｍｇ、ｄｅｘｔｒａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。従って、本酵素を用いてアガロースから高価の珍重性単糖類であるＡＨＧの大量生産が可能である。

本発明は上記問題を解決し、上記必要性によって案出されたものであって、その目的は、バイオエネルギーの生産などのための発酵性単糖類であるガラクトースへの変換に必須の酵素を提供することにある。

本発明の他の目的は、ネオアガロビオースを基質として用いて、単糖類糖であるガラクトースとＡＨＧに変換する方法を提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１〜配列番号１１で構成された群より選択されたα-ネオアガロビオース加水分解酵素（α-ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ；以下、「α-ＮＡＢＨ」という）を提供する。

本発明の好適な実施例において、前記α-ネオアガロビオース加水分解活性を有する酵素は、配列番号１〜配列番号１１に開示されたアミノ酸配列だけでなく、前記酵素の１つ以上の置換、欠損、転位、付加などの変異により産生される変異蛋白質などの前記α-ネオアガロビオース加水分解活性を有する蛋白質も本発明の酵素の権利範囲に含まれ、好ましくは、配列番号１〜配列番号１１に開示されたアミノ酸配列と配列同一性が８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上及び９９％以上であるアミノ酸配列を含む。

本発明において、ポリペプチドが他の配列に対して特定比率（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％）の配列同一性を有するということは、前記２つの配列を整列させる時、前記配列の比較時に前記比率のアミノ酸残基が同一であることを意味する。前記整列及び百分率相同性又は同一性は、当業界において公知となった任意の適切なソフトウェアプログラム、例えば文献［ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ. Ｍ. Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ）１９８７Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３０ｓｅｃｔｉｏｎ７.７.１８）に記載されたものを用いて決定できる。好ましいプログラムとしては、ＧＣＧＰｉｌｅｕｐプログラム、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎら、１９８８Ｐｒｏｃ. ＮａｔｌＡｃａｄ. ＳｃｉＵＳＡ８５：２４４４-２４４８）、及びＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＭａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎａｔｌ. Ｃｅｎｔ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｉｎｆ.，ＮａｔｌＬｉｂ. Ｍｅｄ.（ＮＣＩＢＮＬＭＮＩＨ）, Ｂｅｔｈｅｓｄａ, ＭＤ,及びＡｌｔｓｃｈｕｌら１９９７ＮＡＲ２５：３３８９-３４０２）がある。他の好ましい整列プログラムは、ＡＬＩＧＮＰｌｕｓ（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｎｄＥｄｕｃａｔｉｏｎａｌｓｏｆｔｗａｒｅ, ＰＡ）であって、好ましくは基本媒介変数を用いるものである。使用可能な他の配列ソフトウェアプログラムは、ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅＶｅｒｓｉｏｎ６.０（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ, ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎ, Ｍａｄｉｓｏｎ, ＷＩ）で利用可能なＴＦＡＳＴＡＤａｔａＳｅａｒｃｈｉｎｇＰｒｏｇｒａｍである。

本発明の一実施例において、前記酵素はサッカロファガス・デグラダンスなどから得ることが好ましいが、これに限定されるものではない。

本発明のサッカロファガス・デグラダンスは通常、購入（ＳａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓｄｅｇｒａｄａｎｓＡＴＣＣ４３９６１）できるが、これに限定されない多様な方法で得られる。

また、本発明は前記本発明の酵素をコードする遺伝子を提供する。

本発明の一実施例において、前記遺伝子は配列番号１２に記載された遺伝子が好ましいが、これに限定されるものではない。

さらに、本発明の一実施例において、前記遺伝子はサッカロファガス・デグラダンスから得ることが好ましいが、これに限定されるものではない。

また、本発明は、サッカロファガス・デグラダンスを培養し、培養液から本発明の酵素を採取することを含む、本発明の酵素を製造する方法を提供する。

さらに、本発明は、本発明の酵素を用いてα-ネオアガロビオースを分解して前記分解物からガラクトース及びアンヒドロガラクトースを採取することを含むガラクトース及びアンヒドロガラクトースを製造する方法を提供する。

また、本発明は、図８に示すモチーフ１〜５０（計５０個のモチーフ）で構成された群より選択されたモチーフのうち、１、２、３、４、５、６、７、１４、１６、１７、２０、３４、４０を含む１３個のモチーフを含むα-ネオアガロビオース加水分解酵素（α-ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ）を提供し、より好ましくは、図８に示す５０個のモチーフのうち、モチーフ７と３４を少なくとも含むα-ネオアガロビオース加水分解酵素（α-ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ）を提供する。

蛋白質モチーフは、規則的に表されるパターンで表示できれば、通常パターンの表現様式は正規表現式で表す；
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｅｘｐａｓｙ.ｃｈ／ｐｒｏｓｉｔｅ／ｐｒｏｓｕｓｅｒ.ｈｔｍｌ；例えば：
ＰＡ［ＡＣ］-ｘ-Ｖ-ｘ４-｛ＥＤ｝。

本パターンは、以下の通り解析される：［ＡｌａｏｒＣｙｓ］-ａｎｙ-Ｖａｌ-ａｎｙ-ａｎｙ-ａｎｙ-ａｎｙ-｛ａｎｙｂｕｔＧｌｕｏｒＡｓｐ｝
ＰＡ＜Ａ-ｘ-［ＳＴ］（２）-ｘ（０,１）-Ｖ.

このパターンは配列のＮ-末端になければならず（「＜」）、以下の通り解析される：
Ａｌａ-ａｎｙ-［ＳｅｒｏｒＴｈｒ］-［ＳｅｒｏｒＴｈｒ］-（ａｎｙｏｒｎｏｎｅ）-Ｖａｌ；ＳｉｇｒｉｓｔＣ.Ｊ.Ａ., ＣｅｒｕｔｔｉＬ., ＨｕｌｏＮ., ＧａｔｔｉｋｅｒＡ., ＦａｌｑｕｅｔＬ., ＰａｇｎｉＭ., ＢａｉｒｏｃｈＡ., ＢｕｃｈｅｒＰ.ＰＲＯＳＩＴＥ：ａｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄｄａｔａｂａｓｅｕｓｉｎｇｐａｔｔｅｒｎｓａｎｄｐｒｏｆｉｌｅｓａｓｍｏｔｉｆｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒｓ. ＢｒｉｅｆＢｉｏｉｎｆｏｒｍ. ３：２６５-２７４（２００２）；ＳｉｇｒｉｓｔＣ.Ｊ.Ａ., ＤｅＣａｓｔｒｏＥ., Ｌａｎｇｅｎｄｉｊｋ-ＧｅｎｅｖａｕｘＰ.Ｓ., ＬｅＳａｕｘＶ., ＢａｉｒｏｃｈＡ., ＨｕｌｏＮ. ＰｒｏＲｕｌｅ：ａｎｅｗｄａｔａｂａｓｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｎＰＲＯＳＩＴＥｐｒｏｆｉｌｅｓ. Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００５Ｎｏｖ１；２１（２１）：４０６０-６. Ｅｐｕｂ２００５Ａｕｇ９；ＴｉｍｏｔｈｙＬ.Ｂａｉｌｅｙ,ＮａｄｙａＷｉｌｌｉａｍｓ, ＣｈｒｉｓＭｉｓｌｅｈ, ａｎｄＷｉｌｆｒｅｄＷ.Ｌｉ, ＭＥＭＥ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇａｎｄａｎａｌｙｚｉｎｇＤＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｍｏｔｉｆｓ, ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ,Ｖｏｌ. ３４, ｐｐ. Ｗ３６９-Ｗ３７３, ２００６）。

本発明で細胞、核酸、蛋白質又はベクターと関連して用いられる時、用語の「組み換え」とは、前記細胞、核酸、蛋白質又はベクターが異種核酸又は蛋白質の導入又は本来的な核酸又は蛋白質の変更により変形されたり、又は前記細胞がこのように変形された細胞から由来したことを意味する。即ち、例えば、組み換え細胞は、前記細胞の本来的（非組み換え）な形態内では発見されない遺伝子を発現したり、又は異なっては発現時に異常に発現したり、又は全く発現されない本来的な遺伝子を発現する。

用語の「蛋白質」及び「ポリペプチド」は、本発明で相互交換可能に用いられる。本発明ではアミノ酸残基について通常の１文字又は３文字のコードが用いられる。

本発明において「遺伝子」は、本発明の酵素のコーディング領域の前及び後の領域、それだけでなく、個別のコーディング断片間の介在配列が含まれた、ポリペプチドを生産するのに係わるＤＮＡ断片を意味し得る。

本発明において、用語の「核酸」とは単鎖又は二重鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの化学的変形体を包括する。用語の「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、本発明で相互交換可能に使用され得る。遺伝暗号が縮退しているため、特定アミノ酸をコードするために、１つ以上のコドンを使用でき、本発明は特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを包括する。本発明において、「ベクター」とは１つ以上細胞類型内に核酸を導入するために設計されたポリヌクレオチド配列を意味する。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセットなどがある。

本発明で用いられた「発現ベクター」は適当な宿主内で目的のＤＮＡを発現させることができる適当な制御配列に作動可能に連結されているＤＮＡ配列を有するＤＮＡ構造物を意味する。このような制御配列には、転写を招くプロモータ、転写を調節する任意的オペレーター（ｏｐｅｒａｔｏｒ）配列、ｍＲＮＡ上の適当なリボソーム結合部位をコードする配列、エンハンサー及び転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれ得る。

本発明で「プロモータ」は遺伝子の転写を開始するために、ＲＮＡ重合酵素を結合させるのに係わる調節配列である。前記プロモータは、誘導性プロモータ又は構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プロモータであり得る。

本発明における用語の「由来する」は用語の「〜から起源する」、「得られる」又は「〜から得ることが可能な」、及び「〜から単離された」を包括し、本発明で用いられる時、これは前記ヌクレオシド配列によりコードされるポリペプチドが前記ヌクレオシドが本来的に存在するか、又は前記ヌクレオシド配列が挿入されている細胞から生産されることを意味する。

用語の「培養」は、液体又は固体培地で適当な条件下で微生物細胞集団を成長させることを意味する。好ましい実施例において、培養は（典型的には容器又は反応器内での）アガロースを含む基質を最終生成物として生物転換することを意味する。発酵は、微生物により有機物質を酵素的及び嫌気的に分解してより単純な有機化合物を生産することを意味する。発酵が嫌気的条件下で起きるものではあるが、さらに発酵は酸素の存在下でも起きるので、前記用語を厳格な嫌気的条件にのみ限定しようとする意図はない。

本発明で用いられた用語の「回収」、「単離」及び「分離」は、自然に結合されている１つ以上の成分から除去された化合物、蛋白質、細胞、核酸又はアミノ酸を意味する。

本発明で用いられた細胞と関連して使われた用語の「形質転換」、「安定した形質転換」及び「遺伝子導入（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」は、細胞が複数世代を通じて維持されるエピゾームプラスミドとしての、又はそのゲノム内に統合された非本来的（例えば、異種）な核酸配列を有することを意味する。

本発明で用いられた用語の「発現」は、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが生産される方法を意味する。前記方法には転写及び翻訳が含まれる。

核酸配列を細胞内に挿入する用語の「導入」は「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」、又は「形質転換」又は「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」を意味し、核酸配列の真核又は原核細胞内への統合に関する言及が含まれ、この時、前記核酸配列は細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体、又はミトコンドリアＤＮＡ）内に統合されて、自律レプリコンに転換されるか、又は一時的に発現する。

以下、本発明について説明する。

1．紅藻類を含む海洋バイオマスの前処理工程過程中、α-ネオアガロビオースから発酵性糖であるガラクトースを生成する酵素処理工程

寒天多糖体から発酵性糖を生成するために単糖類に分解する前処理過程としては、大きく化学的方法と酵素的方法の２つの方法が利用可能である。まず、化学的方法は、複合多糖類を無作為的に分解するため、所望の発酵性単糖類を選択的に生産することが非常に難しいだけでなく、生成された糖の発酵を阻害する副産物を生成することもある。また、アルカリ処理や酸処理の場合、相当量の汚染物質を排出し、これを浄化させるために多くの費用がかかり、微生物が利用可能な発酵性糖の生産方法には適していない。酵素的方法としては、微生物が生成するアガロースを用いて寒天多糖体を分解させることが可能である。このような方法に使用可能な酵素としては、αアガラーゼ又はβアガラーゼが挙げられる。寒天多糖体を分解する酵素として、αアガラーゼは寒天多糖体に存在するα-１,３とβ-１,４結合のうち、α結合を加水分解して最終的にβ-アガロビオース二糖体を作り、βアガラーゼはβ結合を切断してα-ネオアガロビオース二糖体を生成する。このような酵素的前処理の過程中にβアガラーゼを用いる場合、最終産物はα-ネオアガロビオースであって、これは通常の微生物が使用できない非発酵性糖である。これを発酵性糖であるガラクトースに最終的に変換する前処理工程のためには、α-ネオアガロビオース加水分解酵素が欠かせない。

２．寒天多糖体の酵素的分解産物であるα-ネオアガロビオースからガラクトース又はＡＨＧの生産

現在、ネオアガロビオースの加水分解で得られる３,６-アンヒドロ-Ｌ-ガラクトース（３,６-Ａｎｈｙｄｒｏ-Ｌ-ｇａｌａｃｔｏｓｅ）は商業的にも販売されておらず、Ｄ型のＡＨＧのみ購入可能な状況にあり、しかも高価で販売されている（２００９年現在、２００ポンド（英国）／１００ｍｇ、ｄｅｘｔｒａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。従って、本酵素を用いてアガロースから高価のＡＨＧの大量生産が可能である。

本発明の発明者らは、海洋細菌サッカロファガス・デグラダンスでα-ネオアガロビオース加水分解酵素の活性を確認し、該当遺伝子を初めて確認した。また、大腸菌に形質転換して蛋白質を大量生産してα-ネオアガロビオース加水分解酵素の活性を確認した。新規なα-ネオアガロビオース加水分解酵素遺伝子の酵素活性を用いて寒天多糖体を含む海洋バイオマスの前処理工程で適用し、前処理工程で得られたα-ネオアガロビオースからガラクトースを含む発酵性糖の獲得に利用する。

近年、寒天多糖体を炭素源として用いて成長できる海洋細菌であるサッカロファガス・デグラダンス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓｄｅｇｒａｄａｎｓ）が発見され、ゲノム配列が決定された。

α-ネオアガロビオース加水分解酵素の遺伝子をスクリーニングするために、まずサッカロファガス・デグラダンスでα-ネオアガロビオース加水分解酵素の活性を確認した。その次に、ゲノム配列情報の分析を通じてサッカロファガス・デグラダンスの遺伝子のうち、糖加水分解酵素ファミリー３２に属する遺伝子（蛋白質データベースＵｎｉｐｒｏｔｄａｔａｂａｓｅＩＤ：Ｑ２１ＨＢ２）をα-ネオアガロビオース加水分解酵素として予測した。実際に蛋白質がα-ネオアガロビオース加水分解酵素の活性を有しているかを確認するために、発現用ベクターにクローニングし、大腸菌で過発現して蛋白質を分離精製した後、最終的に酵素の活性を確認した。

本発明では新規なα-ネオアガロビオース加水分解酵素の塩基配列と蛋白質配列を報告している。特に、上述した通り、近年、海藻類バイオマスを用いたバイオエネルギーの生産からバイオマスの発酵性糖への酵素的変換工程のうち、寒天多糖体からアンヒドロガラクトース及びガラクトースの生産にはα-ネオアガロビオース加水分解酵素の使用が必須であるので、バイオマス前処理のコスト削減及び歩留まりの向上効果を期待できるという効果を奏する。また、バイオ燃料を生産する酵母や細菌などにα-ＮＡＢＨ遺伝子を導入して寒天（アガー）又はネオアガロビオースから直接バイオ燃料を生産することも期待できる。さらに、海洋バイオマスから高付加価値の単糖類であるガラクトースとＡＨＧを生産する工程にもα-ネオアガロビオース加水分解酵素を用いて、有用物質の生産も可能である。

寒天多糖体の構造を示す図である。Ｓ. ｄｅｇｒａｄａｎｓ２-４０から得られた細胞内粗酵素による反応生成物の薄膜クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎｌａｙｅｒｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を示す写真である。レーンＡ、ガラクトースのスタンダード；レーンＢ、０.２５％（ｗ／ｖ）アガロースを細胞内酵素と培養したもの、レーンＣ、０.３％（ｗ／ｖ）ゲリジウム（紅藻類）粉末を細胞内酵素と培養したもの。酵素反応は３０℃、２０ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ６.８）で１２時間行った。本発明でスクリーニングした遺伝子の塩基配列及び蛋白質配列を示す。大腸菌で発現して精製されたアガラーゼ；１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動；Ａ：分子サイズマーカー、Ｂ：α-ネオアガロビオース加水分解酵素（α-ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ）を示す。 α-ネオアガロビオース加水分解酵素（α-ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ）及びβアガラーゼによるアガロース加水分解の産物の薄膜クロマトグラフィー写真を示す。酵素反応を３０℃、２０ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ６.８）で行い、その基質濃度は０.２５％（ｗ／ｖ）であった。（ａ）ガラクトース（ｂ-ｃ）反応混合物。Ａ：ガラクトース標準物質；Ｂ：α-ネオアガロビオース加水分解酵素（α-ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ）反応産物（２時間反応）；Ｃ：ネオアガロビオース。 α-ネオアガロビオース加水分解酵素（α-ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ）及びβアガラーゼによるアガロース加水分解の産物の液体クロマトグラフィー質量分析（ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を通じた反応産物の確認を示している。質量分析器を用いた反応産物の質量分析結果（ｆｏｒｍａｔｅ（ＨＣＯＯ-、分子量：４５）にアニオン化）、図６に示すように、ガラクトースの質量は２２５.１（１８０＋４５）、アンヒドロガラクトースは２０７.１（１６２＋４５）で確認されている。従って、加水分解酵素の産物がガラクトースとアンヒドロガラクトースであることを確認している。即ち、基礎科学支援センターソウル分所に質量分析を依頼して得た結果が図６に示す質量分析スペクトラムであり、その結果を解析した結果として酵素の加水分解産物を確認した。 α-ネオアガロビオース加水分解酵素を含むホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）蛋白質のモチーフ（ｍｏｔｉｆ）分析結果を示す。 α-ネオアガロビオース加水分解酵素の特異的モチーフを示す。図８で確認されたα-ネオアガロビオース加水分解酵素の特異的モチーフをいずれも含んでいる蛋白質の配列を示す。図８で確認されたα-ネオアガロビオース加水分解酵素の特異的モチーフをいずれも含んでいる蛋白質の配列を示す。図９及び図１０から得られた１０個の配列とα-ネオアガロビオース加水分解酵素のアミノ酸配列を用いた多重配列整列を示す。大腸菌で発現して精製されたシュードアルテロモナスアトランティカ由来アガラーゼ；１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＬａｎｅＡ、分子サイズマーカー；ＬａｎｅＢ、α-ネオアガロビオース加水分解酵素を示す。大腸菌で発現して精製されたストレプトマイセス・セリカラー由来アガラーゼ；１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＬａｎｅＡ、α-ネオアガロビオース加水分解酵素；ＬａｎｅＢ、分子サイズマーカーを示す。 α-ネオアガロビオース加水分解酵素（α-ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ）及びβアガラーゼによるアガロース加水分解の産物の薄膜クロマトグラフィー写真である。酵素反応を３０℃、２０ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ６.８）で２時間行い、その基質濃度は０.２５％（ｗ／ｖ）であった。（Ａ）ガラクトース（Ｂ-Ｄ）反応混合物。ＬａｎｅＡ、ガラクトース標準物質；ＬａｎｅＢ、サッカロファガス・デグラダンス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓｄｅｇｒａｄａｎｓ２-４０）由来α-ネオアガロビオース加水分解酵素（α-ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ）反応産物；ＬａｎｅＣ、シュードアルテロモナスアトランティカ（ＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓａｔｌａｎｔｉｃａＴ６ｃ）由来α-ネオアガロビオース加水分解酵素（α-ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ）反応産物；ＬａｎｅＤ、ストレプトマイセス・セリカラー（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＡ３）由来α-ネオアガロビオース加水分解酵素（α-ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ）反応産物。

以下、非限定的な実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明を説明する目的で記載されたものであって、本発明の範囲は、下記の実施例により制限されない。

実施例１：サッカロファガス・デグラダンス粗抽出液からのα-ネオアガロビオース加水分解酵素の酵素活性の確認
サッカロファガス・デグラダンスがα-ネオアガロビオース加水分解を通じて単糖類であるガラクトースとＡＨＧを生成する酵素活性を有しているかを確認するために、次のような方法で粗抽出液を得て活性を確認した。サッカロファガス・デグラダンスを、海水塩を含む培地で対数増殖期の中間まで育成させた後、４０ｍｌの培養液を遠心分離した後に超音波を利用して細胞を破砕し、粗抽出液を得た後、寒天多糖体をβアガラーゼで分解して得られたアガロースを基質として反応分解産物をＴＬＣで観察した。Ａレーンではガラクトース標準物、Ｂレーンでは０.２５％（ｗ／ｖ）のアガロースをサッカロファガス・デグラダンスの細胞内粗酵素液と反応させた産物、Ｃレーンでは０.３％（ｗ／ｖ）紅藻類である乾燥した寒天粉をサッカロファガス・デグラダンスの細胞内粗酵素液と反応させた後、産物をＴＬＣで分析した結果である。サッカロファガス・デグラダンスの細胞内粗酵素液との反応を通じてアガロースと寒天からいずれも単糖類であるＡＨＧとガラクトース、そして二糖類を生成することが確認された。従って、サッカロファガス・デグラダンスは細胞内にα-ネオアガロビオース加水分解を通じて単糖類であるガラクトースとＡＨＧを生成する酵素を有していることが分かる。

本発明でスクリーニングした遺伝子の塩基配列及び蛋白質のアミノ酸配列は、図３の通りである。

実施例２：α-ネオアガロビオース加水分解酵素の生化学的活性及び特徴調査
精製されたα-ネオアガロビオース加水分解酵素の活性は、以下の通り確認された。まず寒天多糖体をβアガラーゼで処理して酵素的処理の最終産物であるネオアガロビオースを生成した後、それを基質としてα-ネオアガロビオース加水分解酵素の反応産物をＴＬＣで確認した（図５のＴＬＣ結果）。ＴＬＣ溶媒条件（ｎ-Ｂｕｔｈａｎｏｌ：ＥｔＯＨ：Ｗａｔｅｒ；３：２：２）でα-ネオアガロビオース加水分解酵素で処理された基質は、ガラクトースとアンヒドロガラクトースと推定される物質に分解されることが確認された。ガラクトースＲｆ値は約０.４６、ネオアガロビオースのＲｆ値は約０.５８でＴＬＣ上で確認された。

ネオアガロビオース加水分解酵素により生成された産物の分子量を測定するために、液体クロマトグラフィー-質量分析器（Ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ-ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を通じて分子量を確認した。アンヒドロガラクトース（ＡＨＧ）は分子量が１６２であり、ガラクトース分子量は１８０であることをＬＣ-ＭＳ分析結果で示された２０７.１ｍ／ｚはアンヒドロガラクトースに蟻酸（ｆｏｒｍｉｃａｃｉｄ）が結合された状態である分子量でアンヒドロガラクトースが検出されたことが分かり、１７９.１ｍ／ｚと２２５.１ｍ／ｚはガラクトースとガラクトースと結合した蟻酸の分子量でガラクトースが検出されたことが確認できる。従って、ＬＣ-ＭＳで示されるように、ネオアガロビオース加水分解酵素の反応産物である２種類の単糖類であるガラクトースとアンヒドロガラクトースが反応産物であることが確認できる（図６参照）。

実施例３：α-ネオアガロビオース分解酵素の特異的ペプチドモチーフ配列
＊一般に、蛋白質モチーフとは、同一の分子的機能を有する蛋白質で一種のパターンのように現れる短いペプチド配列を意味する。このような蛋白質モチーフは、蛋白質全体の配列中、大体進化的に正常に保存されており、活性部位を含む分子的機能を代表する領域で表示されるパターン化されたアミノ酸配列で表示される（ＳｉｇｒｉｓｔＣ.Ｊ.Ａ., ＣｅｒｕｔｔｉＬ., ＨｕｌｏＮ., ＧａｔｔｉｋｅｒＡ., ＦａｌｑｕｅｔＬ., ＰａｇｎｉＭ., ＢａｉｒｏｃｈＡ., ＢｕｃｈｅｒＰ.ＰＲＯＳＩＴＥ：ａｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄｄａｔａｂａｓｅｕｓｉｎｇｐａｔｔｅｒｎｓａｎｄｐｒｏｆｉｌｅｓａｓｍｏｔｉｆｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒｓ. ＢｒｉｅｆＢｉｏｉｎｆｏｒｍ. ３：２６５-２７４（２００２）；ＳｉｇｒｉｓｔＣ.Ｊ.Ａ., ＤｅＣａｓｔｒｏＥ., Ｌａｎｇｅｎｄｉｊｋ-ＧｅｎｅｖａｕｘＰ.Ｓ., ＬｅＳａｕｘＶ., ＢａｉｒｏｃｈＡ., ＨｕｌｏＮ. ＰｒｏＲｕｌｅ：ａｎｅｗｄａｔａｂａｓｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｎＰＲＯＳＩＴＥｐｒｏｆｉｌｅｓ.Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００５Ｎｏｖ１；２１（２１）：４０６０-６. Ｅｐｕｂ２００５Ａｕｇ９；ＴｉｍｏｔｈｙＬ. Ｂａｉｌｅｙ, ＮａｄｙａＷｉｌｌｉａｍｓ, ＣｈｒｉｓＭｉｓｌｅｈ, ａｎｄＷｉｌｆｒｅｄＷ. Ｌｉ, ＭＥＭＥ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇａｎｄａｎａｌｙｚｉｎｇＤＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｍｏｔｉｆｓ, ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ, Ｖｏｌ. ３４、ｐｐ. Ｗ３６９-Ｗ３７３, ２００６）。

α-ネオアガロース加水分解酵素を規定付けられる蛋白質モチーフの配列を確認するために、まずα-ネオアガロビオース加水分解酵素のアミノ酸配列をテンプレートとして用いて公共データベースをＮＣＢＩブラスト（ｂｌａｓｔ）を用いて検索して統計的留意性（Ｅ-ｖａｌｕｅ＜０.００１）を有する６０個（α-ネオアガロビオース加水分解酵素を含む）の蛋白質のアミノ酸配列を収集した。これらの配列を蛋白質モチーフ検索プログラムであるＭＥＭＥ（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｍｅ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ／ｍｅｍｅ４_１／ｉｎｔｒｏ．ｈｔｍｌ；使用パラメーター：ｍｏｄｅ＝ｚｅｒｏｏｒｏｎｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ＆ｎｓｉｔｅｓ＝５０、ｍｗｉｎ＝８それ以外の条件はｄｅｆａｕｌｔｐａｒａｍｅｔｅｒを用いた；ＴｉｍｏｔｈｙＬ. Ｂａｉｌｅｙ, ＮａｄｙａＷｉｌｌｉａｍｓ, ＣｈｒｉｓＭｉｓｌｅｈ, ａｎｄＷｉｌｆｒｅｄＷ. Ｌｉ, ＭＥＭＥ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇａｎｄａｎａｌｙｚｉｎｇＤＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｍｏｔｉｆｓ, ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ, Ｖｏｌ. ３４, ｐｐ. Ｗ３６９-Ｗ３７３, ２００６）を用いてα-ネオアガロビオース分解酵素に特異的なモチーフを検索した。その結果、図７のように、サッカロファガス・デグラダンスのα-ネオアガロビオース加水分解酵素は相同性を有する蛋白質の分析から得られた計５０個のモチーフのうち、１３個の特異的モチーフ（１、２、３、４、５、６、７、１４、１６、１７、２０、３４、４０）を有することが確認された。従って、この１３個の特異的モチーフがα-ネオアガロビオース分解酵素の活性を代表するモチーフであることが確認できた。その中でもモチーフ７と３４は、α-ネオアガロビオース加水分解酵素の活性を代表する蛋白質に必ず現れる必須の２個のモチーフであって、それぞれ図８及び図９に示す（通常、蛋白質モチーフは、正規表現式（ｒｅｇｕｌａｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を用いて表すので、図面でも同じ方式で表現した；ＳｉｇｒｉｓｔＣ.Ｊ.Ａ., ＣｅｒｕｔｔｉＬ., ＨｕｌｏＮ., ＧａｔｔｉｋｅｒＡ., ＦａｌｑｕｅｔＬ., ＰａｇｎｉＭ., ＢａｉｒｏｃｈＡ., ＢｕｃｈｅｒＰ. ＰＲＯＳＩＴＥ：ａｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄｄａｔａｂａｓｅｕｓｉｎｇｐａｔｔｅｒｎｓａｎｄｐｒｏｆｉｌｅｓａｓｍｏｔｉｆｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒｓ. ＢｒｉｅｆＢｉｏｉｎｆｏｒｍ. ３：２６５-２７４（２００２））。従って、１３個の特異的モチーフのうち一部を含み、その中でもモチーフ７と３４を必ず含む蛋白質はα-ネオアガロビオース加水分解活性を有すると言える（図８参照）。α-ネオアガロビオース分解酵素と配列相同性を示す蛋白質の中でこれらの１３個の特異的モチーフの一部を含む一方、モチーフ７と３４を必ず含む蛋白質は１０個であることが確認された（図９及び１０参照）。

＊前記α-ネオアガロビオース分解酵素で発見される１３個の特異的モチーフの一部を含む一方、モチーフ７と３４を必ず含む蛋白質は現在公共データベース上で１０個が発見されている。それらのオリジンはそれぞれ、ＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓａｔｌａｎｔｉｃａＴ６ｃ, Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａｓｐ. ＰＲＥ１, ＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｐｌｅｂｅｉｕｓＤＳＭ１７１３５, Ｇｒａｍｅｌｌａｆｏｒｓｅｔｉｉ（ＳｔｒａｉｎＫＴ０８０３）, ＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍＨＴＣＣ２１７０, Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ. ｏｒａｌｔａｘｏｎ７８６ｓｔｒ. Ｄ１４, Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ. ５_１_３９ＢＦＡＡ, ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＡ３である。それぞれのアミノ酸配列は図１０に示す。

図１１に示されている配列は、上述したように、αネオアガロビオース加水分解酵素と配列相同性を有する蛋白質の中で１３個の特異的モチーフの一部を含む一方、モチーフ７と３４を必ず含む１０個の蛋白質を選んで多重整列したものであり、それらの１０個の蛋白質の配列は、図９及び図１０に示す。

実施例４：α-ネオアガロビオース加水分解酵素遺伝子の蛋白質配列の相同性の確認
サッカロファガス・デグラダンス由来の加水分解酵素の蛋白質配列の相同性の検索を通じて類似する機能を有すると予想される候補遺伝子を確認した。候補遺伝子の具体的な機能は知られていないが、炭水化物関連の酵素／蛋白質データベースであるＣＡＺｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｃａｚｙ.ｏｒｇ）によれば皆文リコーシード加水分解酵素(ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｈｙｄｒｏｌａｓｅｆａｍｉｌｙ３２, ＧＨ３２）に属することが確認された。ＧＨ３２ｆａｍｉｌｙに属する蛋白質が有する知られている機能はｉｎｖｅｒｔａｓｅ（ＥＣ３.２.１.２６）；ｅｎｄｏ-ｉｎｕｌｉｎａｓｅ（ＥＣ３.２.１.７）；β-２,６-ｆｒｕｃｔａｎ６-ｌｅｖａｎｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＥＣ３.２.１.６４）；ｅｎｄｏ-ｌｅｖａｎａｓｅ（ＥＣ３.２.１.６５）；ｅｘｏ-ｉｎｕｌｉｎａｓｅ（ＥＣ３.２.１.８０）；ｆｒｕｃｔａｎ β-（２,１）-ｆｒｕｃｔｏｓｉｄａｓｅ／１-ｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＥＣ３.２.１.１５３）；ｆｒｕｃｔａｎ β-（２,６）-ｆｒｕｃｔｏｓｉｄａｓｅ／６-ｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＥＣ３.２.１.１５４）；ｓｕｃｒｏｓｅ：ｓｕｃｒｏｓｅ１-ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＥＣ２.４.１.９９）；ｆｒｕｃｔａｎ：ｆｒｕｃｔａｎ１-ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＥＣ２.４.１００）；ｓｕｃｒｏｓｅ：ｆｒｕｃｔａｎ６-ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＥＣ２.４.１.１０）；ｆｒｕｃｔａｎ：ｆｒｕｃｔａｎ６Ｇ-ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＥＣ２.４.１.２４３）；ｌｅｖａｎｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＥＣ２.４.１.-）である。従って、ＧＨ３２ｆａｍｉｌｙに属する一部の蛋白質がネオアガロビオース加水分解能と同じ分子機能を有することは、本発明で初めて報告している。

サッカロファガス・デグラダンス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓｄｅｇｒａｄａｎｓ２-４０）由来α-ネオアガロビオース加水分解酵素（以下、α-ＮＡＢＨという）のアミノ酸配列の相同性の検索（ブラスト検索-添付ファイル参照）から得られた配列のうち、５０％以上の相同性を有する蛋白質配列をブラストのＥ-ｖａｌｕｅにより羅列すれば、以下の通りである（次はＵｎｉｐｒｏｔデータベース番号を使用、括弧内は由来微生物及び％ｉｄｅｎｔｉｔｙ）。
１．Ｑ１５ＵＦ２（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓａｔｌａｎｔｉｃａ（ＳｔｒａｉｎＴ６ｃ／ＢＡＡ-１０８７）、７０％）、
２．Ｑ９３ＰＢ３（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａｓｐ.ＰＲＥ１., ５９％）、
３．Ｂ４ＣＹ７４（ＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｐｌｅｂｅｉｕｓＤＳＭ１７１３５., ６０％）、
４．Ａ０Ｍ２４５（Ｇｒａｍｅｌｌａｆｏｒｓｅｔｉｉ（ＳｔｒａｉｎＫＴ０８０３）., ５６％）、
５．Ａ４ＡＲ３９（ＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍＨＴＣＣ２１７０., ５７％）、
６．Ｃ６Ｊ３Ｐ３（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.ｏｒａｌｔａｘｏｎ７８６ｓｔｒ.Ｄ１４., ５８％）、
７．Ｃ６ＪＤＤ４（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ.５_１_３９ＢＦＡＡ., ５８％）、
８．Ｃ６Ｊ３１３（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.ｏｒａｌｔａｘｏｎ７８６ｓｔｒ.Ｄ１４., ５７％）、
９．Ｑ１５ＸＰ８（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓａｔｌａｎｔｉｃａ（ＳｔｒａｉｎＴ６ｃ／ＢＡＡ-１０８７）、５５％）、
１０．Ｑ９ＲＫＦ６（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、５６％）

実施例５：大腸菌での発現及び大きさの確認
前記で獲得した５０％ｉｄｅｎｔｉｔｙ以上の配列相同性を有する蛋白質の中で最も高い配列相同性を有するシュードアルテロモナスアトランティカ（ＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓａｔｌａｎｔｉｃａＴ６ｃ）由来蛋白質（Ｑ１５ＵＦ２）と最も低いストレプトマイセス・セリカラー（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＡ３）由来蛋白質（Ｑ９ＲＫＦ６）をそれぞれクローニングしてα-ＮＡＢＨ活性を有しているかを確認した。まず、これらを暗号化する遺伝子の塩基配列をそれぞれ大腸菌発現ベクターであるｐＥＴ２１ａ（ノバジェン、米国）に挿入した（以下、シュードアルテロモナスアトランティカ由来α-ＮＡＢＨ遺伝子を含む発現ベクターを「ｐＰｓＡＧＡＪ」、ストレプトマイセス・セリカラー由来α-ＮＡＢＨ遺伝子を含む発現ベクターを「ｐＳｃＡＧＡＪ」という）。組み換えα-ＮＡＢＨが大腸菌で成功裏に発現することを確認するために、ｐＰｓＡＧＡＪとｐＳｃＡＧＡＪを発現用大腸菌であるＥ.ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後に、５０ｍｇ／Ｌ濃度のアンピシリン抗生剤を含む固体培地に塗抹した。前記形質転換により得られたコロニーを５０ｍｇ／Ｌ濃度のアンピシリン抗生剤が添加されたルリアベルターニ（ＬＢ）培地に接種した後、３７℃で一日間振盪培養して菌体を確保した。その後、発現の確認のために、形質転換体を５０ｍｇ／Ｌ濃度のアンピシリン抗生剤が添加されたルリアベルターニ（ＬＢ）培地に接種した後、３７℃でＯＤ_６００＝０.５〜１.０まで振盪培養し、０.５ｍＭ／Ｌの濃度でＩＰＴＧを添加して１８０ｒｐｍで４時間発現を誘導した。培養液は遠心分離（１２０００ｒｐｍ、４℃、１０分）して菌体を回収し、回収した菌体は２０ｍＭのトリス緩衝液（Ｔｒｉｓ-ＨＣｌｐＨ７.４）に懸濁して超音波破砕機で破砕した後、１２％のＳＤＳ-ＰＡＧＥで大きさを確認した。大きさが確認された破砕した懸濁液を１５分間遠心分離して上澄み液を粗酵素液として用いた。

実施例６：α-ネオアガロビオース加水分解酵素の生化学的活性の確認
精製されたα-ＮＡＢＨの活性は、以下の通り確認された。まず寒天多糖体をβアガラーゼで処理して酵素的処理の最終産物であるネオアガロビオースを生成した後、それを基質としてα-ＮＡＢＨの反応産物をＴＬＣで確認した。ＴＬＣを通じた確認は、Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０ＴＬＣ平板に反応液を１ｕｌ点滴し、ＴＬＣ溶媒条件（ｎ-Ｂｕｔｈａｎｏｌ：ＥｔＯＨ：Ｗａｔｅｒ；３：２：２）で展開した。展開したＴＬＣ平板は１次処理溶液である硫酸（１０％（v／v）Ｈ_２ＳＯ_４ｉｎＥｔｈａｎｏｌ）で処理した後、乾燥し、１次処理された平板は再び２次処理溶液であるナフトレゾルシノール（０.２％（ｗ／ｖ）ｎａｐｈｔｈｏｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌｉｎＥｔｈａｎｏｌ）で処理した。このように処理されたＴＬＣ平板は乾燥後、加熱した。

前記実施例４〜６の結果は、以下の通りである。

発現用菌株であるＥ.ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）を用いて形質転換したシュードアルテロモナスアトランティカとストレプトマイセス・セリカラー由来α-ＮＡＢＨの発現と大きさの確認は１２％のＳＤＳ-ＰＡＧＥを通じて確認した。シュードアルテロモナスアトランティカとストレプトマイセス・セリカラー由来α-ＮＡＢＨの予想分子量は、それぞれ４０.７ｋＤａと４１.１ｋＤａ程度であり、予想分子量と同一であることが確認された（図１２、図１３）。

また、分解産物を確認するために、標準物質としてＤ-ガラクトースを用いて予想分解産物を確認した。α-ＮＡＢＨで処理された二糖類であるネオアガロビオースはＤ-ガラクトースと同一のＲｆ値で確認されたガラクトースとアンヒドロガラクトースと推定される物質に分解されることを確認した（図１４）。

Claims

配列番号１及び２に記載されたアミノ酸配列からなる群から選択されるα−ネオアガロビオース加水分解酵素を少なくとも１つ用いてα−ネオアガロビオースを分解し、分解物からガラクトース又は３,６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（AHG）を採取することを含む、ガラクトース又は３,６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを製造する方法。
配列番号１及び２に記載されたアミノ酸配列からなる群から選択されるα−ネオアガロビオース加水分解酵素を少なくとも１つ含む、α−ネオアガロビオースからガラクトース又は３,６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（AHG）を製造するための組成物。