JP5425402B2

JP5425402B2 - メイタンシノイドエステル類を調製するための方法

Info

Publication number: JP5425402B2
Application number: JP2007552258A
Authority: JP
Inventors: ウィディソン，ウエイン・シー; チャリ，ラヴィ・ヴイ・ジェイ
Original assignee: イミュノジェン・インコーポレーテッド
Priority date: 2005-01-21
Filing date: 2006-01-20
Publication date: 2014-02-26
Anticipated expiration: 2026-01-20
Also published as: CY1111157T1; US7301019B2; SI1838715T1; PL1838715T3; EP1838715A2; EP1838715A4; JP2014012693A; CA2601670C; CA2601670A1; US20060167245A1; AU2006206421B2; EP1838715B1; DE602006017797D1; PT1838715E; WO2006078809A3; JP2008528493A; DK1838715T3; AU2006206421A1; ATE486077T1; WO2006078809A2

Description

[01] 本出願は、２００５年１月２１日に出願された米国仮出願第60/644,984に対して、優先権を主張する。該出願の開示全体は、参照によって本明細書に明示的に援用される。

発明の分野
[02] 本発明は、実質的に単一のジアステレオマーであるメイタンシノイド類を調製するための方法に関する。より具体的には、本発明は、Ｃ３位における側鎖がＬ−立体配置である単一のジアステレオマーとして実質的に存在する、チオールまたはジスルフィドを含有するメイタンシノイドエステル類を調製するための方法に関する。これらのメイタンシノイドエステル類は、チオール基を介してこれらを細胞結合剤と連結させ、次いでこれらを特定の細胞集団を標的として送達することにより、治療剤として用いることが可能な、細胞毒性剤である。

発明の背景
[03] メイタンシノイド類は、高度に細胞毒性の薬物である。メイタンシンは、Kupchanらによって、東アフリカの低木であるMaytenus serrataから最初に単離され、そして、メトトレキサート、ダウノルビシン及びビンクリスチンなどの慣用の癌化学療法剤よりも１００〜１０００倍細胞毒性であることが示された（米国特許第3,896,111）。続いて、いくつかの微生物もまた、メイタンシノール及びメイタンシノールのＣ−３エステル類などのメイタンシノイド類を産生することが、発見された（米国特許第4,151,042）。メイタンシノール及びメイタンシノール類似体の合成Ｃ−３エステル類もまた、報告されている（Kupchanら、21 J.Med.Chem. 31-37（1978年）；Higashideら、270 Nature 721-722（1977年）；Kawaiら、32 Chem.Pharm.Bull. 3441-3451（1984年））。Ｃ−３エステル類が調製されているメイタンシノール類似体の例には、芳香環（例えば、デクロロ）、あるいはＣ−９、Ｃ−１４（たとえば、水酸化メチル基）、Ｃ−１５、Ｃ−１８、Ｃ−２０及びＣ−４，５に修飾を伴うメイタンシノールが、含まれる。

[04] 自然発生及び合成Ｃ−３エステル類を、二つの群に分類することが可能である：
（ａ）単純なカルボン酸を有するＣ−３エステル（米国特許第4,248,870；第4,265,814；第4,308,268；第4,308,269；第4,309,428；第4,317,821；第4,322,348；及び、第4,331,598）、ならびに、
（ｂ）Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンの誘導体を有するＣ−３エステル（米国特許第4,137,230；第4,260,608；第5,208,020；第5,416,064；及び、12 Chem.Pharm.Bull. 3441（1984年））。

[05] （ｂ）群のエステル類は、（ａ）群のエステル類よりもかなり細胞毒性であることが見いだされた。メイタンシノイド類は高度に細胞毒性であるため、これらは、癌などの多くの疾患の治療において利用されることが期待された。この期待は、まだ実現されていない。メイタンシンを用いた臨床試験は、多数の副作用により、好ましくなかった（Isselら、5 Can.Trtmnt.Rev. 199-207（1978年））。中枢神経系への有害作用及び胃腸症状のために、さらなる治療を拒否する患者がおり（Issel、204）、かつ、メイタンシンは、蓄積性である恐れのある末梢神経障害と関係するようにみえた（Issel、207）。

[06] しかしながら、高度に細胞毒性であるメイタンシノイド類の型を、多くの疾患の治療において効果的に用いることがなお可能であることが、記載されている（米国特許第5,208,020及び第5,416,064；Chariら、52 Cancer Res. 127-131（1992年）；Liuら、93 Proc.Natl.Acad.Sci. 8618-8623（1996年））。

[07] 米国特許第5,208,020、第5,416,064及び第6,333,410は、エステル基を有するメイタンシノイドをメイタンシノールへまず変換し、次いで、生じたメイタンシノールをジスルフィドを含有するアシルＮ−メチル−Ｌ−アラニンを用いてエステル化して、ジスルフィドを含有するメイタンシノイド類を得ることによって、チオールを含有するメイタンシノイドを産生することが可能であることを、開示している。ジチオスレイトールを用いたジスルフィド基の還元により、チオールを含有するメイタンシノイド類が得られた。しかしながら、この方法は、面倒でかつほんの中程度の収率をもたらすいくつかの非効率的な工程を、伴う。

[08] より具体的には、メイタンシノールは、水素化アルミニウムリチウムなどの還元開裂によって、メイタンシンまたは他のメイタンシノールのエステルから、まず生じる。（Kupchan, S.M.ら、21 J Med.Chem. 31-37（1978年）；米国特許第4,360,462）。また、メイタンシノールを、微生物であるノカルジア（Nocardia）から単離することも可能である（Higashideら、米国特許第4,151,042を参照されたい）。特定の一実施例において、テトラヒドロフラン中で、−５℃での水素化アルミニウムリチウムを用いた還元開裂による、アンサマイトシンＰ−３のメイタンシノールへの変換が、記載されている（米国特許第4,162,940）。

[09] この方法における次の工程は、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン誘導体、ならびにジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などの適切な剤及び触媒量の塩化亜鉛を用いた、メイタンシノールの異なるエステル誘導体への変換である（米国特許第4,137,230、第4,260,609、第5,208,020、第5,416,064及び第6,333,410；Kawaiら、32 Chem.Pharm.Bull. 3441-3951（1984年）を参照されたい）。すべての場合において、Ｄ及びＬ−アミノアシル側鎖を含有する二つのジアステレオマー生成物が、少量の未反応のメイタンシノールと同様に、生じる。先に記載した方法において（Kupchan, S.M., 21 J Med.Chem. 31-37（1978年）；米国特許第4,360,462；米国特許第6,333,410）、所望のＬ−アミノアシルエステルは、二つのシリカゲルカラムまたはシリカゲルカラムとＨＰＬＣカラムの組み合わせによって精製した後に、得られる。加えて、完全なラセミ化のため、所望のＬ−アミノアシル異性体の単離収率は、ほんの３０％程である。したがって、ここまでに記載した方法は面倒で、非経済的で、そして工業規模での使用にあまり適さない。

[10] したがって、所望のジアステレオマーの合成を主にもたらす、チオールを含有するメイタンシノイド類の調製及び精製のための改善された方法が、大いに必要とされる。

本発明の概要
[11] 本発明は、メイタンシノイドエステルを製造する方法であって、メイタンシノールまたは遊離Ｃ−３ヒドロキシル部分を有する他のメイタンシノイド類のアニオンを形成し、そしてアニオンを活性化カルボキシル化合物と反応させて、それによりメイタンシノイドエステルを生産することを含んでなる上記方法を、包含する。

[12] メイタンシノールのアニオンは、メイタンシノールと塩基との反応によって生成することが可能である。
[13] メイタンシノイドエステルを生成するために用いられる活性化カルボキシル化合物は、化学式ＲＣＯＸ［式中、Ｘは、無水物または混合無水物をもたらす−ＯＣＯＲ’であるか、あるいは、Ｘは、ハライド、アルコキシ基、アリールオキシ基またはイミダゾールであり、そして、Ｒ及びＲ’は、同じかまたは異なり、かつ、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖、分岐もしくは環状アルキルまたはアルケニル、あるいはＮ−メチル−Ｌ−アラニル部分などの置換アミノ酸部分から選択される］により、一般に定義される。

[14] このような活性化カルボキシル化合物は、これに限定されないが、酸無水物、混合無水物、環状無水物、酸ハロゲン化物、イミダゾリド、エステルまたはその混合物を、一般に包含する。

発明の詳細な説明
[15] 本発明は、メイタンシノイドエステル類、特に、実質的に一つのジアステレオマーであるチオール及びジスルフィドを含有するメイタンシノイドエステル類の調製及び精製のための改善された方法を、提供する。

[16] 「実質的に」の語は、本明細書では、所望のメイタンシノイドジアステレオマーが、およそ７５％程度またはそれより多く、好ましくは７５〜８０％、より好ましくは８０〜８５％、そしてよりいっそう好ましくは８５％〜１００％、ジアステレオマー的に純粋であることを指す。

[17] 一側面において、本発明の方法は、メイタンシノールまたは遊離Ｃ−３ヒドロキシル部分を有する他のメイタンシノイド類のアニオンを形成し、そしてアニオンを活性化カルボキシル化合物と反応させて、それによりメイタンシノイドエステルを生産することを、含んでなる。

[18] 該手法の出発材料は、メイタンシノール、または遊離Ｃ−３ヒドロキシル部分を有する任意の自然発生もしくは合成メイタンシノイドである。
[19] 適切なメイタンシノイド類の具体的な例には、これに限定されないが：
（１）Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第4,256,746）（アンサマイトシンＰ２のＬＡＨ還元により調製される）；及び、
（２）Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第4,294,757）（塩化アシルを用いたアシル化により調製される）；
が含まれる。

[20] 適切なメイタンシノイド類の具体的な例には、
（１）Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ₂ＯＲ）（米国特許第4,331,598）；
（２）Ｃ−１４−ヒドロキシメチルもしくはアシルオキシメチル（ＣＨ₂ＯＨまたはＣＨ₂ＯＡｃ）（米国特許第4,450,254）（Nocardiaから調製される）；
（３）Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第4,364,866）（Streptomycesによるメイタンシノールの変換によって調製される）；
（４）Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第4,313,946及び第4,315,929）（Trewia nudifloraから単離される）；
（５）Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第4,362,663及び第4,322,348）（Streptomycesによるメイタンシノールの脱メチル化によって調製される）；及び、
（６）Ｃ−９−アルコキシ（Akimotoら、Chem.Pharm.Bull.（1984年）、第32巻、2565頁）；
などの、他の位に修飾を有するメイタンシノール類似体もまた含まれる。

[21] アニオンを、任意の適切な反応によって形成することが可能である。例えば、メイタンシノールまたは遊離Ｃ−３ヒドロキシル部分を有する他のメイタンシノイド類を、ヘキサメチルジシラジド亜鉛、ヘキサメチルジシラジドナトリウム、ヘキサメチルジシラジドリチウム及びヘキサメチルジシラジドカリウムから非限定的に選択される、ヘキサメチルジシラジド金属；メチルリチウム、ｎ−ブチルリチウム、ｔｅｒｔ−ブチルリチウム、フェニルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）、ペンチルナトリウム及び２−フェニルイソプロピル−カリウムから非限定的に選択される、アルキル金属またはアリール金属；水素化ナトリウム及び水素化カリウムから非限定的に選択される、水素化金属；ソーダアミド；ならびにカリウムアミドなどの、非水溶性塩基と、反応させることが可能である。

[22] 好ましくは、非水溶性塩基は、ヘキサメチルジシラジド亜鉛である。
[23] 当業者は、アニオンとの反応によってエステルを形成させるのに有用な適切な活性化カルボキシル化合物を、容易に認識するであろう。適切な活性化カルボキシル化合物の例には、無水酢酸及びイソ酪酸無水物から非限定的に選択されるカルボン酸無水物などの酸無水物、ならびに、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオ−１−オキソプロピル）−Ｌ−アラニン及びＮ−メチル−Ｎ−（４−メチルジチオ−４−メチル−１−オキソペンチル）−Ｌ−アラニンの無水物などのＮ−メチル−Ｌ−アラニン誘導体などの、アミノ酸誘導体の無水物；リン酸塩もしくは硫酸塩と、酢酸、プロピオン酸、酪酸などのアルカン酸のカルボン酸部分、または非限定的にＮ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオ−１−オキソプロピル）−Ｌ−アラニン及びＮ−メチル−Ｎ−（４−メチルジチオ−４−メチル−１−オキソペンチル）−Ｌ−アラニンなどのＮ−メチル−アラニン誘導体のカルボン酸部分などのアミノ酸誘導体との混合無水物から非限定的に選択される、混合無水物；Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物及びＮ−メチル−Ｄ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物から非限定的に選択される、環状無水物；酸フッ化物、酸塩化物、酸臭化物及び酸ヨウ化物から非限定的に選択される、酸ハロゲン化物；塩化アセチル、フッ化アセチル、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオ−１−オキソプロピル）−Ｌ−アラニンもしくはＮ−メチル−Ｎ−（４−メチルジチオ−４−メチル−１−オキソペンチル）−Ｌ−アラニンの酸フッ化物などのアミノ酸誘導体の酸フッ化物から非限定的に選択される、アシルイミダゾリド類；アシル置換イミダゾリド類、例えば、酢酸またはプロピオン酸などのアルカン酸のイミダゾリド、あるいは、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオ−１−オキソプロピル）−Ｌ−アラニン及びＮ−メチル−Ｎ−（４−メチルジチオ−４−メチル−１−オキソペンチル）−Ｌ−アラニンなどのＮ−メチル−アラニン誘導体などの、アミノ酸誘導体のイミダゾリド；ならびに、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステル類、パラ−ニトロフェニルエステル類、オルト−ニトロフェニルエステル類、ジニトロフェニルエステル類及びペンタフルオロフェニルエステル類から非限定的に選択される、カルボキシルエステル類が、含まれる。

[24] 本発明の別の側面では、活性化カルボキシル化合物は、化学式ＲＣＯＸ［式中、Ｘは、無水物または混合無水物をもたらす−ＯＣＯＲ’であるか、あるいは、Ｘは、ハライド、アルコキシ基、アリールオキシ基、イミダゾールまたは−ＯＹ（式中、Ｙは、スクシンイミド、フタルイミド、アリールまたは置換アリールである）であり、そして、Ｒ及びＲ’は、同じかまたは異なり、かつ、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖、分岐もしくは環状アルキルまたはアルケニル、あるいはＮ−メチル−Ｌ−アラニル部分などの置換アミノ酸部分から選択される］により表される。

[25] 好ましくは、Ｘは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、ピリジル、イミダゾリル、置換イミダゾリル、または−ＯＹ（式中、Ｙは、スクシンイミド、フタルイミド、アリール、または、パラニトロフェニル、オルト−ニトロフェニル、ジニトロフェニル及びペンタフルオロフェニルなどの置換アリールである）である。

[26] 本発明のさらなる側面では、活性化カルボキシル化合物は、カルボキシルが活性化されたアミノ酸を含有する化学式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）または（Ｉｄ）の化合物によって表される：

［式中、Ｘは、ハライド、アルコキシ基、アリールオキシ基、イミダゾールまたは−ＯＹ（式中、Ｙは、スクシンイミド、フタルイミド、アリールまたは置換アリールでを表す）を表すか、あるいは、Ｘは、それが無水物もしくは混合無水物を形成するように選択され；Ｑは、Ｈまたは分岐もしくは直鎖アルキル基を表し；そして、Ｖは、Ｈまたは分岐もしくは直鎖アルキル基を表し；そして、Ｙ₂は、

（式中、Ｒ₁及びＲ₂は、それぞれ独立して、Ｈ、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖、分岐もしくは環状アルキルまたはアルケニル、例えばＣＨ ₃ およびＣ ₂ Ｈ ₅ 、フェニルまたは置換フェニルであり、かつ、加えて、Ｒ₂はＨであることが可能であり；
Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇及びＲ₈は、それぞれ独立して、Ｈ、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖、分岐もしくは環状アルキルまたはアルケニル、例えばＣＨ ₃ およびＣ ₂ Ｈ ₅ 、フェニルまたは置換フェニルであり；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０、または１〜５の整数であり；
Ｚ₂は、Ｒ₉、ＳＲ₉またはＣＯＲ₉（式中、Ｒ₉は、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル、分岐アルキルまたは環状アルキル、あるいは、単純なアリールもしくは置換アリール、または複素環である）であり；そして、
ｐは、０または１のいずれかである）
を表す］。

[27] 加えて、Ｘは、−ＯＣＯＲ₉（式中、Ｒ₉は、上記に定義されるとおりである）であることが可能であり、あるいは、Ｘは、化学式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の対称無水物をもたらす。

[28] Ｑ及びＶによって表される適切なアルキル基は、これに限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロペンチル等のＣ₁−Ｃ₁₀アルキル基である。

[29] 好ましくは、Ｘは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、ピリジル、イミダゾリル、アルキル基が直鎖、分岐もしくは環状のいずれかであるアルキルイミダゾリル（メチルイミダゾリル、エチルイミダゾリル、シクロペンチルイミダゾリルなど）に限定されるような置換イミダゾリル、あるいは−、ＯＹ（式中、Ｙは、スクシンイミド、フタルイミド、アリールまたは置換アリールを表す）を表す。

[30] アリールは、６〜１５個の炭素原子を含有するアリールを意味し、かつ、これに限定されないが、フェニル、ビフェニル、１−ナフチル及び２−ナフチルが含まれる。
[31] 置換フェニル及び置換アリールの例には、パラ−ニトロフェニル、オルト−ニトロフェニル、ジニトロフェニル及びペンタフルオロフェニルが含まれる。

[32] 複素環の例には、ピリジル及び置換ピリジル、フリル、オキサゾリル、チエニル、チアゾリル、インドリル、モルホリノ、ピペリジノ及びピペラジノが含まれる。
[33] 好ましくは、活性化カルボキシル化合物は、酸フッ化物または酸無水物である。

[34] 反応条件は、当業者により容易に決定される。
[35] 当業者は、反応に必要とされる時間を、これに限定されないが、高圧クロマトグラフィまたは薄層クロマトグラフィなどの技術を用いて、容易にモニターすることが可能である。典型的な反応は、一晩撹拌した後に完了するが、しかし、置換物の温度及び濃度などの種々の要因に応じて、遅く行っても、または速く行ってもよい。反応は、−２０℃〜８０℃、好ましくは−１０℃〜６０℃、より好ましくは−１０℃〜４０℃、そして、最も好ましくは０℃〜３５℃で行うことが可能である。

[36] 適切な溶媒は、当業者によって容易に決定され、そしてこれに限定されないが、テトラヒドロフランもしくは置換テトラヒドロフラン、ヘキサン類、ジエチルエーテルなどのエーテル類、ジメトキシエタン、ジオキサン、またはその混合物が含まれる。

[37] 反応停止条件には、これに限定されないが、水、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールもしくはイソプロパノールなどのアルコール；塩酸、ギ酸、酢酸及びリン酸などの酸；あるいは、炭酸ナトリウムもしくは炭酸カリウム、重炭酸ナトリウムもしくは重炭酸カリウム、水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウムなどの塩基；を用いた反応停止が、含まれる。

[38] 精製条件は、当業者によって容易に決定され、そしてこれに限定されないが、シリカゲルもしくはアルミナ上でのカラムクロマトグラフィ、調製用薄層クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、向流分配及び再結晶化が、含まれる。

[39] これより、本発明を、特定の実施例を参照することによって、説明することにする。しかしながら、本発明は、これに限定されるものではない。特に明記しない限り、すべてのパーセント、割合等は、重量による。

実施例
反応スキーム

（実施例１：リチウムヘキサメチルジシラジド（ＬｉＨＭＤＳ）を用いた、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中での、無水酢酸によるメイタンシノールのエステル化）
[40] 無水ＴＨＦ（１ｍｌ）中のメイタンシノール溶液（２５．８ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ中に調製し、撹拌子及びセプタムを備え付け、そしてアルゴン雰囲気下に置いた。反応槽を、ドライアイス及びアセトンを含有する浅型デュワーフラスコ内で、−４０℃に冷却した。ＴＨＦに溶解した１ＭＬｉＨＭＤＳ（９．５ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）溶液を、シリンジを介して反応フラスコに一滴ずつ加え、そして、反応溶液を撹拌させて、温度を−４０℃に維持した。無水酢酸（５．６ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）を、１５分後に加え、そして、反応を進行させ、２時間にわたってゆっくりと温めた。反応を、水溶性塩化アンモニウム（２ｍＬ）の添加によって反応停止させ、そして、粗反応混合物を分液漏斗に移した。粗生成物及び未反応の出発材料を、酢酸エチル中に二回抽出し（２ｘ６ｍＬ）、各抽出からの有機抽出物を合わせ、ブライン（２ｍＬ）で洗浄し、そして無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた。溶媒を、減圧下で蒸発させ、そして、粗残留物を、調製用薄層クロマトグラフィ（Analtech Uniplate（商標登録）、２０ｘ２０ｃｍ、１０００ミクロン）により精製して、塩化メチレンとメタノールの混合物（９５：５、ｖ／ｖ）にて溶出した。ＭＳ：ｍ／ｚ，実測値：６２９．４（Ｍ＋Ｎａ）⁺；計算値：６２９．２。

（実施例２：リチウムヘキサメチルジシラジド（ＬｉＨＭＤＳ）を用いた、無水１，２−ジメトキシエタン中での、イソ酪酸無水物によるメイタンシノールのエステル化）
[41] メイタンシノール溶液（１８．６ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）を１，２−ジメトキシエタン（０．８ｍＬ）中で、丸底フラスコ中に調製し、撹拌子及びセプタムを備え付け、そしてアルゴン雰囲気下に置いた。反応槽を、ドライアイス及びアセトンを含有する浅型デュワーフラスコ内で、−４０℃に冷却した。無水ＴＨＦに溶解した１ＭＬｉＨＭＤＳ（２７．６ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌ）溶液を、シリンジを介して反応フラスコに一滴ずつ加え、そして、反応溶液を撹拌させて、温度を−４０℃に維持した。１５分後に、イソ酪酸無水物（６．５ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）を加え、そして、反応物を、さらに２．５時間撹拌し続けた。分析用薄層クロマトグラフィ（Analtech Uniplate（商標登録）、２．５ｘ１０ｃｍ、２５０ミクロン）を、塩化メチレンとメタノールの混合物（９５：５、ｖ／ｖ）にて溶出させると、所望のＣ３イソブチリルエステルの形成が示された。反応溶液を−４０℃に冷却し、追加のイソ酪酸無水物（１３．１ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、そして、反応をさらに２時間進行させ、ゆっくりと温めた。分析用ＴＬＣを、塩化メチレンとメタノールの混合物（９５：５、ｖ／ｖ）にて溶出させると、より多くの所望の生成物の存在が示された。

（実施例３：ナトリウムヘキサメチルジシラジド（ＮａＨＭＤＳ）を用いた、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中での、イソ酪酸無水物によるメイタンシノールのエステル化）
[42] 無水ＴＨＦ（０．５ｍＬ）中のメイタンシノール溶液（１４ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）を、ガラスバイアル中に調製し、撹拌子及びセプタムを備え付け、そしてアルゴン雰囲気下に置いた。反応槽を、ドライアイス及びアセトンを含有する浅型デュワーフラスコ内で、−４０℃に冷却した。ＴＨＦに溶解した１ＭＮａＨＭＤＳ（７．１ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）溶液を、シリンジを介して反応フラスコに一滴ずつ加え、そして、反応溶液を撹拌させて、温度を−４０℃に維持した。イソ酪酸無水物（６．２ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）を、１５分後に加え、そして、反応を進行させ、２時間にわたってゆっくりと温めた。分析用薄層クロマトグラフィ（Analtech Uniplate（商標登録）、２．５ｘ１０ｃｍ、２５０ミクロン）を、塩化メチレンとメタノールの混合物（９５：５、ｖ／ｖ）にて溶出させると、所望のＣ３イソブチリルエステルの形成が示された。

（実施例４：カリウムヘキサメチルジシラジド（ＫＨＭＤＳ）及びクラウンエーテルである１８−クラウン−６を用いた、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中での、イソ酪酸無水物によるメイタンシノールのエステル化）
[43] 無水ＴＨＦ（０．５ｍＬ）中のメイタンシノール溶液（１１．５ｍｇ、２０．３μｍｏｌ）を、ガラスバイアル中に調製し、撹拌子を備え付け、そしてアルゴン雰囲気下に置いた。反応槽を、ドライアイス及びアセトンを含有する浅型デュワーフラスコ内で、−４０℃に冷却した。無水ＴＨＦ（０．５ｍＬ）中のＫＨＭＤＳ（６．１ｍｇ、３０．４μｍｏｌ）及び１８−クラウン−６（８．０ｍｇ、３０．４μｍｏｌ）溶液を、調製し、そして反応フラスコに加え、反応温度を−４０℃に維持した。１５分後に、イソ酪酸無水物（４．８ｍｇ、３０．４μｍｏｌ）を反応フラスコに加え；反応を、ゆっくりと温めながら３時間にわたり進行させた。分析用薄層クロマトグラフィ（Analtech Uniplate（商標登録）、２．５ｘ１０ｃｍ、２５０ミクロン）を、塩化メチレンとメタノールの混合物（９５：５、ｖ／ｖ）にて溶出させると、所望のメイタンシノールのＣ３イソブチリルエステルの形成が示された。

（実施例５：ビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛を用いた、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中での、イソ酪酸無水物によるメイタンシノールのエステル化）
[44] 無水ＴＨＦ（０．５ｍＬ）中のメイタンシノール溶液（１８．７ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）を、ガラスバイアル中に調製し、撹拌子を備え付け、そしてアルゴン雰囲気下に維持した。反応溶液を、ビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛（３２．１ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）を加えながら、攪拌した。イソ酪酸無水物（７．８ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）を、１５分後に反応槽に加え、そして、反応を、室温にて２時間、進行させた。反応の進行は、分析用ＨＰＬＣ分析によって、Agilent Zorbax（商標登録）Ｃ−８カラム（４．６ｘ１５０ｍｍ）を用いて、流速１．００ｍＬ／分にて以下のような水とアセトニトリルの勾配で溶出して、測定した：

これらの条件下では、所望の生成物は、保持時間１１．１１分に溶出した。
（実施例６：リチウムヘキサメチルジシラジド（ＬｉＨＭＤＳ）を用いた、無水１，２−ジメトキシエタン中での、イソ酪酸無水物によるメイタンシノール−Ｃ９−ＯＭｅのエステル化）
[45] 無水１，２−ジメトキシエタン（０．２ｍＬ）中のメイタンシノール−Ｃ９−ＯＭｅ溶液（４．５ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）を、撹拌子を備え付けたガラスバイアル中に調製し、そしてアルゴン雰囲気下に維持した。反応溶液を、ドライアイス及びアセトンを含有する浅型デュワーフラスコ内で、−４０℃に冷却した。無水ＴＨＦ中の１ＭＬｉＨＭＤＳ（６．４ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）溶液を、反応槽に加え、そして溶液を撹拌して、温度を−４０℃に維持した。イソ酪酸無水物（３．０ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）を、１５分後に反応槽に加え、そして、反応を、ゆっくりと温めながら一晩進行させた。反応の進行は、分析用ＨＰＬＣ分析によって、Agilent Zorbax（商標登録）Ｃ−８カラム（４．６ｘ１５０ｍｍ）を用いて、流速１．００ｍＬ／分にて以下のような水とアセトニトリルの勾配で溶出して、測定した：

これらの条件下では、所望の生成物は、保持時間１８．３３分に溶出した。
（実施例７：ビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛を用いた、無水１，２−ジメトキシエタン中での、イソ酪酸無水物によるメイタンシノール−Ｃ９−ＯＭｅのエステル化）
[46] 無水１，２−ジメトキシエタン（０．２ｍＬ）中のメイタンシノール−Ｃ９−ＯＭｅ溶液（４．４ｍｇ、７．６μｍｏｌ）を、撹拌子を備え付けたガラスバイアル中に調製し、そしてアルゴン雰囲気下に維持した。ビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛（７．３ｍｇ，１８．９μｍｏｌ）を、反応槽に加え、そして、溶液を室温にて撹拌した。イソ酪酸無水物（３．０ｍｇ、１８．９μｍｏｌ）を、１５分後に反応物に加え、そして、反応を、室温にて４時間にわたり進行させた。反応の進行は、分析用ＨＰＬＣ分析によって、Agilent Zorbax（商標登録）Ｃ−８カラム（４．６ｘ１５０ｍｍ）を用いて、流速１．００ｍＬ／分にて以下のような水とアセトニトリルの勾配で溶出して、測定した：

これらの条件下では、所望の生成物は、保持時間２１．２分に溶出した。
（実施例８：ビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛を用いた、無水塩化メチレン（ＣＨ ₂ Ｃｌ ₂ ）中での、イソ酪酸無水物によるメイタンシノールのエステル化）
[47] 無水ＣＨ₂Ｃｌ₂（０．５ｍＬ）中のメイタンシノール溶液（２１．２ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）を、撹拌子を備え付けたガラスバイアル中に調製し、そしてアルゴン雰囲気下に維持した。反応溶液を、ビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛（３６．３ｍｇ，０．０９４ｍｍｏｌ）を加えながら、攪拌した。イソ酪酸無水物（８．８ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）を、１５分後に反応物に加え、そして、反応を、室温にて４時間にわたり進行させた。反応の進行は、分析用ＨＰＬＣ分析によって、Agilent Zorbax（商標登録）Ｃ−８カラム（４．６ｘ１５０ｍｍ）を用いて、流速１．００ｍＬ／分にて以下のような水とアセトニトリルの勾配で溶出して、測定した：

これらの条件下では、所望の生成物は、保持時間１０．９９分に溶出した。
（実施例９：ビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛を用いた、無水１，２−ジメトキシエタン中での、イソ酪酸無水物によるメイタンシノールのエステル化）
[48] 無水１，２−ジメトキシエタン（０．５ｍＬ）中のメイタンシノール溶液（１５．８ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）を、撹拌子を備え付けたガラスバイアル中に調製し、そしてアルゴン雰囲気下に維持した。反応溶液を、ビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛（２７．０ｍｇ，０．０７０ｍｍｏｌ）を加えながら、攪拌した。イソ酪酸無水物（６．７ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）を、１５分後に反応物に加え、そして、反応を、２時間にわたり室温にて進行させた。反応の進行は、分析用ＨＰＬＣ分析によって、Agilent Zorbax（商標登録）Ｃ−８カラム（４．６ｘ１５０ｍｍ）を用いて、流速１．００ｍＬ／分にて以下のような水とアセトニトリルの勾配で溶出して、測定した：

これらの条件下では、所望の生成物は、保持時間１０．６５分に溶出した。
（実施例１０：ビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛及びクラウンエーテルである１８−クラウン−６を用いた、無水塩化メチレン（ＣＨ ₂ Ｃｌ ₂ ）中での、イソ酪酸無水物によるメイタンシノールのエステル化）
[49] 無水ＣＨ₂Ｃｌ₂（０．３ｍＬ）中のメイタンシノール溶液（１４．６ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）を、撹拌子を備え付けたガラスバイアル中に調製し、そしてアルゴン雰囲気下に維持した。反応溶液を、ビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛（２５．１ｍｇ，０．０６５ｍｍｏｌ）を加えながら撹拌し、続いて、ＣＨ₂Ｃｌ₂（０．２ｍＬ）中の１８−クラウン−６溶液（１７．２ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）を加えた。イソ酪酸無水物（６．７ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）を、１５分後に反応物に加え、そして、反応を、２時間にわたり室温にて進行させた。反応の進行は、分析用ＨＰＬＣ分析によって、Agilent Zorbax（商標登録）Ｃ−８カラム（４．６ｘ１５０ｍｍ）を用いて、流速１．００ｍＬ／分にて以下のような水とアセトニトリルの勾配で溶出して、測定した：

これらの条件下では、所望の生成物は、保持時間１１．８８分に溶出した。
（実施例１１：ビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛を用いた、無水塩化メチレン（ＣＨ ₂ Ｃｌ ₂ ）中での、Ｎ−メチル−Ｎ−（４−メチルジチオ−４−メチル−１−オキソプロピル）−Ｌ−アラニンによるメイタンシノールのエステル化）
反応スキーム

[50] ＣＨ₂Ｃｌ₂（０．５ｍＬ）中のＮ−メチル−Ｎ−（４−メチルジチオ−４−メチル−１−オキソプロピル）−Ｌ−アラニン溶液（８７．３ｍｇ、０．３１３ｍｍｏｌ）を、撹拌子を備え付けたガラスバイアル中に調製し、そして、氷浴中で０℃に冷却した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６０．６ｍｇ、０．４６９ｍｍｏｌ）及び［ビス（２−メトキシエチル）アミノ］三フッ化硫黄（８３．１ｍｇ，０．３７５ｍｍｏｌ）を、反応バイアルに、連続的に加えた。反応物を、維持された０℃の温度にて、３０分間撹拌し続けた。ＣＨ₂Ｃｌ₂（０．５ｍＬ）中のメイタンシノール（２９．５ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）及びビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛（２４０．９ｍｇ、０．６２４ｍｍｏｌ）溶液を、フッ化アシル形成後に、反応槽に加えた。反応を０℃にて１５分間進行させた後、氷浴を取り除き、そして、反応を、アルゴン雰囲気下で室温にて一晩続けた。分析用薄層クロマトグラフィ（Analtech Uniplate（商標登録）、２．５ｘ１０ｃｍ、２５０ミクロン）を、塩化メチレンとメタノールの混合物（９５：５、ｖ／ｖ）にて溶出させると、所望のメイタンシノールのＣ３位におけるＮ−メチル−アラニルエステルの形成が示された。反応の変換の程度は、分析用ＨＰＬＣ分析によって、Vydac（商標登録）protein & peptide Ｃ１８カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）を用いて、流速１．５０ｍＬ／分にて以下のような水とアセトニトリルの勾配で溶出して、測定した：

これらの条件下では、所望の生成物は、保持時間２３．０７分に溶出し、Ｄ−異性体は検出されなかった。ＭＳ：ｍ／ｚ実測値８４８．８（Ｍ＋Ｎａ⁺）計算値８４９．４。

（実施例１２：ビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛を用いた、無水塩化メチレン（ＣＨ ₂ Ｃｌ ₂ ）中での、Ｎ−メチル−Ｎ−（４−メチルジチオ−４−メチル−１−オキソプロピル）−Ｌ−アラニンによるメイタンシノールのエステル化）

反応スキーム
[51] Ｎ−メチル−Ｎ−（４−メチルジチオ−４−メチル−１−オキソプロピル）−Ｌ−アラニン（３６．６ｍｇ、０．３１３ｍｍｏｌ）及び１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１３．５１ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）溶液を、撹拌子を備え付けた丸底フラスコ中で、ＣＨ₂Ｃｌ₂（０．５ｍＬ）中に調製し、そして、アルゴン雰囲気下に維持した。溶液を、対称無水物が形成されるため、室温にて３０分間、激しく撹拌した。反応混合物を、グラスウールを介してろ過し、そして、ＣＨ₂Ｃｌ₂（１ｍＬ）中に調製したメイタンシノール（１２．３ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）及びビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛（４２．５ｍｇ、０．１０９ｍｍｏｌ）を含有する反応フラスコに加えた。反応を、室温にて、アルゴン雰囲気下で撹拌しながら進行させた。３時間後に、追加の５当量のビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛（４２．５ｍｇ、０．１０９ｍｍｏｌ）を、反応槽に加え、そして、反応を一晩進行させた。分析用薄層クロマトグラフィ（Analtech Uniplate（商標登録）、２．５ｘ１０ｃｍ、２５０ミクロン）を、塩化メチレンとメタノールの混合物（９５：５、ｖ／ｖ）にて溶出させると、所望のメイタンシノールのＣ３位におけるＮ−メチル−Ｌ−アラニルエステルの形成が示された。反応の変換の程度は、分析用ＨＰＬＣ分析によって、Vydac（商標登録）protein & peptideＣ１８カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）を用いて、流速１．５０ｍＬ／分にて以下のような水とアセトニトリルの勾配で溶出して、測定した：

これらの条件下では、チオールを含有する生成物は、２０．７５分に溶出し、Ｄ−異性体は検出されなかった。ＭＳ：ｍ／ｚ実測値７８０．８（Ｍ＋Ｎａ⁺）計算値７８１．４。

（実施例１３：Ｉｃの合成）

６０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中に懸濁した５０．２ｍｇのＮ−メチル−Ｌ−アラニンに、０．１８６ｍｌのＤＩＰＥＡを加えた。固体塊を、超音波処理によって微細な懸濁液へと分散させた後に、８２．６ｍｇの１，１’−カルボニルジイミダゾールを、４時間にわたり５回に分けて加えた。反応物を、一晩撹拌し、次いで、ジクロロメタンを用いて短いシリカカラムを介してろ過した。ろ液を蒸発させ、そしてエーテル／ヘキサンを用いて結晶化し、２８ｍｇ（収率４５％）の生成物を得た。

化合物Ｉｄは、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニンから、同様に調製することが可能である。化合物Ｉｃはまた、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン上でのホスゲンの反応によっても調製することが可能である。

反応図
（実施例１４：ビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛を用いた、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中での、Ｉｃによるメイタンシノールのエステル化に続く、４−メチルジチオ−４−メチル−ペンタン酸（ＭＭＰ）によるアミド形成）
メイタンシノール（２０ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）及びＩｃ（２７ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を、０．３０ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解した。ビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛（８１ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を一滴ずつ加えながら、溶液を、アルゴン雰囲気下で激しく撹拌した。反応物を、３時間撹拌し、次いで、以下に記載するＨＰＬＣ方法２を用いて分析し、二重に検出を行った（２５４ｎｍ吸光度及び質量分析）。分析は、所望のＩＩａへの変換５０％（保持時間１０分）、望ましくないＩＩｂへの変換５％（保持時間１２．８分）、及び未反応のメイタンシノール２５％（保持時間１２．８分）を、示した。ＩＩａ及びＩＩｂ生成物は不安定であるため、単離されず、反応混合物を、０．２０ｍＬの１：１の飽和ＮａＨＣＯ_３：飽和ＮａＣｌ、及び１ｍＬの酢酸エチルを用いて抽出した。有機層に、４−メチルジチオ−４−メチル−ペンタン酸（６８ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）及び１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ−ＨＣｌ６６ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、２時間撹拌した。ＨＰＬＣ方法２を用いた分析は、ＩＩａとＩＩｂのすべてが反応して、ＩＩＩａ：ＩＩＩｂの９５：５混合物が得られたことを、示した。溶液を、０．３ｍＬの０．２５％水溶性ＨＣｌで洗浄し、続いて、０．２ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄した。溶媒を、真空下で蒸発させることによって除去し、そして、残留物を、移動相としてＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ９４：６を用いたシリカクロマトグラフィにより精製し、続いて、２５０ｘ１０ｍｍの５ミクロン粒子サイズのKromasil（商標登録）ＣＮ結合シリカカラムを用いて、ヘキサン：酢酸エチル：２−プロパノール６８：８：２４の定組成の移動相により精製し、ここで、ＩＩＩａの保持時間は１０分、ＩＩＩｂの保持時間は１９分であった。溶媒を、真空下で蒸発させると、１１．６ｍｇの所望のＩＩＩa（０．０１４ｍｍｏｌ、メイタンシノールからの全収率４０％）が得られた。MS: m/z found 848.9 (M+Na) calculated (849.4)。
ＨＰＬＣ方法２
カラム：C8 Kromasil（商標登録）１５０ｘ２．０ｍｍ５ミクロン粒子サイズ。
流速（fow rate）：０．２２ｍＬ／分。
温度：外界。
試料の調製：１０μＬの反応混合物を、５００μＬの１０：１アセトニトリル：酢酸に加えた。
注入容量：４μＬ。
移動相：Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸を含有する脱イオン水；Ｂ＝アセトニトリル
勾配：

[52] 本明細書に引用されるすべての出版物及び他の参考文献は、その全体が参照によって明示的に本明細書に援用される。

Claims

メイタンシノイドエステルを製造する方法であって、メイタンシノールまたは遊離Ｃ−３ヒドロキシル部分を有するメイタンシノイドのアニオンを形成し、そして、当該アニオンを活性化カルボキシル化合物と反応させることにより、メイタンシノイドエステルを生成することを含み、該活性化カルボキシル化合物が、化学式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）または（Ｉｄ）によって表され：

［式中、Ｘは、ハライド、アルコキシ基、アリールオキシ基、イミダゾール、−ＯＹ（式中、Ｙは、スクシンイミド、フタルイミド、アリールもしくは置換アリールである）、無水物または混合無水物を表し；Ｑは、分岐もしくは直鎖アルキル基を表し；Ｖは、Ｈまたは分岐もしくは直鎖アルキル基を表し；そして、Ｙ_２は、

（式中、Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖、分岐もしくは環状アルキルまたはアルケニル、フェニルまたは置換フェニルであり、かつ、加えて、Ｒ_２はＨであることが可能であり；
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７及びＲ_８は、それぞれ独立して、Ｈ、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖、分岐もしくは環状アルキルまたはアルケニル、フェニルまたは置換フェニルであり；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０、または１〜５の整数であり；
Ｚ_２は、Ｒ_９、ＳＲ_９またはＣＯＲ_９（式中、Ｒ_９は、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル、分岐アルキルまたは環状アルキル、あるいは、単純なアリールもしくは置換アリール、または複素環である）であり；そして
ｐは、０または１のいずれかである）
を表す］
からなる、上記メイタンシノイドエステルを製造する方法。
メイタンシノールまたは遊離Ｃ−３ヒドロキシル部分を有するメイタンシノイドを非水溶性塩基と反応させることによって、アニオンを形成する、請求項１に記載の方法。
非水溶性塩基が、ヘキサメチルジシラジド金属、アルキル金属、アリール金属、水素化金属、ソーダアミドまたはカリウムアミドである、請求項２に記載の方法。
ヘキサメチルジシラジド金属が、ヘキサメチルジシラジド亜鉛、ヘキサメチルジシラジドナトリウム、ヘキサメチルジシラジドリチウムまたはヘキサメチルジシラジドカリウムである、請求項３に記載の方法。
アルキル金属またはアリール金属が、メチルリチウム、ｎ−ブチルリチウム、ｔｅｒｔ−ブチルリチウム、フェニルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）、ペンチルナトリウムまたは２−フェニルイソプロピル−カリウムである、請求項３に記載の方法。
水素化金属が、水素化ナトリウムまたは水素化カリウムである、請求項３に記載の方法。
化学式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）または（Ｉｄ）中のＱがメチル基である、請求項１に記載の方法。
化学式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）または（Ｉｄ）中のＸが、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、ピリジル、イミダゾリル、置換イミダゾリルまたは−ＯＹ（式中、Ｙは、スクシンイミド、フタルイミド、アリールまたは置換アリールである）である、請求項１に記載の方法。
化学式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）または（Ｉｄ）中のＸが、−ＯＣＯＲ_９（式中、Ｒ_９は、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル、分岐アルキルまたは環状アルキル、あるいは、単純なアリールもしくは置換アリール、または複素環である）である、請求項１に記載の方法。
Ｘが、化学式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の対称無水物をもたらす置換基である、請求項１に記載の方法。
アニオンを、メイタンシノールまたは遊離Ｃ−３ヒドロキシル部分を有するメイタンシノイドをヘキサメチルジシラジド亜鉛と反応させることによって形成する、請求項１または７に記載の方法。
活性化カルボキシル基が、化学式（Ｉｃ）または（Ｉｄ）によって表される、請求項１に記載の方法。
メイタンシノイドエステルが、実質的に単一のジアステレオマーである、請求項１に記載の方法。
ジアステレオマーが、Ｌ−アミノアシルエステルである、請求項１３に記載の方法。