JP5397990B2 - 免疫賦活ペプチド及びそれを含む飼料 - Google Patents
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Description
特に、家畜の免疫力の向上や抗菌性や抗ウイルス性を高められるペプチドを与える試み、及びこれらのペプチドを含有させた飼料を家畜に与えて、家畜の免疫系を高める、いわゆる免疫賦活作用を有する飼料添加物及び飼料は開発されていなかった。ウイルスに対抗するためには、免疫系を高める方法が重要な対処法の一つであるが、家畜自体に感染する又は家畜を媒介としてヒトに感染するPRRS (Porcine Reproductive
and Respiratory Syndrome, 豚繁殖・呼吸障害症候群)ウイルス、PCV2 (Porcine CircoVirus Type2、豚サーコウイルス2型)、インフルエンザウイルスなどの種々のウイルスに家畜が感染した場合に対処する具体的方法は見出されていなかった。
本発明は係る知見に基づくものであり、家畜血液を亜臨界水処理又は蛋白分解酵素処理により低分子化したペプチドからなる免疫賦活ペプチドであり、更にそのペプチドを含有した飼料を提供するものである。
なお、亜臨界水処理は既に公知の技術であり、例えば特許文献1に詳述されている。具体的には、水の臨界点(374℃、22MPa)以上の温度・圧力の水を超臨界水、当該臨界点よりやや低い温度・圧力の高圧熱水を亜臨界水と称されており、亜臨界水処理とは当該亜臨界水で被処理物を処理することを意味する。
また、蛋白質の低分子化方法としては、蛋白分解酵素を用いた酵素分解法が広く利用されている(例えば、特許文献2〜4など参照)。
しかし、これらの文献には、家畜血液の亜臨界水処理ペプチド及び蛋白分解酵素処理ペプチドが免疫賦活作用を有することは記載されていない。
また、本発明の飼料は、上記の免疫賦活ペプチドを含有する飼料である。
上記の家畜としては、豚、兎、羊、牛、家禽(例えば、鶏、七面鳥、うずらなど)などが挙げられ、好適には豚又は鶏の血液が使用される。
連続式亜臨界水処理の一例を示すと、連続式亜臨界水処理装置は主に高圧ポンプ、プレヒーター及び反応容器から構成され、反応器は横型であっても縦型であっても良い。被処理原料(家畜血液)は、被処理原料濃度が8〜35%(重量%、以下同様)になるように、必要に応じて加水又は濃縮されたものが使用される。均質化された被処理原料液は高圧ポンプで送液され、プレヒーターで反応温度まで昇温され、反応器内で設定温度・圧力下で所定の時間滞留させ、滞留時間を反応時間とした。反応後の反応液は冷却水タンクに通すことで100℃以下に冷却し、冷却された液は背圧弁を通過させて常圧に戻した後、反応液を回収する。
酸性又はアルカリ性物質の添加量は所望する分解の程度、処理条件などにより適宜調整することができるが、一般に被処理原料液に0.1〜5%(w/v%、以下同様)、好ましくは0.5〜3%、より好ましくは0.8〜1.5%程度添加される。
蛋白分解酵素としては、家畜血液中の蛋白質を酵素分解できる酵素であれば特に限定されず、動植物由来、微生物由来の蛋白分解酵素、より具体的には例えばブロメライン、パパイン、トリプシン、ペプシンなどを挙げることができるが、好ましくは微生物由来のアルカリ性プロテアーゼ(例えば、アルカラーゼ、ノボザイムFM、プロテアーゼPなど、いずれも商品名)が使用される。なお、酵素は2種以上を併用してもよい。
家畜血液の蛋白分解酵素による酵素分解は常法に準じて行うことができる。例えば、家畜血液を、必要に応じて使用する蛋白分解酵素の至適pHに調整した緩衝液又は精製水に溶解し、次いで所定量の蛋白分解酵素を添加し、各蛋白分解酵素の至適温度で適当な時間(例えば、30分〜5時間程度、好ましくは1〜2時間程度)インキュベートし加水分解する。分解後、加熱(例えば、100℃で5分間程度)して酵素を失活させることにより、家畜血液の酵素分解液を得ることができる。
なお、以下、フィブリンを除去した血液の亜臨界水処理物をフィブリン除去亜臨界水処理物と称し、フィブリン除去した血液の蛋白分解酵素処理物をフィブリン除去蛋白分解酵素処理物と称する。
乾燥手段は特に限定されず、液体などを乾燥して粉末化できるものであれば何れの手段も使用できるが、簡便であることから、ドラムドライヤー、スプレードライヤーが好適に使用され、係る加熱乾燥手段による乾燥は常法に準じて行うことができる。加熱温度としては、上記の処理液を乾燥できる温度であれば特に限定されないが、110〜160℃程度、好ましくは120〜150℃程度で行われる。
本発明のペプチド及び飼料は家畜の免疫賦活を目的として家畜(例えば、豚、鶏、兎、羊、牛など)に給餌され、現時点での農水省の通達を考慮すると豚又は家禽(特に鶏)の飼料添加物又は飼料として好適に使用される。
上記の免疫賦活とは、家畜の免疫力を高めて疾病の予防・治療を図る作用である。係る免疫賦活の具体的な例としては、例えば、抗ウイルス活性、抗細菌活性が挙げられる。
抗ウイルス活性は家畜のウイルス感染により引き起こされる疾病の予防・治療活性であり、当該ウイルスとしては例えばPRRSウイルス、PCV2、ニューカッスル病ウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、豚流行性下痢ウイルス、豚ヘルペスウイルス1型、口蹄疫ウイルス、豚コレラウイルス、豚インフルエンザ、高病原性鶏インフルエンザウイルスなどが例示される。
また、抗細菌活性は家畜の細菌感染により引き起こされる疾病の予防・治療活性であり、当該細菌としては例えばサルモネラ菌、マイコプラズマ、連鎖球菌、大腸菌、クロストリジウム、ヘモフィルス・パラスイス、豚丹毒菌などが例示される。
豚血液(固形分15%)を、連続式亜臨界水処理装置を用いて、190℃、3MPa、滞留時間12分間の条件で亜臨界水処理した。亜臨界水処理物を濾過し、残渣を除去して亜臨界水処理液を得た。
得られた亜臨界水処理液10リットルをダブルドラムドライヤー(ドラム径312mm、長さ400mm、表面温度140℃、ドラム間隔0.2mm)のドラム間に1時間かけて供給し、乾燥させた後、スクレーパーでドラムから剥離させて豚血液亜臨界水処理物を得た。
鶏血液も同様な処理により、鶏血液亜臨界水処理物を調製した。
豚血液(固形分15%)をそのまま放置し、フィブリンを生成させた。凝固したフィブリンを荒く砕き、篩にかけフィブリンを80%除去した血液を取得した。このフィブリン除去血液を、実施例1と同様にして亜臨界水処理及び乾燥処理を行い、フィブリン除去豚血液亜臨界水処理物を調製した。
鶏血液についても同様な処理を行い、フィブリン除去鶏血液亜臨界水処理物を調製した。
実施例2において、亜臨界水処理後の反応液をそのまま30分間静置した。生成した沈殿物を濾取し、通風乾燥機で乾燥して、豚血液の亜臨界水処理後沈殿物を得た。
実施例2における鶏血液の亜臨界水処理液についても、同様な方法で処理し、鶏血液の亜臨界水処理後沈澱物を得た。
豚血液に市販の蛋白質分解酵素(アルカラーゼ2.4L(ノボザイム))を家畜血液に対して0.5重量%添加し、55℃で2時間反応させ、加熱処理(90℃、30分)により酵素を失活させた後、ダブルドラムドライヤーで乾燥させることにより、豚血液酵素処理物を調製した。
鶏血液についても同様な処理により、鶏血液酵素処理物を調製した。
マクロファージ活性化試験
豚血液と鶏血液の亜臨界水処理物(実施例1)及び蛋白分解酵素処理物(実施例4)をマクロファージ(RAW264.7細胞)と混合して培養して、サイトカイン(TNF-α、腫瘍壊死因子-α)の産生量が増加すること及び、それにより産生されるNO(一酸化窒素)が増加することを確認した。なお、活性化補助剤としてLPS(リポポリサッカライド)、無添加群には亜臨界水処理物の代わりにPBSを添加した。
より具体的には、LPS(終濃度1μg/ml)で刺激したマウス由来マクロファージ細胞(細胞終濃度4×105cells/ml)に、豚血液若しくは鶏血液の亜臨界水処理物又は豚血液若しくは鶏血液の蛋白分解酵素処理物を終濃度1.25mg/mlで添加し、24時間培養した。培養後の上清中のTNF-α量を市販のELISAキット(Quantikine
Mouse TNF-α)で、NO量を比色法(NO2/NO3 Assay
Kit-CII(DOJINDO))で[NO2 -+NO3 -]量を測定することにより求めた。
なお、培養は、DMEM(FBS10%及びペニシリン1%添加)培地中、37℃にてCO2インキュベータ(5%CO2,95%空気)で行った。
給餌試験
豚の給餌試験は各群300頭、そして鶏の給餌試験は各群300羽で行った。試験の概要は以下のとおりである。
豚試験:日本飼養標準 豚(農林水産省農林水産技術会議事務局編)に基づき、各群とも餌中の粗蛋白質(CP)は22%、可消化粗蛋白質(DCP)は20%、可消化エネルギー(DE)は3.7Mcal/kg、可消化養分総量(TDN)は84%とした。
試験区では試験食中の亜臨界水処理物含量を4%とした。試験期間は2週間とし、水と食餌は自由摂取とした。飼育形態は一般のコマーシャル農場で群飼とした。7日齢より当該飼料で餌付けをはじめ、21日齢で離乳させた。21日齢より二週間、当該飼料を摂取させ、35日齢で採血を行い、各種分析に供した。
各試験項目の概要は以下のとおりである。
採血後の血清を、基質であるMicrococcus属の菌体懸濁液に添加し、600nmの濁度の減少を読み取ることで測定した。
(2) NK活性
採血後の全血液を用い、51Cr遊離法で測定した。具体的には、フローサイトメトリーにてソーティングすることにより、NK細胞を得た。51CrにてラベルしたK562細胞をターゲット細胞(1×104個/well)として両細胞を96穴プレートに植え込み,37℃、4時間インキュベーションした.その後,上清をガラスフィルターにて回収し、ガンマーカウンターで放射活性を測定した.細胞障害率は以下の式で求めた.
細胞障害率(%)=(各実験遊離(cpm)-自然遊離(cpm))/(最大遊離(cpm)-自然遊離(cpm))×100
(3)
IgG総量
採血後、遠心分離して得た血清を市販のELISAキット(IgG Pig ELISA Quantiation Kit(BETHYL)、又はIgG(Fc)
Chicken ELISA Quantiation Kit(BETHYL))にて測定した。
採血後、遠心分離して得た血清を96穴プレートに20μlずつ分注した。各ウェルに兎保存血液(事前に1×108 cells/mlに調製)を80μlずつ分注し、シールして37℃で60分インキュベートした。反応停止液を100μl添加した後、遠心分離(2000rpm、10分)した。上清150μlを別の96穴平底プレートに移した後、マイクロプレートリーダーにて405nmの波長で吸光度を測定した。得られた結果は平均をとった後、下記の計算式で血液障害性率(=補体活性能)を計算した。
血球障害性(%)=補体活性能(%)={([S]−[SB])−([N]−[NB])}/{([P]−[PB])−([N]−[NB])}×100
式中、[S]:サンプル 、[SB]:サンプルブランク、[N]:ネガティブコントロール、[NB]:ネガティブコントロールブランク、[P]:ポジティブコントロール、[PB]ポジティブコントロールブランク
採血した血液を遠心分離して得られた血清を血清自動分析器(OLYMPUS 680)を用いて測定した(参考文献:日本臨床化学会 臨床化学18(4):226-230,1989)。
(6)GPT濃度
採血した血液を遠心分離して得られた血清を血清自動分析器(OLYMPUS 680)を用いて測定した(参考文献:日本臨床化学会 臨床化学18(4):250-254,1989)。
採血した血液を遠心分離して得られた血清を試料とした。血清よりQIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN)を用いて全DNAを抽出し、PRRSウイルスゲノムをターゲットとし、PCRにより検出を行った。
(8)PCV2感染
採血した血液を遠心分離して得られた血清を試料とした。血清よりQIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN)を用いて全DNAを抽出し、PCV2ゲノムをターゲットとし、PCRにより検出を行った。
検査材料としては盲腸便を用いた。方法は鶏病研究会の方法で行った。(鶏病研報28:55−66;1992 および37:14−30;2001)
(10)ニューカッスル病ウイルス(アジア型)感染
採血した血液を遠心分離して得られた血清を試料とした。市販のELISA Kit(NDエリーザキット ゲンコーポレーション)を用いて抗体価を測定することで、感染を判定した。
豚(又は鶏)血液亜臨界水処理物群:実施例1で調製した豚(又は鶏)血液亜臨界水処理物を含む飼料を給餌した群;
フィブリン除去豚(又は鶏)血液亜臨界水処理物:実施例2で調製した、フィブリンを除去した血液の亜臨界水処理物を含む飼料を給餌した群;
亜臨界水処理後沈澱物群:実施例3で調製した、亜臨界水処理後沈澱物を含む飼料を給餌した群。
なお、豚血液由来の亜臨界水処理物を含む飼料は豚に給餌し、鶏血液由来の亜臨界水処理物を含有する飼料は鶏に給餌した。
事故率について、コントロール群では5%であったが、亜臨界水処理物を含む飼料を給餌した群では1〜2%であり、低値であった。
PRRSウイルス感染及びPCV2感染については、コントロール群では陽性であったが、亜臨界水処理物を含む飼料を給餌した群ではいずれも陰性であり、ウイルス感染が抑制されていた。
サルモネラ菌感染及びニューカッスル病感染については、コントロール群では陽性であったが、亜臨界水処理物を含む飼料を給餌した群ではいずれも陰性であり、ウイルス及び細菌感染が抑制されていた。
ウイルス感染又は細菌感染後の組織の炎症状況を反映するGOT濃度やGPT濃度も、コントロール群で高値を示すことが確認された。
なお、亜臨界水処理物を含む飼料を給餌された群間では、亜臨界水処理物群よりも、フィブリン除去亜臨界水物群が高い効果を示し、更に亜臨界水処理後沈澱物群はより高い効果を示した。
以上の結果より、本発明の豚血液又は鶏血液の亜臨界水処理ペプチドを含有した飼料は、PRRS、PCV2、サルモネラ病及びニューカッスル病を抑制し、事故率を著しく低下させ得る、優れた免疫賦活飼料であることが確認された。
Claims (7)
- フィブリンを除去した家畜血液の亜臨界水処理ペプチドからなる免疫賦活ペプチド。
- 家畜血液が80%以上のフィブリンを除去した血液である請求項1記載の免疫賦活ペプチド。
- 家畜血液を亜臨界水処理した後に静置して生成する沈殿物からなる請求項1又は2記載の免疫賦活ペプチド。
- 家畜血液が豚又は鶏血液である請求項1〜3のいずれかに記載の免疫賦活ペプチド。
- 免疫賦活が、家畜の抗ウイルス活性及び抗細菌活性である請求項1〜4のいずれかに記載の免疫賦活ペプチド。
- ウイルスが、PRRSウイルス、PCV2又はニューカッスル病ウイルスである請求項5記載の免疫賦活ペプチド。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のペプチドを含有する飼料。
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