JP5435990B2 - 中空糸モジュールを用いる長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、中空糸モジュールを用いた長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物の製造方法に関する。

糖鎖は、固体の発生、細胞分化、細胞増殖、アポトーシス、組織形成、免疫、血液型抗原、毒素やウィルスの受容体、癌化、疾病、細胞機能の発現、または細胞間相互作用等の様々な場面において、シグナルやマーカー分子として重要な役目を果たしている。これにより、バイオテクノロジーや医薬品開発の分野において、糖鎖を有する化合物の需要が高まっている。特に糖鎖を有する化合物は、医薬品、診断薬、糖鎖チップ等への応用が見込まれている。

このような糖鎖の機能を応用展開するためには、多様な糖鎖を有する化合物の製造が必要である。糖鎖を有する化合物の製造方法としては、化学合成及び酵素による合成方法が挙げられる。化学合成では一種類の天然型糖鎖を得る為に多くの反応ステップ及び精製等の技術を必要とし、一方で収率が低いため、得られる糖鎖を有する化合物は天然物からの抽出と比較してコストが高いという欠点があった。

また、酵素反応による糖鎖の合成には、加水分解酵素と糖転移酵素を用いた方法があるが、いずれも使用する酵素に制限があり、また酵素の安定性等の問題から、現状では大量の糖鎖の安定的な合成が難しい。

近年、簡単な構造の糖鎖（糖鎖プライマーと称する）を動物細胞に投与すると、細胞内で糖鎖プライマーに糖鎖が付加され、伸長した糖鎖が培養液中に排出されることにより、多様な糖鎖が産生されることが報告されている。更に細胞の種類を変えることにより異なった構造の糖鎖が合成されることが判明し、多様な糖鎖生産への応用が検討されてきた。

例えば、糖鎖プライマーとして

を用い、これをＢ１６細胞に投与することにより、

が糖鎖伸長反応により合成されることが知られている（特許文献１）。
また、同様に前記糖鎖プライマーをＣＯＳ７細胞に投与することにより、

ないし

が合成されることも知られており（特許文献２）、さらに、前記糖鎖プライマーをＶｅｒｏ細胞に投与することにより、

が合成されることも知られている（非特許文献１、非特許文献２）。

特開２０００−２４７９９２号公報 特開２００３−２７４９９３号公報

Ａ．Ｍｉｙａｇａｗａ，Ｍ．Ｃ．Ｚ．Ｋａｓｕｙａ ａｎｄ Ｈａｔａｎａｋａ，Ｃｈｅｍ Ｃｅｎｔ Ｊ．２００７ Ｎｏｖ ５；１：２６．， Ｔ．Ｋａｔｏ，Ｋ．Ｈａｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．２００８ Ｊａｎ １８；１１７８（１−２）：１５４−９．

しかしながら、従来の糖鎖プライマー法による糖鎖の伸長反応は、主に培養皿（シャーレ）を用いた平面単層培養、もしくはマイクロキャリアーを用いた高密度培養で実施されている。平面単層培養法では、大量培養が困難であり、マイクロキャリアー法を用いた高密度培養に関しても、撹拌を伴う培養法であることから、マイクロキャリアー自体の衝突による細胞への傷害を防ぐ為にも、液体培地に対するマイクロキャリアーの投入量に制限がある。更に、培養中細胞が死滅・剥離するため、培養液の回収方法に課題があった。その為、長期的な連続生産には不向きな面もあった。

また、動物細胞を大量培養する場合に中空糸モジュールを用いることが知られているが、本発明者らは糖鎖プライマー法を実施するにあたり、単純に中空糸モジュールを適用しても動物細胞が死滅等して長期的な連続生産ができるわけではなく、糖鎖伸長生成物を大量生産することができないことを明らかにした。

そこで本発明が解決しようとする課題は、動物細胞を内包した中空糸モジュールを用いて糖鎖プライマー法を実施するにあたり、長期的な連続生産が可能で、大量合成が可能な長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物の製造方法を提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意努力した結果、中空糸モジュールを用いた糖鎖プライマー法を実施するにあたり、中空糸の単位面積当たり、ある特定範囲の投与量で糖鎖プライマーを動物細胞に投与することにより、極めて長期間の連続生産が可能となり、その結果、長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物の大量合成が可能となることを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、中空糸モジュール内に動物細胞を内包させ、該動物細胞に培養液を投与する工程（１）と、無血清培養液を投与する工程（２）と、長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体からなる糖鎖プライマーを含有するプライマー溶液を投与する工程（３）とをこの順で有する長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物の製造方法であって、前記工程（３）において前記糖鎖プライマーの投与量が中空糸の単位表面積当たり、０．５〜２０〔ｎｍｏｌ／ｃｍ^２〕であることを特徴とする長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物の製造方法を提供する。

本発明の製造方法により、糖鎖プライマー法による長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物を合成する際に、６ヶ月以上の連続的且つ長期的な製造が可能となり、極めて多量の長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物の合成が可能となる。

本発明の中空糸モジュールの断面図の具体例である。 本発明の中空糸モジュールを用いた製造装置の具体例である。 本発明の実施例および比較例により得られた長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体全合成量を示すグラフである。 実施例１で得られたＧＭ３類似体（ＧＭ３ＯＣ１２）のＮＭＲデータである。

（中空糸モジュール）
本発明に用いる中空糸モジュールとは多数の中空糸を束ねてハウジング内に封入した容器全体を指す。本発明の中空糸モジュールの具体例を図１に示す。ハウジング１内に中空糸２の両端がシール材３で固定されて両端内腔が開口されており、シール材を介して蓋材８が取り付けられており、各両端内腔側４は接続口５で外部と接続されている。また中空糸の外腔側６は開口部７で外部と接続することができる。

本発明に用いる中空糸モジュールは中空糸が充填できればどのような形状でも良いが、外部装置によって担持しやすい形状あるいは担持しやすい付属品を備えていることが好ましい。

本発明で用いる中空糸の膜の構成ポリマーは特に限定されないが、物質透過性を有する中空繊維状の膜であって通常用いられるポリスルホン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、セルロースアセテート、ポリアクリルニトリル、フッ素系樹脂、再生セルロース、修飾セルロース（「ＣＥＬＬＭＡＸ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ」（登録商標：スペクトラム社）、「ＦｉｂｅｒＣｅｌｌ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ」（登録商標：ＦｉｂｅｒＣｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）、「ヴィタファイバー（Ｖｉｔａｆｉｂｅｒ）」（登録商標：アミコン社））、ポリアミドなどの熱可塑性高分子による骨格構造を有する不溶性担体が用いられる。また、これらの誘導体が主成分であってもよい。さらにこれらの素材に化学的に修飾を加えたものであっても良く、生体適合性に優れた素材が望ましい。

使用される中空糸の内径はおよそ１０〜２０００〔μｍ〕、好ましくは５０〜５００〔μｍ〕であり、膜厚は１〜５００〔μｍ〕、好ましくは１０〜１００〔μｍ〕である。また、中空糸の表面積は特に限定されるものではないが、５〔ｃｍ^２〕〜３．２〔ｍ^２〕の範囲であり、好ましくは５０〔ｃｍ^２〕〜２．０〔ｍ^２〕の範囲であり、さらに好ましくは１００〔ｃｍ^２〕〜１．６〔ｍ^２〕の範囲である。ただし、該表面積とは、中空糸モジュール内の中空糸膜の外腔側の総表面積をさし、（中空糸の外径）×π×（中空糸１本当たりの長さ）×（モジュール内の中空糸束の本数）で表される。

孔径としては動物細胞のサイズより小さい必要がある。具体的には１５〔μｍ〕以下であることが好ましく、さらに好ましくは５．０〔μｍ〕以下、より好ましくは１．０〔μｍ〕以下である。一方、ＤＭＥＭやＤＭＥＭ Ｆ１２、ＲＰＭＩ、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（いずれも、登録商標：インビトロジェン社）といった培養液や無血清培養液また、成長因子などのプライマー溶液中の物質が通過するサイズよりも大きい必要がある。具体的には分画分子量１，０００〔Ｄａ〕以上であることが好ましく、さらに好ましくは５，０００〔Ｄａ〕以上、より好ましくは１０，０００〔Ｄａ〕以上である。孔径が小さいと物質の透過性が低下し、孔径が大きくなると物質の透過性が上昇する。

（培養装置の構成例）
本発明の製造方法に用いられる製造装置の一例を図面を用いて説明する（図２）。中空糸モジュール９の中空糸内腔側へ接続口５とチューブ１０とがコネクタ類を介してつながっており、さらに該チューブ１０を通じてリザーバ１１内の液が送液ポンプ１２により循環される。

（動物細胞に培養液と投与する工程）
本発明において動物細胞の培養は、培養液を動物細胞に投与し、３０〜４０〔℃〕、好ましくは３７±０．２〔℃〕で１〜１０日間培養すればよい。動物細胞に培養液を投与するには、例えば、培養液を、中空糸膜を介して内腔から外腔へ拡散濾過により供給すればよい。この際、動物細胞が排出する老廃物を外腔から内腔へと排出することにより動物細胞が培養される。

（動物細胞）
本発明により使用する動物細胞としては、各種動物由来細胞、ヒト組織由来正常細胞、ヒト癌細胞などが挙げられる。また、糖鎖合成酵素、特にヒト型をコードするＤＮＡを組み込んだベクターを含む各種細胞が用いられるが、これらに限定されるものではない。具体的にはＢ１６メラノーマ細胞（マウス悪性黒色腫）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞）、ＣＯＳ７細胞（アフリカミドリザル腎細胞）、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎細胞）、ＰＣ１２細胞（ラット副腎褐色細胞腫）などが好ましいものとして挙げられる。これらの動物細胞は、抗体やリガンドなどの刺激因子などで予め刺激、加工されている細胞であっても良い。

本発明の製造方法において、動物細胞は中空糸の内腔側でも外腔側でもどちらに内包されていても良いが、内腔側に内包した場合には培養スペースが限定されるなどの理由から一般的には外腔側に内包するよう充填することが好ましい。動物細胞を中空糸外腔に播種するには、開口部７から動物細胞の浮遊液を流し込めばよい。播種する動物細胞の細胞数は、使用する動物細胞種により異なるため、特に限定されるものではないが、中空糸表面単位面積当たり、１×１０^３〜１×１０^５〔ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２〕であり、好ましくは５×１０^３〜５×１０^４〔ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２〕である。

（培養液）
本発明に用いる培養液は、培養しようとする細胞の生育必須成分を含有するものであれば、従来公知のいかなる培養液も用いることができ、特に限定されない。また、細胞の生育必須成分とは、培養しようとする細胞が増殖するうえで必要不可欠な成分であり、種々の有機物、無機物で構成され、酸素等を供給するための溶存ガスも含まれる。具体的な培養液としては、例えば、ＤＭＥＭＦ１２培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、α−ＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ培地、ＳｔｅｍＳｐａｎ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ培地、ＨｙｂｒｉｄｏｍａＳＦＭ培地、及びこれらの混合物等が挙げられるが、これらの培地に限定されない。また、培養の際は添加物としてウシ血清、ウシ胎児血清、ウマ血清、ヒト血清など血清やインターロイキン、インターフェロン、インシュリン、トランスフェリン、セレンなどのサイトカインや増殖因子などを添加することができる。更に、ストレプトマイシン，クロラムフェニコール，抗真菌剤等の抗生物質も添加しても良い。

また血清は、１．０％〜３０％〔ｖ／ｖ〕、好ましくは２．０％〜２０％〔ｗ／ｖ〕、より好ましくは５．０％〜１５％〔ｗ／ｖ〕の濃度で添加する。

（無血清培養液を投与する工程）
本発明の製造方法において、上述した動物細胞に培養液を投与する工程の後に、無血清培養液を投与する工程を行う。本工程の期間は、動物細胞が死滅しない範囲であればかまわないが、あまり長い期間行うと動物細胞が死滅する。具体的には、０．５〜１２時間、好ましくは１〜８時間、より好ましくは２〜６時間の範囲程度である。培養温度は３０〜４０〔℃〕、好ましくは３７±０．２〔℃〕程度である。

無血清培養液として使用する培地としては、上記に挙げた培養液を使用できる。その他にＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標：インビトロジェン社）の様な血清使用量低減培地、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ−ＳＦＭ（登録商標：インビトロジェン社）、ＶＰ−ＳＦＭ（登録商標：インビトロジェン社製）のような無血清培地も使用できるが、これに限定されるものではない。

無血清条件で細胞を維持する際に、培養液中にインシュリン、血小板由来増殖因子、上皮細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、ソマトメジン、ヒドロコーチゾント、トリヨードチロニン等の成長因子、あるいはエタノールアミン、ホスホエタノールアミン、リノール酸、コレステロール、ダイズ脂質等の脂質関連因子、その他、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、微量必須重金属，亜セレン酸，トコフェロール等も添加しても良い。

上記の成長因子等は、０．０５％〜１０％〔ｗ／ｖ〕、好ましくは０．１％〜５．０％〔ｗ／ｖ〕、より好ましくは０．５％〜２．０％〔ｗ／ｖ〕の濃度で添加する。

また、糖鎖プライマーの細胞への取り込み効率の悪化、あるいは産生物の抽出の際に不純物になる等の理由から、フェノールレッドを含有しない培地の方が好ましい。

（プライマー溶液を投与する工程）
本発明の製造方法は、前記無血清培養液を投与する工程の後、長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体からなる糖鎖プライマーを含有するプライマー溶液を投与する工程を行う。

プライマー溶液を投与は、前記の無血清培地に糖鎖プライマーを添加したものをプライマー溶液として動物細胞に投与する。

本発明に用いるプライマー溶液は長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体からなる糖鎖プライマーを含有する。より具体的には糖鎖プライマーは、生体内で糖脂質糖鎖の合成プレカーサーになるラクトシルセラミドの構造を模倣して作られたラクトースもしくはガラクトース、又はＮ−アセチルグルコサミンもしくはＮ−アセチルガラクトサミンなどにアルキル鎖を付けた誘導体である。具体的には、
式（Ｉ）：（Ｇ１）ｘ（Ｇ２）ｙ（Ｇ３）ｚ−Ｌ−Ｘ
中において、Ｇ１、Ｇ２及びＧ３が、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン等により構成され、ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜３の整数であり、好ましくは０〜２、ただしｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない。また式（Ｉ）中において、Ｌは、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−、Ｔｈｒ−Ｏ−とアルキル鎖（ＣＨ２）ｎの連結基であり、即ち−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−及びＴｈｒ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−から選択される。ただし、アルキル鎖（ＣＨ２）ｎのｎは、８〜２０の整数であり、好ましくは８〜１６、より好ましくは１２である。更にＸは、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、及び−Ｃ１−Ｃ４アルキルから選択される基である。
さらに具体的に好ましい糖鎖プライマーとしては、

（ＬａｃＯＣ１２）が好ましいものとして挙げられる。該糖鎖プライマーは、非特許文献３もしくは、非特許文献４に記載されているが、これに限定されるものではない。

Ｍ．Ｃ．Ｚ． Ｋａｓｕｙａ， Ｋ．Ｈａｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｃｈｅｍ．， ２４， ７０５（２００５）） Ｙ．Ｍｕｒｏｚｕｋａ， Ｋ．Ｈａｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ， ２， ｐ．１０６３−１０７７（２００５）

培養細胞で糖鎖伸長反応させるには、単層細胞密着状態（コンフルエント）に増殖した動物細胞に、無血清あるいは低血清培地を用いて糖鎖プライマーを含有するプライマー溶液を投与し、３０〜４０〔℃〕、好ましくは３７±０．２〔℃〕で１〜５日間培養すれば、伸長した糖鎖を含む長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体を含有する産生原液を得ることができる。

この際、プライマー溶液中において糖鎖プライマーの濃度は２５〜１００〔μｍｏｌ／Ｌ〕、好ましくは４０〜７０〔μｍｏｌ／Ｌ〕の範囲である。なお、プライマー溶液を中空糸モジュール内で循環させる場合において、無血清培養液からプライマー溶液に切り替える際の初期値としてリザーバ内のプライマー濃度を前記濃度範囲に設定することが好ましい。

また、本発明の製造方法において糖鎖プライマーの投与量は、中空糸モジュールの体積及び、投与するプライマー量（ｍｏｌ）により決定される。投与する糖鎖プライマーの投与量は、中空糸の単位面積当たり、その下限値が０．５〔ｎｍｏｌ／ｃｍ^２〕以上、好ましくは１．０〔ｎｍｏｌ／ｃｍ^２〕以上、より好ましくは２．０〔ｎｍｏｌ／ｃｍ^２〕以上であり、一方、上限値は２０〔ｎｍｏｌ／ｃｍ^２〕以下、好ましくは１５〔ｎｍｏｌ／ｃｍ^２〕以下、さらに好ましくは１２〔ｎｍｏｌ／ｃｍ^２〕以下である。なお、プライマー溶液を中空糸モジュール内で循環させる場合において、無血清培養液からプライマー溶液に切り替える際の初期値としてリザーバ内の糖鎖プライマー量を前記投与量範囲に設定しておくことが好ましい。

プライマー溶液の総量は、中空糸モジュールやチューブ、リザーバタンクをはじめとする装置全体の容量、大きさによるため一概には規定できないが、おおよそ、中空糸単位面積当たり０．０２〜０．５〔ｍＬ／ｃｍ^２〕の範囲となるように設定することが好ましい。
また、培養液の総量よりもプライマー溶液の総量を少なくすることが、細胞の死滅を抑制し長期的な連続生産に適する点で好ましい。

本発明の製造方法は上記範囲内において長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物の大量生産が可能となり、さらには、前記工程（１）〜工程（３）を繰り返し行うことにより、６ヶ月以上連続して長期培養も可能である。

（回収工程）
本発明において、伸長した糖鎖を含む長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体を含有する産生原液から該長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物を回収する工程は、細胞から糖脂質を回収する場合などに通常用いる回収法など、公知慣用の方法を用いればよく、特に限定されるものではないが、例えば培養上清をハーベストし、濃縮、分離、構造解析を行えばよく、多種類の糖鎖のライブラリーを得ることが出来る。細胞の種類によって糖鎖プライマーの種類と投与量、培養液、培養日数が異なるので、細胞毎に培養の最適条件を見出すことは、糖鎖伸長生成物の効率的な生産に繋がる。ハーベスト液に含まれる糖鎖伸長生成物は、アフィニテイークロマトグラフ、限外濾過、あるいは硫安沈殿などを用いて濃縮分離し、高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで構造解析を行う。未知物質については高速薄層クロマトグラフィーにブロッティング後、酵素処理を行い、得られた物質の組成分析から構造の推定を行えばよい。

（培養および糖鎖伸長生成物の製造例）
本発明においては、まず中空糸モジュール９の中空糸の外腔側に動物細胞を播種した後、リザーバ１１内に培養液を充填して、５〜１０日間、循環させて動物細胞を培養させる。続いて、リザーバ１１内を無血清培養液に交換して、２〜２４時間、循環させる。続いて、リザーバ１１内をプライマー溶液に交換して、１〜５日間、循環して長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体を製造した後、プライマー溶液を回収して動物細胞内で産生した長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体を回収する。その後、さらに連続して培養する場合には、リザーバ１１内を血清を含む培養液に交換して、４〜１０日間、循環させて動物細胞を培養させる。その後、必要に応じてリザーバ１１内を無血清培養液に交換して、２〜２４時間、循環させた後、続いて、リザーバ１１内をプライマー溶液に交換して、１〜５日間、循環して長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体を製造した後、培地回収して動物細胞内で産生した長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体を回収すればよい。本発明の長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の製造方法は、この工程を繰り返すことにより連続して６ヶ月以上の長期培養が可能となり、長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の大量生産も可能となる。

また、必要であればリザーバ等において溶存酸素濃度、ｐＨ値、温度、培地成分をセンサーにより測定し、コンピュータによりフィードバック制御系装置を用いて酸素、二酸化炭素、培地成分などの供給装置の制御やヒーターによる温度調整をすることも可能である。このような培養回路において、所定の流速で培養液を送液できるローラーポンプなどを用いて培養用中空糸モジュールを接続し、培養期間中に乳酸、ｐＨ値などの培養状態を表す指標をセンサーにより測定し、これを基にコンピュータによりポンプを制御して流量を変動できることが望ましい。細胞が産生した糖鎖伸長生成物に関して、該糖鎖伸長生成物が中空糸膜の孔を通過できるものであれば、培養しながらリザーバから回収することも可能である。

培養液には所定のｐＨ値に維持するための緩衝系を含むことが可能であり、二酸化炭素／重炭酸塩系およびＨＥＰＥＳ緩衝系を使用することでｐＨを調節しうる。さらに長時間の培養によって重炭酸塩系あるいはＨＥＰＥＳ緩衝系による培地ｐＨ値の緩衝作用を長期間維持するためには外部装置からの二酸化炭素の供給をすることも可能である。培地の温度は既存のインキュベーターやヒーター等を用いて３０〜４０〔℃〕、好ましくは３７±０．２〔℃〕で制御する。

（その他培養方法との組合せ）
本発明の製造方法において、マイクロキャリア法、ゲル包埋法といった、当業者に公知な細胞培養法を適宜組み合わせて用いることもできる。マイクロキャリア法は、ガラス、ゼラチン、セルロースなどでできたビーズに細胞を付着させて培養する方法であり、またゲル包埋培養法は、コラーゲンあるいはアガロース中で細胞を三次元的に培養する方法である。

これらの細胞培養法では、細胞とともにマイクロキャリアあるいはゲルを、上記細胞投入用導管から投入し、上述した培養液を中空糸の外腔側に循環させることによって動物細胞を培養し、続いてプライマー溶液を投与して糖鎖伸長生成物製造を行うことができる。また、培養液循環速度、培地交換の有無、酸素添加方法といった培養条件は、細胞の種類、細胞濃度等に応じて適宜設定すればよい。

（長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物について）
本発明の製造方法により得られた長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物としては、前記糖鎖プライマーに糖鎖が伸長した化合物であるが、より好ましくは、
式（Ｉ）：（Ｇ_１）_ｘ（Ｇ_２）_ｙ（Ｇ_３）_ｚ−Ｌ−Ｘ
（ただし、式（Ｉ）中、Ｇ_１、Ｇ_２及びＧ_３は、それぞれ独立して、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸、Ｌ−フコースに代表される環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、Ｌは、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−、Ｔｈｒ−Ｏ−とアルキル鎖（ＣＨ_２）_ｎの連結基であり、即ち−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｓ−（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−及びＴｈｒ−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−から選択される。またＸは、−Ｎ_３、−ＮＨ_２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、及び−Ｃ_１−Ｃ_４アルキルから選択される基である。ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり、好ましくは０〜３、より好ましくは０〜２である。ただしｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない。式（Ｉ）中において、アルキル鎖（ＣＨ_２）_ｎのｎは、８〜２０の整数であり、好ましくは８〜１６、より好ましくは１２である。）で示される化合物である。

より具体的には、糖鎖プライマーとして

を用い、これをＢ１６細胞に投与した場合には、

が糖鎖伸長反応により合成される。
また、同様に前記糖鎖プライマーをＣＯＳ７細胞に投与した場合には、

ないし

が合成される。さらに、前記糖鎖プライマーをＶｅｒｏ細胞に投与した場合には、

が合成される。

（長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の用途について）
本発明の製造方法により得られた長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物は、例えば分析用、医薬用標準糖鎖として用いることができる。また診断薬用の糖鎖アレイに用いることもでき、さらには、毒素・病原体除去装置など医療器具に用いる毒素・病原体の除去用材料として用いることもできる。

（実施例１）Ｂ１６メラノーマ細胞（マウス黒色腫）を用いた糖鎖伸長生成物の産生（糖鎖プライマー投与量２．８４〔ｎｍｏｌ／ｃｍ^２〕）
・細胞播種
１０ｃｍφｄｉｓｈ（旭テクノグラス（株）製）を用いて、Ｂ１６細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭＦ１２培地（インビトロジェン株式会社）を用いて前培養し、１×１０^７〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕の細胞懸濁液を調製，５〔ｍＬ〕（Ｔｏｔａｌ５×１０^７〔ｃｅｌｌｓ〕）を中空糸モジュール（膜面積２２００〔ｃｍ^２〕、ＣｅｌｌＭａｘＣＭ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ １９００，ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）外腔に注入してシリンジを用いて撹拌してモジュール内部を均一にして播種した。

・該動物細胞に培養液を投与する工程（１）
培養液として１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭＦ１２培地（インビトロジェン株式会社）１０００〔ｍＬ〕を用いて、リザーバ・チューブ内及びモジュール外腔を循環させ、培養システム（ＣｅｌｌＭａｘ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，登録商標：ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を用いてＣＯ_２インキュベータにて３７℃，５％ＣＯ_２の条件で培養した。

・無血清培養液を投与する工程（２）
続いて、工程（１）の培養液を、無血清培養液（１％（ｖ／ｖ）インシュリン・トランスフェリン・二酸化セリン（ＩＴＳＸ インビトロジェン株式会社）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１％（ｖ／ｖ）抗生物質を含む））１０００〔ｍｌ〕で置き換え、リザーバ・チューブ内及びモジュール外腔を循環させ、４時間培養した。

・プライマー溶液を投与する工程（３）（糖鎖プライマー投与量２．８４〔ｎｍｏｌ／ｃｍ^２〕）
次に、以下の要領で糖鎖プライマーを動物細胞に投与した。
糖鎖プライマーは１−（ｎ−ｄｏｄｅｃｙｌ）−β−Ｌａｃｔｏｓｉｄｅを使用した。該糖鎖プライマーは、非特許文献４の１０７６頁９行目から１０７７頁後ろから９行目までの記載に従って合成した（^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ５．１１（ｄ，１Ｈ），５．０７（ｄ，１Ｈ），４．７７（ｄ，１Ｈ），４．６５（ｍ，２Ｈ），４．５３（ｍ，２Ｈ），４．１７（ｍ，２Ｈ），３．７８−３．２８（ｍ，８Ｈ），３．００（ｍ，１Ｈ），１．５０（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｍ，１６Ｈ），^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ１０３．８（Ｃ１’），１０２．５（Ｃ１））。
上記の糖鎖プライマーを５０〔ｍｍｏｌ／Ｌ〕（２７．５ｍｇ／ｍＬ）となるよう、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１％（ｖ／ｖ）インシュリン・トランスフェリン・二酸化セリン（ＩＴＳＸインビトロジェン株式会社）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１％（ｖ／ｖ）抗生物質を含む）１〔Ｌ〕に１〔ｍＬ／Ｌ〕加えた（プライマー終濃度５０〔μｍｏｌ／Ｌ〕）。これをプライマー溶液とした。該プライマー溶液１２５〔ｍＬ〕を培養中のリザーバー、チューブ内及びモジュール外腔の培養液と交換した。２４時間後及び４８時間後にサンプリングを行い代謝物測定を行った。また、４８時間後にリザーバ及びモジュール外腔液を回収し、糖鎖伸長反応物の測定を行った。

・長期培養
上記工程（１）、工程（２）、および工程（３）をこの順で１セットとして、３２回繰り返し行い、６ヶ月間、長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体を製造した。長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の全合成量を表１および図３に示す。また得られた長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体は図４に示したＮＭＲにより、

で表されるＧＭ３類似体（ＧＭ３ＯＣ１２）であることが確認された。

（実施例２）（糖鎖プライマー投与量５．６８〔ｎｍｏｌ／ｃｍ^２〕）
実施例１、工程（３）で該プライマー溶液１２５〔ｍＬ〕とした部分を、プライマー溶液２５０〔ｍＬ〕に置き換えた以外は、実施例１と同様にして長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体を製造した。長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体全合成量を表１および図３に示す。

（実施例３）（糖鎖プライマー投与量１１．４〔ｎｍｏｌ／ｃｍ^２〕）
実施例１、工程（３）で該プライマー溶液１２５〔ｍＬ〕とした部分を、プライマー溶液５００〔ｍＬ〕に置き換えた以外は、実施例１と同様にして長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体を製造した。長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体全合成量を表１および図３に示す。

（比較例１）（糖鎖プライマー投与量０．４５〔ｎｍｏｌ／ｃｍ^２〕）
実施例１、工程（３）でプライマー溶液中の糖鎖プライマーが５０〔ｍｍｏｌ／Ｌ〕（２７．５ｍｇ／ｍＬ）とした部分を、２０〔ｍｍｏｌ／Ｌ〕（１１．０ｍｇ／ｍＬ）に置き換え、且つ、該プライマー溶液１２５〔ｍＬ〕とした部分を、プライマー溶液５０〔ｍＬ〕に置き換えた以外は、実施例１と同様にして長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体を製造した。長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体全生産量を表１および図３に示す。

（比較例２）（糖鎖プライマー投与量２２．７〔ｎｍｏｌ／ｃｍ^２〕）
糖鎖プライマー溶液を１０００〔ｍＬ〕としたこと以外は実施例１と同様にして長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体を製造した。長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体全合成量を表１および図３に示す。

（測定法）長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体（糖鎖伸長反応物）の測定
ＳｅｐＰａｋＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）にメタノール１０〔ｍＬ〕を通し、次いでＭｉｌｌｉＱ超純水１０〔ｍＬ〕を通して平衡化した。平衡化したカラムに試料７〔ｍＬ〕を通し、超純水１０〔ｍＬ〕にて洗浄後、メタノール３〔ｍＬ〕，次いでクロロホルム／メタノール（２：１）を通して糖脂質を溶出させ、溶出液を窒素気流中で乾燥させた。乾燥させた試料をクロロホルム／メタノール（２：１）に再溶解させ、ＨＰＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ社製）にて展開（展開溶媒クロロホルム／メタノール／０．２５％ＫＣｌａｑ）させた。ＨＰＴＬＣプレート上の溶媒を乾燥させた後、ＨＰＴＬＣプレートを、レゾルシノール硫酸試薬を噴霧し発色させ、合成したオリゴ糖鎖の検出、並びにデンシトメーターを用いて各レーンのバンド強度を測定した。また、標準のＧＭ３様糖鎖とＲｆ値が等しいバンドにおいて、測定したバンドの強度から長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体合成量を比較した。

（測定法）糖鎖（オリゴ糖鎖）伸長生成物の同定
合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ２０（日本錬水株式会社製）１００〔ｇ〕に試料８００〔ｍＬ〕を吸着ささせ、蒸留水１〔Ｌ〕で洗浄後、Ｈ_２Ｏ／メタノール溶液で１００／０〜０／１００の範囲で溶出させた。ＨＰＴＬＣにて各溶出画分を分析し、ＧＭ３溶出画分を回収した。その後、ＳｅｐＰａｋＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）にて精製を行い、精製品１．２〔ｍｇ〕を得た。この試料について、^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）を用いて以下の条件にて、糖鎖伸長生成物の同定を実施した。
試料濃度：２．２ｍｇ／ｍＬ
溶媒：Ｄ_２Ｏ
積算回数：２５６回

（実施例４）〜（実施例６）
細胞をＢ１６の替わりに表１に示したＣＯＳ７を用いた他は、実施例１〜実施例３と同様にして培養を行い、糖鎖伸長生成物ＧＭ３類似体（ＧＭ３ＯＣ１２）を得た。糖鎖伸長生成物全量は、表１に示した。
（比較例３）〜（比較例４）
細胞をＢ１６の替わりに表１に示したＣＯＳ７を用いた他は、比較例１〜比較例２と同様にして培養を行い、糖鎖伸長生成物ＧＭ３類似体（ＧＭ３ＯＣ１２）を得た。糖鎖伸長生成物全量は、表１に示した。

（実施例７）〜（実施例９）
細胞をＢ１６の替わりに表１に示したＣＯＳ７を用い、実施例１〜実施例３と同様にして培養を行い、糖鎖伸長生成物ＧＭ２類似体（ＧＭ２ＯＣ１２）を得た。糖鎖伸長生成物全量は、表１に示した。
（比較例５）〜（比較例６）
細胞をＢ１６の替わりに表１に示したＣＯＳ７を用い、比較例１〜比較例２と同様にして培養を行い、糖鎖伸長生成物ＧＭ２類似体（ＧＭ２ＯＣ１２）を得た。糖鎖伸長生成物全量は、表１に示した。

（実施例１０）〜（実施例１２）
細胞をＢ１６の替わりに表１に示したＣＯＳ７を用い、実施例１〜実施例３と同様にして培養を行い、糖鎖伸長生成物ＧＤ１ａ類似体（ＧＤ１ａＯＣ１２）を得た。糖鎖伸長生成物全量は、表１に示した。
（比較例７）〜（比較例８）
細胞をＢ１６の替わりに表１に示したＣＯＳ７を用い、比較例１〜比較例２と同様にして培養を行い、糖鎖伸長生成物ＧＤ１ａ類似体（ＧＤ１ａＯＣ１２）を得た。糖鎖伸長生成物全量は、表１に示した。

（実施例１３）〜（実施例１５）
細胞をＢ１６の替わりに表１に示したＶｅｒｏを用い、実施例１〜実施例３と同様にして培養を行い、糖鎖伸長生成物Ｇｂ３類似体（Ｇｂ３ＯＣ１２）を得た。糖鎖伸長生成物全量は、表１に示した。
（比較例９）〜（比較例１０）
細胞をＢ１６の替わりに表１に示したＶｅｒｏを用い、比較例１〜比較例２と同様にして培養を行い、糖鎖伸長生成物Ｇｂ３類似体（Ｇｂ３ＯＣ１２）を得た。糖鎖伸長生成物全量は、表１に示した。

本発明により得られる長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体は、医薬品、診断薬、糖鎖チップ等への応用が可能である。

１ハウジング
２中空糸
３シール材
４内腔
５接続口
６外腔
７開口部
８蓋材
９中空糸モジュール
１０チューブ
１１リザーバ（タンク）
１２ポンプ
１３酸素供給装置

Claims (5)

1. 中空糸モジュール内に動物細胞を内包させ、該動物細胞に培養液を投与する工程（１）と、無血清培養液を投与する工程（２）と、長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体からなる糖鎖プライマーを含有するプライマー溶液を投与する工程（３）とをこの順で有する長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物の製造方法であって、
   前記工程（３）において前記糖鎖プライマーの投与量が中空糸の単位表面積当たり、０．５〜１５〔ｎｍｏｌ／ｃｍ２〕であって、前記プライマー溶液の総量が中空糸の単位表面積当たり０．０２〜０．５〔ｍＬ／ｃｍ２〕の範囲であることを特徴とする長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物の製造方法。
2. 中空糸モジュール内に動物細胞を内包させ、該動物細胞に培養液を投与する工程（１）と、無血清培養液を投与する工程（２）と、長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体からなる糖鎖プライマーを含有するプライマー溶液を投与する工程（３）とをこの順で有する長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物の製造方法であって、
   前記工程（３）において前記糖鎖プライマーの投与量が中空糸の単位表面積当たり、０．５〜１５〔ｎｍｏｌ／ｃｍ２〕であって、溶液の濃度が２５〜１００〔μｍｏｌ／Ｌ〕の範囲であることを特徴とする長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物の製造方法。
3. 動物細胞がＢ１６メラノーマ細胞、Ｖｅｒｏ細胞またはＣＯＳ７細胞である請求項１または２に記載の長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物の製造方法。
4. 前記培養液の総量より前記プライマー溶液の総量が少ないことを特徴とする請求項１または２に記載の長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物の製造方法。
5. 表面に動物細胞を接着させたマイクロキャリアを中空糸モジュールに充填する請求項１または２に記載の長鎖アルキルグリコシド及びその誘導体の糖鎖伸長生成物の製造方法。

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