JP5437709B2 - 抗酸化剤 - Google Patents
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Description
本発明は、植物を原料とする優れた抗酸化能を有する乾留液を含有する抗酸化剤に関するものである。
植物から得られた抗酸化剤については、センダングサ属植物エキスから得られた新規化合物を含有する抗酸化剤及びセンダングサ属植物エキス画分を含有する抗酸化剤がある（特許文献１参照）。また、植物から減圧により乾留し得られた乾留液については、抗酸化剤に関するものではないが、茶を乾留して得られる沸点範囲が２０mmHgの場合で１８０〜２００℃にある乾留分を有効成分とする消臭剤（特許文献２参照）、および一般大型竹の稈筒であるタケ筒部を温度１２０〜２５０℃にて１００mmHg以下の減圧条件下で乾留して得た減圧乾留物からなる抗菌成分およびその抗菌成分を含有する抗菌性製品（特許文献３参照）が開示されている。
植物には抗酸化性を示すものが多くあるが、長年にわたる漢方薬や民間薬としての使用経験または食経験から、それらから抽出された抗酸化性成分は合成の抗酸化剤に比べ安全性が高い。しかしながら植物そのものの抗酸化能は弱く何らかの抽出操作を必要とする。さらに、植物からの抗酸化性成分の抽出は何段階かの抽出操作を要し、煩雑である。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、植物から簡単な操作で得られ、強い抗酸化能を持つ抗酸化剤を提供することを目的とするものである。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、植物としてヨモギに着目し、ヨモギを特定の条件下で乾留して得られる乾留液の抗酸化能が顕著に優れることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、ヨモギを２６０〜３５０℃、１００mmHg以下の減圧条件下で乾留して得られた乾留液を含有する抗酸化剤であることを特徴とする。
本発明の抗酸化剤は、ヨモギを特定の温度及び減圧条件下で乾留して得られる乾留液を含有するので、他の植物に比べて格段に優れた抗酸化能を有するとともに、消臭効果及び抗菌活性をも併せて有する。
本発明の抗酸化剤は、上述したとおり、ヨモギを２６０〜３５０℃、１００mmHg以下の減圧条件下で乾留して得られた乾留液を含有する点に特徴を有する。
乾留材料としてのヨモギは、通常は入手したときの状態で用いてもよいが、より好ましくはヨモギを乾燥した後、粉砕し、粉体化したものが用いられる。ヨモギの乾燥物を用いる場合、乾燥条件は特に限定されず、通常は５０〜８０℃で５〜２４時間乾燥したものが用いられる。
乾留を行う場合、ヨモギを乾留装置に供給して、高温かつ減圧下で行うことが必要である。好適な乾留条件は２６０〜３５０℃（より好ましくは２７０〜３３０℃、更に好ましくは２８０〜３２０℃）、１００mmHg以下（より好ましくは６０mmHg以下、更に好ましくは２０〜４０mmHg）である。
上記の条件で得られた乾留液は通常褐色の不溶物を含む黄褐色の溶液である。本発明では、得られた乾留液をそのままの状態で抗酸化剤として供することもできるし、該乾留液を希釈剤で希釈した希釈乾留液を抗酸化剤として供してもよい。希釈乾留液を抗酸化剤とする場合は、希釈剤として、例えば水、エタノール、プロパノール、エチレングリコールなどが用いられる。乾留液中または希釈乾留液中に不溶物がある場合は、ろ過又は遠心分離などにより不溶物を取り除き、均一の溶液とし、抗酸化剤として用いることが望ましい。なお、上記の方法により不溶物を取り除いた希釈乾留液を調製する場合、乾留液中の不溶物を取り除いた後、希釈剤と混合する方法、または乾留液と希釈剤を混合した後、不溶物を取り除く方法のうち、どちらの方法を採用してもよい。
上述した好適な乾留条件で得られた乾留液は、これと同じ条件でヨモギ以外の植物を乾留して得られた乾留液と比べて格段に優れた抗酸化能を有するとともに、ヨモギを上述した好適な乾留条件以外の条件で得られた乾留液と比べても格段に優れた抗酸化能を有する。さらに、上述した好適な乾留条件で得られた乾留液は消臭効果及び抗菌活性をも併せて有する。したがって、本発明の抗酸化剤は食品、化粧品、医薬部外品などへの添加剤として有用である。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
１．乾留液の抗酸化能
１−１.乾留液の調製
（実施例１，比較例１〜１５）
表１に示す１６種類の植物（以下、単に「乾留材料」という場合がある）を、５０〜８０℃で５〜２４時間の条件で乾燥し、得られた乾燥物１５０〜２００ｇを乾留装置に供給し、３００℃、２５mmHgで４時間乾留を行い、乾留材料１００ｇ当たり１０〜２０ｇの乾留液を得た。続いて、得られた乾留液を１０％（w/v）になるようにエタノールで希釈し、次いで希釈液をろ紙でろ過して不溶物を除き、１０％(w/v)乾留液のエタノール溶液を得、これを試験液とした。１６種類の植物のうちヨモギが実施例１で他の植物は比較例である。
（比較例１６）
植物としてヨモギを使用し、乾留温度を２２０℃に設定したこと以外は、実施例１と同様にして１０％(w/v)乾留液のエタノール溶液を得、これを試験液とした。
１−１.乾留液の調製
（実施例１，比較例１〜１５）
表１に示す１６種類の植物（以下、単に「乾留材料」という場合がある）を、５０〜８０℃で５〜２４時間の条件で乾燥し、得られた乾燥物１５０〜２００ｇを乾留装置に供給し、３００℃、２５mmHgで４時間乾留を行い、乾留材料１００ｇ当たり１０〜２０ｇの乾留液を得た。続いて、得られた乾留液を１０％（w/v）になるようにエタノールで希釈し、次いで希釈液をろ紙でろ過して不溶物を除き、１０％(w/v)乾留液のエタノール溶液を得、これを試験液とした。１６種類の植物のうちヨモギが実施例１で他の植物は比較例である。
（比較例１６）
植物としてヨモギを使用し、乾留温度を２２０℃に設定したこと以外は、実施例１と同様にして１０％(w/v)乾留液のエタノール溶液を得、これを試験液とした。
１−２．試験方法
以下のDPPH法により、各試験液の抗酸化能を測定した。表１に実施例１と比較例１〜１５の抗酸化能を比較した結果、表２に実施例１と比較例１６の抗酸化能を比較した結果を示す。
（Ａ）400μM DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) エタノール溶液の調製
（１) DPPH 3.94 mgを秤量し、エタノール 25 mLに撹拌溶解する。
（Ｂ）検量線の作成
（１）400μM DPPH エタノール溶液をエタノールで３倍に希釈し、その希釈液 0.9 mL を試験管に分注する。
（２）希釈液の入った試験管にエタノール300, 250, 200, 150, 100μLを n=２で添加する。
（３）0.2 mM α-トコフェロールエタノール溶液（8.6 mg → エタノール 100 mL）を上記（Ｂ）（２）で加えたエタノールと0.2 mM α-トコフェロールエタノール溶液の合計が 300 μLになるよう試験管 (n=2) に添加し、撹拌する。この場合α-トコフェロールの量は 0, 10, 20, 30, 40 nmol/assayとなる。
（４）添加２０分後に 516 nmでの吸光度を測定する。
（５）横軸にα-トコフェロール量 (nmol/assay)、縦軸に吸光度をとり、最小二乗法により検量線を作成する。
以下のDPPH法により、各試験液の抗酸化能を測定した。表１に実施例１と比較例１〜１５の抗酸化能を比較した結果、表２に実施例１と比較例１６の抗酸化能を比較した結果を示す。
（Ａ）400μM DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) エタノール溶液の調製
（１) DPPH 3.94 mgを秤量し、エタノール 25 mLに撹拌溶解する。
（Ｂ）検量線の作成
（１）400μM DPPH エタノール溶液をエタノールで３倍に希釈し、その希釈液 0.9 mL を試験管に分注する。
（２）希釈液の入った試験管にエタノール300, 250, 200, 150, 100μLを n=２で添加する。
（３）0.2 mM α-トコフェロールエタノール溶液（8.6 mg → エタノール 100 mL）を上記（Ｂ）（２）で加えたエタノールと0.2 mM α-トコフェロールエタノール溶液の合計が 300 μLになるよう試験管 (n=2) に添加し、撹拌する。この場合α-トコフェロールの量は 0, 10, 20, 30, 40 nmol/assayとなる。
（４）添加２０分後に 516 nmでの吸光度を測定する。
（５）横軸にα-トコフェロール量 (nmol/assay)、縦軸に吸光度をとり、最小二乗法により検量線を作成する。
（Ｃ）試験液の測定
（１）DPPH希釈液 0.9 mL を試験管に分注し、それにエタノール 250 μL を添加する。
（２）試験液 50 μL を試験管(n=2)に添加し、撹拌する。
（３）添加２０分後に 516 nmでの吸光度を測定する。
（４）得られた吸光度より、検量線を用いてα-トコフェロール相当量を算出する。
（１）DPPH希釈液 0.9 mL を試験管に分注し、それにエタノール 250 μL を添加する。
（２）試験液 50 μL を試験管(n=2)に添加し、撹拌する。
（３）添加２０分後に 516 nmでの吸光度を測定する。
（４）得られた吸光度より、検量線を用いてα-トコフェロール相当量を算出する。
表１より、実施例１と比較例１〜１５の各植物の乾留液の抗酸化能を比べると、ヨモギ由来の乾留液（実施例１）が格段に優れた抗酸化能を有することが分かった。
表２より、乾留温度が３００℃（実施例１）では抗酸化能が１００３（nmolα-トコフェロール相当量／assay）となり、乾留温度が２２０℃（比較例１６）では、抗酸化能が１５（nmolα-トコフェロール相当量／assay）となった。したがって、原料として同じヨモギを用いた場合でも乾留温度の違いにより抗酸化能が格段に異なることが分かった。
２．ヨモギの乾留液のＨＰＬＣクロマトグラム
実施例１の１０％（w/v）エタノール溶液のＨＰＬＣ分析を下記の条件で行った。図１にクロマトグラムを示す。
・溶出法：Gradient（勾配溶離）分析
・カラム：ワイエムシィ社製 YMC-Pack ODS-A A-312 150 × 6 mmI.D.
・カラム温度：４０℃
・溶出液：Ａ液 水
Ｂ液 エタノール
時間（分） Ｂ液濃度（％）
０ ５
１０ ５
４０ ４０
６０ ４０
・流量：0.8 mL/min
・検出器：フォトダイオードアレイ（UV 220, 254, 280 nm）
・注入量：５μL
実施例１の１０％（w/v）エタノール溶液のＨＰＬＣ分析を下記の条件で行った。図１にクロマトグラムを示す。
・溶出法：Gradient（勾配溶離）分析
・カラム：ワイエムシィ社製 YMC-Pack ODS-A A-312 150 × 6 mmI.D.
・カラム温度：４０℃
・溶出液：Ａ液 水
Ｂ液 エタノール
時間（分） Ｂ液濃度（％）
０ ５
１０ ５
４０ ４０
６０ ４０
・流量：0.8 mL/min
・検出器：フォトダイオードアレイ（UV 220, 254, 280 nm）
・注入量：５μL
３．乾留液の消臭効果
前記「１−１．乾留液の調製」の項で調製した実施例１と比較例１〜１５の試験液について、以下の４種類の悪臭物質を対象として以下の試験方法により消臭率を測定した。表３に結果を示す。
３−１．試験悪臭物質
アンモニア（NH3)、トリメチルアミン((CH3)3N)、メチルメルカプタン(CH3SH)、硫化水素(H2S)
３−２．試験方法
Ａ．アンモニア
400 mLガラス製容器に試験液1 mLを取り、50％エタノール4 mLで希釈し、容器を密封した後1.4％アンモニア水100 μLを加えた。室温で１時間放置後、アンモニア検知管3L（ガステック社製）で容器中のアンモニアの濃度を測定した。
Ｂ．トリメチルアミン
400 mLガラス製容器に試験液1 mLを取り、50％エタノール4 mLで希釈し、容器を密封した後3％トリメチルアミン水溶液100 μLを加えた。室温で１時間放置後、アミン類検知管No.180（ガステック社製）で容器中のトリメチルアミンの濃度を測定した。
Ｃ．メチルメルカプタン
400 mLガラス製容器に試験液1 mLを取り、エタノール：0.1 Mゼレンセン緩衝液（pH10）（１：１）4 mLで希釈し、容器を密封した後0.9％メチルメルカプタンNa水溶液100 μLを加えた。室温で１時間放置後、メチルメルカプタン検知管No.71（ガステック社製）で容器中のメチルメルカプタンの濃度を測定した。
Ｄ．硫化水素
400 mLガラス製容器に試験液1 mLを取り、エタノール：0.5 Mトリス緩衝液（pH8.5）(１：１) 9 mLで希釈し、容器を密封した後硫化水素ガス200 μLを加えた。室温で１時間撹拌放置後、硫化水素検知管4LL（ガステック社製）で容器中の硫化水素の濃度を測定した。
３−３．消臭率（％）
消臭率（％）＝〔（ブランクの濃度−試験液の濃度）／ブランクの濃度〕×１００
前記「１−１．乾留液の調製」の項で調製した実施例１と比較例１〜１５の試験液について、以下の４種類の悪臭物質を対象として以下の試験方法により消臭率を測定した。表３に結果を示す。
３−１．試験悪臭物質
アンモニア（NH3)、トリメチルアミン((CH3)3N)、メチルメルカプタン(CH3SH)、硫化水素(H2S)
３−２．試験方法
Ａ．アンモニア
400 mLガラス製容器に試験液1 mLを取り、50％エタノール4 mLで希釈し、容器を密封した後1.4％アンモニア水100 μLを加えた。室温で１時間放置後、アンモニア検知管3L（ガステック社製）で容器中のアンモニアの濃度を測定した。
Ｂ．トリメチルアミン
400 mLガラス製容器に試験液1 mLを取り、50％エタノール4 mLで希釈し、容器を密封した後3％トリメチルアミン水溶液100 μLを加えた。室温で１時間放置後、アミン類検知管No.180（ガステック社製）で容器中のトリメチルアミンの濃度を測定した。
Ｃ．メチルメルカプタン
400 mLガラス製容器に試験液1 mLを取り、エタノール：0.1 Mゼレンセン緩衝液（pH10）（１：１）4 mLで希釈し、容器を密封した後0.9％メチルメルカプタンNa水溶液100 μLを加えた。室温で１時間放置後、メチルメルカプタン検知管No.71（ガステック社製）で容器中のメチルメルカプタンの濃度を測定した。
Ｄ．硫化水素
400 mLガラス製容器に試験液1 mLを取り、エタノール：0.5 Mトリス緩衝液（pH8.5）(１：１) 9 mLで希釈し、容器を密封した後硫化水素ガス200 μLを加えた。室温で１時間撹拌放置後、硫化水素検知管4LL（ガステック社製）で容器中の硫化水素の濃度を測定した。
３−３．消臭率（％）
消臭率（％）＝〔（ブランクの濃度−試験液の濃度）／ブランクの濃度〕×１００
表３より、ヨモギ、茶、竹、もみがら、小麦ふすま、ケイヒ、クマザサ、カキノハの各乾留液は４種類の悪臭物質に対して消臭効果を示すことが分かった。
４．乾留液の抗菌活性
以下の１６種類の乾留材料から得られた乾留液について試験液を調製し、以下の方法で抗菌活性を検討した。表４に本試験に用いた菌株リストを示し、表５に結果を示す。
４−１．乾留材料
ヨモギ、茶、竹、もみがら、米ぬか、そばがら、小麦ふすま、菜種油粕、椿油粕、ごま油粕、ごま、ショウガ、オウバク、ケイヒ、クマザサ、カキノハ
４−２．乾留方法
各乾留材料を５０〜８０℃で５〜２４時間の条件で乾燥し、得られた乾燥物１５０〜２００ｇを乾留装置に供給し、３００℃、２５mmHgで４時間乾留を行い、乾留材料１００ｇ当たり１０〜２０ｇの乾留液を得た。
４−３．試験液の調製
Ａ．細菌、酵母、乳酸菌の抗菌性試験に用いた試験液
得られた乾留液を2.0 g秤量し、エタノールで全量を4 mLとし、不溶物のあるものは遠心分離し（3000rpm、5分）、上清を試験液とした。（50％(w/v)乾留液エタノール溶液）
Ｂ．真菌の抗菌性試験に用いた試験液
得られた乾留液を5.0 g秤量し、エタノールで全量を50 mLとし、不溶物のあるものはろ紙でろ過し試験液とした。（10％(w/v)乾留液エタノール溶液）
以下の１６種類の乾留材料から得られた乾留液について試験液を調製し、以下の方法で抗菌活性を検討した。表４に本試験に用いた菌株リストを示し、表５に結果を示す。
４−１．乾留材料
ヨモギ、茶、竹、もみがら、米ぬか、そばがら、小麦ふすま、菜種油粕、椿油粕、ごま油粕、ごま、ショウガ、オウバク、ケイヒ、クマザサ、カキノハ
４−２．乾留方法
各乾留材料を５０〜８０℃で５〜２４時間の条件で乾燥し、得られた乾燥物１５０〜２００ｇを乾留装置に供給し、３００℃、２５mmHgで４時間乾留を行い、乾留材料１００ｇ当たり１０〜２０ｇの乾留液を得た。
４−３．試験液の調製
Ａ．細菌、酵母、乳酸菌の抗菌性試験に用いた試験液
得られた乾留液を2.0 g秤量し、エタノールで全量を4 mLとし、不溶物のあるものは遠心分離し（3000rpm、5分）、上清を試験液とした。（50％(w/v)乾留液エタノール溶液）
Ｂ．真菌の抗菌性試験に用いた試験液
得られた乾留液を5.0 g秤量し、エタノールで全量を50 mLとし、不溶物のあるものはろ紙でろ過し試験液とした。（10％(w/v)乾留液エタノール溶液）
４−４.試験方法
Ａ．菌液前培養
細菌、酵母、乳酸菌にはSCD培地、真菌にはサブロー培地を用い、121℃で20分滅菌し、冷後それぞれの菌を植菌し、35℃で48時間静置培養した。
Ｂ．菌液接種
（１）細菌、酵母、乳酸菌にはSCD寒天培地、真菌にはサブロー寒天培地を用い、121℃で20分滅菌した。
（２）滅菌した培地を約60℃に保ち、細菌、酵母、乳酸菌用にはシャーレに各50%乾留液エタノール溶液400μL、SCD寒天培地9.6 mLを加え、よく混和し、寒天平板を作成した。（乾留液20 mg/mL SCD寒天培地、2％乾留液）また、真菌用にはシャーレに各10％乾留液エタノール溶液200μL、サブロー寒天培地9.8 mLを加え、よく混和し、寒天平板を作成した。（乾留液2 mg/mLサブロー寒天培地、0.2％乾留液）
（３）冷後、寒天平板にレプリカ用接種器を用いて、それぞれの菌液を接種し、35℃で培養した。細菌、酵母、乳酸菌は２日目、真菌は３日目に菌の生育を目視で判定した。尚、それぞれの試験菌株数は細菌２０株、酵母６株、乳酸菌５株、真菌７株である。
（４）細菌、酵母、乳酸菌用のコントロールとしてSCD寒天培地9.6 mLにエタノール400μLを加えて寒天平板を、真菌用のコントロールとしてサブロー寒天培地9.8 mLにエタノール200μLを加えて寒天平板を作成し、それぞれの菌液を接種し、すべての試験菌の生育を確認した。
Ａ．菌液前培養
細菌、酵母、乳酸菌にはSCD培地、真菌にはサブロー培地を用い、121℃で20分滅菌し、冷後それぞれの菌を植菌し、35℃で48時間静置培養した。
Ｂ．菌液接種
（１）細菌、酵母、乳酸菌にはSCD寒天培地、真菌にはサブロー寒天培地を用い、121℃で20分滅菌した。
（２）滅菌した培地を約60℃に保ち、細菌、酵母、乳酸菌用にはシャーレに各50%乾留液エタノール溶液400μL、SCD寒天培地9.6 mLを加え、よく混和し、寒天平板を作成した。（乾留液20 mg/mL SCD寒天培地、2％乾留液）また、真菌用にはシャーレに各10％乾留液エタノール溶液200μL、サブロー寒天培地9.8 mLを加え、よく混和し、寒天平板を作成した。（乾留液2 mg/mLサブロー寒天培地、0.2％乾留液）
（３）冷後、寒天平板にレプリカ用接種器を用いて、それぞれの菌液を接種し、35℃で培養した。細菌、酵母、乳酸菌は２日目、真菌は３日目に菌の生育を目視で判定した。尚、それぞれの試験菌株数は細菌２０株、酵母６株、乳酸菌５株、真菌７株である。
（４）細菌、酵母、乳酸菌用のコントロールとしてSCD寒天培地9.6 mLにエタノール400μLを加えて寒天平板を、真菌用のコントロールとしてサブロー寒天培地9.8 mLにエタノール200μLを加えて寒天平板を作成し、それぞれの菌液を接種し、すべての試験菌の生育を確認した。
表５より、ヨモギ、竹、もみがら、そばがら、小麦ふすま、椿油粕、ショウガ、オウバク、ケイヒ、クマザサの各乾留液は他の乾留液に比べ強い抗菌活性を示すことが分かった。
本発明の抗酸化剤は食品、化粧品、医薬部外品などへの添加剤として広く利用可能である。
Claims (1)
- ヨモギを２６０〜３５０℃、１００mmHg以下の減圧条件下で乾留して得られた乾留液を含有する抗酸化剤。
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