JP5394742B2 - Il−15rベータ/ガンマを介したil−15活性の選択的かつ強力なエンハンサーとしてのil−15rアルファスシドメイン、およびハイパーアゴニスト(il15rアルファスシ−il15)融合タンパク質 - Google Patents
Il−15rベータ/ガンマを介したil−15活性の選択的かつ強力なエンハンサーとしてのil−15rアルファスシドメイン、およびハイパーアゴニスト(il15rアルファスシ−il15)融合タンパク質 Download PDFInfo
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Description
IL−15は、IL−2のように、元来T細胞成長因子として記述されてきたサイトカインである(1)。4つのα−ヘリックス束ファミリーに属する2つのサイトカインおよびそれらの膜受容体は、シグナル変換を起こす2つのサブユニット(IL−2R/IL−15Rβおよびγ鎖)を共有する(2)。IL−2Rβ/γ複合体は両サイトカインの中等度親和性受容体である。主にそれはほとんどのNK細胞で発現し、ナノモル濃度のIL−2またはIL−15によりインビトロで活性化し得る。
例えば活性化T細胞上で発現し、ピコモル濃度の、いずれのサイトカインでも活性化し得る高親和性IL−2およびIL−15受容体はまた、サイトカイン特異性を引き起こし、サイトカイン結合親和性を促進する自身専用のα鎖(IL−2RαおよびIL−15Rα)を含有する(3)。
両サイトカインは先天性免疫および適応免疫において中心的な役割を担っている。ところが初期のインビトロ実験では大量の機能的重複が見られ(活性化リンパ球およびNK細胞の増殖および細胞毒性の誘導、B細胞増殖の共刺激ならびにT細胞の免疫グロブリン合成、化学誘引)(1,4〜6)、より最近の実験では、2つのサイトカインはインビボの相補的で、対照的ですらある作用を示すことが分かってきた。ところがマウスのIL−2またはIL−2Rαノックアウトは活性化TおよびB細胞、IL−15ならびにIL−15Rαノックアウト集団の増加を伴う自己免疫性表現型と関連しており、NK、NK−T、上皮内リンパ球および記憶CD8T細胞の特定の欠損をまねいた(7,8)。さらに、IL−2は、活性化誘導細胞死(AICD)を誘導することで末梢寛容を促進するが、IL−15はIL−2媒介AICDを阻害し(9)、IL−2と異なりIL−15はCD8記憶T細胞の生存因子である(10)。
これらの観察と一致して、IL−2の主要な役割は活性化T細胞の絶え間ない増加を制限することであるが、IL−15はT細胞分裂の開始と記憶T細胞の生存に重要であることが示唆されている(11)。
IL−15トランス提示の新規なメカニズムとして、IL−15およびIL−15Rαは抗原提示細胞(単球、樹状細胞)により協調的に発現し、IL−15Rαに結合したIL−15は、IL−15Rβ/γ受容体のみを発現する隣接のNKまたはCD8T細胞にトランス型で提示されるということが記述されてきた(12)。免疫学的シナプスで生じる共刺激事象として、IL−15トランス提示は現在、インビボでのIL−15作用にとっての主力のメカニズムであることが分かっている(13、14)。それは腫瘍の免疫監視において主要な役割を担うことが示唆されている(15)。
しかしIL−2Rα単独はIL−2の低親和性(Kd=10nM)受容体であり、IL−15Rαは高親和性(Kd=100pM)のIL−15に結合する。タンパク質分解によるIL−2Rαの分断は、リンパ球活性化のダウンレギュレーションに関与している自然のメカニズムである。IL−2Rαは、Th1細胞を阻害しアレルギー環境を好む主要なダニアレルゲンであるDer p1により(17)、また、癌に遭遇するT細胞の増殖を抑制する腫瘍誘導メタロプロテイナーゼにより(18)切断される。このように生成された可溶IL−2Rαは、インビトロでのIL−2作用の競合的阻害剤である。しかしながら、それは依然として低親和性IL−2結合剤であり、インビボでのIL−2活性のダウンレギュレーションに効率的には関与しない傾向にある。
ヒトIL−15Rαの可溶形態は、MMPを含む分断過程によりIL−15Rα陽性細胞から自然に放出されることも可能であることが近年明らかになっている(19)。可溶IL−2Rαと対照的に、この可溶IL−15Rα受容体は高親和性でIL−15に結合し、高親和性IL−15Rα/β/γシグナリング複合体を経て駆動される増殖を効率的にブロックすることができた。この結果はsIL−15Rαが相同体sIL−2Rαのようにアンタゴニストとして挙動するという考え、およびインビトロまたはインビボでのマウスsIL−15Rαの阻害効果と一致した(20、21)。
該フラグメントは、IL−15Rベータ/ガンマ(=IL−15Rβ/γ)中等度親和性受容体を介して、高親和性受容体によりこれらに影響を及ぼすこともなく、IL−15の生物活性のみならず結合を促進することが可能である。また、本発明者らはIL−15Rβ/γ複合体の強力なスーパーアゴニストとして挙動する融合タンパク質について記述する。該融合タンパク質は、共有原子価、例えば柔軟なリンカーにより、IL−15RαまたはIL−15Rアルファのスシドメインを保持するIL−15Rアルファフラグメントに融合するIL−15(または保存的フラグメント、アゴニスト、その模倣体)などのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素を有している。
それはGiron-Michelらの「Membrane-bound and soluble IL-15/IL-15Ralpha complexes display differential signaling and functions on human haematopoietic progenitors」(Blood, 1 October 2005, Vol. 106, No. 7, pp. 2302-2310; 2005年6月にオンラインで先行公表)という題名の刊行物である。
Giron-Michelらの刊行物は以下のことを開示した(Giron-Michelらの図7を参照):
− 組換えIL−15(rIL−15)は、10ng/mlの用量で使用される場合、有意な抗アポトーシス効果を誘導し、また
− rIL−15は0.1ng/mLの用量では有意な抗アポトーシス効果は誘導しないが、
− 可溶IL−15Rアルファの市販されている形態で使用された場合は、0.1ng/mL用量でrIL−15は有意な抗アポトーシス効果を誘導する。
Giron-Michelらが使用した可溶IL−15RアルファはIL−15Rアルファの市販されている形態(R&D Systemsから入手、147−IR参照下)である。この可溶IL−15Rアルファはエクソン3が欠損した可溶IL−15Rアルファを修飾した形態である。故に、Giron-Michelらが使用した可溶IL−15Rアルファの形態は、IL−15Rアルファのエクソン4コード部分に直接結合しているIL−15Rアルファのエクソン2コード部分を有し、IL−15Rアルファのエクソン3コード部分は有していない。したがってGiron-Michelらが使用した可溶IL−15Rアルファの形態は、IL−15Rアルファのフラグメントと対応しないが、その修飾形態には対応する。
さらに、Giron-Michelらが使用した可溶IL−15Rアルファの形態は、共有原子価によりそれに結合したFcフラグメント(ヒトIgG)を含む。FcフラグメントはIL−15Rベータ/ガンマに結合しない。したがって、Giron-Michelらの刊行物は、可溶IL−15Rアルファ形態が共有原子価によって、IL−15Rベータ/ガンマ結合要素に結合するような化合物については全く開示していない。
さらにGiron-Michelらの刊行物は、抗アポトーシス効果を開示しているが、IL−15Rベータ/ガンマ陽性細胞の増殖および/または活性化への影響は全く開示していない。さらに、開示された抗アポトーシス効果アッセイは、(i)rIL−15非存在下での可溶IL−15Rアルファ−Fcフラグメントまたは(ii)いずれのFcフラグメントも有しない可溶IL−15Rアルファを含有する対照試料を全く有していないことに注目し得る。したがって開示された抗アポトーシス効果は、使用の化合物のIL−15Rアルファ部分に直接寄与することは不可能である。
本発明はIL−15Rベータ/ガンマシグナル伝達経路に、ならびにNKおよび/またはT細胞などの、IL−15Rベータ/ガンマ陽性細胞の活性化および/または増殖および/またはアポトーシスの阻止を誘導および/または刺激することに関する。
本発明は、該アゴニスト作用を発揮するのに必要な、このIL−15Rアルファ細胞外領域に含有されている最小限の構造単位がIL−15Rアルファ細胞外領域のスシドメインであることを説明している。
本発明はさらに、このIL−15Rアルファ細胞外領域のヒンジ領域および尾部がこのアゴニスト作用の効率を有意に高めていることも説明している。
本発明はさらに、野生型IL−15と比較して30から150倍の生物活性の増大を有し、IL−15と可溶IL−15Rアルファスシドメインの単純な会合より強力でさえある化合物を提供する。
本発明は、IL−15Rアルファ、および少なくとも1つのIL−15Rアルファスシドメインを含むIL−15Rアルファフラグメントに関する。
該化合物は、野生型IL−15と比較して30から150倍の生物活性の増大を有することが可能であり、IL−15と可溶IL−15Rアルファスシドメインの自由会合より強力であり得る。
前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチド以外に、本発明の前記共有結合化合物は、少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素を含む。
例示した非ヒト哺乳動物IL−15はサルIL−15、またはネズミIL−15(例えばアクセッション番号NM_008357のマウスIL−15;アクセッション番号NM_013129のラットIL−15)、またはウサギIL−15(例えばアクセッション番号DQ157152)、ヒツジIL−15(例えばアクセッション番号NM_001009734)、またはブタIL−15(例えばアクセッション番号NM_211390)である。例示した非哺乳動物IL−15はニワトリ(例えばアクセッション番号NM_204571)である。
化合物は、天然IL−15で誘導されたものと同レベル以上の生物学的応答を誘導する場合にIL−15アゴニストと称される。いっそう高いレベルの生物学的応答を誘導するアゴニスト(スーパーアゴニスト)が好ましい。
IL−15アゴニストは通常は、IL−15Rアルファおよび/またはIL−15Rベータ/ガンマへの結合親和性を有し、この親和性は天然IL−15のものと少なくとも有意差があるとは言えず、天然IL−15のものより有意に高いことが好ましい。
前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドのアミノ酸配列は:
○ IL−15Rアルファ(IL−15Rアルファスシドメインを有するIL−15Rアルファの前記細胞外領域)の細胞外領域のアミノ酸配列であるか、または、
○ IL−15Rアルファの細胞外領域のフラグメントのアミノ酸配列であり、前記フラグメントはIL−15Rアルファの前記細胞外領域のスシドメインを保持し、前記スシドメインは最初のエクソン2にコードされたシステイン残基(C1)で開始し、第4のエクソン2にコードされたシステイン残基(C4)で終了し、残基C1およびC4は共にスシドメインに含まれていると定義されており、または
○ 前記スシドメインの4つの各システイン残基(C1、C2、C3およびC4)を保持する変異アミノ酸配列である。
該IL−15Rアルファスシドメインの保存的変異配列は親スシドメインの配列から、アミノ酸の少なくとも1つの欠失および/または少なくとも1つの置換および/または少なくとも1つの付加により得られるが、以下の特徴:
i.IL−15Rベータ/ガンマに対するIL−15の親和性を増加させる能力、
ii.ベータ/ガンマ陽性細胞、もっと詳しく言えばナイーブなNKおよび/またはT細胞などのベータ/ガンマ陽性アルファ陰性細胞に対する抗アポトーシス効果を誘導および/または刺激する能力、
iii.IL−15Rベータ/ガンマシグナル伝達経路を経たIL−15生物学的作用の効率を促進、すなわちベータ/ガンマ陽性細胞、もっと詳しく言えばナイーブまたは静止NKおよび/またはT細胞などのベータ/ガンマ陽性アルファ陰性細胞の増殖および/または活性化を誘導および/または刺激する能力
の少なくとも1つの能力を保持している。
好ましくは、前記保存的変異体は、上記のiii.に記述された特徴を保持している。
上述の特徴をアッセイする適切な細胞系はIL−15Rベータ/ガンマ陽性IL−15Rアルファ陰性細胞である。該細胞系の例は、ベータおよびガンマ鎖(例えばヒトベータおよびヒトガンマ鎖)でトランスフェクション可能な細胞系32Dである。
あるいは、ナイーブまたは静止NKおよび/またはT細胞は、血液試料などの生物学的試料から精製可能である。
さらに好ましくは配列同一性の割合は少なくとも90%、いっそうさらに好ましくは少なくとも92%、最も好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%である。
IL−15Rアルファのエクソン1は、IL−15Rアルファのシグナルペプチドをコードする。
IL−15Rアルファのエクソン2は、IL−15Rアルファのスシドメインをコードする。
エクソン3の5’末端部分は、IL−15Rアルファのヒンジ領域として公知の領域をコードする。
エクソン3の残りの部分ならびに他の細胞外エクソン(すなわちヒトIL−15rアルファならびにほとんどの種のエクソン4、エクソン5およびエクソン6の5’部分)は、IL−15Rアルファの尾部としても公知のグリコシル化部位に富んだ領域をコードする。
残りのIL−15Rアルファエクソン(すなわちヒトIL−15rアルファならびにほとんどの種のエクソン6の3’部分ならびにエクソン7)は、IL−15Rアルファの膜透過領域および細胞質内領域をコードする。
前記ヒトIL−15Rアルファのアミノ酸配列は、配列番号3(267個のアミノ酸)のヒトIL−15Rアルファ配列の配列であることが最も好ましい。配列番号3のヒトIL−15Rアルファの細胞外領域は、配列番号40(配列番号3の1..209)のアミノ酸配列を含む。配列番号40のシグナルペプチド欠失形態は配列番号44(配列番号3の31..209)として一覧に示してある。
IL−15Rアルファのいくつかのヒト対立遺伝子は、配列番号3の位置182で、Asnアミノ酸(aatまたはaacにコードされるアミノ酸n)の代わりに、Thrアミノ酸(act、acc、acaまたはacgにコードされるアミノ酸t)を含んでよい。該変異体は天然に存在し機能的である。
本出願では、該ヒトIL−15Rアルファの対立遺伝子天然変異体は、配列番号3(アミノ酸配列)および配列番号1または2(cDNAおよびCDS配列)の参照ヒトIL−15Rアルファ配列と、ならびに、そこから直接得た参照ヒトIL−15Rアルファ配列、すなわち配列番号40または44(アミノ酸配列)および配列番号39および43(CDS配列)の細胞外領域配列と同等であることを意味する。
配列番号3のヒトIL−15Rアルファの7つのエクソンの位置は以下の表1に記載してある。
これに関して、下記表1に記載されているとおりエクソン1の位置は1..170であり、エクソン2では171..365であり、それらはそれぞれ1..171ならびに172..365ではなく、アクセッション番号U31628で入手可能な配列で公表されていることを留意されたい。
本出願では、配列が「開始」および「終了」位置により定義されている場合、これらの開始および終止位置は記載の配列内に含まれていることを意味する。
好ましい非ヒト哺乳動物IL−15RアルファはサルIL−15Rアルファ(例えばチンパンジーIL−15Rアルファ)、またはネズミIL−15Rアルファ(例えばマウスIL−15Rアルファ、ラットIL−15Rアルファ)、またはウサギIL−15Rアルファ、またはブタIL−15Rアルファを特に含む。
IL−15Rアルファの細胞外領域は通常、最初のN末端アミノ酸から、尾部である最後のアミノ酸(またはグリコシル化部位に富んだ領域)の範囲のIL−15Rアルファ配列の領域として定義される。以下に詳述するとおり、IL−15Rアルファ配列の尾部は、当業者が、例えばソフトウェアの助けを借りて判定できる。
配列番号40のヒトIL−15Rアルファ細胞外領域のアミノ酸配列は、ヒトIL−15Rアルファのエクソン1〜5およびエクソン6の小規模の5’部分にコードされている。
ヒトIL−15Rアルファのエクソン1(配列番号8)は、IL−15Rアルファシグナルペプチド(配列番号4の核酸配列;配列番号5のアミノ酸配列)をコードする。
エクソン2(配列番号9)は、ヒトIL−15Rアルファのスシドメインをコードする配列を含む。
エクソン2の最後の3’コドンは、ヒンジ領域の最初のアミノ酸をコードする。
エクソン4(配列番号11)、エクソン5(配列番号12)を加えたエクソン3の残りの3’部分およびエクソン6の5’部分(配列番号1の699..709)は、グリコシル化部位に富んだ領域(尾部としても公知である)をコードする。
配列番号44の配列は、配列番号40のIL−15Rアルファ細胞外領域の、シグナルペプチド欠失形態である。本発明ではシグナルペプチドを使用してよいが、場合による。該シグナルペプチドはIL−15Rアルファシグナルペプチドまたは他のタンパク質のシグナルペプチドであり得る。したがってIL−15Rアルファ細胞外領域のシグナルペプチド欠失形態(配列番号44など)は、完全なIL−15Rアルファ細胞外配列(配列番号40など)と直接に同等である。
前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドを定義するIL−15Rアルファまたはそのフラグメントの細胞外領域は、IL−15Rアルファスシドメインを含有する。
IL−15Rアルファのスシドメインはベータシート構造を有する。
それはIL−15Rアルファのエクソン2にコードされている。それは最初のエクソン2にコードされたシステイン残基(C1)で開始し、第4のエクソン2にコードされたシステイン残基(C4)で終了する。
標準的なN末端からC末端への配向におけるIL−15Rアルファタンパク質配列を考える場合、IL−15Rアルファのスシドメインは、シグナルペプチドの後方の最初のシステイン残基(C1)で開始し、シグナルペプチドの後方の第4のシステイン残基(C4)で終了すると定義することができる。
残基C1およびC4は、両方ともスシ配列に含まれる。
IL−15Rアルファスシドメインは、Prosite(http://us.expasy.org/prosite/)、InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)、SMART(http://elm.eu.org/)などの適切なソフトウエアを使ったIL−15Rアルファのアミノ酸配列の分析によっても判定可能である。
例えば、ヒトIL−15Rアルファの細胞外領域の前記フラグメントのアミノ酸配列は、配列番号16(it+ヒトIL−15Rアルファスシ)または18(t+ヒトIL−15Rアルファスシ)の配列であり得る。
シグナルペプチドはタンパク質の翻訳後輸送を目的とした短い(15〜60アミノ酸長)ペプチド鎖である。タンパク質の輸送後、シグナルペプチダーゼによりタンパク質から切断されるシグナルペプチドもある。シグナルペプチドは標的シグナルまたはシグナル配列と称してもよい。シグナルペプチドのアミノ酸配列はサイトゾルで合成されたタンパク質を、核、ミトコンドリア基質、小胞体、葉緑体およびペルオキシソームなどの特定の細胞小器官へと導く。
配列番号5に示すとおりヒトIL−15Rアルファのシグナルペプチドは、1つのシステイン残基を含有する30個のアミノ酸のN末端アミノ酸配列である。
IL−15Rアルファのエクソン2は、スシドメイン、すなわち本発明に必要な最小構造単位を含有する。
−前記IL−15Rアルファのエクソン2にコードされたIL−15Rアルファ細胞外領域の一部、または
−該エクソン2にコードされた部分のフラグメント
を含むことが可能である(または本質的に成る)。
例えば、配列番号40のヒト細胞外領域のエクソン2にコードされた部分は位置31から位置94までの範囲の配列(すなわち配列番号24)であり、すなわちそれはit+スシ+iである。
このエクソン2にコードされた部分のフラグメントは、t+スシ;it+スシ;t+スシ+iである。
例えば、前記エクソン2にコードされた配列は以下:
−配列番号24の配列であるヒト細胞外IL−15Rアルファのエクソン2にコードされた部分、
−配列番号98の配列であるチンパンジー細胞外IL−15Rアルファのエクソン2にコードされた部分、
−配列番号97の配列であるハツカネズミ細胞外IL−15Rアルファのエクソン2にコードされた部分、
−配列番号99の配列であるドブネズミ細胞外IL−15Rアルファのエクソン2にコードされた部分
であり得る。
該変異体には、その配列に保存的アミノの欠失および/または置換および/または付加を有するものが特に含まれる。
IL−15Rアルファ細胞外領域フラグメントの保存的変異体配列は、親IL−15Rアルファ細胞外領域フラグメントの配列から、アミノ酸の少なくとも1つの欠失および/または少なくとも1つの置換および/または少なくとも1つの付加により得られ、以下の特徴:
i.IL−15Rベータ/ガンマに対するIL−15の親和性を増加させる能力、
ii.ベータ/ガンマ陽性細胞、もっと詳しく言えばナイーブなNKおよび/またはT細胞などのベータ/ガンマ陽性アルファ陰性細胞に対する抗アポトーシス効果を誘導および/または刺激する能力、
iii.IL−15Rベータ/ガンマシグナル伝達経路を経たIL−15生物学的作用の効率を促進、すなわちベータ/ガンマ陽性細胞、もっと詳しく言えばナイーブなまたは静止NKおよび/またはT細胞などのベータ/ガンマ陽性アルファ陰性細胞の増殖および/または活性化を誘導および/または刺激する能力
の少なくとも1つの能力を保持している。
保存的変異体は、親配列に、この親配列の全長にわたって、少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を持つものを特に含む。好ましくは同一性の前記割合は少なくとも90%、いっそうさらに好ましくは少なくとも92%、最も好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%である。
本発明の非常に有利な一実施態様にしたがって、IL−15Rアルファ細胞外領域の前記フラグメントは、前記IL−15Rアルファのエクソン3にコードされた配列由来の少なくとも1つのアミノ酸をさらに含んでよい。
−前記IL−15Rアルファのエクソン2および3にコードされたIL−15Rアルファ細胞外領域の一部、または
−前記スシドメインを保持している該エクソン2〜3にコードされた部分のフラグメント
を含むか、あるいは成ってよい。
−配列番号93の配列であるヒト細胞外IL−15Rアルファのエクソン3にコードされた部分、
−配列番号95の配列であるチンパンジー細胞外IL−15Rアルファのエクソン3にコードされた部分、
−配列番号94の配列であるハツカネズミ細胞外IL−15Rアルファのエクソン3にコードされた部分、
−配列番号96の配列であるドブネズミ細胞外IL−15Rアルファのエクソン3にコードされた部分
であり得る。
したがって当業者は、前記IL−15Rアルファスシドメインに付加したエクソン3にコードされたアミノ酸数を、30に、好ましくは25、より好ましくは20、さらにより好ましくは18、最も好ましくは17、例えば17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6に限定することに利点を見出すこともある。
したがってエクソン3にコードされたアミノ酸の最も好ましい数は、上述の各下限から上述の各上限の組み合わせに起因する区間の数である。
エクソン3にコードされた部分の好ましいフラグメントの例として、配列番号3(または配列番号40)のヒトIL−15Rアルファのエクソン3にコードされた部分、すなわち、位置95および127を共に含む位置95から位置127の範囲の部分(すなわち:配列番号3または40の配列95..127)から得るフラグメントすべてが挙げられる。
したがって本発明の好ましい化合物は、前記スシドメイン以外に、配列番号3の位置95から127の範囲の配列(位置95および127も共に含む)より得られる少なくとも1つのアミノ酸を含む、少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドを含む。それは:
−好ましい数の該アミノ酸(すなわち、「少なくとも2つのアミノ酸、より好ましくは少なくとも3つのアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも4つのアミノ酸、最も好ましくは少なくとも5つのアミノ酸」)、または
−最も好ましい数の該アミノ酸(すなわち「少なくとも2つのアミノ酸、より好ましくは少なくとも3つのアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも4つのアミノ酸、最も好ましくは少なくとも5つのアミノ酸」と「最大30、好ましくは最大25、より好ましくは最大20、さらにより好ましくは最大18、最も好ましくは最大17、例えば17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6」とに起因する任意の組み合わせ)
を含むことが最も好ましい。
−前記IL−15Rアルファのエクソン2および3にコードされるIL−15Rアルファ細胞外領域の一部またはその保存的変異体、あるいは
−前記IL−15Rアルファのエクソン2にコードされるIL−15Rアルファ細胞外領域の一部、および前記IL−15Rアルファのエクソン3にコードされるIL−15Rアルファ細胞外領域の一部のフラグメント
を含むことができる(または本質的になることができる)。
−前記IL−15Rアルファのエクソン2および3にコードされたIL−15Rアルファ細胞外領域の一部またはその保存的変異体、あるいは
−該エクソン2〜3にコードされた部分または該エクソン2〜3にコードされた変異体のフラグメント、但し、該フラグメントはスシドメインを保持している
を含むことができる(または本質的に成ることができる)。
i.IL−15Rベータ/ガンマに対するIL−15の親和性を増加させる能力、
ii.ベータ/ガンマ陽性細胞、もっと詳しく言えばナイーブなNKおよび/またはT細胞などのベータ/ガンマ陽性アルファ陰性細胞に対する抗アポトーシス効果を誘導および/または刺激する能力、
iii.IL−15Rベータ/ガンマシグナル伝達経路を経たIL−15生物学的作用の効率を促進、すなわちベータ/ガンマ陽性細胞、もっと詳しく言えばナイーブなまたは静止NKおよび/またはT細胞などのベータ/ガンマ陽性アルファ陰性細胞の増殖および/または活性化を誘導および/または刺激する能力
の少なくとも1つの能力を保持している。
好ましくは、前記保存的変異体は、上記のiii.に記述した特徴を保持している。
保存的変異体には、親配列に、この親配列の全長にわたって、少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を有するものが特に含まれる。好ましくは同一性の前記割合は少なくとも90%、いっそうさらに好ましくは少なくとも92%、もっとも好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%である。
本発明者らは、IL−15Rアルファのヒンジ領域がシグナル変換効率のこの上昇に、およびIL−15Rベータ/ガンマ陽性細胞増殖および活性のこの上昇にさらにとりわけ関与していることを明らかにしている。
潜在的グリコシル化部位の位置は、潜在的O−グリコシル化部位の同定ではソフトウエアNetOGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc-3.1/)を、潜在的N−グリコシル化部位の同定ではソフトウエアNetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)を使用して判定する。
配列番号79のチンパンジーIL−15Rアルファにおいて、ヒンジ領域は配列番号82の配列を有する。
したがってIL−15Rアルファヒンジ領域のフラグメントは、1(例えばアミノ酸i)、2(例えばアミノ酸ir)、3(例えばアミノ酸ird)、4(例えばアミノ酸irdp)、5(例えばアミノ酸irdpa)、6(例えばアミノ酸irdpal)、7(例えばアミノ酸irdpalv)、8(例えばアミノ酸irdpalvh)、9、10、11、12、13または14アミノ酸のフラグメントであり得る。
好都合にも、前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドは、配列番号14のヒトスシドメインおよび配列番号20のヒンジ領域のフラグメントを含むことが好ましい。
IL−15Rアルファヒンジ領域の前記フラグメントのアミノ酸配列は、iまたはirまたはirdを含むか、あるいはそれ自体である。
配列番号22、24および26のスシ含有ポリペプチドは、配列番号14のスシドメインおよび配列番号20のヒンジ領域の「i」フラグメントを含む。
−グリコシル化部位に富んだ領域または尾部として公知の細胞外IL−15Rアルファの領域のアミノ酸配列、もしくは
−そのフラグメント
を含んでよい。
IL−15Rアルファのグリコシル化部位に富んだ領域は潜在的グリコシル化部位をいくつか含む領域である。それはIL−15Rアルファの「尾」部を意味することもある。それは(標準的な「N末端からC末端への」配向における配列を考える場合)ヒンジ領域の後方の最初のアミノ酸残基で開始し、IL−15Rアルファの膜透過領域の前方の最後のアミノ酸残基で終了する。それはいくつかの潜在的グリコシル化部位を含む。
膜透過ドメインは、TopPred (http://biowed.pasteur.fr/seqanal/interfaces/topred.html)、TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)などの適切なソフトウエアを使用してIL−15Rアルファのアミノ酸配列を分析することで判定する。
配列番号32のヒトIL−15Rアルファ尾部は、前記ヒトIL−15Rアルファのエクソン3の3’部、ならびにエクソン4、エクソン5およびエクソン6の5’部にコードされている。
−IL−15Rアルファのグリコシル化部位に富んだ領域の、エクソン3にコードされた部分、または
−該エクソン3にコードされた部分のフラグメント
を含んでよい。
前述したとおり、当業者が適当であると判断したエクソン3にコードされた部分の任意のフラグメントが使用可能であり、例えば任意のフラグメントは少なくとも1つのアミノ酸、好ましくは少なくとも2つのアミノ酸、より好ましくは少なくとも3つのアミノ酸のフラグメントである。
エクソン1、2、3以外の細胞外IL−15Rアルファエクソンは、尾部のC末端フラグメントをコードする。
該部分、またはそのフラグメントは本発明の化合物の効率をさらに促進する可能性がある。
該スシ含有ポリペプチドのアミノ酸配列の例として、配列番号38、シグナルペプチド欠失配列番号42、またはシグナルペプチド欠失配列番号44の配列が挙げられる。
生物レベルまたは細胞レベルでは、本発明の生成物はIL−15生物学的作用を誘導および/または刺激するという特徴を含む。それは、IL−15、IL−15模倣体および/またはIL−15アゴニストにより発揮され、誘導され、または刺激されるそれらの生物学的作用を刺激する。
よって本発明の生成物(すなわち単離した形態での本明細書に記述したスシ含有ポリペプチド、もっと詳しく言えば本発明の化合物)は、IL−15生物学的作用のアゴニストと見なしてもよい。
本発明の他の生成物にはIL−15Rベータ/ガンマおよびIL−15Rアルファ/ベータ/ガンマシグナル伝達経路の両方の効率を促進可能であるものがある。それは本発明のRLI融合タンパク質のケースで顕著である(配列番号60のアミノ酸配列;配列番号59の核酸配列)。
IL−15は補助細胞とリンパ系細胞間のクロストークに関与している。
それは末梢組織においてNK細胞、NKT細胞およびCD8+記憶T細胞の成長に必須である。
それはCD34+造血細胞の分化を誘導できる最も強力な生理学的因子である。
当業者は、評価または監視に適当であると、あるいは利便性が高いと判断する任意のIL−15生物学的応答を選択できる。
前記IL−15生物学的作用は、IL−15Rベータ/ガンマ+IL−15Rアルファ−細胞に対して、IL−15および/またはIL−15模倣体および/またはIL−15アゴニストにより発揮され、誘導され、あるいは刺激される生物学的作用であることが好ましい。
該細胞は例えば、哺乳動物生体から採取可能である。
TF−1ベータ細胞は、ベータ鎖でTF−1細胞をトランスフェクトすることで利用できる。
TF−1細胞は、ATCCアクセッション番号CRL−2003でAmerican Type Culture Collection ATCC; P. O. Box 1549; Manassas, VA 20108; U.S.A.; cf. http://www.lgcpromochem.com/atcc/から入手できる。
その後IL−2Rベータ組換えレトロウイルスを使用してTF−1細胞を感染させ、G418を含有する培地中での選択後、TF−1βを生成することが可能である。
静止NKおよび/またはT細胞は当業者で入手できる。それらは例えば、血液試料などの細胞試料を精製することで得られる。
静止NKおよびT細胞は以下のとおり健常成体ドナーの血液から単離可能である:全血は高速遠心分離し、淡黄色の膜を得る。この淡黄色の膜は密度勾配遠心分離(Histopaque, Sigma)し、末梢血液リンパ球を得る。その後静止NK細胞は、NK細胞陰性単離キット(Dynal, Biotech ASA, Oslo, Norway)を使用し、末梢血液リンパ球から単離する。あるいは、静止T細胞は、T細胞陰性単離キット(Dynal, Biotech ASA, Oslo, Norway)を使用し、末梢血液リンパ球から単離する。
例えば、ネズミ32D細胞系(ATCC CRT−11346)はベータおよびガンマ鎖、好ましくはヒトおよびガンマ鎖によりトランスフェクトできる。
ベータ鎖テンプレートは、ヒトIL−2Rベータ配列(NCBIアクセッション番号K03122)にしたがって、プルーフリーディングポリメラーゼPfu(Stratagene no 600390)およびセンスプライマー(配列番号70)として
ならびにアンチセンスプライマー(配列番号71)として
を使用し、RT−PCRによりHuT102(ATCC TIB−162)のRNAから利用可能である。PCR生成物は、Zero Blunt PCR Cloning Kit(In Vitrogen cat no K2700-20)またはTOPO XL PCRクローニングキット(In Vitrogen cat no K4750-10)を使用し効率よくクローン化する。その後IL−2Rベータ遺伝子のcDNAを、キットの記述どおりに、Pantropic Retroviral Expression System(BD Biosciences Clontech no 631512)のpLXRNレトロウイルス発現ベクターのマルチクローニングサイト中にサブクローン化し、GP2−293細胞へトランスフェクトし、組換えレトロウイルスを生成する。
ガンマ鎖テンプレートは、ヒトインターロイキン−2受容体ガンマ配列(NCBIアクセッション番号D11086)にしたがって、プルーフリーディングポリメラーゼPfu、およびセンスプライマーとして
(配列番号100)、およびアンチセンスプライマーとして
(配列番号101)を使用し、RT−PCRによりTF1(ATCC CRL2003)またはHuT102(ATCC TIB−162)のRNAから利用できる。PCR生成物は、Zero Blunt PCRクローニングキットまたはTOPO XL PCRクローニングキットを使用し効率よくクローン化する。その後IL−2Rγ遺伝子のcDNAを、pcDNA 3.1/HYGRO(In Vitrogen)中にサブクローン化し、pcDNA IL−2Rγ/HYGROプラスミドを生成する。
本発明の化合物はシグナルペプチドを含んでよい。このシグナルペプチドは前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチド、または前記少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素に直接または間接的に結合可能である。前記シグナルペプチドは、共有原子価により前記化合物に結合可能である。
シグナルペプチドは細胞からのタンパク質分泌を容易にする。
このシグナルペプチドは例えば、前記フラグメントに直接または間接的に結合するヒトIL−15Rアルファ(配列番号5の配列であるヒトIL−15Rアルファのシグナルペプチドなど)、または前記フラグメントに直接または間接的に結合する他のタンパク質のシグナルペプチド(配列番号58のウシプレプロラクチンのシグナルペプチドなど)などのIL−15Rアルファのシグナルペプチドであってよい。
シグナルペプチドの例としては以下が挙げられる:
−ヒト野生型IL−15Rアルファのリーダー配列にコードされたペプチド(配列番号4)、すなわちヒト野生型IL−15Rアルファの最初の30個のN末端アミノ酸(配列番号5)、または
−ウシプレプロラクチンのリーダー配列にコードされたペプチド(配列番号57)、すなわちウシプレプロラクチンの最初の31個のN末端アミノ酸(配列番号58)。
当業者が適当であると判断する他のシグナルペプチドも使用してよい。さらに、アミノ酸配列を変化させずに、IL−15リーダー配列の特定のヌクレオチドを変化させることが可能である。また、シグナルペプチドとして作用する配列の能力に影響を及ぼさないアミノ酸変化が起こり得る。
−該「天然」シグナルペプチドに間接的に結合してもよいし、または
−前記スシ含有ポリペプチドが得られるIL−15Rアルファ由来ではないシグナルペプチドに直接または間接的に結合してよい。
例えば、分子タグおよび/またはタンパク分解部位は、シグナルペプチドとスシドメイン間、またはシグナルペプチドとIL−5Rベータ/ガンマ結合要素間に位置することが可能である。前記分子タグおよび/またはタンパク分解部位は前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドまたは前記IL−15Rベータ/ガンマ結合要素に直接または間接的に結合してよい。
分子タグの例として、特にFLAG(登録商標)タグが挙げられる。
タンパク分解部位の例として、特にXa結合部位が挙げられる。
FLAG(登録商標)オクタペプチド(Hoppら、Bio/Technology 6: 1204, 1988)は融合タンパク質の生物学的活性を変化させず、抗原性が高く、特異性モノクローナル抗体により可逆的に結合したエピトープをもたらし、発現した融合タンパク質の検出を速め、精製を容易にする。FLAG(登録商標)配列はまた、AspLys対合の直後に、ウシ粘膜エンテロキナーゼによって、その残基で特異的に切断される。このペプチドで覆われた融合タンパク質はまた、大腸菌の細胞内分解に耐性を示す場合がある。FLAG(登録商標)配列に結合するネズミモノクローナル抗体は、アクセッション番号HB9259でATCCに寄託されている。FLAG(登録商標)配列を有している融合タンパク質の精製における抗体の使用法は米国特許第5,011,912号に記載されている。
Flagエピトープおよび因子Xa結合部位をコードする配列の例として、配列番号53および55(それぞれ配列番号54および56のアミノ酸配列)が挙げられる。
本発明との関連で、「アミノ酸残基」は当業者に既知の任意のアミノ酸残基を意味する(例えばSewaldら、2002 (42)を参照; http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/でIUPACと命名)。
これは天然のアミノ酸(例えば3文字のコード、Ala、bAla、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Valの使用など)ならびに未加工および/または合成アミノ酸およびその誘導体(例えばAad、Abu、Acp、Ahe、Aib、Apm、Dbu、Des、Dpm、Hyl、MeLys、MeVal、Nva、HAO、NCap、Abu、Aib、MeXaa等を包含する(例えば(Mullerら、1993; Auroraら、1998; Obrechtら、1999; Maisonら、2001; Formaggioら、2003; Nowickら、2003; (43-48)を参照。
前記アミノ酸残基またはその誘導体は、任意のその異性体、特に、任意のキラル異性体、例えばL−またはD−イソ型であり得る。
アミノ酸誘導体によって、本発明者らは当技術分野では既知の任意のアミノ酸誘導体を言っている(例えばSewaldら、2002 (42) を参照; http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/でIUPACと命名)。
例えば、アミノ酸誘導体には、側鎖、例えばアルキル側鎖の付加および/またはヘテロ原子置換を担う天然アミノ酸から誘導可能な残基が挙げられる。アミノ酸誘導体のさらなる例として、化学的修飾を担うアミノ酸が挙げられ、該修飾は、天然親ペプチドの生物学的作用(単数または複数)を模倣またはそれに拮抗することが可能な非ペプチド構造要素を含有している化合物である模倣ペプチドまたはペプチド模倣体に見られる。ペプチド模倣体は通常、酵素的に切断可能なペプチド結合などの古典的なペプチドの性質はもはや有していない。
薬剤を投与すべき患者に、より少量のこれらアミノ酸を選択することで、適切なアミノ酸を正確に選択し得る。用量および投与計画は、患者の前記アミノ酸におけるレベルに応じて決めることができる。用量および投与計画は、患者のアミノ酸量を正常な標準レベルまで増やすことを目的とするものであることが好ましい。
本発明の前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドは、前記少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素へ直接結合してよい。
最も好適なリンカー配列は(1)柔軟で拡張された立体配座を選択し、(2)融合タンパク質の機能的ドメインと相互に作用し得る規則的な2次構造を生成する傾向を示さず、(3)機能的タンパク質ドメインとの相互作用を促進し得る最低限の疎水性または荷電特性を有するとされている。柔軟なタンパク質領域の典型的表面アミノ酸としてはGly、AsnおよびSer(すなわちG、NまたはS)が挙げられる。事実上、Gly、AsnおよびSerを含有しているアミノ酸配列の任意の順列は、リンカー配列の上記の基準を満たすことが予想される。Thr、Ala、Leu、Gln(すなわちT、A、L、Q)などの他の中性に近いアミノ酸もリンカー配列中で使用してよい。リンカー配列の長さは融合タンパク質の生物学的活性に多大な影響を及ぼすことなく変化してよい。
リンカー配列の例は米国特許第5,073,627号および5,108,910号に記載されている。
本発明にさらにとりわけ好適な柔軟リンカーの例として、配列番号49または51の配列にコードされるものが挙げられる(それぞれリンカー20とも称される配列番号50およびリンカー26とも称される配列番号52のアミノ酸配列)。
あるいは、前記少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素の配列に対して、前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドの配列はC末端側に位置し得る。
融合タンパク質は、異なる、または異種のタンパク質またはペプチド由来の2つ以上の領域を含むポリペプチドである。融合タンパク質は、目的の配列からフラグメントを酵素切断およびライゲーションする通常の技術を使用し調製する。合成オリゴヌクレオチドを使用するPCR技術は目的のフラグメントを調製および/または増幅させるために使用してよい。目的の配列を表す重複合成オリゴヌクレオチドもまた、融合タンパク質をコードするDNA構築物を調製するために使用可能である。融合タンパク質は数個の、リーダー(またはシグナルペプチド)配列、リンカー配列、ロイシンジッパー配列または他のオリゴマー形成配列を含む配列、および融合タンパク質の簡易な精製または迅速な検出の手段を提供する高抗原性部分をコードする配列を含むことができる。
本発明の化合物のさらなる例として、以下を含む融合タンパク質が挙げられる:
−配列番号5のシグナルペプチド、
−配列番号54のFlagタグおよびXa結合部位配列、
−配列番号30のスシ含有ポリペプチド(it+スシ+ヒンジ)、
−配列番号50のリンカー、および
−配列番号48のヒト野生型IL−15、
すなわち配列番号60にコードされたRLI融合タンパク質。
本発明の化合物のさらなる例として、以下を含む融合タンパク質が挙げられる:
−配列番号58のシグナルペプチド、
−配列番号56のFlagタグおよびXa結合部位配列、
−配列番号48のヒト野生型IL−15、
−配列番号52のリンカー、
−配列番号30のスシ含有ポリペプチド(it+スシ+ヒンジ)、
すなわち配列番号62のILR融合タンパク質。
好ましくは、本発明の化合物は、標準的FMOCプロトコールを使用して固相ペプチド合成(SPPS)技術により合成する(例えばCarpinoら、1970, J. Am. Chem. Soc. 92 (19): 5748-5749; Carpinoら、1972, J. Org. Chem. 37 (22): 3404-3409を参照)。
よって本発明は、IL−15Rベータ/ガンマシグナル伝達経路を刺激し、それによってNKおよび/またはT細胞などのIL−15Rベータ/ガンマ陽性細胞の活性化および/または増殖を誘導および/または刺激することを目的とする生成物をコードする核酸(DNAまたはRNA)にも関する。
もっと詳しく言えば、本発明の核酸は、本明細書で定義した本発明の単離スシ含有ポリペプチド、または本明細書で定義した本発明の共有結合した(すなわち少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素に直接または間接的に共有原子価で結合した少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドを有している)化合物をコードしている。その縮重を十分に考慮しながら、前記コーディングは普遍的遺伝子コードにしたがっている。
本発明の核酸は、トランスフェクションベクターまたは発現ベクターなどのベクター内に任意に含有させることが可能である。
本発明の核酸は、転写プロモーターまたはエンハンサーなどの好適な転写または翻訳調節配列、転写を制御する任意のオペレーター配列、好適なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳開始および終結を制御する適切な配列に操作可能に結合してよい。
該ベクターの例として、pEF1/myc−His(In Vitrogen, V921-20)、pcDNA3.1(In Vitrogen, V800-20)が挙げられる。
本発明の核酸はまた、翻訳したポリペプチドの細胞外分泌を改善することを可能にするリーダー配列に結合してよい。該リーダー配列の例として、ラットプレプロラクチン(配列番号57)由来の、またはヒトIL−15RアルファシグナルペプチドなどのIL−15Rアルファ(配列番号4のCDS)由来のリーダー配列が挙げられる。
これらの核酸配列は、それらの3’末端の終止コドン(TAG、TGA、TAA)も含んでよい。
−前記ヒトIL−15Rアルファの核コーディングは、配列番号2の配列を含むことができる;
−前記ヒト細胞外IL−15Rアルファの核コーディングは、配列番号39の配列を含むことが可能である;
−前記ヒトスシドメインの核コーディングは、配列番号13の配列を含むことができる;
−前記ヒト尾部の核コーディングは、配列番号31の配列を含むことができる;
−前記ヒト尾部の前記エクソン3にコードされた部分の核コーディングは、配列番号33の配列を含むことができる;
−前記ヒトIL−15の核コーディングは、配列番号47の配列を含むことができる;
−本発明の共有結合した化合物の核コーディングは、配列番号59(RLI融合タンパク質)または配列番号61(ILR融合タンパク質)の配列を含むことができる。
本発明の核酸は、その3’末端に終止コドン(例えばtag、tgaまたはtaa)を含むことが可能である。
前記ベクターは、例えばトランスフェクション、または発現ベクターであり得る。
本明細書で使用する「トランスフェクションされた」または「トランスフェクション」は1つ以上の外因性核酸の真核細胞への導入を意味する。トランスフェクションは、リン酸カルシウム沈殿、硫酸デキストラン沈殿、エレクトロポレーション、リポソーム媒介核酸輸送、粒子衝突などの弾道的な方法等を含む標準的な物理的および化学的トランスフェクション技術によるプラスミドなどの裸核酸の導入を含んでいる。トランスフェクションは、ウイルス変換または感染(受容体媒介および非受容体媒介)を含む生物学的方法による核酸の細胞への導入も含んでいる。
本明細書で使用するとおり、「形質転換された」または「形質転換」は、1つ以上の外因性核酸の原核細胞への導入を意味する。形質転換は、裸核酸ならびにファージなどの核酸ベクターの導入を含んでいる。
原核生物には、グラム陽性およびグラム陰性生物、例えば大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)ならびにバチルス属、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、ブドウ球菌族内の他の様々な種が含まれる。
好適な宿主細胞の例として、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)などの酵母および哺乳動物または昆虫起源の樹立細胞系などの高等真核細胞も挙げられる。好適な高等真核細胞の例として、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、例えばチャイニーズ卵巣ハムスター細胞系CHO/dhfr−(CHO duk−)(ATCCnoCRL−9096)または上皮細胞系、例えばサル上皮細胞系COS−7(ATCCnoCRL1651)またはヒト細胞系、例えば293c18ヒト腎細胞系(ATCCnoCRL−10852)またはFreeStyle293−Fヒト腎細胞系(In Vitrogen noR790−07)などの哺乳動物細胞系が挙げられる。
前記宿主細胞は、真核細胞、哺乳動物細胞(ヒトまたはCHO細胞などの非ヒト)、酵母細胞または原核細胞(大腸菌など)であってよい。
前記宿主細胞は、該細胞がより効率的(グリコシル化のいかなる問題とも無関係に)である本発明のとおり、哺乳動物細胞であることが最も好ましい。
本発明の生成物は、本明細書で定義した単離形態およびその共有結合形態で前記スシ含有ポリペプチドを特に含み、本明細書では本発明の共有結合化合物と称される(すなわち、少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素に共有原子価で直接または間接的に結合した少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドを含む化合物)。
本発明の生成物は特定のT/NKサブセットなどのリンパ球サブセットの拡張に有用である。したがって本発明は、NK細胞、NK−T細胞、CD8+記憶細胞などの1つまたは数種のリンパ球集団を拡張するための薬剤としての本発明の生成物の使用、ならびに該使用を目的とした、少なくとも1つの本発明の生成物を含む医薬組成物および薬剤を含めたアジュバント、組成物およびキットに関する。
前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドおよび前記少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素は、例えば本発明の共有結合化合物の形態などの結合形態で、または分離形態で使用可能である。
よって本発明は:同時の、別々の、または連続的な使用のための、すなわちキット・オブ・パーツ(kit-of-parts)形態での組み合わせの製剤として:
−本明細書で定義した前記少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素、および
−本明細書で定義した前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチド、
またはそれらの各核酸、ベクター、宿主細胞
に関する。
したがって本発明は、医薬組成物および薬剤を含むアジュバント、組成物またはキットである該製剤に関する。
本発明の医薬組成物、薬剤およびワクチンには本発明の少なくとも1つの生成物を、場合によって医薬的に許容され得るビヒクルおよび/または担体および/または希釈剤および/またはアジュバントが含まれる。
−単離したIL−15Rアルファスシドメイン、またはその保存的変異体を含む、IL−15の生物学的作用を誘導および/または刺激することを特に意図した組成物、
−免疫治療組成物のアジュバントを製造するための、単離したIL−15Rアルファスシドメイン、またはその保存的変異体の使用、
−IL−15の生物学的作用を誘導および/または刺激することを特に意図した組成物を製造するための、単離したIL−15Rアルファスシドメイン、またはその保存的変異体の使用、
に関する。
該薬剤またはワクチンは、IL−15活性の増大が望まれる疾患または病気、特に癌または免疫不全などを予防および/または治療および/または緩和することを目的としている。該薬剤またはワクチンは、リンパ球(T細胞、CD8+T細胞、NK細胞、樹状細胞など)の増殖および/もしくは生存ならびに/または腫瘍細胞に対するそれらの活性を刺激することで作用する可能性がある。
したがって該抗腫瘍薬またはワクチンは、効率的な抗腫瘍サーベイランスまたは抗腫瘍除去をするにはNKおよび/またはCD8+T細胞集団の活性が不十分である患者を対象としている。
該抗腫瘍薬またはワクチンはもっと詳しく言えば、IL−15Rベータ/ガンマを発現するが、IL−15Rアルファは発現しないNKおよび/またはCD8+T細胞の集団が不十分である、またはその活性的集団が不十分である患者を対象としている。
−IL−15などの、本明細書で定義した少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素、および
−単離したIl−15Rアルファスシドメインまたはその保存的変異体などの、本明細書で定義した少なくとも1つのスシ含有ポリペプチド
を含む。
好ましくは、IL−15などの少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素、および単離したIl−15Rアルファスシドメインまたはその保存的変異体などの前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドは融合タンパク質内で結合しており、それによって本発明の共有結合した化合物が形成される。
本発明はもっと詳しく言えば、HIV関連免疫不全に関する病気または疾患の予防および/または緩和および/または治療に関する。
この予防および/または緩和および/または治療には、本発明の生成物を必要とする患者に投与することが挙げられる。
本発明は、該予防および/または緩和および/または治療用の薬剤および/または組成物に関する。
−本発明の化合物、
−本発明の核酸、
−本発明のベクター、
−本発明の宿主細胞
の中で少なくとも1つの要素を含むことを特徴としている。
好都合にも、前記アジュバントはCD8メモリー応答を改善する。
用語『アジュバント』は、組成物に添加して免疫応答(先天性免疫応答および/または適応免疫応答)を改善し得る物質を定義することを意図している。本発明において、それはさらに、組成物に添加してこの組成物の経時的な効率、すなわち免疫応答の持続時間を改善し得る物質(記憶CD8+T細胞)を包含する。
それはまさに、IL−15Rベータ/ガンマ陽性細胞の増殖および活性化、もっと詳しく言えばナイーブなNKおよび/またはT細胞由来のNKおよび/またはT細胞の分化を誘導および/または刺激することが自然に自力で可能である。
用語『有効成分』は、免疫応答を誘起し得る物質を定義することを意図している。
それゆえに、誘導された他の免疫応答に関連するアジュバントとして用いようと、または免疫応答を自然に自力で誘導する有効成分として用いようと、本発明の化合物は免疫応答の強さおよび/または持続時間を改善する。それは好都合には:
−先天性免疫応答の改善を誘導し、
−適応免疫応答の改善、もっと詳しく言えばCD8メモリー応答の改善を誘導する。
−本明細書で定義した本発明の化合物、
−本発明の核酸、
−本発明のベクター、
−本発明の宿主細胞
の中で少なくとも1つの要素を含むアジュバント組成物に関する。
そのスシドメインを保持した可溶IL−15Rアルファ分子またはそのフラグメントを提供する工程、
それを、天然IL−15の結合親和性よりも有意に低くはないIL−15Rベータ/ガンマ結合親和性を有し(IL−15Rベータ/ガンマに結合するため、天然IL−15および/またはIL−2と競合可能である)、また、好適にIL−2Rアルファに結合しないIL−15、IL−15フラグメント、アゴニストまたは模倣体から選択されたIL−15Rベータ/ガンマ結合要素に共有原子価で結合させる工程、
を含み、
これらによって、これらに起因する化合物は免疫治療組成物のアジュバントである。
○ IL−15Rアルファのスシドメインが、最初のエクソン2にコードされたシステイン残基(C1)で開始し、第4のエクソン2にコードされたシステイン残基(C4)で終了し、残基C1およびC4は共にスシ配列に含まれていると定義されている、前記IL−15Rアルファのスシドメインを保持しているヒトIL−15Rアルファまたはそのフラグメントの細胞外領域のアミノ酸配列であるか、あるいは
○ 前記スシドメインの4つのシステイン残基(C1、C2、C3およびC4)がそれぞれ保持されていれば、該IL−15RアルファまたはIL−15Rアルファフラグメント配列に少なくとも85%同一である。
好ましくは同一性の前記割合は少なくとも90%、いっそうさらに好ましくは少なくとも92%、最も好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%である。
本発明はもっと詳しく言えば、本明細書に定義したIL−15Rアルファのスシドメインを含有する少なくとも1つのポリペプチドを含む組成物、医薬組成物または薬剤に関しており、ここで前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドは、スシドメインを保持しているエクソン2および3にコードされた細胞外IL−15Rアルファの一部または該部分のフラグメントを含むか、あるいはそれから成る。
好ましくは、本発明は:
−そのアミノ酸配列が配列番号3の位置1から位置127まで拡張しているアミノ酸であるヒトIL−15Rアルファフラグメント、または
−前記フラグメントのスシドメインを保持しているそのサブフラグメント
を含む組成物、医薬組成物または薬剤に関しており、ここでは:
−前記スシドメインは、最初のエクソン2にコードされたシステイン残基(C1)で開始し、第4のエクソン2にコードされたシステイン残基(C4)で終了し、残基C1およびC4は共にスシドメインに含まれていると定義され、
−前記シグナルペプチドのアミノ酸配列は、前記配列番号3の位置1から位置30まで拡張している配列であり、
−前記フラグメントまたはサブフラグメントの変異体は、前記フラグメントまたはサブフラグメントの全長にわたって少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有する。
好ましくは同一性の前記割合は少なくとも90%、いっそうさらに好ましくは少なくとも92%、最も好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%である。
該組成物、医薬組成物または薬剤はさらに、本明細書で定義したIL−15またはIL−15フラグメントまたは変異体などの、少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素を含んでよい。
前記少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素は前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドに共有原子価で結合することができず、すなわち遊離形態で前記組成物に位置し、および/または前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドに共有原子価で結合することが可能である。後者では、本発明の組成物、医薬組成物または薬剤は実際、本明細書で定義した本発明の化合物を含む。
該医薬組成物または薬剤は、NKおよび/またはT免疫応答の増加および/または活性化を誘導および/または刺激することを目的とし得る。
該医薬組成物または薬剤は、予防および/または緩和および/または治療のワクチン組成物を目的とし得る。
該医薬組成物または薬剤は、感染病の予防および/もしくは緩和および/もしくは治療、ならびに/または免疫不全(HIV誘導免疫不全など)の予防および/もしくは緩和および/もしくは治療、ならびに/または腫瘍の成長または存在の予防および/もしくは緩和および/もしくは治療(および少なくとも1つの腫瘍抗原を含有してよい)、ならびに/またはX−SCIDの予防および/もしくは緩和および/もしくは治療を目的とし得る。
本発明の好ましい一実施態様にしたがって、前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドは、天然IL−15の結合親和性よりも有意に低くはないIL−15Rベータ/ガンマ結合親和性を有する、IL−15、またはIL−15フラグメント、模倣体もしくはアゴニスト(すなわちIL−15Rベータ/ガンマに結合するため、天然IL−15および/またはIL−2と競合可能であるフラグメント、模倣体またはアゴニスト)であるIL−15Rベータ/ガンマ結合要素に共有結合する。
−本発明の化合物、
−本発明の核酸、
−本発明のベクター、
−本発明の宿主細胞
の中で少なくとも1つの要素を含むことを特徴としている。
該医薬組成物はさらに、医薬的に適切なビヒクル(担体、希釈剤、賦形剤、添加剤、pH調整剤、乳化剤または分散剤、保存剤、界面活性剤、ゲル化剤ならびに緩衝剤、他の安定剤および可溶化剤等)を含んでよい。
−本発明の化合物、
−本発明の核酸、
−本発明のベクター、
−本発明の宿主細胞
の中で少なくとも1つの要素を含むことを特徴としている。
前記薬剤は免疫治療組成物であることが好ましい。
該薬剤は、予防および/または緩和および/または治療用ワクチン組成物であることが最も好ましい。
前記薬剤はさらに、生理学的に適切なビヒクル(担体、希釈剤、賦形剤、添加剤、pH調整剤、乳化剤または分散剤、保存剤、界面活性剤、ゲル化剤ならびに緩衝剤、他の安定剤および可溶化剤等)を含んでよい。
前記腫瘍は、例えばメラノーマ、リンパ球、癌腫(例えば子宮頸癌)、乳癌、卵巣癌、膵臓腫瘍であり得る。
好都合にも、前記抗腫瘍薬は、トランス提示を解して作用する抗腫瘍ワクチンである。
本発明の抗腫瘍薬はさらに、少なくとも1つの腫瘍抗原を含むことができる。前記少なくとも1つの腫瘍抗原は可溶形態であるか、あるいは本発明の化合物に(共有原子価または他の結合形態によって)結合することが可能である。前記少なくとも1つの腫瘍抗原は好都合にも、該抗原のある樹状細胞、例えば前記少なくとも1つの腫瘍抗原を発現する遺伝子改変樹状細胞の形態で提供される。
腫瘍抗原は腫瘍細胞のみに提示され、正常細胞に提示され得ないことがある。この場合、それらは腫瘍特異性抗原(TSA)または腫瘍特異性移植抗原(TSTA)または腫瘍拒絶抗原(TRA)と称され、典型的に腫瘍特異的突然変異に起因している。感染ウイルスが細胞を不死にし、ウイルス抗原を発現するようにさせると、通常TSAが現れる。ウイルスに誘導されないTSAは、B細胞リンパ腫のBCRまたはT細胞リンパ腫のTCRのイディオタイプである。
癌遺伝子は発癌性ウイルス内で発現する場合がある。ほとんどの癌遺伝子は実際宿主細胞に存在し、ここでそれらは細胞成長の調節に機能している。ウイルスに誘導され、ウイルスプロモーターの制御下で発現された場合、宿主細胞遺伝子の生成物、すなわち癌原遺伝子の生成物は、腫瘍細胞の成長を無制限にする。癌原遺伝子にコードされたタンパク質は通常、正常細胞に発現することから、腫瘍細胞上で過剰発現すればそれらは腫瘍関連抗原と見なされる。
これらの抗原を認識した細胞毒性Tリンパ球は、増殖または転移する前に腫瘍細胞を破壊し得る可能性がある。しかしながら腫瘍細胞はMHCクラスI発現を下方制御する場合がある。それらは、T CD8+細胞と相互作用するのに必要なB7のような共刺激分子または接着分子を欠いていることが多い。細胞免疫を阻害するTGFベータなどの抑制サイトカインを生成することで免疫応答を活性的に抑制する腫瘍細胞もある。
−サイクリン依存キナーゼ4などの細胞サイクル制御因子(メラノーマ)、
−ベータ−カテニンなどのシグナル変換器(メラノーマ)、
−カスパーゼ−8などのアポトーシス調節因子(扁平上皮癌)、
−MAGE抗原などの精巣タンパク質(メラノーマ、乳房腫瘍、グリオーマ腫瘍)、例えばMAGE−1(アクセッション番号P43355)、MAGE−2(アクセッション番号P43356)、MAGE−3(アクセッション番号P43357)、MAGE−4(アクセッション番号P43358)、MAGE−6(アクセッション番号P43360)、MAGE−8(アクセッション番号P43361)、MAGE−9(アクセッション番号P43362)、MAGE−10(アクセッション番号P43363)、MAGE−11(アクセッション番号P43364)、MAGE−12(アクセッション番号P43365)、
−チロシナーゼ(アクセッション番号P14679)などのメラニン合成に関与する化合物(メラノーマ)、
−表面IgイディオタイプなどのBCRイディオタイプ(リンパ腫)、
−Her−2/neu、MUC−1などのチロシンキナーゼ受容体(乳癌および卵巣癌)
−MUC−1などのグリコシル化不十分のムチン(乳房腫瘍、膵臓腫瘍)、
−HPV E6およびE7などのウイルス遺伝子生成物(子宮頸癌)。
本発明の方法にしたがって同定された治療に有用な化合物は、特定の化合物に適した任意の方法で患者に、例えば経口、静脈内、非経口、経皮、経粘膜的に、もしくは化合物の効果を必要とする部位に、あるいはその近傍に(例えば、固形または半固形の生物学的に適合可能かつ吸収性のマトリックスの形態での化合物で)手術または移植で投与してよい。治療量は当業者により適宜判断され、体重の関数である。
−IL−15Rベータ/ガンマ陽性細胞を以下の要素:
−本発明の化合物、
−本発明の核酸、
−本発明のベクター、
−本発明の宿主細胞
の少なくとも1つと接触させる工程を含み、このことによって、前記IL−15Rベータ/ガンマ陽性細胞の増殖および/または活性化が誘導および/または刺激される。
前記接触は、前記IL−15Rベータ/ガンマ陽性細胞の増殖および/または活性化を可能にする条件下で行われる。該条件には、期間および環境条件(温度、大気、培地)が特に挙げられる。該条件の調整は、当業者の適性に従う。
本発明はまた、IL−15Rベータ/ガンマ陽性細胞の増殖および/または活性化を誘導および/または刺激するインビトロでの方法に関するものであり、該方法は:
−IL−15Rベータ/ガンマ陽性細胞を含む細胞試料を提供する工程、
−前記試料を以下の要素:
−本発明の化合物、
−本発明の核酸、
−本発明のベクター、
−本発明の宿主細胞
の少なくとも1つと接触させる工程を含み、該接触は、前記IL−15Rベータ/ガンマ陽性細胞の増殖および/または活性化を誘導および/または刺激することを可能とする期間および環境条件下であることを特徴とする。
−静止NKおよび/またはT細胞を以下の要素:
−本発明の化合物、
−本発明の核酸、
−本発明のベクター、
−本発明の宿主細胞
の少なくとも1つと接触させる工程を含み、該接触は、前記試料に含まれる前記静止NKおよび/またはT細胞の活性化を誘導することを可能とする期間および環境条件下であることを特徴とする。
本発明はまた、活性化NKおよび/またはT細胞を生成するインビトロでの方法に関するものであり、該方法は:
−静止NKおよび/またはT細胞を含む細胞試料を提供する工程、
−前記試料を以下の要素:
−本発明の化合物、
−本発明の核酸、
−本発明のベクター、
−本発明の宿主細胞
の少なくとも1つと接触させる工程を含み、該接触は、前記試料に含まれる前記静止NKおよび/またはT細胞の活性化を誘導することを可能とする期間および環境条件下であることを特徴とする。
したがって用語「含んでいる」(または「含む」)は、用語「から成っている」(「から成る」)ならびに用語「本質的に〜から成っている」(「本質的に〜から成る」)を含む。したがって、用語「含んでいる」(または「含む」)は本出願では、もっと詳しく言えば、用語「から成っている」(「から成る」)および用語「本質的に〜から成っている」(「本質的に〜から成る」)を包含していることを意味する。
実験手順
細胞培養およびサイトカイン−
組換えヒトIL−15(rIL−15)をPeprotech Inc(Rocky Hill, NJ)から購入した。Mo−7骨髄性白血病細胞系(IL−15Rβ/γは発現するがIL−15Rαは発現しないヒト細胞系)およびTF−1赤白血病ヒト細胞系(IL−15RαおよびIL−15Rγは発現するがIL−15Rβは発現しない細胞系;ATCC CRL−2003)を10%の熱不活性ウシ胎仔血清(FCS)、2mMのグルタミンおよび1ng/mlのGM−CSF(R&D Systems; Abington, UK)を含有しているRPMI1640培地中で培養した。TF−1−β細胞(22)は、250μg/mlのジェネテシン(geneticin)を補充した同じ培地中で培養した。Kit225ヒトTリンパ腫細胞系(IL−2依存細胞系)を6%のFCS、2mMのグルタミン、10ng/mlのrIL−2(Chiron; Emeryville, CA)を含有しているRPMI1640培地中で培養した。
内因性マウスIL−15Rγ鎖およびトランスフェクションされたヒトIL−15Rβ鎖(ATCC CRL−11346から入手可能な32D細胞系)を発現するマウス32Dβ細胞系をRPMI、10%FCS、0.4ng/mlのm−IL−3、10μg/mlのb−メルカプトエタノール、250μg/mlのジェネテシン中で培養した。
sIL−15Rα−IL−2をCHO細胞で発現させ、(23)に記載のとおりに調製した。IL−15Rα(成熟コーディング配列のアミノ酸1〜66)のスシドメインをヒトIL−2(sIL−15Rα−スシ−IL−2)の分子に結合した同様の構造を作成した。
IL15Rαのスシ−ドメインをPCRで増幅した。PCR生成物を精製し、BamHIおよびHindIII(Fermentas, Vilnius, Lithuania)で消化し、pQE30発現ベクターにライゲーションした。IPTG誘導下、大腸菌SG13009細胞中で発現を行った。細胞溶解後、封入体を洗浄し、6mMのグアニジンHCl、20mMのリン酸ナトリウム、pH7.4、20mMのイミダゾール、150mMの塩化ナトリウムおよび1mMのDTT中で可溶化した。IL−15Rα−スシは、1mMの還元グルタチオンおよび0.2mMの酸化グルタチオンを加えた可溶化バッファーで平衡化したNi−NTAアガロースカラム(Qiagen)に捉えた。それを、カラムバッファー(24)中、6から0MのグアニジンHClの勾配を介してリフォールディングし、250mMのイミダゾールで溶出した。
融合タンパク質の構造を図2Eに示す。ヒトIL−15Rαスシドメイン(aa1−77)およびヒトIL−15を、RLIではリンカー20
、またはILRではリンカー26
によって分離した。
FlagエピトープおよびFactor Xa結合部位
をコードする配列はシグナルペプチド(sp)とコーディング配列間に付加した。RLIにはヒトIL−15Rα(配列番号5)の内因性spを、ILRにはウシプレプロラクチン(配列番号58)のspを使用した。
これらの構造を、pFastBac1(InVitrogen)発現ベクターのBamHIおよびHindIII間に挿入して2つの発現ベクターを生成し、それをBac-Bac発現システム(InVitrogen)を使用したバキュロウイルスDNA中で組換えた。組換えバキュロウイルスを使用してSF9細胞(ATCC CRL−1711)を感染させ、融合タンパク質をSF900II培地(GibcoTM Invitrogen Corp.)で発現させ、感染から4日後に回収した。融合タンパク質の濃度は、捕捉抗体として抗IL−15mAb247(R&D Systems)および露出抗体として抗FlagM2ペルオキシダーゼ接合体(Sigma; St Louis, MO)を用いてELISAで測定した。
これらの実験はBIACore2000バイオセンサー(BIACore, Uppsala, Sweden)を用いて行った。rIL−15をCM5センサーチップに共有結合させ、上昇濃度のsIL−15Rα−IL2、sIL−15Rα−スシ−IL−2またはsIL−15Rα−スシの結合を監視した。BIAlogue動力学評価ソフトウエアを用いてセンサーグラムの分析を行った。
無サイトカイン培地での48時間の培養および16時間の[3H]−チミジンとの培養の4時間後、(19)の記載どおりに、Mo−7、TF−1βおよびKit225細胞のrIL−15、rIL−2、RLIまたはILRに対する増殖応答を[3H]−チミジン取り込みにより測定した。
アネキシンVアッセイを、FACScanフローサイトメーターおよびAnnexin V-FITC Apoptosis検出キット(BD Biosciences Pharmingen、フランス)を使用して行った。サイトカイン欠乏後、細胞を、1ml中5.105細胞個/ウェルでマルチウェルプレートに播種し、様々な反応物(rIL−15、sIL−15Rα−スシおよびRLI融合タンパク質を補充した培地で培養した。CellQuestソフトウエアを使用してデータを得、分析した。
ヒトrIL−15、sIL−15Rα−スシおよびRLI融合タンパク質を[125I]−ヨウ素で標識化し、次いで結合実験を前述の(19)のとおりに行った。内部移行には、4℃で標識sIL−15Rα−スシまたはRLIを用いて細胞を平衡化し、温度を37℃に変更した。異なる時間間隔で、2つの試料を洗浄し、遠心分離した。細胞ペレットの1つを0.2Mのグリシン−HClバッファー、pH2.5で処理し、他方をPBS、pH7.4で4℃で5分間処理した。遠心分離後、総リガンド結合を、PBSで処理した細胞ペレットから測定し、一方、膜結合画分および内部移行画分をそれぞれ、酸pHで処理した上清および細胞ペレットから測定した。
IL−15に結合しているIL−15Rαは主にスシドメインに起因する−
前述の研究(25)では、IL−15Rのエクソン2にコードされた「スシ」ドメインを除去するとIL−15の膜固定IL−15Rαへの結合が完全に抑止されたことが示され、このことからスシドメインが結合に必須であることが分かる。IL−15結合におけるスシドメインの寄与を直接測定するため、細胞外ドメイン全体またはN末端スシドメインのみを含有しているIL−15Rαの可溶形態が調製され、IL−15結合について競合アッセイおよび表面プラズモン共鳴(SPR)技術で検定された。
図1Aに示すとおり、CHO細胞で生成され、ヒトIL−2の分子(精製用タグとして使用)に結合した全IL−15Rα細胞外ドメインを有するsIL−15Rα−IL−2融合タンパク質は、高親和性(kon=3.7 105M−1s−1;koff=1.4 10−5s−1;Kd=38pM)でIL−15に結合した。IL−15RαのスシドメインをヒトIL−2に結合させている同様の構造もIL−15に結合したが(図1B)、親和性は10倍低く、これは主に反応速度が速かったためである(kon=3.1 105M−1s−1;koff=1.3 10−4s−1;Kd=420pM)。
可溶スシドメインは大腸菌でも生成した。このsIL−15Rα−スシも低親和性(kon=2.5 105M−1s−1;koff=3.8 10−4s−1;Kd=1.5nM)でIL−15に結合した(図1C)。
これらの結果から、スシドメインはIL−15の結合親和性の大部分に関与しているが、全長細胞外ドメインに提示された高親和性結合を完全には再構成しないということが示される。
図1Eに示すとおり、ヒンジ領域と呼ばれる、エクソン3にコードされた最初の13個のアミノ酸まで拡張している可溶スシドメインの結合親和性は、sIL−15Rα−スシ−IL−2と比較して4倍増加しており、これは非拡張スシドメインも含有しており、また、全長可溶IL−15Rαよりわずか3倍低い親和性を示し、この時3つの構築物はすべて、類似の折りたたみ能を有する真核系で生成した。これらの結果から、ヒンジ領域まで拡張したスシドメインは全長細胞外ドメインに提示された高親和性結合をほとんど完全に再構成するということが分かる。
様々な可溶IL−15Rαタンパク質に対して算出されたIL−15(KD)の親和定数および統計的試験定数(Chi2)を与えるセンサーグラムの分析結果を以下の表3に示す。
放射性ヨウ化IL−15と結合せずに、IL−15Rγ鎖も発現するがIL−15Rβ鎖は発現しないヒト細胞系TF−1に発現されたIL−15Rαと競合する能力について、3つの可溶形態のIL−15Rαを試験した(図1D)。3つのタンパク質は、SPR技術で測定されたKdに類似したそれぞれのIC50:100pM(sIL−15R(−IL−2)、270pM(sIL−15Rα−スシ−IL−2)および1.3nM(sIL−15Rα−スシ)で、TF−1細胞に結合しているIL−15を阻害した。
可溶スシドメインは容易に、高収率にて大腸菌内で生成したために、さらなる研究のすべてに対して選択した。最初の例では、IL−15Rβ/γ複合体を発現するだけの細胞系で試験した(内因性マウスIL−15Rγ鎖およびトランスフェクションされたヒトIL−15Rβ鎖を発現するヒトMo−7細胞系およびマウス32Dβ細胞系)。予想どおり、Mo−7細胞系は、ナノモル濃度のrIL−15またはrIL−2に応答して増殖した(図2Aおよび2B)。予想外に、固定濃度のsIL−15Rα−スシ(10nM)をアッセイに加えると、低濃度のrIL−15に対して増殖反応が約4倍増加した。sIL−15Rα−スシは増殖反応を自力では誘導しなかった。32Dβでは、約10倍の推移で、同様の結果が得られた。sIL−15Rα−スシはMo−7細胞のrIL−2駆動型増殖に影響を及ぼさないという事実により特異性を評価した(図2B)。sIL−15Rα−スシが、増殖効果を単独ではわずかしか誘導しない固定濃度(1nM)のrIL−15の効果を、用量依存的に、IL−15のそのKdに類似したIC50(3.5nM)で高めることが、図2Cに示されている。
スシのIL−15生物活性に対する相乗効果が単一分子へ移行することが可能かを評価するために、IL−15とスシドメインを結合する融合タンパク質をコードする分子構築物を合成した。該2つの構造には、柔軟なリンカーを、IL−15のC末端とスシドメイン(ILR)またはその逆(RLI)のN末端間に誘導した(図2E)。これらのタンパク質の構造を説明する分子モデルを図2Fに示す。これらの2つの融合タンパク質をMo−7細胞の増殖について試験した。
図2Dに示すとおり、両タンパク質は、類似の(約25pM)EC50およびrIL−15単独(3nM)またはrIL−15とsIL−15Rα−スシの等モル混合物(0.9nM)のEC50よりはるかに低いEC50で、Mo−7細胞の増殖の用量依存的誘導を誘発した。これらの結果はさらに、IL−15作用に対するsIL−15Rα−スシの相乗効果を支持し、IL−15:sIL−15Rα−スシ複合体を共有結合リンカーで安定させると、この相乗作用が顕著に高められるということを示唆している。
サイトカイン離脱に続き、アポトーシス性Mo−7細胞の画分は48時間後に10%から80%まで増加した(図3A、グラフaおよびb)。時点0で添加した場合、rIL−15(5nM)はこのアポトーシスを70%まで低下させた(図3A、グラフc)。単独では、sIL−15Rα−スシ(10nM)は効果を示さなかった(図3Ab)。しかし、それはrIL−15の抗アポトーシス効果を著しく高めた(48時間で35%のアポトーシス)(図3A、グラフc)。IL−15のアポトーシス阻止に対するsIL−15Rα−スシの相乗効果は動態解析(図3B)および用量反応曲線(図3C)によって支持される。rIL−15は、約1.5nMのIC50、IL−15β/γ受容体の飽和度に一致する値で挙動した。10nMのsIL−15Rα−スシ存在下で、このIC50は約10倍低かった(170pM)。RLI融合タンパク質はアポトーシスを著しく阻止した(図3B)。モルベースではそれは、約40pMのIC50でIL−15:sIL−15Rα−スシ会合体より活性的でさえあった(図3C)。
予想どおり、Mo−7細胞は、中等度親和性(Kd=13.5nM)、800部位/細胞の最大結合能でIL−15に結合した(図4A)。sIL−15Rα−スシ(10nM)を添加すると、最大結合能(1180部位/細胞)にさほど影響を及ぼすこともなくIL−15結合の親和性(Kd=7nM)が増加した。放射性ヨウ化RLI融合タンパク質を使用した場合(図4B)、それは同様の同数の受容体部位(730部位/細胞)に結合し、結合の親和性(Kd=780pM)がIL−15のものより著しく高まっていることを本発明者らは見出した。図4Cから、RLIが効率的に素早く内部移行し得ることが分かる。細胞画分の結合放射活性は約20分で減少し、続いて同時に細胞内放射活性が上昇した。
ヒトリンパ腫細胞系Kit225は内因性IL−15Rα、βおよびγ鎖を発現し、ヒトTF−1β細胞系は内因性IL−15Rαおよびγ鎖、その上トランスフェクションされたヒトIL−15Rβ鎖を発現する。したがって、図5Aおよび5B(それぞれEC50=19pMおよび21pM)に示すとおり、低い、ピコモル濃度のIL−15に応答して、これらの細胞系は増殖する。Mo−7または32Dβ細胞に見られるものと対照的に、等モルのsIL−15Rα−スシをIL−15に添加しても、どの細胞型のIL−15用量反応曲線にもさほど影響はなかった。ILR融合タンパク質は、2つの細胞系に対してrIL−15と同等に活性であった。RLIもまた、Kit225細胞に対してrIL−15と同等に活性であったが、TF−1β細胞に対してはrIL−15より約16倍効率的(EC50=1.2pM)あった。
sIL−15Rα−スシおよびRLIの効果をさらに、サイトカイン欠乏により誘導したTF−1β細胞アポトーシスについて分析した。ヒストグラムを図5C(グラフa、b、cおよびd)に示す。一方、反応速度および用量反応曲線を図5Dおよび5Eにそれぞれ示す。rIL−15は、用量および時間に依存的に、TF−1βアポトーシスを阻害した。sIL−15Rα−スシは単独では効果がなく、IL−15の効果を変化させることはなかった。ILR融合タンパク質はrIL−15と同等に活性であり、一方、RLIは、rIL−15のものより約3倍高い保護効果を有していた(rIL−15またはsIL−15Rα−スシおよびrIL−15に対する6.5pMの代わりに、RLIにはIC50=2.5pM)。
IL−15Rα−スシがTF−1βのIL−15増殖に影響を及ぼさない範囲で、本発明者らは、広範な濃度で分析したIL−15結合に対するその効果を試験した(図6A)。飽和結合曲線のスキャッチャード分析から、少数の高親和性結合部位(IL−15Rα/β/γ複合体、Kd=22pM、Bmax=100部位/細胞)ならびに多量の中等度親和性結合部位(IL−15Rβ/γ複合体、Kd=30nM、2800部位/細胞)の存在と適合するIL−15結合部位に2つのクラスがあることが示された。sIL−15Rα−スシはIL−15結合の増加を誘導し、この結合はスキャッチャード分析で主に中等度親和性成分に対するIL−15結合の親和性(Kd=3.5nM)の増加に起因しているとされた。高親和性成分に対するsIL−15Rαの効果をさらに具体的に試験するために、低濃度の放射性標識したIL−15でその効果を分析した。図6Bに示すように、sIL−15Rα−スシは25nMの濃度まで、高親和性受容体を主に標的にする低濃度IL−15(200pM)のIL−15結合に影響を及ぼさなかった(図6B)。
放射性標識したsIL−15Rα−スシのTF−1β細胞への結合(図6C)は、rIL−15の存在に完全に依存している特異的結合成分を示した。1nMのrIL−15の存在下で、sIL−15Rα−スシ結合を反映するKdは、IL−15に対するその親和性と適合する値3.5nMであり、最大結合能(3300部位/細胞)は多数のIL−15中等度結合部位と適合していた。さらに図6Dに示すように、放射性標識したsIL−15Rα−スシは効率的に内部移行した。放射性標識したRLI融合タンパク質はまた、TF−1β細胞に結合した(図6E)。単一特異的結合成分は250pMのKdで見られ、最大能力(4000部位/細胞)は再度、多量のIL−15中等度親和性結合部位に適合可能であった。いったん結合すると、RLIもまた効率的に内部移行した(図6F)。
ヒトIL−15Rαのエクソン2の欠失はIL−15結合を完全に抑止し、サイトカイン認識においてスシドメインの不必要な機能を示すことが以前に示された(25)。IL−15Rα(sIL−15Rα−IL−2融合タンパク質の文脈において)の細胞外部分のC末端尾部(エクソン3から5)を除去すると、SPRではIL−15に対する結合親和性が10倍減少し、競合アッセイではその親和性は3.5倍減少することが、本発明で示されている。
熱力学に関しては、親和性の10倍の減少が算出され、IL−15のIL−15Rαとの相互作用の自由エネルギーの10%損失に対応していた。したがって、エクソン2(スシドメイン)にコードされたN末端構造ドメインは、大部分(90%)ではあるがすべてではないIL−15結合能を有している。本発明者らの研究室の近年のデータから、エクソン3にコードされたドメインもIL−15結合に寄与することが示されている。
大腸菌で生成されたsIL−15Rα−スシの親和性は、CHO細胞で生成されたsIL−15Rα−スシ−IL−2のものより3から4倍低かった。スシドメインがNまたはO結合グリコシル化の可能性がある任意の部位を含有していない限り、この差異は2つのタンパク質のグリコシル化状態の違いでは説明できない(2)。したがって、それは2つのタンパク質の構造的折りたたみの違いに起因している可能性がある。
膜IL−15Rαに結合しているIL−15と競合している一方で、sIL−15Rα−スシはIL−15β/γ複合体を介したIL−15作用を促進することでアゴニスト効果を発揮することが見出された。中等度親和性IL−15受容体(Mo−7、32Dβ)単独か、あるいは高親和性および中等度親和性IL−15受容体(TF−1β、Kit225)の両方を発現する細胞の研究から、sIL−15Rα−スシのアゴニスト作用はIL−15Rβ/γ複合体に特異的に向けられたものであることが示された:(i)それはIL−15の非存在下では効果がなく、(ii)それはIL−15の存在下で、中等度IL−15結合部位のものと匹敵する密度である結合部位の単一親和性クラスで、TF−1β細胞と結合し、(iii)Mo−7細胞およびTF−1β細胞では、それは、IL−15Rβ/γ複合体に対するIL−15の親和性を増加したが、TF−1β細胞での高親和性複合体へのIL−15の結合に影響を及ぼさず、(iv)Mo−7細胞のIL−15β/γを介してそれはIL−15生物学的作用(増殖、アポトーシスの阻止)の効率を促進したが、TF−1β細胞の高親和性受容体を媒介した同様の生物学的効果に影響を及ぼすことはなかった。
このアゴニスト作用の機能性は、sIL−15Rα−スシがいったんIL−15と結合してMo−7細胞のIL−15Rβ/γに結合すれば、高効率に細胞内部移行するという事実によってさらに支持された。その可能性はILRおよびRLI融合タンパク質を考慮すると、高まった:(i)RLIは、IL−15自体よりほとんど20倍の親和性でIL−15Rβ/γに結合した。(ii)RLIの結合に次いで、融合タンパク質が迅速に内部移行した。(iii)RLIまたはILR融合タンパク質は、機能アッセイにおいてIL−15より極めて強力であった。Mo−7細胞の2つの融合タンパク質の用量反応曲線はKit225またはTF−1β細胞の高親和性受容体を介したIL−15の曲線に匹敵しており、これらの融合タンパク質が中等度親和性受容体のみを発現する細胞の高親和性応答をほとんど完全に再構成することが示された。
したがって、結果として、sIL−15Rα−スシおよびIL−15は複合体を形成し、共同でIL−15Rβ/γ受容体への結合親和性を増加させるということが分かった。対照的に、いったん後者が膜高親和性受容体複合体と会合していれば、sIL−15Rα−スシはIL−15結合および生物活性に影響を及ぼすことができない。しかし、sIL−15Rα−スシがこの高親和性複合体にすでに関与しているIL−15にまだ結合可能であるかを考慮しないわけにはいかず、主に高親和性受容体を発現する細胞、すなわち類似したレベルの3つの受容体サブユニットを発現する細胞の有用性で試験することが可能であった。
本発明者らの研究室では以前、COS細胞で発現した、またはIL−15Rα陽性細胞により自然生成されたsIL−15Rαが、高親和性(Kd=166pM)でIL−15を結合し、低濃度(3から10pMのIC50)でKit225細胞のIL−15誘発性増殖を阻害することで強力なアンタゴニストとして挙動することを示している(19)。本発明と対照的に、これらの結果は、sIL−15Rα−スシはKit225細胞またはTF−1β細胞の増殖には影響を及ぼさず、Mo−7細胞に対するアゴニストであることを示している。
他の対照的な結果として、組換えヒトsIL−15Rα(エクソン3欠損)−Fcホモ二量体キメラとのrIL−15の混合物はMo−7細胞への抗アポトーシス効果を誘導することが可能であるが、同用量のrIL−15単独では効果がないという近年の報告がある(26)。
これらの作用の違いを説明しようと、あるモデルが本特許出願の図7に提案されている。高親和性IL−15応答を考慮すると、sIL−15Rαは、IL−15の補充に対する膜IL−15Rαの競合者として作用する(図7A)。反して、sIL−15Rα−スシとIL−15との複合体は膜IL−15Rβ/γと会合し、IL−15の生物学的効果を高め得る(図7B)。高親和性受容体を考慮するとsIL−15Rα−スシに阻害効果がないことを明らかにするために、2つの代案が挙げられる(図7C)。第1の代案によれば、sIL−15Rα−スシのIL−15に対する親和性(本書ではKd=1.5nM)はsIL−15Rα(Kd=160pM)より低く(19)、したがってKit225またはTF−1β細胞の膜IL−15Rαと効率的に競合することができない。第2の代案によれば、sIL−15Rα−スシはIL−15への結合において膜IL−15Rαと競合し、Mo−7細胞で形成されるものと類似したIL−15Rβ/γとの複合体を形成することが可能である。IL−15が活性化されるより高い濃度(高親和性受容体の20pMの代わりにIC50=750pM、図2および5)を必要とすることから、該複合体は効率的ではない。しかし、IL−15Rβ/γがKit225またはTF−1β細胞のIL−15Rαに対して過剰に存在していることを踏まえると、該複合体の低い効率はその高密度(TF−1β細胞の100個の高親和性受容体の代わりに約3000個の中等度親和性受容体、図6を参照)により補償することが可能であった。この結果、生物学的効果に関して変化は見られなくなる。しかしながら、sIL−15Rα−スシはTF−1β細胞のIL−15高親和性結合に影響を及ぼさないという本発明者らの見解(図6B)は第1の代案を支持する。
sIL−15RαおよびsIL−15Rα−スシ間の機能的差異から、sIL−15RαのC末端尾部が膜IL−15Rαとの競合、ひいてはsIL−15Rαのアンタゴニスト作用に重要な役割を担っていることが分かる。この尾部は、IL−15Rβ/γとの可溶IL−15Rαの会合を妨げるか、あるいは該会合を可能にするものであるが、機能するためにIL−15Rβ/γが不適切な立体配座になる。可溶性の一般的なγ鎖の場合では類似したメカニズムが提案されている(27)。この(γ鎖の全細胞外部分に対応する)可溶γ鎖の阻害活性は、C末端部分の除去またはWSXWSモチーフの突然変異によって破壊された。この2つの領域はサイトカイン結合に関与していない。
スシのアゴニスト効果は、拡大したサイトカインのIL−6ファミリー(すなわちsIL−6R、sIL−11R、sCNTFRおよびIL−12p40サブユニット)内で可溶受容体について記述したアゴニスト効果を想起させる(28)。しかし、これまでγcファミリー(sIL−2Rα、sIL−2Rβ、sIL−4R)内で記述していた可溶受容体すべて、およびsIL−15Rα自体がサイトカインアンタゴニストとして挙動する限り、該アゴニスト作用は、IL−15Rの場合、予測不可能である(19、29)。したがって本結果により、IL−15Rαの可溶スシドメインがこのファミリー内の予想外かつ高効率のアゴニストであることが確認された。
サイトカイン移行シグナル伝達の概念は、IL−6の場合に最初に使用され、この概念では可溶IL−6Rは、IL−6反応性細胞のIL−6の作用に対する感受性を高め、細胞を、gp130は発現するがIL−6に対して反応する膜IL−6Rは発現しないようにするということが分かった(30)。この概念はgp130サイトカインファミリー(IL−11R、CNTFR、CLC)の他のメンバーにまで拡大されている(31〜34)。IL−15の場合、サイトカインのトランス提示のメカニズムが示されており(12)、ここでは単球/樹状細胞に生成されたIL−15は同様の細胞によって発現された膜IL−15Rαに会合し、IL−15Rβ/γ+IL−15Rα−バイスタンダー細胞の増殖を刺激し得る。近年の報告では、トランス提示は、同様の細胞によるIL−15およびIL−15Rαの発現を必要とするインビボにおける主力のメカニズムであることが示唆されている(13、14、35、36)。それは移行シグナル伝達の概念にやや似通っており、この概念では、トランス提示されたIL−15/IL−15Rα複合体はIL−15Rβ/γ+IL−15Rα−細胞をIL−15の生理学的濃度に対して感受性を持たせるようにすることが可能である。この点では、膜IL−15Rαは、そのIL−15Rβ/γ複合体への結合活性およびシグナル伝達の効率を高めることでIL−15作用のアゴニストとして作用する(12)。本発明者らのデータから、sIL−15Rα−スシは同様に挙動し、IL−15Rβ/γ+IL−15Rα−細胞をIL−15の作用に対して感受性を持たせるようにすることが分かる。このことから、膜IL−15Rαのスシドメインがトランス提示に不可欠なものであることが示唆される。本発明者らはIL−15Rα発現細胞に生成され、IL−15Rαの全細胞外部分を包含するsIL−15RαがIL−15作用に抑制的であることを示している(19)。それは、IL−15の生物学的効果を限定する負のフィードバック機構を構成する傾向にある。対照的に、本研究で記述されたsIL−15Rα−スシは、アゴニスト効果を示す。該可溶スシがIL−15Rα発現細胞によって生成されれば、IL−15トランス提示機構に関与することが可能であろう。該自然に生成される可溶スシドメインの存在は未だ記述されていないが、(i)スシドメインを膜透過ドメインへ結合させる(エクソン3から5にコードされた)尾部が欠損しているものも含む膜IL−15Rαの様々なイソ型が記述されている事実(3、25、37)、および(ii)それらのいくつかの可溶対応物の、分断による生成が解明されてきた事実(19)により支持されている。したがって、sIL−15RαおよびsIL−15Rα−スシは相反する調節作用を有し、そのようなものとして両者はIL−15生物学的作用の規模および持続時間を調整することに関与することが可能であった。
本発明はまた、ILRまたはRLIなどの融合タンパク質を生成する柔軟なリンカーを使用することはIL−15の場合、有効な手段であることを示している。スシドメインを有するIL−15の分子モデルが生成され(図2)、IL−15のC末端をスシのN末端(ILR融合タンパク質)またはその逆(RLI融合タンパク質)に結合させる柔軟なリンカーを設計する上での支援となった。そのモデルはまた、IL−15Rβおよびγ鎖への結合に関与していると考えられているIL−15の領域をリンカーがマスキングしていないことを予期させた。上述のとおり、2つの融合タンパク質は、Mo−7細胞のIL−15Rβ/γ複合体を活性化する場合、IL−15ならびにIL−15にsIL−15Rα−スシを加えた複合体より極めて活性的であることが判明した。TF−1β細胞で、また高親和性受容体の活性化を考慮すると、ILR融合タンパク質はIL−15と同等に活性であり、RLI融合タンパク質ではさらに10倍活性であり、細胞増殖の誘導の際、EC50は1.2pMと低かった。高活性のため、これらのハイパーIL−15融合タンパク質は、リンパ球サブセット、特にIL−15のトランス提示が生理学的活性化工程であると示唆されているリンパ球(NK、CD8記憶T細胞)の拡張用の貴重なツールを構成することが分かっている(13)。したがってそれらは、癌、免疫不全または感染疾患の患者の治療に的をしぼった治療戦略における非常に効率的なアジュバント分子である。
Claims (42)
- IL−15Rベータ/ガンマシグナル伝達経路を刺激し、それによりNKおよび/またはT細胞などのIL−15Rベータ/ガンマ陽性細胞の活性化および/または増殖を誘導および/または刺激することを目的とした化合物であって、
該化合物は、IL−15Rアルファの細胞外領域のスシドメインを含む少なくとも1つのポリペプチドに柔軟なペプチドリンカーにより間接的に共有結合している少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素を含むことを特徴とし、ここで:
−前記少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素はIL−15であり、そして
−IL−15Rアルファの細胞外領域のスシドメインを含む前記少なくとも1つのポリペプチドのアミノ酸配列は:
○ IL−15Rアルファの細胞外領域のアミノ酸配列であるか、あるいは
○ IL−15Rアルファの細胞外領域のフラグメントのアミノ酸配列であり、前記フラグメントは前記IL−15Rアルファ細胞外領域のスシドメインを保持し、前記スシドメインは最初のエクソン2にコードされたシステイン残基(C1)で開始し、第4のエクソン2にコードされたシステイン残基(C4)で終了し、残基C1およびC4は共に前記スシドメインに含まれていると定義されるアミノ酸配列である、
ここで、前記ペプチドリンカーは、少なくとも1つの、しかし30個未満のアミノ酸を含む、
化合物。 - 前記IL−15Rアルファが、ヒトIL−15Rアルファ、またはサルIL−15Rアルファ、またはネズミIL−15Rアルファ、またはウサギIL−15Rアルファ、またはブタIL−15Rアルファであることを特徴とする、請求項1に記載の化合物。
- 前記IL−15Rアルファ細胞外領域のアミノ酸配列が、配列番号40のヒトIL−15Rアルファ細胞外領域、配列番号80のチンパンジーIL−15Rアルファ細胞外領域、配列番号74のハツカネズミIL−15Rアルファ細胞外領域、または配列番号86のIL−15Rアルファ細胞外領域、の配列であることを特徴とする、請求項1〜2のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記スシドメインのアミノ酸配列が、配列番号14のヒトIL−15Rアルファスシドメイン、配列番号81のチンパンジーIL−15Rアルファスシドメイン、配列番号75のハツカネズミIL−15Rアルファスシドメイン、または配列番号87のIL−15Rアルファスシドメイン、の配列であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の化合物。
- IL−15Rアルファ細胞外領域の前記フラグメントが:
−前記IL−15Rアルファのエクソン2および3にコードされたIL−15Rアルファ細胞外領域の一部、または
−前記スシドメインを保持している、該エクソン2〜3にコードされた部分のフラグメント
を含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の化合物。 - 前記エクソン2にコードされた配列が:
−配列番号24の配列であるヒト細胞外IL−15Rアルファのエクソン2にコードされた部分、
−配列番号98の配列であるチンパンジー細胞外IL−15Rアルファのエクソン2にコードされた部分、
−配列番号97の配列であるハツカネズミ細胞外IL−15Rアルファのエクソン2にコードされた部分、
−配列番号99の配列であるドブネズミ細胞外IL−15Rアルファのエクソン2にコードされた部分
であることを特徴とする、請求項5に記載の化合物。 - 前記エクソン3にコードされた配列が:
−配列番号93の配列であるヒト細胞外IL−15Rアルファのエクソン3にコードされた部分、
−配列番号95の配列であるチンパンジー細胞外IL−15Rアルファのエクソン3にコードされた部分、
−配列番号94の配列であるハツカネズミ細胞外IL−15Rアルファのエクソン3にコードされた部分、
−配列番号96の配列であるドブネズミ細胞外IL−15Rアルファのエクソン3にコードされた部分
であることを特徴とする、請求項5〜6のいずれか1項に記載の化合物。 - IL−15Rアルファ細胞外領域の前記フラグメントが:
−前記IL−15Rアルファのエクソン2にコードされたIL−15Rアルファ細胞外領域の一部、または
−前記スシドメインを保持している、該エクソン2にコードされた部分のフラグメント
から成ることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の化合物。 - IL−15Rアルファ細胞外領域の前記フラグメントが、前記IL−15Rアルファのエクソン2にコードされたIL−15Rアルファ細胞外領域の一部を含み、さらに前記IL−15Rアルファのエクソン3にコードされた配列由来の少なくとも1つのアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の化合物。
- IL−15Rアルファ細胞外領域の前記フラグメントが:
−前記IL−15Rアルファのエクソン2および3にコードされたIL−15Rアルファ細胞外領域の一部、または
−前記IL−15Rアルファのエクソン2にコードされたIL−15Rアルファ細胞外領域の一部および前記IL−15Rアルファのエクソン3にコードされたIL−15Rアルファ細胞外領域の一部のフラグメント
から成ることを特徴とする、請求項9に記載の化合物。 - IL−15Rアルファ細胞外領域の前記フラグメントが:
−前記IL−15Rアルファのヒンジ領域、または
−該ヒンジ領域のフラグメントであって、
ここで、前記IL−15Rアルファヒンジ領域のアミノ酸配列は:
−配列番号20のヒトIL−15Rアルファヒンジ配列、
−配列番号82のチンパンジーIL−15Rアルファヒンジ配列、
−配列番号76のハツカネズミIL−15Rアルファヒンジ配列、または
−配列番号88のドブネズミIL−15Rアルファヒンジ配列であるフラグメント
をさらに含むIL−15Rアルファのフラグメントであることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の化合物。 - 前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドが、配列番号30のポリペプチドであることを特徴とする、請求項11に記載の化合物。
- ヒトIL−15Rアルファヒンジ領域の前記フラグメントのアミノ酸配列が、アミノ酸I、IRまたはIRDを含むことを特徴とする、請求項11に記載の化合物。
- 前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドが、配列番号22、24、26、28のポリペプチドであることを特徴とする、請求項13に記載の化合物。
- ヒトIL−15Rアルファ細胞外領域の前記フラグメントが、さらに:
−ヒトIL−15Rアルファのグリコシル化部位を多く含む領域のエクソン3にコードされた部分、配列番号34の配列である前記エクソン3にコードされた部分、または
−配列番号34のフラグメント
を含むことを特徴とする、請求項1〜7、9〜11のいずれか一項に記載の化合物。 - 前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドが、配列番号36のポリペプチドであることを特徴とする、請求項15に記載の化合物。
- IL−15Rアルファ細胞外領域の前記フラグメントが、さらに:
−エクソン1、2、3以外の1つまたはいくつかのIL−15Rアルファ細胞外エクソンにコードされた細胞外IL−15Rアルファの一部、または
−該部分のフラグメント
を含むことを特徴とする、請求項5〜7、9〜11、13、15に記載の化合物。 - 前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドまたは前記少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素に直接または間接的に結合したシグナルペプチドを含むことを特徴とする、請求項1〜17のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記IL−15が、ヒトIL−15であることを特徴とする、請求項1〜18のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記ヒトIL−15のアミノ酸配列が、配列番号48の配列であることを特徴とする、請求項19に記載の化合物。
- 前記少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素が、IL−2Rアルファに結合しないことを特徴とする、請求項1〜20のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドが、前記少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素に、10〜30個のアミノ酸長を有するペプチドリンカーを介して結合することを特徴とする、請求項1〜21のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記ペプチドリンカーのアミノ酸配列が、配列番号50または52の配列であることを特徴とする、請求項22に記載の化合物。
- 前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドが、前記少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素に関連してN末端位置にあることを特徴とする、請求項1〜23のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記少なくとも1つのスシ含有ポリペプチドが、前記少なくとも1つのIL−15Rベータ/ガンマ結合要素に関連してC末端位置にあることを特徴とする、請求項1〜23のいずれか一項に記載の化合物。
- そのアミノ酸配列が、配列番号60の配列であることを特徴とする、請求項1〜7、9〜12、18〜24のいずれか一項に記載の化合物。
- そのアミノ酸配列が、配列番号62の配列であることを特徴とする、請求項1〜7、9〜12、18〜23、25のいずれか一項に記載の化合物。
- IL−15Rベータ/ガンマシグナル伝達経路を刺激し、それによりNKおよび/またはT細胞などのIL−15Rベータ/ガンマ陽性細胞の活性化および/または増殖を誘導および/または刺激することを目的とした化合物をコードする核酸であって、普遍的遺伝子コードにしたがってその縮重を十分考慮して、請求項1〜27のいずれか一項に記載の化合物をコードすることを特徴とする、核酸。
- 請求項28に記載の少なくとも1つの核酸を含むことを特徴とする、ベクター。
- 請求項28に記載の核酸、および/または請求項29に記載のベクターによって形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。
- 哺乳動物細胞であることを特徴とする、請求項29記載の宿主細胞。
- 以下の要素:
−請求項1〜27のいずれか一項に記載の化合物、
−請求項28に記載の核酸、
−請求項29に記載のベクター、
−請求項30〜31のいずれか一項に記載の宿主細胞
のうち少なくとも1つの要素を含むことを特徴とする、免疫治療組成物のためのアジュバント。 - CD8メモリー応答を向上させることを特徴とする、請求項32記載のアジュバント。
- 以下の要素:
−請求項1〜27のいずれか一項に記載の化合物、
−請求項28に記載の核酸、
−請求項29に記載のベクター、
−請求項30〜31のいずれか一項に記載の宿主細胞
のうち少なくとも1つの要素を含むことを特徴とする、医薬組成物。 - 以下の要素:
−請求項1〜27のいずれか一項に記載の化合物、
−請求項28に記載の核酸、
−請求項29に記載のベクター、
−請求項30〜31のいずれか一項に記載の宿主細胞
のうち少なくとも1つの要素を含むことを特徴とする、薬剤。 - 予防および/または緩和および/または治療ワクチン組成物であることを特徴とする、請求項35記載の薬剤。
- 腫瘍の成長または存在の予防および/または緩和および/または治療を目的とすることを特徴とする、請求項35または36に記載の薬剤。
- 少なくとも1つの腫瘍抗原をさらに含むことを特徴とする、請求項37に記載の薬剤。
- 感染疾患の予防および/または緩和および/または治療を目的とすることを特徴とする、請求項35または36に記載の薬剤。
- 免疫不全の予防および/または緩和および/または治療を目的とすることを特徴とする、請求項35または36に記載の薬剤。
- IL−15Rベータ/ガンマ陽性細胞の増殖および/または活性化を誘導および/または刺激するインビトロでの方法であって:
−IL−15Rベータ/ガンマ陽性細胞を含む細胞試料を提供する工程、
−前記試料を以下の要素:
−請求項1〜27のいずれか一項に記載の化合物、
−請求項28に記載の核酸、
−請求項29に記載のベクター、
−請求項30〜31のいずれか一項に記載の宿主細胞
の少なくとも1つと接触させる工程を含み、前記接触は、前記IL−15Rベータ/ガンマ陽性細胞の増殖および/または活性化を誘導および/または刺激することを可能とする期間および環境条件下であることを特徴とする方法。 - 活性化NKおよび/またはT細胞を生成するインビトロでの方法であって:
−静止NKおよび/またはT細胞を含む細胞試料を提供する工程、
−前記試料を以下の要素:
−請求項1〜27のいずれか一項に記載の化合物、
−請求項28に記載の核酸、
−請求項29に記載のベクター、
−請求項30〜31のいずれか一項に記載の宿主細胞
の少なくとも1つと接触させる工程を含み、該接触は、該試料に含まれる静止NKおよび/またはT細胞の活性化を誘導することを可能とする期間および環境条件下であることを特徴とする方法。
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